JPH01112161A - 免疫凝集定量装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微粒子凝集体の粒度測定法を用いた免疫凝集
定量装置に係り、特に免疫凝集反応を応用した定量法に
好適な、免疫凝集定量装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、ラテックスビーズ等の微粒子表面に抗体を結合さ
せ、これと試料を反応させて、反応により変化する濁度
の差から試料中の抗原の量を測定する方法がある。この
原理は、微粒子表面の抗原が抗原抗体反応を起こし微粒
子を凝集させること及びこの凝集が抗原量に対し定量的
に変化することに基づいており、この方法で各種のタン
パク質等の定量が行われている。しかし、凝集度に分布
をもつ反応液全体を一度に測定するために平均粒度しか
求められず、抗原濃度算出において精度的な問題があっ
た。

これを解決する方法として、例えば反応液をシースフロ
一方式により凝集塊ごとに分散させそれぞれの散乱強度
を測定する方法がある（日本臨床検査自動化学会誌、ニ
ー１，２２６　（１９８６））。

この方法によれば、凝集塊個々の凝集度を測定でき、凝
集度分布も測定できるので、抗原濃度の算出精度を向」
ニさせることができる。

しかしながら、この方法においても、凝集度測定を光学
的測定に依っており、試料中に共存する散乱体や色素等
の吸収体の影響は免れず、測定精度に限界があった。

上記従来技術は、試料中に共存する散乱体や色素等の吸
収体や蛍光体の影響について配慮されておらず、測定誤
差を生ずる問題があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上記従来技術の有する問題点を解決し、抗原
抗体反応により生じた凝集体の大きさど分布を正確に測
定することができ、抗原濃度を精度良く求めることがで
きる免疫凝集定量装置を堤供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、凝集度の測定を光学的測定によらず、磁気
的測定により行うことにより達成される。

即ち、微粒子として磁気体を用い、この凝集状態をたと
えばＳＱＵＩＤ（超伝導量子干渉素子）のような磁気測
定手段を免疫凝集定量装置に用いることにより達成され
る。

本発明は次の如き方法によって、抗原濃度を定量的に測
定するものである。

磁化し得る微粒子の表面に抗体を結合させ、この微粒子
を試料中の抗原と反応させる。この抗原・抗体反応に伴
って微粒子の凝集塊が生しる。

こうして準備した測定用反応液をシースフローセルに移
し、シース液を流しながら、微粒子の凝集塊を分散させ
ると共に、シース液流に従ってこれを移動させる。この
液流中の凝集塊を磁化し、この磁気モーメントを測定す
ることによって抗原濃度を定量測定することが出来る。

磁化し得る微粒子としては、強磁性体であるＦｅ、Ｎｉ
、Ｃｏ等の金属粒子が代表的な例である。γ−フェライ
ト粒子、マグネタイト粒子が用いるのに容易に材料であ
る。又、こうした磁化し得る材料の被膜をコーティング
した粒子を用いても良い。

微粒子の粒径は通常２μｍ程度以下を用いる。

更に１μｍ以下がより好ましい。粒径が余り小さいと凝
集塊が発生する磁束が小さくなるので、粒径の選択は磁
気測定系の感度、ＳＮ比等の測定能力を考慮して行なえ
ば良い。

微粒子表面に抗体を結合させるには、これまで知られて
いる次の如き手段を用いることが出来る。

（１）微粒子表面に抗体を吸着により結合させる。

（２）微粒子表面に抗体を吸着させたのち、抗体分子間
を化学的に架橋処理する。架橋反応によって、単なる吸
着の場合より、微粒子と抗体の結合がより強固となる。

化学的に架橋処理するに用いるに有用な架橋剤の例とし
ては、アルデヒド基、カルボジイミド基。

マレイミド基等を有する二官能性物質があげられる。

（３）微粒子表面に抗体を化学的に結合させる。

（４）微粒子表面に官能基を有する有機高分子材料を被
覆させ、この官能基を用いて抗体を共有結合させる。

、　　官能基を有する有機高分子材料としては、例えば
メタクリル酸ポリマー等が通常用いられる。

化学的に架橋処理するのに用いられる架橋剤としては、
アルデヒド基、カルボジイミド基、マレイミド基等を有
する二官能性物質が有効な例である。

官能基としてはアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基
、水酸基等が好ましい例である。

シースフローセルは通常の形態のもの、たとえばフロー
サイ１〜メータに適用されている機構と同等のもので良
い。

検出部分は微粒子を磁化させる磁石と、磁気強度を測定
する磁束計から構成されており、磁束計としてはＳＱＵ
ＩＤ磁束計を用いることが望ましい。

磁束計は検出コイルを互いに直交する２ないし３方向に
配置した構成にすると特に精密な測定が可能となる。

本発明が適用できる抗原の例としては、ヒトα−フェト
プロティン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェ
リチン、β２マイクログロブリン（β２−ｍ）、ヒト絨
毛性ゴナド１−ロピン（ＨＣＧ）、Ｃ反応性蛋白（ＣＲ
Ｐ）、リウマチ因子等がある。

〔作用〕

抗体を結合させる微粒子として磁気体を用いれば、凝集
により生ずる凝集塊の凝集度は、磁気強度の測定により
可能となる。この場合、光学的測定における上述した影
響因子が問題とならないため、高精度で測定することが
可能となる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。

球形のγ−フェライト粒子（平均粒径０．７５μｍ）の
表面に、抗ヒトαフェトプロティン抗体（抗ヒトＡＦＰ
抗体）を吸着させ、さらにグルタルアルデヒドを使用し
て抗体分子間を架橋処理し、固定化抗体磁気ピースを得
た。固定化の方法は、従来知られている方法で良く、た
とえば、［タンパク質ハイブリッド」稲田祐二編、ｐ１
９９−１２２、共立出版（東京）１９８７年などに記載
されている。

各種濃度のＡＦＰを含む血清２０μＱに上記磁気ビーズ
懸濁液１００μＱを加え室温で１５分間反応させた。

この反応液をシースフローセル１の被検液部２に移し、
シース液３を流しながら、反応液中の凝集塊を分散させ
て検出部４に導く。シース液として生理食塩水を用いた
が、適当な緩衝液あるいは水でも良い。用いたシースフ
ローセルは、たとえばフローサイトメータに応用されて
いる機構と同等のものである。シースフローセルの流路
部は内径１００μｍとし、流速１０　ｍ　／　ｓ程度と
なるように、シース液流量および試料とシース液の圧力
差を設定して用いた。

分散された凝集塊は流れに従って検出部４に導かれる。

検出部４は、磁化用の磁石５とＳＱＵＩＤ磁束計６によ
り構成されている。

磁石５は、微粒子を磁化させるもので、リング状の電磁
石を用いることにより流れの方向に沿った一方向に磁化
方向を配向させて磁化させることができる。磁化方向の
例を矢印７で示す。

磁束計６は、ＳＱＵＩＤ磁束計であり、３対の検出コイ
ルを互いに直交する方向に配置して構成した。つまり第
５図にこの状態を示す。第６図は第５図のＡＡ’断面を
示す。シースフローセル流路部１の側面に２対（８１，
８２）　、流れの方向に直交する方向に１対（８３）設
けて、磁気モーメントのＸ＋Ｖ＋Ｚ成分をそれぞれ検出
できるようにした。

検出した信号値は、Ａ／Ｄ変換器にてＡＤ変換し、パソ
ナルコンピュータ１２に導き、各信号値の２乗値の和の
平方根を算出して、磁気モーメントの大きさを求めた。

この処理によって、測定対象の微粒子塊が回転すること
により磁気モーメントの一方向成分の検出だけでは測定
値に誤差を生じることを回避した。

なお、装置の簡略化のために一方向のみ、または二方向
のみに検出コイルを配置して測定することも可能である
。

第７図はｉ略構成のコイルの配置状態の１例を示す。第
８図は第７図のＡＡ’断面を示す断面図である。この図
では１個１組の検出コイルを用いる場合で示しである。

この際、微粒子塊が回転しないように配慮することが必
要であり、回転による誤差を考慮する必要がある。

ところでＳＱＵＩＤに用いる超伝導体材料として例えば
酸化物超電導体を用いることも可能である。例えば（Ｒ
Ｔｌ：１．−Ｘ　２　Ｍｘ　２　ｘｕｏ３−Ｘ等の一般
式で表わされる酸素欠損型ペロブスカイト構造若しくは
に２ＮｉＦ、型構造の高温超伝導材を用いても良い。

上記一般式においてＲＥはＬａ、Ｙ、Ｓｒ。

Ｙｂ、Ｌｕ、Ｔｍ、Ｄｙ、Ｓｃ、Ｃｅ、Ｐｒ。

Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｈｏ、Ｅｒ等の元素を
表わし、ＭはＢａ、Ｓｒ、Ｃａ、に等の元素を表わす。

本実施例においては、超伝導状態を得るためにＳＱＵＩ
Ｄ（検出コイルならびにＳＱＵＩＤ素子）を液体窒素に
て冷却して用い、フローセル部の凍結を防ぐために、検
出コイルとフローセル間に、透磁性の良好な断熱材１３
を配置した。

上記の高温超伝導材を用いれば、このような冷却および
断熱が簡略化でき、あるいは排除可能となる。

この磁束計６を用いて、凝集塊の磁気強度を測定するこ
とにより、それぞれの凝集塊に含まれる微粒子数（凝集
度）が容易に求められる。同時に凝集度の分布も求めら
れる。測定結果を第２図及び第３図に示す。第２図にみ
られる如く、凝集塊に集められる粒子数によって出力信
号に大小が生ずる。

この凝集度の分布から、２個以上の微粒子から成る凝集
塊の割合を算出して凝集比を求める。

求められた凝集比をＡＦＰａ度に対してプロットすると
第４図のような相関が得られた。

同様にヘパリン処理した血液（赤血球等を含む）中のＡ
ＦＰ測定を行ったが、問題なく凝集塊の大きさを正確に
測定でき血清の場合と同様な相関曲線が得られた。

したがって、本実施例によれば、試料中に共存する光散
乱体及び色素等の吸収体２発光体の影響を受けることな
く、抗原抗体反応による微粒子の凝集状態を計測するこ
とができる。

同様に溶血試料、乳び血清試料の測定にも有効である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、試料中に含まれるタンパク質や血球等
の光散乱体や色素等の吸収体や蛍光体の影響なく正確に
抗原抗体反応により生じた凝集体の大きさと分布を測定
できるので、精度良く、抗原濃度を測定できる効果があ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の装置構成の概念図、第２図
は検出信号の一例を示す図、第３図は粒度分布の測定例
、第４図はＡ　Ｆ　Ｐ　？１ＩＩＩ定例を示す図、第５
図は磁気測定部の構成を示す図、第６図は第５図の磁気
測定部の一部断面図、第７図は磁気３＋’］定部の別な
構成を示す図、第８図は第７図の磁気測定部の一部断面
図である。 １・・・シースフローセル、 ２・・・被検液部、 ３・・・シース液の流れを示す矢印、 ４・・・磁気検出部、 ５・・磁石、 ６・ＳＱＵＩＤ磁束計、 ７・・・磁化方向を示す矢印、 ８　（８１，８２，８３）・・・検出コイル、９・・・
ＳＱＵＩＤ素子、 １０・・信号処理回路、 １１・・・Ａ／Ｄ変換器、 １２・・・パーソナルコンピュータ、 １３・・断熱材。 第３国 ／　づｙし算しり＄２５たソのメｍｌｌが〔第７月

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微粒子表面に抗体を結合させ、これと試料とを反応
   させて生ずる微粒子の凝集を計測して、試料中の抗原濃
   度を測定する免疫凝集定量装置において、上記反応によ
   り生じた微粒子の凝集塊を凝集塊ごとに分散させ、液流
   に従って移動させる手段と、液流中の凝集塊の大きさを
   磁気測定により計測する検出手段とを有することを特徴
   とする免疫凝集定量装置。 ２、微粒子表面に抗体を吸着により結合させることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置
   。 ３、微粒子表面に抗体を吸着させたのち、抗体分子間を
   化学的に架橋処理することにより結合させることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置。 ４、微粒子表面に抗体を化学的に結合させることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置。 ５、微粒子表面に官能基を有する有機高分子を被覆させ
   、この官能基を用いて抗体を共有結合させることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置。 ６、微粒子は磁化しうる物質からなることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置。 ７、磁化しうる物質が強磁性体であることを特徴とする
   特許請求の範囲第６項記載の免疫凝集定量装置。 ８、磁化しうる物質が金属であることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項記載の免疫凝集定量装置。 ９、検出部分は微粒子を磁化させる磁石と、磁気強度を
   測定する磁束計から構成されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の免疫凝集定量装置。 １０、磁束計はＳＱＵＩＤ磁束計であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第９項記載の免疫凝集定量装置。 １１、磁束計は検出コイルを互いに直交する２ないし３
   方向に配置して構成したことを特徴とする特許請求の範
   囲第１０項記載の免疫凝集定量装置。