JP7895637B2 - 眼病態に対するウイルスベクターベースの遺伝子療法 - Google Patents

Description

政府の権利の陳述
本発明は、米国国立眼科研究所からの支援に加え、ゲイツ再生医療センター（Gates Center for Regenerative Medicine）および失明予防研究所（Research to Prevent Blindness）からの追加支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年２月２２日に出願された、「眼病態に対するウイルスベクターベースの遺伝子療法（Viral Vector-Based Gene Therapy for Ocular Conditions）」と題する米国仮特許出願第６３／１５２，１５２号明細書の優先権を主張し、その全体をあらゆる目的で参照により本明細書に援用するものとする。

本開示は概して、傷害または疾患によって引き起こされる網膜損傷を治療するための組成物、システムおよび方法に関する。具体的な実施態様は、眼損傷に罹患したか、または発症するリスクがある被験体の網膜神経節細胞への少なくとも１つの熱ショックタンパク質のウイルスベクター媒介送達を含む。

発明の背景
緑内障には世界で７５００万人近くが罹患しており、およそ８００万人がこの疾患で失明している。米国だけでも３００万人近くが緑内障に罹患しており、この数は２０５０年までに２倍以上になると予想されている。緑内障に関連した視力喪失は、眼内圧として知られる眼球内部の圧力の上昇に主に起因することが多いため、従来の緑内障治療の第一選択は、通常は眼内圧を低下させるように配合された薬物の局所適用を含む。しかしながら、このアプローチにより圧力の低下に成功したとしても、軸索変性および網膜神経節細胞（「ＲＧＣ」）として知られる網膜内の細胞の継続的な死滅のために、多くの患者が失明することとなる。軸索変性およびＲＧＣ死に個別に、また特に組合せで寄与する因子の多様性から、緑内障および他の眼病態の治療は困難となっている。したがって、ＲＧＣ死および軸索変性に対抗する安全かつ効果的な方法が必要とされている。

発明の概要
本開示は、緑内障を含む様々な眼病態に対する新規の遺伝子療法を含む。実施形態には、少なくとも１つの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ」）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶベクター」）が含まれる。開示のｒＡＡＶベクターは、コードされたＨＳＰが眼内で最も必要とされる箇所でのＨＳＰの標的発現を誘導するＲＧＣ特異的プロモーター配列を含むこともできる。網膜損傷によって引き起こされる眼病態の少なくとも１つの症状の治療、予防および／または緩和の成功は、ｒＡＡＶ－ＨＳＰベクターの単回投与によって達成することができる。本明細書に要約される実験データによって示されるように、開示のベクター、医薬組成物および関連療法は、長時間（例えば、少なくとも約２０週間）にわたってＲＧＣ死を実質的に阻止、減速および／または低減することにより、網膜損傷を予防または治療することができる。

本開示の特定の実施形態によると、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防および／または緩和する方法は、被験体にｒＡＡＶベクターを含む治療有効量の組成物を投与することを含み得る。ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７（本明細書では「ＨｓｐＢ１」とも称される）等の少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列を含むこともできる。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。

方法の幾つかの実施形態では、網膜神経節細胞は、哺乳動物網膜神経節細胞を含み得る。方法の幾つかの実施形態では、哺乳動物網膜神経節細胞は、ヒト網膜神経節細胞を含み得る。方法の幾つかの実施形態では、組成物は、被験体が眼傷害を受けるか、または被験体において網膜疾患もしくは病態が診断されてから２４時間以内に少なくとも１回投与することができる。方法の幾つかの実施形態では、組成物を硝子体内投与することができる。幾つかの実施形態では、組成物を１回だけ投与することができる。方法の幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２型ベクターであり得る。

方法の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は緑内障である。方法の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、黄斑変性、糖尿病性眼疾患、網膜剥離および網膜色素変性症からなる群から選択される。方法の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、興奮毒性損傷、物理的損傷、化学的損傷、神経栄養因子欠乏、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリア機能不全、軸索輸送不全またはそれらの組合せによって引き起こされる。方法の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、網膜神経節細胞の喪失を含む。方法の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、眼内圧の上昇を含む。

本開示の実施形態によると、被験体の網膜神経節細胞におけるＨｓｐ２７タンパク質産生を増加させる方法が、被験体の眼にｒＡＡＶベクターを含む治療有効量の組成物を投与することを含む。ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７タンパク質をコードする核酸配列を、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列とともに含み得る。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。処置した眼の網膜神経節細胞におけるＨｓｐ２７タンパク質の量は、組成物を投与しない別の眼の網膜神経節細胞と比較して増加し得る。方法の幾つかの実施形態では、被験体の網膜神経節細胞は、ヒト網膜神経節細胞を含み得る。方法の幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２型ベクターであり得る。

本開示の実施形態によると、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防および／または緩和するためのシステムは、注射デバイスと、ｒＡＡＶベクターを含む治療有効量の組成物とを含み得る。ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７等の少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列を含むこともできる。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。注射デバイスは、組成物を被験体に硝子体内投与するように構成され得る。

システムの幾つかの実施形態では、注射デバイスはツベルクリン注射器であり得る。システムの幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は緑内障である。システムの幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、網膜神経節細胞の喪失を含む。システムの幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、眼内圧の上昇を含む。システムの幾つかの実施形態では、網膜神経節細胞は、哺乳動物網膜神経節細胞を含み得る。システムの幾つかの実施形態では、網膜神経節細胞は、ヒト網膜神経節細胞を含み得る。システムの幾つかの実施形態では、注射デバイスは単回使用デバイスであり得る。システムの幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２型ベクターであり得る。

本開示の実施形態によると、医薬組成物は、ｒＡＡＶベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含み得る。ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７等の少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列を含むこともできる。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。医薬組成物は、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するように配合され得る。

組成物の幾つかの実施形態では、網膜神経節細胞は、哺乳動物網膜神経節細胞を含み得る。組成物の幾つかの実施形態では、哺乳動物網膜神経節細胞は、ヒト網膜神経節細胞を含み得る。組成物の幾つかの実施形態では、医薬組成物は、硝子体内投与用に配合され得る。組成物の幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス２型ベクターであり得る。組成物の幾つかの実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、網膜神経節細胞の喪失、眼内圧の上昇および／または緑内障を含む。

本開示の実施形態によると、ｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するための薬剤の製造に使用することができる。ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７等の少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列を含むこともできる。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。

幾つかの製造実施形態では、医薬組成物は、硝子体内投与用に配合され得る。幾つかの製造実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は緑内障を含む。幾つかの製造実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、網膜神経節細胞の喪失を含む。幾つかの製造実施形態では、網膜疾患、傷害または病態は、眼内圧の上昇を含む。

本開示の実施形態によると、ｒＡＡＶベクターは、Ｈｓｐ２７等の少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｒＡＡＶベクターは、核酸配列の上流に位置するプロモーター配列を含むこともできる。プロモーター配列は、網膜神経節細胞における核酸配列の発現を誘導することができる。ｒＡＡＶベクターは、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するように配合され得る。

本概要は、本開示の完全な範囲（extent and scope）を代表すると意図されるものではなく、そのように解釈されるべきでもない。さらに、本明細書における「本開示」またはその態様への言及は、本開示の或る特定の実施形態を意味すると理解すべきであり、必ずしも全ての実施形態を特定の記載に限定すると解釈されるべきではない。本開示は、添付の図面および詳細な説明のみならず、本概要に様々な詳細度で記載され、本概要に要素、構成要素等を含めるか、または含めないことによる、本開示の範囲に関する限定は意図されない。開示の実施形態のいずれかからの特徴は、限定されることなく互いに組み合わせて用いることができる。加えて、本開示の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および添付の図面を検討することにより、当業者に明らかとなるであろう。

図面は、本発明の幾つかの実施形態を説明するものであるが、同一の参照番号は、図面に示される異なる図または実施形態において同一または類似の要素または特徴を指す。

本明細書に開示される実施形態によるＨｓｐ２７タンパク質をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターのマップである。 本明細書に開示される実施形態によるαＡ－クリスタリンタンパク質をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターのマップである。 本明細書に開示される実施形態によるαＢ－クリスタリンタンパク質をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターのマップである。 本明細書に開示される実施形態によるＨｓｐ２０タンパク質をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターのマップである。 本明細書に開示される実施形態による、Ｂｒｎａ３免疫染色による健常および緑内障マウスに由来するＲＧＣに対する様々なｒＡＡＶ２ベクターの効果を示す共焦点顕微鏡画像である。 本明細書に開示される実施形態による、健常および緑内障マウスに由来するＲＧＣに対する様々なｒＡＡＶ２ベクターの定量的効果を示す棒グラフである。 ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７の硝子体内投与によって媒介されるＲＧＣにおけるＨｓｐ２７の発現を示す共焦点顕微鏡画像である。 図７Ａに示すＲＧＣから抽出されたＨｓｐ２７タンパク質を示すウエスタンブロットである。 ｒＡＡＶ２－αＡ－クリスタリンの硝子体内投与によって媒介されるＲＧＣにおけるαＡ－クリスタリンの発現を示す共焦点顕微鏡画像である。 図８Ａに示すＲＧＣから抽出されたαＡ－クリスタリンタンパク質を示すウエスタンブロットである。 ｒＡＡＶ２－αＢ－クリスタリンの硝子体内投与によって媒介されるＲＧＣにおけるαＢ－クリスタリンの発現を示す共焦点顕微鏡画像である。 図９Ａに示すＲＧＣから抽出されたαＢ－クリスタリンタンパク質を示すウエスタンブロットである。 ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２０の硝子体内投与によって媒介されるＲＧＣにおけるＨｓｐ２０の発現を示す共焦点顕微鏡画像である。 図１０Ａに示すＲＧＣから抽出されたＨｓｐ２０タンパク質を示すウエスタンブロットである。 本明細書に開示される実施形態による眼内圧に対するマイクロビーズ注射の効果を示す折れ線グラフである。 図１１Ａに示すマイクロビーズベースの高眼圧症のマウスモデルにおけるＲＧＣ死に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す棒グラフである。 本明細書に開示される実施形態によるＢｒｎａ３免疫染色を用いた健常マウスまたは高眼圧症に罹患したマウスのＲＧＣに対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す共焦点顕微鏡画像である。 本明細書に開示される実施形態によるマイクロビーズベースの高眼圧症のマウスモデルにおけるＲＧＣ軸索輸送に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す棒グラフである。 本明細書に開示される実施形態によるＣＴ－Ｂ染色を用いたＲＧＣ軸索輸送に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す共焦点顕微鏡画像である。 本明細書に開示される実施形態によるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の前後の眼内圧に対する複数回のマイクロビーズ注射の効果を示す折れ線グラフである。 図１３Ａに示すマイクロビーズベースの高眼圧症のマウスモデルにおけるＲＧＣ死に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す折れ線グラフである。 本明細書に開示される実施形態によるＢｒｎａ３免疫染色を用いた図１３Ｂに示すＲＧＣに対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す共焦点顕微鏡画像である。 マイクロビーズベースの高眼圧症のマウスモデルにおけるＲＧＣ軸索輸送に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す棒グラフである。 ＣＴ－Ｂ染色を用いた図１４Ａに示すＲＧＣ軸索輸送に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す共焦点顕微鏡画像である。 本明細書に開示される実施形態によるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与後２０週間にわたる眼内圧に対するマイクロビーズ注射の効果を示す折れ線グラフである。 本明細書に開示される実施形態によるマイクロビーズ注射およびｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与を受けた網膜で測定されたパターン網膜電図（「ＰＥＲＧ」）振幅を示す棒グラフである。 本明細書に開示される実施形態による網膜グリオーシスに対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の効果を示す共焦点顕微鏡画像パネルである。

詳細な説明
本開示は、緑内障および関連する眼損傷を含む網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防および／または緩和するための組成物、方法およびシステムに関する。実施形態は、Ｈｓｐ２７等の少なくとも１つのＨＳＰをコードするｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物を投与することを含む遺伝子療法アプローチによってＲＧＣ死を低減または予防することを含む。特にＲＧＣにおけるＨＳＰレベルを上昇させるために、ｒＡＡＶベクターは、ＨＳＰ配列に操作可能に連結したＲＧＣ特異的プロモーター配列を含み得る。許容可能な担体および／または添加剤も含み得る医薬組成物は、被験体が緑内障（例えば正常眼圧緑内障）等の眼病態と診断される前および／もしくは後、または被験体が眼傷害を受けた後に１回以上投与することができる。幾つかの例では、医薬組成物の１回の投与だけで、眼病態を効果的に治療または予防するのに十分であり得る。開示の方法で、例えば硝子体内に医薬組成物を投与すると、眼内の抗アポトーシスＨＳＰのレベルが上昇することで、そうでなければ傷害または眼病態の発症後に起こり得るＲＧＣ死が顕著に阻害される可能性がある。本明細書に記載される遺伝子療法に従って用いられるｒＡＡＶベクターは、有利には、低い免疫原性および最小限の細胞毒性を示し得る。要するに、これらの利点により、眼療法の分野で以前に検討されていなかった安全で効果的な方法でＲＧＣ死を予防、低減および／または減速することができる。

以下に別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的上、以下の用語を明確にするために定義する。

本明細書で使用される場合、ＨＳＰは、それぞれ約８０～約１００アミノ酸残基の範囲のクリスタリンコアドメインを有するストレスタンパク質である。ＨＳＰは、更なる生理的機能の中でも、それらが存在する細胞内で抗アポトーシス活性および分子シャペロン活性を示すことがある。ＨＳＰは、低分子量ＨＳＰ（約１２～４３ｋＤａ）と高分子量ＨＳＰ（約１００～１１０ｋＤａ）とに分類することができる。低分子量ＨＳＰの例としては、Ｈｓｐ２７（ＨｓｐＢ１とも呼ばれる）、Ｈｓｐ２０（ＨｓｐＢ６とも呼ばれる）およびα－クリスタリン（αＡおよびαＢの２つのサブユニットから構成される）が挙げられる。高分子量ＨＳＰとしては、例えばＨｓｐ９０が挙げられる。本開示において、ＨＳＰ遺伝子または配列は、ＨＳＰタンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含む。

本明細書で使用される場合、「被験体」は、ヒトまたは他の哺乳動物を意味する。非ヒト被験体には、例えば家庭用ペットおよび／または家畜等の様々な哺乳動物が含まれ得るが、これらに限定されない。被験体は、治療を必要とするとみなすことができる。開示の組成物、方法およびシステムは、健常なヒト被験体、緑内障と診断された患者、１つ以上の他の眼疾患と診断された患者、様々な眼傷害を患っている患者、糖尿病患者、または視力喪失を起こしている患者の治療に効果的であり得る。

本明細書で使用される場合、「眼病態」は、被験体の片眼または両眼に悪影響を及ぼすものを含む、眼に関係する全ての疾患または病態を包含する。本明細書に開示される治療方法の標的とされる眼疾患、傷害および病態は、特に網膜組織を損傷する可能性がある。本明細書で企図される眼病態の非限定的な例としては、緑内障、正常眼圧緑内障、黄斑変性、糖尿病性眼疾患、糖尿病性網膜症、網膜グリオーシス、網膜剥離、網膜色素変性症、ＲＧＣ死、眼内圧上昇、興奮毒性損傷、物理的損傷（例えば、虚血および／または再灌流）、化学的損傷、神経栄養因子欠乏、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリア機能不全、軸索輸送不全またはそれらの組合せを挙げることができる。

本明細書で使用される場合、「緑内障」は、視神経の不可逆的損傷による視覚機能の永久的喪失を特徴とする疾患を指す。緑内障の２つの主なタイプは、原発性開放隅角緑内障および閉塞隅角緑内障であり、これらの一方または両方を本明細書に記載される実施形態に従って治療することができる。

本明細書で使用される場合、「眼内圧」という用語は、眼球内の液体の圧力を指す。正常なヒトの眼の眼内圧は通例、約１０～約２１ｍｍＨｇの範囲である。眼内圧「上昇」は従来、約２１ｍｍＨｇ以上と考えられる。眼内圧上昇は、緑内障の発症のリスク因子であり得る。

本明細書で企図される網膜損傷の治療は、疾患、傷害または他の病態によって引き起こされるか、またはそれと関連する網膜損傷の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和することを包含する。したがって、「治療する」、「治療」または「緩和」は、治療処置および予防（prophylactic or preventative）措置の両方を指し、その目的は、標的の病的状態および／または症状を予防または減速（軽減）することである。治療を必要とする人には、病態を罹患または発症する傾向がある人だけでなく、既に病態と診断された人が含まれる。被験体が本開示の方法に従って治療有効量の医薬組成物を受けた後、視力障害、視力喪失、視力異常、ＲＧＣ軸索変性、ＲＧＣの細胞体の損傷、およびＲＧＣ死の１つ以上の観察可能かつ／もしくは測定可能な低減、またはその欠如を示す場合、被験体は網膜損傷の「治療」に成功する。「治療する（treat）」または「治療する（treating）」という用語は、本明細書において説明を簡単にするためだけに一貫して使用され、したがって限定的なものと解釈されるべきではない。

「低減する（Reducing）」、「低減する（reduce）」または「低減」は、網膜損傷の重症度、範囲、頻度または長さを減少させることを意味する。

ｒＡＡＶベクターを含む組成物の「有効量」は、具体的に記載された目的を果たすのに十分な量であり、記載の目的に関して経験的に日常的な方法で決定することができる。例えば、本明細書で使用される「有効量」は、被験体のＲＧＣにおけるＨＳＰタンパク質産生を増大または増強するｒＡＡＶベクターの量と定義することができる。「治療有効量」という用語は、被験体における網膜疾患、傷害または病態の少なくとも１つの症状を検出可能に繰り返して治療、リスク低減、予防または緩和するｒＡＡＶベクターを含む組成物の量を指す。これには、眼内圧上昇、ＲＧＣ細胞体損傷、ＲＧＣ死、視力喪失および／またはＲＧＣ軸索変性等の疾患の兆候または症状の頻度または重症度の低減が含まれるが、これらに限定されない。かかる改善は、本明細書に開示される方法に従って開示の医薬組成物を投与していない眼または被験体と比べて検討され得る。治療により病状が改善し得るが、疾患の完全な治癒ではない可能性があることが当業者には理解される。例えば、緑内障患者の治療の成功は、患眼における視野喪失がそれ以上進行しないこと、または患眼における視野喪失の進行速度が減速することから明らかであり得る。

化合物、組成物または作用物質「の投与」および「を投与する」は、本明細書に記載される化合物、組成物もしくは作用物質、化合物、組成物もしくは作用物質のプロドラッグ、または医薬組成物の提供を意味すると理解されるべきである。化合物、作用物質または組成物は、他者が被験体へと（例えば、硝子体内または腹腔内に）提供もしくは投与してもよく、または被験体が自己投与してもよい。

「医薬組成物」または「医薬配合物」は、或る量（例えば単位投与量）の開示の化合物、例えばｒＡＡＶ－ＨＳＰの１つ以上を、担体、希釈剤および／またはアジュバントを含む１つ以上の非毒性の薬学的に許容可能な添加物、ならびに任意に他の生物学的に活性な成分とともに含む組成物である。かかる医薬組成物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (19th Edition)に開示されているような標準的な医薬配合技術によって調製することができる。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な添加剤」または「薬学的に許容可能な担体」は、医薬組成物の所望の形態または粘稠度に寄与する薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各々の添加剤または担体は、被験体に投与した場合に本開示の組成物の有効性を実質的に低下させる相互作用、および薬学的に許容可能でない医薬組成物をもたらす相互作用が回避されるように、混合した場合に医薬組成物の他の成分に適合する必要がある。加えて、各々の添加剤または担体は、薬学的に許容可能となるように十分に高純度である必要がある。薬学的に許容可能な担体の非限定的な例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油等を挙げることができる。付加的または代替的には、担体は滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤等を含むことがある。

本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスを指す。「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」または「ｒＡＡＶベクター」という用語は、少なくとも１つの「ＨＳＰ配列」を含む組換えアデノウイルス構築物を指し、「ＨＳＰ配列」はＨＳＰ、ＨＳＰフラグメントまたはＨＳＰドメインをコードする核酸配列、例えば遺伝子を指す。遺伝子発現およびＤＮＡ複製に必要とされる付加的な核酸配列が、所与のｒＡＡＶベクターに含まれていてもよい。かかる配列には、１つ以上のポリアデニル化配列、複製起点、転写エンハンサー等とともにＨＳＰ配列に操作可能に連結した組織特異的プロモーターが含まれ得る。開示のｒＡＡＶベクターは、標的細胞に高い導入効率で導入することができ、そこでベクターが少なくとも１つのＨＳＰ構築物を発現する。

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」という用語は、要素が通常の機能を果たすことを可能にする要素の配置を指す。例えば、ＨＳＰ配列等のＤＮＡコード配列は、コード配列がｍＲＮＡに正確に転写され、スプライシング／結合され、ポリペプチドに翻訳され、生じるタンパク質が生細胞内で適切に機能するのに必要な立体構造にフォールディングするように、プロモーター、エンハンサーおよび／またはターミネーター配列等に融合させることができる。プロモーターおよび／または付加的な調節要素は、かかる要素がＨＳＰ配列の発現を指示する限りにおいて、必ずしもＨＳＰ配列と連続していなくてもよい。例えば、転写されたＤＮＡ配列がプロモーター配列とＨＳＰ配列との間に存在していても、プロモーター配列がコード配列に「操作可能に連結する」とみなすことができる。組換えベクターへの操作可能な連結は、相同的組換え等の当該技術分野で既知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。

本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、異種、組織特異的、構成的または誘導性のプロモーターを含むことができる。実施形態には、ＲＧＣにおいて特異的に少なくとも１つのＨＳＰをコードする１つ以上の核酸の強固な発現を誘導するＲＧＣ特異的プロモーターが含まれる。幾つかの実施形態では、ＲＧＣ特異的プロモーターは、ＲＧＣにおいてのみ発現を駆動することで、潜在的なオフターゲット効果を最小化または排除することができる。幾つかの実施形態では、プロモーターはヒトＤＮＡ、ミニＲＧＣ特異的ニューロフィラメント軽鎖プロモーター、例えばＰｌｅ３４５－ＮＥＦＬを含み得る。ＲＧＣ喪失が緑内障に罹患した被験体における失明の主要なドライバーであるため、ＲＧＣ特異的プロモーターは、疾患を発症するリスクがあるまたは既に疾患と診断された被験体においてＲＧＣ喪失を予防するうえで重要である可能性がある。

開示の遺伝子療法および関連システムでは、ＲＧＣにおけるＨＳＰの発現を誘導するように構築されたｒＡＡＶベクターの形態の発現構築物を含む医薬組成物を利用する。本明細書で使用される場合、「発現構築物」は、ＨＳＰまたはそのペプチドフラグメントをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指すことがある。発現構築物は、それにコードされるＨＳＰの上方調節または過剰発現を駆動することができる。

本明細書で使用される場合、「同一性」または「類似性」という用語は、配列を比較することによって決定される２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列間の関係を表す。当該技術分野において、同一性はまた、配列の文字列間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。

単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈上明らかに他の指定がない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、文脈上明らかに他の指定がない限り、「および」を含むことを意図したものである。「含む（comprises）」という用語は「含む（includes）」を意味する。また、「ＡまたはＢを含む」とは、文脈上明らかに他の指定がない限り、ＡもしくはＢまたはＡおよびＢを含むことを意味する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。加えて、材料、方法および例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照により本明細書に援用される。本明細書で引用される参照文献は、請求項に係る発明の先行技術であるとは認められない。

ベクター
本開示のベクターは、ＲＧＣ特異的プロモーター配列とともに少なくとも１つのＨＳＰをコードするｒＡＡＶベクターを含む。

図１は、本明細書の実施形態に従って用いられる、配列番号１を有する例示的なｒＡＡＶベクター１００を示す。示されるように、ｒＡＡＶベクター１００は、この例ではＰｌｅ３４５ ＮＥＦＬであるＲＧＣ特異的プロモーター１０４の下流に配置されたＨｓｐ２７コード配列１０２（「Ｈｓｐ２７配列」）を含む。幾つかの例では、Ｈｓｐ２７は、眼傷害または疾患と関連するＲＧＣ死を予防、低減および／または減速するのに最も効果的なＨＳＰであり得る。Ｈｓｐ２０、αＡ－クリスタリンおよび／またはαＢ－クリスタリンを含む付加的なＨＳＰも、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターによって被験体に送達された場合にＲＧＣ死に効果的に対抗する可能性がある。かかるＨＳＰは、幾つかの例ではＨｓｐ２７より効果が低いことがある。特定のＨＳＰは、治療される被験体および／もしくは病態、ならびに／または治療方法に応じて様々な有効性レベルを示す可能性がある。上述のＨＳＰの１つ以上が、ＲＧＣの細胞体および／または軸索を、損傷または疾患によって引き起こされる変性から保護するのに特に効果的であり得る。

ｒＡＡＶベクター１００のＨｓｐ２７配列１０２およびそのプロモーター１０４には、ウイルス複製およびパッケージングを促進する２つの逆方向末端反復１０６ａ，１０６ｂが隣接する。シャイン－ダルガノ配列１０８の形のリボソーム結合部位も、ｍＲＮＡプロセシングおよびＨＳＰ発現を増強するキメライントロン配列１１０と同様に含まれる。ｒＡＡＶベクター１００はまた、ウッドチャック肝炎転写後調節要素（「ＷＰＲＥ」）１１２、ＳＶ４０ポリアデニル化配列１１４、ＳＶ４０ｐＡ－Ｒ配列１１６、および酵素的制限切断のための第Ｘａ因子部位１１８を含む。ｒＡＡＶベクターは複製起点１２０を含み、転写時のＲＮＡポリメラーゼの結合のためにｌａｃプロモーター１２２および重複ｌａｃオペレーター配列１２４を含む。ｆ１複製起点１２６は、ファージ粒子へのｓｓＤＮＡのパッケージングを促進する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択のために、例示するｒＡＡＶベクター１００は、アンピシリン耐性遺伝子１２８および上流のプロモーター１３０も含む。抗生物質耐性カセットは、哺乳動物注射用に構築されるｒＡＡＶベクターの実施形態を含む全ての実施形態に含まれていなくてもよい。１つ以上の付加的なＤＮＡ構築物が種々の実施形態に含まれていてもよく、例示したＤＮＡ構築物の１つ以上を除外してもよい。

本発明のｒＡＡＶベクターの作製に使用される特定のアデノウイルスは様々であり得る。例えば１型、２型、３型、４型、５型等を使用することができる。具体的に図示する実施形態では、ｒＡＡＶベクターはアデノ随伴ウイルス２型ベクター（「ｒＡＡＶ２ベクター」）である。

Ｈｓｐ２７配列１０２は、野生型Ｈｓｐ２７タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。付加的または代替的には、実施形態はＨＳＰの一部、例えばＨｓｐ２７の一部を構成するポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。かかる配列は、野生型Ｈｓｐ２７をコードする核酸配列と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％同一であり得る。

付加的または代替的には、本明細書で企図されるｒＡＡＶベクターは、幾つか例を挙げるとＨｓｐ２０、αＡ－クリスタリンまたはαＢ－クリスタリン等の１つ以上の異なるＨＳＰをコードする１つ以上の核酸配列を含むことができる。したがって、単一のｒＡＡＶベクターは、１つのＨＳＰまたは複数のＨＳＰのコード配列を含み得る。

幾つかの例では、ｒＡＡＶベクターは、スクリーニングおよび／または追跡目的でレポーター遺伝子および／またはマーカーを含むことができる。例示的なレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、改変緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、改変赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、増強赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）等をコードする遺伝子を挙げることができる。

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、ＲＧＣ死および／または網膜グリオーシスによって引き起こされるか、またはそれと関連する眼疾患、傷害および／または病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するのに適している。医薬組成物の実施形態は、ＲＧＣ特異的プロモーター配列とともに少なくとも１つのＨＳＰをコードするｒＡＡＶベクターを含み得る。医薬組成物は、被験体の標的部位へのｒＡＡＶベクターの送達を促進および／または安定化するように構成される薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。

幾つかの実施形態では、医薬組成物は、各々が１つ以上の固有のＨＳＰをコードする２つ以上の異なるｒＡＡＶベクターの混合物を含んでいてもよい。例えば、医薬組成物は、Ｈｓｐ２７をコードするｒＡＡＶベクター、Ｈｓｐ２０をコードするｒＡＡＶベクター、αＡ－クリスタリンをコードするｒＡＡＶベクター、および／またはαＢ－クリスタリンをコードするｒＡＡＶベクターを含み得る。

実施形態において、医薬組成物は１つ以上の添加剤を含むか、またはそれと同時に投与することができる。好適な添加剤は、用いられる特定の投与量によって異なることがある。加えて、好適な添加剤は、安定な剤形の製造を容易にする能力等の特定の機能によって選ばれ得る。添加剤は、規則遵守のために選ばれることもある。非限定的な添加剤の例としては、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動促進剤、造粒剤、コーティング剤、湿潤剤、溶媒、共溶媒、懸濁化剤、乳化剤、着色料、固化防止剤、保湿剤、キレート剤、可塑剤、粘性剤、酸化防止剤、防腐剤、安定剤および界面活性剤が挙げられる。当業者であれば、或る特定の薬学的に許容可能な添加剤が２つ以上の機能を果たすことがあり、最終組成物中に添加剤がどの程度存在し、組成物中に他のどの成分が存在するかに応じて代替的な機能を果たすことがあることを理解するであろう。

実施形態において、ｒＡＡＶベクターを１つ以上の緩衝剤および／または希釈剤と同時に投与することができ、その非限定的な例としては、様々な濃度の水酸化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。

特定の添加剤および／または担体の含有は、投与経路によって異なり得る。例えば、非経口投与用の調製物には、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁液、エマルション、凍結乾燥調製物および／または坐剤が含まれ得る。非水溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および／または注射用エステルを挙げることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチン等を使用することができる。ペプチドの安定性または吸収性を高めるために、グルコース、スクロースもしくはデキストラン等の炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオン等の酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤を使用することができる。

幾つかの実施形態では、医薬組成物は局所組成物、例えば液滴形態で提供してもよい。点眼剤は１つ以上の分散剤、可溶化剤および／または懸濁剤も含む水性または非水性基剤を用いて配合することができる。かかる実施形態によると、医薬組成物中のｒＡＡＶベクターの濃度は、硝子体内実施態様に用いられる濃度よりも高いことがある。

治療的アプローチ
眼病態を治療する方法は、治療有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶ－ＨＳＰ組成物を被験体の眼に投与することを含み得る。組成物は、眼傷害を受けるか、または眼疾患が診断された後に投与することができる。実施形態は、被験体が疾患を発症するのを予防するか、または疾患発症時の症状の重症度を軽減するために、未診断の被験体に開示のｒＡＡＶ－ＨＳＰ組成物を投与することも含み得る。幾つかの例では、予防的投与は、被験体に平均を上回る眼疾患発症リスクがあると決定された後に行ってもよい。幾つかの実施形態では、開示の医薬組成物の単回硝子体内投与により、眼内の１つ以上のＨＳＰの濃度を、未治療のままであれば別の方法で不可逆的網膜損傷を引き起こし得るＲＧＣ喪失を低減するのに十分なレベルにまで増加させることができる。実施形態では、１つ以上のＨＳＰの濃度を標的ＲＧＣの細胞体において特異的に増加させることができる。

硝子体内投与が網膜損傷の局部的な改善に最も効果的である可能性があるが、具体的な投与方法は様々であり得る。許容可能な投与方法の非限定的な例としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与を挙げることができる。

前節で述べたように、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含むか、またはそれと同時に投与することができる。関連して、医薬組成物は単独で、または他の治療剤と組み合わせて連続的もしくは同時に投与することができる。かかる付加的な作用物質は、同じ眼病態を治療するために配合しても、またはそうでなくてもよい。

幾つかの例では、１つ以上の用量の本明細書に開示される医薬組成物を含み得る単回投与だけで、緑内障およびその１つ以上の症状を含む眼病態を治療するのに十分である可能性がある。１回しか投与が必要でないことにより、患者ノンコンプライアンスの問題を回避することができ、それにより成功の可能性がさらに高まる。２回以上の投与を必要とする被験体については、投与頻度を変化させることができる。実施形態において、薬学的有効量の組成物を毎週、毎月または毎年投与することができる。開示の組成物を被験体に投与する回数は、治療期間の長さとともに、網膜損傷を引き起こすか、またはそのリスクがある病態の重症度またはタイプによって異なり得る。例えば、医薬組成物を投与して眼傷害を治療する実施形態は、より持続的な治療アプローチを必要とし得る、ｒＡＡＶ組成物を投与して緑内障等の疾患を治療する実施形態よりも少ない個別投与を含むことがある。治療期間の長さも患者特有であり、医師または他の医療供給者によって定期的に再評価され得る。様々な実施形態において、医薬組成物は傷害の直後、例えば傷害から１、２、６、１２または２４時間以内に投与することができる。配合物は１回または複数回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上投与することができる。幾つかの例では、単回用量の開示の医薬組成物により、眼病態を少なくとも約２０週間にわたって効果的に治療することができる。かかる例によると、医薬組成物は２０週間に１回投与され得る。

本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に記載される目的で特別に構成され得るツベルクリン注射器または点滴デバイス等の注射デバイスを用いて投与することができる。幾つかの例では、投与デバイスは単回使用デバイスであってもよく、これは単回用量の医薬組成物も含むキットに含まれていてもよい。したがって、注射デバイスは、網膜損傷の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するためのシステムの一部を構成し得る。

被験体に投与される医薬組成物の治療有効量は変化し得る。実施形態において、被験体に提供される医薬組成物の各硝子体内用量は、約２×１０^９ｐｆｕ／ｍｌ～約１×１０^１０ｐｆｕ／ｍｌ、もしくは約１×１０^１０ウイルスゲノム／ｍｌ（ｖｇ／ｍｌ）、約１×１０^１１ｖｇ／ｍｌ、約１×１０^１２ｖｇ／ｍｌ、約１×１０^１３ｖｇ／ｍｌ、約１×１０^９ｖｇ／眼、約５×１０^９ｖｇ／眼、もしくはそれ以上の範囲のｒＡＡＶ濃度、またはその間の任意の濃度を含み得る。投与は、例えば治療される病態、病態の重症度、配合物の性質、投与方法、被験体の状態、被験体の年齢、被験体の体重、またはそれらの組合せによって異なり得る。投与量レベルは通例、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたは組織培養において有効であることが示された濃度と少なくとも同じ濃度を作用部位で達成するのに十分なものである。

複数の投与技術およびスケジュールに対応するために、本明細書に開示される医薬組成物は、当業者に用いられる方法に従い、薬学的に許容可能な担体および／または添加剤とともに単位投与形態または複数投与形態で調製することができる。例示的な配合物は、水性もしくは油性溶液、懸濁液、またはエマルションの形態であり得る。安定性の向上および長期保存のために、医薬組成物を凍結乾燥してもよい。

以下の実験例は、本発明の例示的な実施形態を説明するために提供され、限定的なものとみなすべきではない。

実施例
実施例１
緑内障等のＲＧＣ死を特徴とする網膜病態に対する様々なＨＳＰのｒＡＡＶ２媒介送達の効果を評価するために、緑内障のマウスモデルを作製し、本明細書に開示される医薬組成物を１回硝子体内投与して治療した。

緑内障マウスモデルの作製は、野生型（ＷＴ）マウスを麻酔し、眼内圧を１５ｍｍＨｇから１２０ｍｍＨｇに上昇させることによって虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害を生じさせることを含むものであった。上昇させた圧力を１時間維持した後、正常範囲内の圧力まで再び低下させた。この手順により、緑内障患者で観察されるＲＧＣ死の程度と同様の相当量のＲＧＣ死（＞５０％）が引き起こされた。

硝子体内注射は、ハミルトン注射器（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzerland）に取り付けたガラスピペットを用いて行った。眼瞼を慎重に広げ、３３ゲージ針を縁郭の真後ろの硝子体に向かって４５°の角度で強膜から硝子体へと挿入した。２μＬの溶液を各注射の間に３０秒の間隔を空けて１μＬずつ注射した。注射後に針をゆっくりと引き抜き、注射部位を局所抗生物質で処置した。

Ｉ／Ｒ傷害の４週間前に、コードされる特定のＨＳＰのみが異なる４つの別個のｒＡＡＶ２治療ベクターを治療マウスの別々の群に硝子体内投与し、ＲＧＣ死を予防、低減および／または減速する能力について評価した。Ｉ／Ｒ傷害を受けていない無傷の対側眼および傷害を受けた対側眼を、それぞれ健常対照および非治療緑内障対照として用いた。

配列番号２を有する１つのｒＡＡＶ２ベクターであるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ４のマップを図２に示す。示されるように、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ４ ２００は、Ｈｓｐ２７配列１０２の代わりにＨｓｐＢ４（αＡ－クリスタリン）コード配列２０２を含むことによってのみ、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７（図１を参照されたい）と異なる。図３は、Ｈｓｐ２７配列１０２の代わりにＨｓｐＢ５（αＢ－クリスタリン）コード配列３０２を含む、配列番号３を有する別のｒＡＡＶ２ベクターであるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ５のマップを示す。図４は、Ｈｓｐ２７配列１０２の代わりにＨｓｐＢ６（Ｈｓｐ２０）コード配列４０２を含む、配列番号４を有する第３のｒＡＡＶ２ベクターであるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ６のマップを示す。最終ベクターであるｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１は、配列番号１を含み、図１に示されるようにｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７と同一である（Ｈｓｐ２７＝ＨｓｐＢ１）。

Ｉ／Ｒ傷害の１４日後およびｒＡＡＶ２投与の６週間後に、全てのマウスを麻酔し、網膜を解剖し、平らにマウントし、ＲＧＣのマーカーであるＢｒｎ３ａ（脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ）について免疫染色した。ＲＧＣ細胞体損傷および全ＲＧＣ喪失に対する１回限りの硝子体内ｒＡＡＶ２投与の効果を図５に示す。より高いＢｒｎ３ａ陽性ＲＧＣ染色（右下のスケールバー＝１００μｍ）から明らかなように、ＲＧＣ数は健常治療群５０２から摘出した対側網膜で最も多く、非治療緑内障群５０４から摘出した対側網膜で最も少なかった。健常マウスと比べて、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１治療群５１２のＲＧＣ数が最も多く、その後にｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ６治療群５１０、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ５治療群５０８およびｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ４治療群５０６が続いた。したがって、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１（ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７）が、緑内障のマウスモデルにおいてＲＧＣ喪失を低減するのに最も効果的であった。注目すべきことに、他のＨＳＰをコードするｒＡＡＶ２ベクターも、非治療緑内障マウスと比べてＲＧＣ喪失を低減し、単独または組合せで眼病態を治療する潜在的有効性が示された。

切除した網膜１平方ミリメートル当たりに存在するＲＧＣの数に基づく、ＲＧＣ喪失に対する各ｒＡＡＶ２ベクターの１回限りの硝子体内投与の定量的効果を図６にグラフで示す。ここで、ｎｓ＝有意でない、^＊ｐ＜０．０５および^＊＊＊ｐ＜０．００１である。示されるように、Ｉ／Ｒ傷害を受けていない健常対照マウス（「Ｃｏｎｔ」）は、１ｍｍ^２当たり２０００個を超えるＲＧＣを有していたが、非治療緑内障マウス（「ビヒクル」）は、有意なＲＧＣ喪失を示した。非治療緑内障マウスと比べて、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ５、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ６およびｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療した緑内障マウスは全て、ＲＧＣ喪失の統計的に有意な予防を示した。本研究では統計的に有意ではなかったが、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ４で治療した緑内障マウスでもＲＧＣ喪失の予防が観察された。

緑内障のマウスモデルを用いて得られたデータに鑑みると、ＨＳＰをコードするｒＡＡＶ２ベクターの僅か１回の硝子体内投与が、ＲＧＣを変性から有意に保護し、ＲＧＣ喪失を低減するのに効果的な可能性があり、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１（またはｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７）が最も効果的である。ＲＧＣ細胞体および軸索はどちらも、本明細書に開示されるｒＡＡＶ２ベクターの投与によって保護され得るが、ｒＡＡＶ２－ＨＳＰ投与の保護効果は、軸索とは対照的にＲＧＣ細胞体において特に顕著である可能性がある。このため、開示のｒＡＡＶ２ベクターは、緑内障等の眼傷害または疾患を患っている哺乳動物、例えばヒトにおいて視力喪失を予防するか、または少なくとも低減することができる長期的効果を示す可能性がある。

実施例２
実施例１で評価したｒＡＡＶ２ベクターが効果的にＲＧＣに浸透し、その中で少なくとも１つのＨＳＰの持続的な過剰発現を誘導するかを確認するために、非治療マウスおよび試験ｒＡＡＶ２ベクターの１つで治療したマウスから得た網膜切片を、硝子体内注射の１ヶ月後に投与したＨＳＰについて免疫染色した。標的ＲＧＣも硝子体内投与の１ヶ月後に消化し、各ＨＳＰに特異的な抗体を用いて行ったウェスタンブロッティングによりＨＳＰタンパク質レベルを決定した。

図７Ａに示されるように、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７を投与していない対側眼から得られた対照ＲＧＣと比べて、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７を硝子体内注射した網膜のＲＧＣにおいてＨｓｐ２７が過剰発現された。図７Ｂにグラフで示されるように、ｒＡＡＶ２ベクターに感染させていない対照細胞の二連サンプル（レーン１およびレーン２）は、検出可能なＨｓｐ２７タンパク質を全く含まなかったが、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２７に感染させた細胞の二連サンプルは、レーン３およびレーン４に存在する濃い約２５ｋＤａのバンドによって示される、強固なレベルのＨｓｐ２７を含んでいた。

図８Ａは、ｒＡＡＶ２－αＡ－クリスタリンを投与していない対側眼から得られた対照ＲＧＣと比べて、ｒＡＡＶ２－αＡ－クリスタリンを硝子体内注射した網膜のＲＧＣにおいてαＡ－クリスタリンが過剰発現されたことを示す。図８Ｂに示されるように、ｒＡＡＶ２－αＡ－クリスタリンに感染させたＲＧＣの二連サンプルは、レーン３およびレーン４に存在する濃い約１９ｋＤａのバンドによって示される、強固なレベルのαＡ－クリスタリンを産生した。レーン１およびレーン２は、ｒＡＡＶ２ベクターに感染させていない対照細胞が、検出可能なαＡ－クリスタリンタンパク質を全く含まなかったことを示す。

図９Ａは、ｒＡＡＶ２－αＢ－クリスタリンを投与していない対側眼から得られた対照ＲＧＣと比べて、ｒＡＡＶ２－αＢ－クリスタリンを硝子体内注射した網膜のＲＧＣにおいてαＢ－クリスタリンが過剰発現されたことを示す。図９Ｂのブロットは、ｒＡＡＶ２－αＢ－クリスタリンに感染させたＲＧＣが、レーン３およびレーン４に存在する濃い約２０ｋＤａのバンドによって示される、強固なレベルのαＢ－クリスタリンを産生したことを示す。レーン１およびレーン２は、ｒＡＡＶ２ベクターに感染させていない対照細胞が、検出可能なαＢ－クリスタリンタンパク質を全く含まなかったことを示す。

図１０Ａは、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２０を投与していない対側眼から得られた対照ＲＧＣと比べて、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２０を硝子体内注射した網膜のＲＧＣにおいてＨｓｐ２０が同様に過剰発現されたことを示す。図１０Ｂのブロットは、ｒＡＡＶ２－Ｈｓｐ２０に感染させたＲＧＣが、レーン３およびレーン４に存在する濃い約１８ｋＤａのバンドによって示される、強固なレベルのＨｓｐ２０を産生したことを示す。レーン１およびレーン２は、ｒＡＡＶ２ベクターに感染させていない対照細胞が、検出可能なＨｓｐ２０タンパク質を全く含まなかったことを示す。

実施例３
ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１がＲＧＣ死を予防することができるかを決定するために、高眼圧症のマウスモデルを採用し、眼内圧が上昇する前にマウスにベクターの硝子体内注射を行った。

ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の予防効果を試験する最初の実験では、試験動物において高眼圧症を誘導する２週間前に、ＨＢＳＳ中の１×１０^９ｖｇ／眼または５×１０^９ｖｇ／眼のいずれかの単回用量のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を治療マウスの別々の群に硝子体内注射した。２週間後、初めにマウスを０．５％塩酸プロパラカインの局所適用で補助したケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって麻酔することで高眼圧症モデルを作製した。ポリスチレンマイクロビーズ（直径１０μｍ、ＰＢＳ １ｍＬ当たり５００万個のビーズ）を各動物の右眼の前房に注射することにより、高眼圧症を片側でのみ誘導した。３３Ｇ針を用いて角膜の中央付近を静かに穿刺し、小さな気泡を注入して前眼房を持ち上げた。少量（２μＬ）のマイクロビーズを、ハミルトン注射器に接続したマイクロピペットによって気泡下の前房に注射した。感染を予防するために、注射した眼に抗生物質軟膏を局所適用した。

眼圧計を用い、眼内圧を４週間にわたって毎週測定した。特に、イソフルランの持続流（酸素と混合した２Ｌ／分の５％イソフルラン）で満たした麻酔室にマウスを入れた。毎週のチェックイン毎に眼圧計により５回測定し、最高および最低の読取り値を除外し、残りの読取り値から各マウスについて平均眼内圧を生成した。

マイクロビーズ注射の４週間後に眼を解剖し、４％ＰＦＡを用いて４℃で一晩、後固定した。網膜を続いて解剖し、ＰＢＳで３回洗浄した後、一晩ブロッキングした（ＰＢＳ中の５％正常ロバ血清および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）。次いで、全載網膜をＲＧＣのマーカーであるＢｒｎ３ａについて免疫染色した。Ｂｒｎ３ａ陽性ＲＧＣ数は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH）を用いて、全載網膜の４つの象限から中間周辺部で計数した（細胞／ｍｍ^２）。対側の無傷眼を対照として用いた。

図１１Ａに示されるように、眼マイクロビーズ注射により、眼内圧は１週間で約１１ｍｍＨｇから約１８ｍｍＨｇに上昇した。眼内圧は、その後低下し、マイクロビーズ注射の４週間後に約１４ｍｍＨｇの最低値に達した。高眼圧（hypertension）マウスにおける眼内圧は、マイクロビーズを注射していない対照マウスよりも有意に高かった（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、０日目と比較）。

ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射の６週間後のＲＧＣ生存に対するｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内投与の影響を図１１Ｂにグラフで示す。ここで、ｎｓ＝有意でない、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。示されるように、眼内圧上昇を受けないか、またはウイルスベクターで治療しなかった対照サンプルから摘出した網膜は、１ｍｍ^２当たりほぼ３９００個のＲＧＣを有していた。対照的に、マイクロビーズおよびＰＢＳを注射した非治療高眼圧マウス（「ビヒクル」）は、６週間後に１ｍｍ^２当たり約２０００個のＲＧＣしか有さず、マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドを注射したマウス（「ＡＡＶ２」）は、１ｍｍ^２当たり約２３００個のＲＧＣを有していた。１×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、６週間後に１ｍｍ^２当たり３６００個を超えるＲＧＣを保持しており、５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、１ｍｍ^２当たり約３９００個のＲＧＣを有していた。したがって、どちらの用量のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１も、高眼圧レベルまで上昇した眼内圧を有する網膜内に存在するＲＧＣの喪失を有意に予防した。

図１１Ｂの定量的ＲＧＣ濃度を得た網膜の共焦点顕微鏡画像を図１１Ｃに示す。より高いＢｒｎ３ａ染色から明らかなように、ＲＧＣ数は健常対照群１１０２から摘出した網膜において最も高かった。Ｂｒｎ３ａ染色は、非治療高眼圧症群１１０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧症群１１０６では、はるかに低かった。１×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１群１１０８および５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１群１１１０は、より高いＢｒｎ３ａ染色から明らかなように、非治療高眼圧症群１１０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧症群１１０６と比べてＲＧＣ死の有意な予防を示した。

ＲＧＣにおける軸索輸送欠損に対するｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の予防効果も、硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射の６週間後に測定した。図１２Ａにグラフで示されるように（ｎｓ＝有意でないおよび^＊ｐ＜０．０５）、コレラ毒素Ｂ（「ＣＴ－Ｂ」）標識を用いて、ＲＧＣにおける軸索輸送を可視化および定量化した。対照マウスから摘出した網膜は、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射の６週間後に約４２のＣＴ－Ｂ強度値を示した。対照的に、ＰＢＳ中のマイクロビーズを注射した非治療マウス（「ビヒクル」）は、６週間後に約２５のＣＴ－Ｂ強度値しか示さず、マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドを注射したマウスは、約２６のＣＴ－Ｂ強度値を示した。１×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、６週間後に約３５のＣＴ－Ｂ強度値を示し、５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、約４２のＣＴ－Ｂ強度値を示した。したがって、低用量のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１は、眼内圧上昇を受けたＲＧＣ内の軸索輸送欠損の発生を部分的に予防し、高用量のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１は、軸索輸送欠損の発生を有意に予防した。５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を注射したＲＧＣ内の軸索輸送は、眼内圧上昇を受けていないＲＧＣで測定された軸索輸送とほぼ等しく、５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内投与が、後に高眼圧症に罹患するマウスにおいて軸索輸送欠損の発生を実質的に予防するのに十分であり得ることが示された。

図１２Ａの定量的ＣＴ－Ｂ強度値を得たＲＧＣ軸索の共焦点顕微鏡画像を図１２Ｂに示す。比較的高いＣＴ－Ｂ染色から明らかなように、健常対照群１２０２における軸索輸送は、５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を注射した高眼圧群１２１０で測定された軸索輸送と同様であった。非治療高眼圧症群１２０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧群１２０６では、軸索輸送は顕著に低かった。１×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１群である１２０８群は、非治療高眼圧症群１２０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧群１２０６と比べて或る程度の軸索輸送の維持を示した。したがって、高眼圧症によって引き起こされる軸索媒介ＣＴ－Ｂ輸送の減少は、５×１０^９ｖｇ／眼のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内投与によって実質的に予防された。

実施例４
眼内圧上昇後のｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１介入が、ＲＧＣ死および軸索輸送欠損を低減、解消または減速することができるかを決定するために、高眼圧症のマウスモデルを採用し、眼内圧が上昇した後にマウスにベクターの硝子体内注射を行った。

初めにマウスを０．５％塩酸プロパラカインの局所適用で補助したケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって麻酔することで高眼圧症モデルを作製した。ポリスチレンマイクロビーズ（直径１０μｍ、ＰＢＳ １ｍＬ当たり５００万個のビーズ）を各動物の右眼の前房に注射することにより、高眼圧症を片側でのみ誘導した。３３Ｇ針を用いて角膜の中央付近を静かに穿刺し、小さな気泡を注入して前眼房を持ち上げた。少量（２μＬ）のマイクロビーズを、ハミルトン注射器に接続したマイクロピペットによって気泡下の前房に注射した。感染を予防するために、注射した眼に抗生物質軟膏を局所適用した。

眼圧計を用い、眼内圧を６週間にわたって毎週測定した。特に、イソフルランの持続流（酸素と混合した２Ｌ／分の５％イソフルラン）で満たした麻酔室にマウスを入れた。毎週のチェックイン毎に眼圧計により５回測定し、最高および最低の読取り値を除外し、残りの読取り値から各マウスについて平均眼内圧を生成した。

試験動物において高眼圧症を誘導してから１週間後に、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の単回用量（１μＬのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中１×１０^９個のウイルスゲノム）を治療群のマウスに硝子体内注射した。２番目の矢印によって示されるように（最初の矢印は初回マイクロビーズ注射を表す）、眼内圧はｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与の２週間後の２回目のマイクロビーズ注射によってさらにもう一度上昇した。

図１３Ａの折れ線グラフに示されるように、マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドの注射を受けた網膜では、最初の眼マイクロビーズ注射により、眼内圧が１週間で約１０ｍｍＨｇから約２３ｍｍＨｇに上昇した。眼内圧は３週目まで低下し、その時点で２回目のマイクロビーズ注射を投与した。注射していない非治療対照眼は、実験期間を通してほぼ一定のＩＯＰを維持した。マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を注射した眼は、２週目および４週目に、健常対照およびＡＡＶ２カプシドを注射した高眼圧症眼と比べてＩＯＰレベルの上昇を示した。しかしながら、３週目には、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内注射は、ＡＡＶ２カプシドを注射した高眼圧症眼と比べて眼内圧を低下させた。

眼圧上昇を受けた眼におけるＲＧＣ生存に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射の影響を図１３Ｂにグラフで示す。示されるように、対照マウスから摘出した網膜は、最初のマイクロビーズ注射の１週間後に、１ｍｍ^２当たりほぼ３８００個のＲＧＣを有していた。ＲＧＣの数は、２週目に１ｍｍ^２当たり約３５００個に減少し、４週目に１ｍｍ^２当たり約３７００個に増加し、その後６週目には１ｍｍ^２当たり約３４００個まで減少した。

対照的に、マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドを注射したマウスは、１週間時点の１ｍｍ^２当たり約３５００個から始めて、２週目に１ｍｍ^２当たり３０００個、４週目に１ｍｍ^２当たり２５００個、６週目に１ｍｍ^２当たり２２００個と研究の過程で１ｍｍ^２当たりのＲＧＣの数の着実な減少を示した。

ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、研究の２週目に１ｍｍ^２当たり約３４００個のＲＧＣを有していた。続いて、ＲＧＣの濃度は、４週目に１ｍｍ^２当たり約３５００個のＲＧＣに上昇し、その後６週目に１ｍｍ^２当たり約３１００個のＲＧＣまで低下した。したがって、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療した網膜における最終ＲＧＣ濃度は、健常対照網膜で測定された最終ＲＧＣ濃度の約８８％であった。したがって、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内注射は、眼内圧上昇を受けた網膜におけるＲＧＣの喪失を、眼内圧上昇を受け、ｒＡＡＶ２カプシドを注射した網膜と比べて有意に低減した（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。

図１３Ｂの定量的ＲＧＣ濃度を得た網膜の共焦点顕微鏡画像を図１３Ｃに示す。研究の６週目のより高いＢｒｎ３ａ染色から明らかなように、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１群１３０２におけるＲＧＣ数は、健常対照群１３０４のＲＧＣ数と同等であったが、非治療高眼圧症群１３０６ではＲＧＣ数が研究の過程で有意に減少した。

高眼圧症の６週間後の軸索輸送に対する硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射の影響をも測定し、図１４Ａにグラフで示す。ここで、ｎｓ＝有意でないおよび^＊ｐ＜０．０５である。示されるように、対照マウスから摘出した網膜は、研究参加の６週間後に約４０のＣＴ－Ｂ強度値を示した。対照的に、マイクロビーズおよびＰＢＳを注射した非治療マウス（「ビヒクル」）は、６週目に約３０のＣＴ－Ｂ強度値を示し、マイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドを注射したマウスは、約２９のＣＴ－Ｂ強度値を示した。ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１で治療したマウスから摘出した網膜は、６週間後に約３９のＣＴ－Ｂ強度値を示した。したがって、硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１投与は、眼内圧上昇を受けたＲＧＣ内の軸索輸送欠損を、同じ眼内圧上昇を受けた非治療ＲＧＣと比べて低減した。ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を注射したＲＧＣ内の軸索輸送は、眼内圧上昇を受けていないＲＧＣで測定された軸索輸送とほぼ同等であった。

図１４Ａの定量的ＣＴ－Ｂ強度値を得た網膜の共焦点顕微鏡画像を図１４Ｂに示す。ＣＴ－Ｂ染色から明らかなように、軸索輸送は健常対照群１４０２で最大であった。ＣＴ－Ｂ強度は、非治療高眼圧症群１４０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧症群１４０６では、はるかに低かった。ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１群１４０８は、非治療高眼圧症群１４０４およびｒＡＡＶ２－カプシド高眼圧症群１４０６と比べて、ほぼ正常な軸索輸送レベルを維持していた。

実施例５
ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内投与が２０週間にわたってＲＧＣ機能低下を緩和することができるかを決定するために、高眼圧症のマウスモデルを採用し、眼内圧が上昇した後にマウスにベクターの硝子体内注射を行った。

高眼圧症モデルは、実験の１日目にマイクロビーズ注射、続いて３週目および６週目に後続のマイクロビーズ注射を行うことによって作製した。眼圧計を用い、眼内圧を２０週間にわたって毎週測定した。最初のマイクロビーズ注射の１週間後に、ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１またはＡＡＶ２カプシドの単回用量をマウスの別々の群に硝子体内注射した。

図１５Ａに示されるように、眼マイクロビーズ注射は、初期値の約１０ｍｍＨｇから６週目の約１８ｍｍＨｇまで眼内圧を有意に上昇させたが、その後２０週目には圧力は約１３まで低下した（ｎｓ＝有意でない、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

ＲＧＣ機能は、２０週間の研究期間にわたってパターン網膜電図（ＰＥＲＧ）振幅により評価した。ＰＥＲＧ測定は、Ｊｏｅｒｖｅｃ機器（Intelligent Hearing Systems，Miami，FL）を用い、製造業者の指示に従って行った。基準電極および接地電極は、それぞれ頭皮および尾部の皮下に配置し、角膜電極は眼球と接触する下円蓋部に配置した。角膜乾燥を防ぐために、少量のＧｅｌＴｅａｒ点眼液を両眼に適用した。システムに取り付けた２つの異なるＬＥＤモニターを用い、空間周波数０．０９５サイクル／度および輝度５００ｃｄ／ｍ^２でコントラスト反転水平バーを表示させた。表示モニターと眼との距離は１０ｃｍに保った。光信号のより良好な投影のために、ＬＥＤモニターをおよそ６０度の角度で設置した。次いで、両眼からの３７２回の掃引（オン－オフ）からなる各ランについて生成されたＰＥＲＧ波形をＰＥＲＧソフトウェアによって各眼別々に処理し、平均した。ＰＥＲＧソフトウェアを用いて総平均ＰＥＲＧ波形を分析して、主要な陽性波（Ｐ１）および陰性波を特定し、振幅および潜時を算出した。

Ｐ１振幅読取り値（μＶで測定）を図１５Ｂに示す。示されるように、ｒＡＡＶ２－カプシドマウスの眼における眼内圧上昇は、対照マウスと比較してＰ１振幅の有意な低下を引き起こした。対照的に、硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射は、対照マウスで測定されたＰ１振幅にほぼ等しいＰ１振幅を維持した。（^＊ｐ＜０．０３；ｎｓ＝有意でない）。したがって、硝子体内ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１注射は、眼内圧を上昇させることによって作製した緑内障のマウスモデルにおいてＲＧＣの視覚機能を改善した。

実施例６
ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１の硝子体内注射が網膜グリオーシスを緩和することができるかを決定するために、高眼圧症のマウスモデルを採用し、眼内圧が上昇した後にマウスにベクターの硝子体内注射を行った。

グリオーシス研究では、マウスの対照群にはマイクロビーズまたはウイルスベクターを注射せず、陽性対照群にマイクロビーズおよびｒＡＡＶ２カプシドを注射し、第３の群にマイクロビーズおよびｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１を注射した。グリア線維性酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（「Ｉｂａ１」）染色を用いて、高分化型グリア細胞の増殖から明らかな網膜グリオーシスを特定した。より高い染色は、より高レベルのグリオーシスを表していた。

図１６の２０倍共焦点顕微鏡画像に示されるように、グリオーシスの顕著な増加を示した、ｒＡＡＶ２カプシドを注射した非治療高眼圧症群１６０４ａ，１６０４ｂと比べて、対照群１６０２ａ，１６０２ｂは、より低いＧＦＡＰおよびＩｂａ１染色をそれぞれ示した。ｒＡＡＶ２－ＨｓｐＢ１治療高眼圧マウス１６０６ａ，１６０６ｂでは、グリオーシスが健常対照群と実質的に同様のレベルまで低減した。

以上、様々な代表的な実施形態および実施態様を或る程度まで詳細に説明したが、当業者であれば、明細書および特許請求の範囲に記載される本発明の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、開示の実施形態に多数の変更を加えることができる。場合によっては、本明細書に直接または間接的に記載される方法論において、様々な工程および操作が或る可能な操作順序で記載されるが、当業者であれば、本開示の趣旨および範囲から必ずしも逸脱することなく、工程および操作を再編成、置換えまたは除外し得ることを認識するであろう。上記の説明に含まれるか、または添付の図面に示されるあらゆる事項が例示にすぎず、限定的なものではないと解釈されることが意図される。詳細または構造の変更は、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の趣旨から逸脱することなく行うことができる。

Claims (13)

1. 被験体における網膜疾患、傷害および病態の少なくとも１つの症状の治療、リスク低減、予防または緩和における使用のための組換えアデノ随伴ウイルス２型ベクターを含む組成物であって、
   前記ベクターが、
   少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質がＨｓｐ２７を含む、核酸配列、と
   前記核酸配列の上流に位置するプロモーター配列であって、前記プロモーター配列が網膜神経節細胞における前記核酸配列の発現を誘導する、プロモーター配列
   を含み、
   前記網膜疾患、傷害または病態が網膜神経節細胞の喪失、眼内圧の上昇および緑内障の少なくとも１つを含み、
   前記プロモーター配列がＰｌｅ３４５－ＮＥＦＬを含む、
   組成物。
2. 前記網膜神経節細胞が哺乳動物網膜神経節細胞を含む、請求項１記載の組成物。
3. 前記被験体が前記傷害を受けるか、または前記網膜疾患もしくは病態が診断されてから２４時間以内に少なくとも１回投与される、請求項１または２記載の組成物。
4. 硝子体内投与される、請求項１から３までのいずれか１項記載の組成物。
5. １回だけ投与される、請求項１から４までのいずれか１項記載の組成物。
6. 前記網膜疾患、傷害または病態が緑内障である、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
7. 前記網膜疾患、傷害または病態が興奮毒性損傷、物理的損傷、化学的損傷、神経栄養因子欠乏、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリア機能不全、軸索輸送不全またはそれらの組合せによって引き起こされる、請求項１から６までのいずれか１項記載の組成物。
8. 被験体における網膜疾患、傷害および病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するためのシステムであって、
   注射デバイスと、
   組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む治療有効量の組成物であって、前記ベクターが、
   少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質がＨｓｐ２７を含む、核酸配列、および
   前記核酸配列の上流に位置するプロモーター配列であって、前記プロモーター配列が網膜神経節細胞における前記核酸配列の発現を誘導する、プロモーター配列
   を含む、組成物と
   を含み、
   前記注射デバイスが前記組成物を前記被験体に硝子体内投与するように構成され、
   前記網膜疾患、傷害または病態が網膜神経節細胞の喪失、眼内圧の上昇および緑内障の少なくとも１つを含み、
   前記アデノ随伴ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス２型ベクターを含み、
   前記プロモーター配列がＰｌｅ３４５－ＮＥＦＬを含む、
   システム。
9. 前記網膜疾患、傷害または病態が緑内障である、請求項８記載のシステム。
10. 前記網膜神経節細胞が哺乳動物網膜神経節細胞を含む、請求項８または９記載のシステム。
11. 前記注射デバイスが単回使用デバイスである、請求項８から１０までのいずれか１項記載のシステム。
12. 医薬組成物であって、
    組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、
    少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質をコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つの生物学的に活性な熱ショックタンパク質がＨｓｐ２７を含む、核酸配列、および
    前記核酸配列の上流に位置するプロモーター配列であって、前記プロモーター配列が網膜神経節細胞における前記核酸配列の発現を誘導する、プロモーター配列
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターと、
    薬学的に許容可能な担体と、
    を含み、
    前記医薬組成物が被験体における網膜疾患、傷害および病態の少なくとも１つの症状を治療、リスク低減、予防または緩和するように配合され、
    前記網膜疾患、傷害または病態が網膜神経節細胞の喪失、眼内圧の上昇および緑内障の少なくとも１つを含み、
    前記アデノ随伴ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス２型ベクターを含み、
    前記プロモーター配列がＰｌｅ３４５－ＮＥＦＬを含む、
    医薬組成物。
13. 前記医薬組成物が硝子体内投与用に配合される、請求項１２記載の医薬組成物。