JPH01117785A - 修飾されたプラスミノゲンアクチベーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生長因子様ドメイン（Ｇ　ｒｏｗｔｈ　　Ｆ
　ａｃｔｏｒ　−１ｉｋｅ　　ｄｏｍａｉｎ）　　（Ｇ
　Ｆ　Ｄ　）変更された、−本鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕ
ＰＡ）誘導、グリコジル化プラスミノゲンアクチベータ
ー（以後、また、ＧＡＳＧＡと呼ぶ）に関する。さらに
詳しくは、本発明は、ヒトゲノムライブラリーからｕＰ
Ａ遺伝子を回収し、それを発現ベクター中に挿入し、前
記プラスミドを修飾し、ｕＰＡ遺伝子のＧＦＤを変更し
、そのようにして得られたプラスミドベクターを動物細
胞中に導入して、それとの形質転換体を産生し、形質転
換された動物細胞から、ＧＦＤ変更、ｓｃ、ｕＰＡＭ導
、グリコジル化プラスミノゲンアクチベーターを回収す
ることからなる、ＧＡＳＧＡを産生ずる方法に関する。

本発明の他の目的は、変更された生長因子様ドメイン（
ＧＦＤ）を有するヒト尿プラスミノゲンアクチベーター
誘導体によって表わされる。さらに詳しくは、本発明は
、ヒトｓｃｕ−ＰＡ（例えば、欧州特許用＠　（ＥＰ−
Ａ）９２１８２号において発表されたｕＰＡの配列参照
）のアミノ酸９およびアミノ酸５０の間の領域、好まし
くはアミノ酸９およびアミノ酸４５の間の領域、最も好
ましくはアミノ酸１９およびアミノ酸３２の間の領域、
好ましくはアミノ酸９およびアミノ酸４５の間の領域を
有する一本鎖または二本鎖のヒト尿プラスミノゲンアク
チベーター誘導体を包含する。

ウロキナーゼ（ｕＰＡ）は、プラスミノゲンアクチベー
ターであり、ヒト尿から得ることができ、種々の型の血
栓または塞栓の病気の装置において使用される。ウロキ
ナーゼの産生は、本質的にヒト尿からの酵素の精製に基
づいてきた。細胞培養技術が開発されそして特異的抗ウ
ロキナーゼ抗体（モノクローナルならびにポリクローナ
ル）が入手できるようになり、ｕＰＡは細胞産生ｐｒｏ
−ｕＰＡの活性産生物であることが示された［ラン（Ｗ
ｕｎ）ら、１９８２、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ　ｈｅｍ、
）、２５７．７２６２−７２６８　；ニールセン（Ｎｉ
ｅｌｓｅｎ）ら、１９８２、バイオケミストリー（Ｂｉ
。

ｃｈｅｍ、）２１，６４１０−６４１５］　ａ　　ｐｒ
ｏ　−ｕＰＡは一本鎖蛋白質（ｓｃ−ｕＰＡ）であるが
、ｕＰＡは二本鎖調製（ｔｃ−ｕＰＡ）である。ｓｃｕ
−ＰＡのｔｃｕ−ＰＡへの転化はｓｃｕ　−ｕ　ＰＡの
単一ペプチド結合の切断に依存する［ベルブ（Ｖ　ｅｒ
ｄｅ）ら、１９８４、プロシーデインダス・才ブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、　）　Ｕ
ＳＡ、８１，４７２’７−４７３１　；　（１９８４）
；ギュンズラー（Ｇ　１ｉｎｚｌｅｒ）ら、Ｈｏｐｐｅ
　　Ｓ、　Ｚｓｃｈｒｆ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　３６３．１１５５−１６５．１９８２］。

一末鎖ｐｒｏ−ｕＰＡのこの特異的切断は、特異的活性
の５０倍以上の増加を生じ、そして蛋白質分解酵素、例
えば、トリプシンまたはプラスミンを使用して得られる
。とくに、プラスミンは、また、生体内におけるこの形
質転換の原因である、と思われる。

プラスミノゲンアクチベーターの不活性の形態は、Ｃ，
ノラン（Ｎ　ｏｌａｎ）らによって１９７７年に既にヒ
ト胚腎細胞の培養において同定された［バイオヒミカ・
エト・バイオロジカル部分タ（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　　
Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ）　１９７７．４９６
．３８４−４００１゜この物質は、著者がウロキナーゼ
のブローアクチベーターの形態であると考え、分子量を
変化しないでトリプシンによって活性化され、そして、
いったん活性化されると、ヒトウロキナーゼに対するウ
サギ抗体によって阻害された。不活性「ブローアクチベ
ーター」は、ベンズアミジン−セファロースのアフィニ
ティクロマトグラフィーによって活性形態から分離され
た。

ストツペリ（ｔｏｐｐｅｌｌｉ）　、Ｍ、　Ｐ　、　　
ら、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａｔｌ
、　　Ａ　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、１９８５．８２．４９３９−４９４
３、は、位置ｌにおけるアミノ酸から位置１３５におけ
るアミノ酸残基におよぶｕＰＡアミノ末端断片（ＡＴＦ
）の単離および特性付けを記載した。

約５６．０００の分子量、フィブリン板上の４０．００
０〜５０．０ＯＯＣＴＡ単位／ｍｇの比活性およびフィ
ブリンに対する高い親和性を有する一末鎖プラスミノゲ
ンアクチベーターは、欧州特許４０２３８号に記載され
ている。

欧州特許出願公告第９２１８２号は、組換えＤＮＡ技術
に介するウロキナーゼ誘導体の調製を取扱っている。と
くに、それは原核宿主（Ｅ、Ｃｏ１１）中で組換えＤＮ
Ａ技術によって得られた低分子量（約３０，０００ダル
トン）のウロキナーゼの精製および特性づけを開示して
いる。

確立されたヒト腎誘導細胞系のｍ　ＲＮ　Ａからえられ
たｃＤＮＡを使用する組み換えＤＮＡ技によって、動物
細胞中でグリコジル化−末鎖ウロキナーゼを産生ずる方
法は、欧州特許出願公告第１５４２７２号に開示されて
いる。ヒトｕＰＡ遺伝子のクローニングは、リッチオ（
Ｒ１ｃｃｉｏ）ら、プロンーデインダス・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、
　　ｌ　　９８５、　ｌ　３、２７５９−２７７１に記
載された。解読領域は、１０のイントロンによって分離
された１７のエクソンにおいて細分されている。彼らの
報告によると、このタンパク質中の機能的ドメインは、
異なるエクソンまたはエクソンの群に連れも戻すことが
できる。とくに、はとんどエクソンＩＶによって合成さ
れる、ｌＯ〜５０のアミノ酸配列と、皮膚生長因子（Ｅ
ＧＦ）およびアルファー型形質転換因子との間の相同性
のあるレベルが発見された。

この生長因子様ドメインは、細胞膜特異的レセプターに
よるタンパク質（ｕＰＡ／ｓｃｕ−ＰＡ）の認識および
結合に参加するように思われる［ストッペリ　（Ｓ　ｔ
ｏｐｐｅｌｌｉ）ら、プロシ、−デインダス・オブ拳ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）　Ｕ
ＳＡ、１９８５．８２．４９３９−４９４３およびアペ
ラ（Ａ　ｐｐｅｌｌａ）ら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　　、　１９８７、２６２、４４３７−４
４４０）。

本発明のＧＦＤ変更ウロキナーゼ様誘導体（ＧＡＳＧＡ
）は、タンパク質ＧＦＤが既知の手段によって変更され
て、ｕＰＡと比較したとき、作用の期間が延長された新
規な誘導体が得られた、ｓｃｕ−ＰＡ／ｕＰＡ誘導体で
ある。この延長された作用は、生体外および生体内の両
者の実験において示すことができる（とくに、人間にお
ける活性の予測であることが知られている、慣用の動物
のモデルについて）。生体内のｕＰＡの短い半減期を考
慮すると、本発明の化合物の性質をゆうする化合物の要
求は、当業者にとって明らかである。

本発明の化合物の他の群は、ＧＦＤ配列の１または２以
上のコピーが、好ましくは［自然ＪＧＦＤからすぐ下流
にまたは上流に挿入されている化合物である。

ある特定の配列においてタンパク質を修飾する、これま
で知られている方法は、「直接の」修飾、例えば、化学
的手段による、および「間接の」タンパク質の修飾、例
えば、タンパク質の解読配列の遺伝子工学の操作による
、を包含する。化学的修飾は、「自然Ｊ　ｓｃｕ−ＰＡ
またはｕＰＡを、アミノ酸９およびアミノ酸５０の間、
好ましくはアミノ酸９およびアミノ酸４５の間、最も好
ましくはアミノ酸１９およびアミノ酸３２の間の領域に
おけるアミノ酸官能の１または２以上のための誘導化試
薬と、選択的に反応させることを包含する。誘導化試薬
はそれら自体知られている。例えば、塩基性アミノ酸、
例えば、リジンまたはアルギニンについて、アミノ官能
とアミド結合または有機結合を形成できる試薬、例えば
、酢酸無水物、１．２−シクロヘキサンジオンおよびフ
ェニルグリオキサールを使用でき、これに対して酸性ア
ミノ酸、例えば、アスパラギン酸について、エステル化
は最も便利な誘導化であろう。必要に応じて、選択的反
応条件を、それ自体既知の手段によって、タンパク買上
の他の不安定な官能の保護と組み合わせることができる
。

しかしながら、大きく好ましい修飾方法は、最終のタン
パク質中に修飾を導入し、こうしてそれがその特異的レ
セプター、例えば、Ｕ　９３７単球上の細胞レセプター
に結合しないようにするために、タンパク質解読領域、
とくにタンパク質ＧＦ領域の遺伝情報を指定するＤＮＡ
および／またはｍＲＮＡ領域、すなわち、アミノ酸９お
よびアミノ酸５０の間、好ましくはアミノ酸９およびア
ミノ酸４５の間、最も好ましくはアミノ酸１９およびア
ミノ酸３２の間のアミノ酸の遺伝情報を指定する領域を
遺伝子工学することによって代表される　［参照、スト
ッペリ（Ｓ　ｔｏｐｐｅｌｌｉ）ら、プロシーデインダ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐ　ｒｏｅ、　　Ｎ　ａｔｌ、　　Ａ　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　　１９８５．８２．４９３９
−４９４３］。

好ましい修飾は、１０２７ｂｐと１７８４ｂｐとの間の
ｕＰＡ解読ゲノムＤＮＡの遺伝子工学の修飾である（ｂ
ｐｌとしてｍＲＮＡ転写部位を仮定する）。

「自然」タンパク質の結合部位の遺伝情報を指定する遺
伝子領域の遺伝子修飾は、ゲノムＤＮＡまたはｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａについて実施できる。それらは、核酸配列上の部
位特異的の欠失、突然変異および挿入を起こすことを包
含する。これらの修飾の主な結果は、ｓｃｕ−ＰＡまた
はｕＰＡのレセプター結合能力の修復であると、同時に
酵素の能力を変更しないで維持することである。場合に
よって、そして事実しばしば、新しいアミノ酸が、前記
修飾の結果として、修飾された配列中に発生し得る。

例えば、イントロンＣ（すなわち、ｕＰＡ遺伝子のエク
ソンＩＩＩおよびＩＶのあいだのイントロン）における
ＰｓｔＩ部位およびイントロンＤ（すなわち、イントロ
ンｒＶおよびＶの間のイントロン）におけるＢｇｌｌｌ
の間の欠失を実施するとき、Ｓｅｔ、およびＡＳ＋）４
５の間のアミノ酸配列の欠失が新しいアミノ酸、すなわ
ち、チロシンのその位置におけるｉｔｄによって達成さ
れ、欠失後の結合プロセスによって発生するトリプレッ
トによってコード（ｃｏｄｅ）される、ＧＡ　Ｓ　ＧＡ
が得られる。

本発明の好ましい実施態様は、ｕＰＡゲノムまたはｃＤ
ＮＡあるいは雑種ｕＰＡゲノムＤＮＡ−ｃＤＮＡにおけ
るエクソンに相当する領域の欠失を包含する、修飾方法
によって代表される。これをゲノム配列について実施す
るとき、ＤＮＡ配列をエクソンＩＶに比較的密接したイ
ントロン領域において切断することは、また、可能であ
り、そして時には便利である。これはそれ自体既知のい
くつかの手順によって実施できる。好ましい手順は、プ
ロモーターから下流の全ｕＰＡ　　ＯＲＦを含有するベ
クターにおけるエクソンＩＶを取り囲むイントロ二／中
に、独特制限部位の導入し、こうしてイントロンＣまた
はイントロンＤにおける新しい部位の存在についてのみ
異なる２つのベクター誘導体を得るによって代表される
。これらの新しい部位ならびに２つのプラスミドに共通
である、この領域における第３部位における制限消化、
および生ずるプラスミド断片の再結合は、なかでも、イ
ントロンＣにおける新しい部位から上流の領域がイント
ロンＤにおける新しい部位から下流の領域に融合されて
いる、新しいプラスミド、すなわち、ｕＰＡ　　ＧＦＤ
に相当する領域の事実上すべて失った配列、を産生ずる
。他の好ましい実施態様は、それ自体既知の技術によっ
て、ｕＰＡ解読領域のイントロンＣ中のＰｓｔ１部位を
Ｓａ！Ｉ部位中に形質転換し、そしてイントロンＣ中の
Ｂｇ１１１部位をＸｈｏＩ中に形質転換し、これらの２
つの部位の間の領域を制限酵素で欠失し、そして２つの
断片を結合して、Ｓｅｒ、およびＡｓ＋）ａｓのアミノ
酸配列がＴｙｒ単位で置換された、ＧＡＳＧＡ誘導体の
遺伝情報を指定する、新しいｕＰＡ解読配列を得る。さ
らに詳しくは、生ずるプラスミドはＳｅ　ｒ＊　〜ｒ−
ｙ　ｓ２１およびＰ　ｈ　ｅ　２６〜ＡＳｐａｓのアミ
ノ酸配列を失っており、一方ＴＡＣコドンによって本来
暗号化されているＴｙｒ２１が、エクソンＩＩＩのＯＲ
ＦのエクソンＶのそれへの融合によって由来したＴＡＴ
コドンによって暗号化されたＴｙｒ残基で置換されてい
る。

好ましくは、上の方法は、ＧＡＳＧＡ発現ベクターが直
接得られるように、ｕＰＡ　　ＯＲＦ　（オーブンリー
ディングフレーム）を含有スるベクターについて実施す
る。あるいは、欠失突然変異体は、また、前述のように
、エクソンＩＶから下流に導入された独特部位（例えば
、Ｘｈｏ１部位）を有するｕＰＡ解読プラスミドから、
エクソン■Ｖから上流および下流のより大きいＤＮＡ部
分を欠失させ、そしてこれらの断片を、エクソンＩＶを
含まない欠失した配列の一部を再び導入することによっ
て、得ることができる。さらに詳しくは、前述のように
ｕＰＡ　　ＯＲＦおよび独特制限部位を含有するベクタ
ーを、エクソン■Ｖから下流に導入された独特部位（例
えば、ＸｈｏＩ）に対して特異的である酵素で、および
エクソンＩＶから上流の他の独特部位（例えば、イント
ロンＢ１すなわち、エクソンＩＶの前に存在するイント
ロン）中に既に存在するＨｉｎｄＩＩＩ）に対して特異
的である他の酵素で、処理する。エクソン■Ｉ■および
ＩＶを失った。生ずるプラスミド断片を、適当な粘着末
端または平滑末端によって、エクソンＩＩＩ（エクソン
■Ｖではない）のみを含有する断片に結合して、正しい
リーディングフレームを維持する事によって結合する。

得られるベクターは、本発明のＧＡＳＧＡ誘導体である
タンパク質の遺伝情報を指定するＧＡＳＧＡ発現ベクタ
ーである。この方法の好ましい実施態様において、ｕＰ
Ａ遺伝子から誘導されたＯＲＦを含有するＵＰＡ発現ベ
クターを、イントロンＤ中に存在するＢｇ１１１部位の
代わりにＸｈｏ１部位を挿入し、次いでＸｈｏｌおよび
Ｈ４ｎｄｌｌＩで消化することによって修飾する。もと
のプラスミドのほとんどを含有するが、エクソンＩＩＩ
およびＩＶに相当する配列を本質的に欠＜ＤＮＡ断片が
得られ、そしてこれを単離する。この断片をイントロン
ＢからイントロンＣに至り、こうしてエクソンＩＩＩを
含有するＨ　ｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−５，ａ、Ｉ　Ｉ断
片に結合して、５ｅｒｓ〜Ｌ３’ＳｚｚおよびＰｈｅ２
ｓ−Ａ５＋）４５のアミノ酸配列を失っており、一方Ｔ
ＡＣコドンによって本来暗号化されているＴｙｒ２４が
、エクソンＩＩＩのＯＲＦのエクソンＶのそれへの融合
によって由来したＴＡＴコドンによって暗号化されたＴ
ｙｒ残基で置換されているＧＡＳＧＡ発現ベクターを得
る。

前述のように、本発明のｕＰＡ”誘導体（ＧＡＳＧＡ）
は、そのｕＰＡレセプター結合能力が実質的に減少する
か、あるいは完全に障害されるように、「自然ＪｕＰＡ
のＧＦＤちゅうのインサートもって得ることができる。

好ましい方法は、遺伝子工学によって、ｕＰＡ解読遺伝
子またはｃＤＮＡまたは雑種ｕＰＡ遺伝子／　ｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａを修飾することを包含する。事実、遺伝子突然変
異発生は、ある数の物理的および化学的因子、例えば、
イオン化輻射、紫外線またはＤＮＡ前駆体の類似体で得
ることができることが知られている。いずれにしても、
好ましい方法は、遺伝子工学によって、例えば、Ｍ１３
誘導ベクター［Ｐ、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）　、Ｍ　
１３ベクターを使用する改良されたオリゴヌクレオチド
部位特異的突然変異、核酸の研究（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、１９８５．１３．４４３１］　
またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用することに
よって、解読配列を直接修飾することである。解読配列
は、トランスフェクションすべき同一のベクター上で、
あるいは異なるベクター上で修飾することができ、引き
続いて適当な断片をトランス７エクシヨンベクターにト
ランスフェクションする。これらの操作の順序は、包含
される特定の基質に依存し、そして通常の実施に基づい
て当業者によって決定される。

制限部位（ＳｃａＩ）は、ｕＰＡレセプターへの結合に
おいて考慮するｕＰＡの部分の遺伝情報を指定するＤＮ
Ａ配列中に存在する。それを開き、そしてタンパク質の
翻訳を停止せずかつリーディングフレームを変化させな
い、ＤＮＡストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を挿入するこ
とが可能である。好ましくは、前記ＤＮＡストレッチは
、トランスフェクションベクターの同定を促進するため
に新しい制限部位を含有する。これらの操作の順序は、
包含される特定の基質に依存し、そして通常の実施に基
づいて当業者によって決定される。

制限部位（Ｓｃａｌ）は、ｕＰＡレセプターへの結合に
おいて考慮するｕＰＡの部分の遺伝情報を指定するＤＮ
Ａ配列中に存在する。それを開さ、そしてタンパク質の
翻訳を停止せずかつリーディングフレームを変化させな
い、ＤＮＡストレッチ（５ｔｒｅｔｃｈ）を挿入するこ
とが可能である。好ましくは、前記ＤＮＡストレッチは
、得られた突然変異体の同定を促進するために新しい制
限部位を含有する。添加した塩基対は、それらの３つま
たは複数用あることができる。これは、所望の長さのＤ
ＮＡストレッチを使用して直接、あるいは複数の工程、
例えば、より大きいストレッチを挿入し、次いでこれを
適当な制限によって所望長さに短くすることによって得
ることがききる。

得られる解読配列は、例えば、「もとのＪｕＰＡの二次
構造のベーターシート、アルファーらせんにおける変更
、例えば、それにおける回転の導入、結合に関係するア
ミノ酸残基の間隔、親水性のプロフィルの修飾またはこ
れらの効果の組み合わせのために、変更されたｕＰＡレ
セプター結合部位をもつタンパク質について暗号化する
ことができる。

簡単に述べると次ぎの操作を実施するニー５ｃａＩによ
る部分的あるいは完全な消化による、ヒトｕＰＡ遺伝子
を含有する発現ベクターのオープニング（ｏｐｅｎｉｎ
ｇ）　　；−既知の配列のＤＮＡリンカ−による新しい
制限部位の挿入； −３つの塩基対または複数の塩基対を挿入するための前
記制限部位の修飾； 一選択因子に対して抵抗性を有するプラスミドの存在下
における、このベクターによる哺乳動物細胞のトランス
フェクション；− 一抵抗性クローンおよび、なかでも、培地中でＧＡＳＧ
Ａを産生するものの選択； 一培地の収集およびそれからのタンパク質の精製。

本発明によれば、ｕＰＡ解読配列中の１０２７ｂｐおよ
び１７８４ｂｐの間のｕＰＡ領域の１．２またはそれよ
り多い複製を挿入することにより、好ましくは順次にも
との１０２７〜１７８４ｂｐのＧＦＤ解読領域（すなわ
ち、本質的にエクソンＩＶ）をもちいて、［自然Ｊ　ｓ
ｃｕ−ＰＡまたはｕＰＡ中に複数のＧＦドメイン挿入す
ることが、また、可能である。

これらのポリー〇ＦドメインをもつＧＡＳＧＡ誘導体は
、自然分子と比較したとき、ｕＰＡレセプターに対して
改良された、より選択的な結合能力を有することが期待
される。

変更されたＧＦ−ドメインを有しくこうしてＵＰＡ−レ
セプターに結合する能力をもはやもたない）ＧＡＳＧＡ
の遺伝情報を指定するベクターは、下に「ＥＯ」と識別
する系列に属し、これに対して複数のＧＦＤ含有ＧＡＳ
ＧＡ発現ベクターは含有されるＧＦＤ単位の数に依存し
て、「ＥＰ」、ｒＥ３Ｊ、ｒＥ４Ｊなどの系列に属する
ものとして識別される。

本発明は、ＧＡＳＧＡ誘導体ならびにｕＰＡレセプター
結合活性の特徴ある障害または実質的な減少を有するそ
れらのアレル形態を包含する。アレル形態は、「自然Ｊ
　ｓｃｕ−ＰＡおよび／またはＰＡを修飾し、好ましく
はｕＰＡ解読領域を修飾し、モして哺乳動物細胞中でこ
の修飾された配列を発現することによって、得ることが
出来る。

そのうえ、本発明は、修飾された他の領域、好ましくは
プラスミン切断に暴露される領域を有するＧＦ−ドメイ
ン変更プラスミノゲンアクチベーターを包含する。ｕＰ
Ａへのその転化に一層抵抗性とするように修飾された領
域を有する、ｓｃｕ−ＰＡ誘導プラスミノゲンアクチベ
ーターの例は、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）２００４５１
号中に記載されるＬ　Ｙ　Ｓ　＋ｓａ、Ｌ　’ｌ　Ｓ　
１３ｍおよびＡ　ｒ　ｇ　＋１１１Ａ　ｒ　ｇ　＋ｓい
修飾誘導体あるいは欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）２１０２
７９号中に記載されるＬｙｓ１１２、Ｐｈｅ＋ｓｙ修飾
誘導体である。

これらの化合物は、アミノ酸９およびアミノ酸５０の間
、好ましくはアミノ酸９およびアミノ酸４５の間、最好
ましくはアミノ酸１９およびアミノ酸３２の間の領域に
おいて、ｃＤＮＡ配列または対応するＤＮＡ配列うえの
部位特異的突然変異によって修飾されている。発現ベク
ター中に挿入された、生ずる解読配列は、適当な動物細
胞を形質転換して、所望のＧＦＤ変更プラスミノゲン誘
導体を産生ずるために使用される。

また、タンパク質分解的切断に対するある種の抵抗を与
える、プラスミン型切断修飾に通常暴露される領域を有
する、これらのＧＦＤ変更、ｓｃｕ−ＰＡ誘導化プラス
ミノゲンアクチベーターは、ＧＦＤ非変頁変更出発化合
物較したとき、作用の増大した期間を有することができ
、および／または所望の作用を得るためにより少ない投
与量で投与することができる。これらの変更の程度およ
び方法は、ｕＰＡレセプターへの非結合性が維持される
かぎり、臨界的ではない。とくに、ＧＦＤ−突然変異は
、プラスミン感受性領域における突然変異後に、導入す
ることができ、あるいはその逆に、そしてＧＦＤ−突然
変異はプラス導入することができる。

ｕＰＡコード領域を含有するＤＮＡ断片は、適当なベク
ター中のヒトゲノムライブラリー、例えば、バクテリオ
ファージラムダまたはニスミド中でそれ自体既知の技術
に従って調製されたライブラリーによって、このような
ライブラリーを、遺伝子自体の一部によって表わされる
適切なりＮＡプローブまたは既知のコード配列に基づい
て調製された適当な長さの合成りＮＡ断片またはｃＤＮ
Ａ誘導プローブを使用してスクリーニングした後、得ら
れる。

便利には、このｕＰＡコード断片はクローニングしたＤ
ＮＡのＳｍａ　Ｉ消化によって得られた７、３ｋｂの断
片である。

これに似たＤＮＡセグメントは、説明および特許請求の
範囲において、「オープンリーディングフレームＪ　　
（ＯＲＦ）と呼び、イントロンによって中断されること
のできる、ｕＰＡ　　ｍＲＮＡの転写−翻訳単位を含み
、好ましくは翻訳効率またはｍｎＲＮＡ安定性を与える
５′および３′非翻訳領域またはその部分を含む、ゲノ
ムＤＮＡ配列を意味する。ＯＲＦの好ましい例は、ｌＯ
イントロンによって中断された、上に定義した配列であ
る。

本発明の方法において使用できる発現ベクターは、動物
細胞、とくに哺乳動物細胞をトランスフェクションする
ために使用する既知のベクターの任意のものである。本
質的には、それらはｍＲＮＡ翻訳を調節する配列、例え
ば、プロモーターおよびポリアデニル化部位を含む。時
には、それは、複製の真核起源を含む。とくに、プロモ
ーター領域は動物細胞中で使用できる既知のものでいず
れであることもできる。異種プロモーターは、哺乳動物
のウィルス、例えば、レトロウィルス（例えば、Ｒ５Ｖ
）　、ＳＶ４０　（早期または後期）およびアデノウィ
ルス（早期または後期）から得ることができる。あるい
は、動物またはヒト由来の調節可能なプロモーターを使
用できる。これらの調節可能なプロモーターの例は、マ
ウスまたはヒトメタロチオネイン！およびＩＩ、熱シヨ
ツク蛋白質などであり、これらは、例えば、次の参考文
献に記載されている：ヘイマー（Ｈａｍｅｒ）ら、真核
ウィルスのベクター（Ｅ　ｕｋａｒｙｏｔｉｃＶ　１ｒ
ａｌ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ）　、Ｙ、グルズマン（Ｇ　Ｉ
ｕｚｍａｎ）編、１９８３．７−１２；マヨ（Ｍａｙｏ
）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）、２９．９９−１０８　（１９
８２）およびカリシ（Ｋ　ａｒｉｎ）ら、ネイチャー　
（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０８．５１３−５１９　　（１
９８４）　　。

これらの調節可能なプロモーターに加えて、ヒトｕＰＡ
プロモーター領域またはその誘導体を、哺乳動物細胞中
でその制御下に置かれた遺伝子を発現するための効率よ
いプロモーターとして適当に使用できることが、また、
発見された。ヒトＵＰＡプロモーター領域は、ヒトゲノ
ムライブラリー（上を参照）からＳｍａＩ消化によって
得られ、そしてヒトｕＰＡ遺伝子上に約−２３５３ｂｐ
〜＋２９ｂｐの約２．３８ｋｂを含有する。

この「自然（ｎａｔｉｖｅ）　Ｊ　ヒトｕＰＡプロモー
ターを使用して適当な哺乳動物細胞系中で遺伝子を発現
することができるばかりでなく、また、もとの調節能力
を維持するか、あるいは改良された調節能力さえを有す
る、欠失、挿入または突然変異によって得られる、その
誘導体を本発明の方法において適当に使用できる。とく
に、ｕＰＡプロモーター領域の欠失誘導体は好ましい。

欠失誘導体の代表例は、ｕＰＡプロモーターを０ｘａＮ
ＩまたはＥｃｏＲＶで処理し、引続いて得られた断片を
ライゲイジョンすることによって得られるものである。

とくに０ｘａＮＩで消化することによって、約−１８２
７ｂｐ〜−１２０２ｂｐの間の０．６ｋｂの断片を失っ
た欠失誘導体が得られ、これに対して約−１８２７ｂｐ
〜−５３７ｂｐの間の１．２９ｋｂの断片を失った欠失
誘導体が得られる。

また、これらの欠失誘導体は、非常に効率よいプロモー
ター系として普通に考えられている通常のウィルスのプ
ロモーター、例えば、Ｒ５Ｖに匹敵するか、なおさらに
高い収率で、調節された遺伝子の発現を誘導できること
が発見された。

ポリアデニル化部位に関すると、それは任意に既知のも
の、例えば、ｕＰＡ遺伝子に対して自然であるか、ある
いは他の哺乳動物の遺伝子からの、プロモーター領域と
関連するもののいずれであることもできる。プロモータ
ー領域、転写イニシェークー、および便利には、ポリリ
ンカーを含有する発現カセットがいったん調製されると
、それを動物細胞中の形質転換のｔ；めに選択した遺伝
子に接合することができる。

一般に、部分を一緒にする特定の順序は臨界的でないの
で、フランキング領域を、まず、マーカーまたは他の領
域、例えば、エンハンサ−１転写調節領域などを含む複
製系に結合した後、遺伝子を挿入する。種々の断片を一
緒にする方法は、構成の容易さ、制限部位の選択、特定
の断片の入手可能性などに関するある数の因子に依存し
、これは究極的には当業者の選択能力の範囲内である。

複製系の選択は、ある程度、−時的または安定な発現を
望むかどうかに依存する。−時的発現のために、複製の
起源を含有するウィルスの配列（例えば、５ｖ４０）に
基づくエピゾームの要素を使用する。安定な発現は、他
のエピゾームの要素（例えば、ウシ乳頭腫ウィルスに基
づくベクター）またはゲノム中に組込んだ配列を使用し
て達成できる。これらのウィルスの配列のある数はマー
カー、例えば、遺伝干出、士およびｄｈｆｒに接合され
た。これらのマーカーは、ベクターを含有する細胞の選
択および組込まれた異質配列の増幅を可能とする。

所望の物質、例えば、ヒトｐｒｏ−ｕＰＡの産生を増強
するために、ｕＰＡ発現カセットを含有する第１構成体
および選択可能なマーカーを含有する第２依存性構成体
と一緒に細胞を共形質転換することか便利であることが
ある。

あるいは、ｕＰＡ力セントが遺伝子、例えば、牝の発現
カセットと直列に存在する直列構成体を調製することに
よって、遺伝子を増幅することができる。

宿主細胞は任意の動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞ま
たは鳥類の細胞であることができ、これはｕＰＡ発現ベ
クターで形質転換するとき、ｐｒｏ−ｕＰＡを回収可能
な量で産生することができる。これらの細胞の例は、ヒ
ト由来の細胞を明白に包含し、形質転換前に回収可能な
量でｐｒｏ−ｕＰＡを産生することができるか、あるい
はできない既知の確立された細胞系を包含し、その例は
次の通りである：ＬＢ６、親り細胞から誘導されたマウ
ス線維芽株細胞系［コルサロ（Ｃｏｒｓａｒｏ）Ｃ，Ｍ
、およびパールソン（Ｐ　ｅａｒｓｏｎ）　Ｌ　、　Ｍ
　、、哺乳動物細胞中のＤＮＡ仲介遺伝子の転移の効率
の増大、ツマチック・セル・ジェネチックス（Ｓｏｍａ
ｔｉｃ　　ｃｅｌｌ　　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）７．６０３
−６１６．１９８１］、ＣＨＯ、チャイニーズハムスタ
ー卵巣［カオ（Ｋａｏ）Ｆ、Ｔ、　、ブック（Ｐ　ｕｃ
ｋ）Ｆ５プロンーデインダス・オブ・ナンヨナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ％　６０．１２７５
−１２８Ｌ　　１９６８］およびＡ４３１ヒト類表皮癌
細胞系［７アブリカント（Ｆ　ａｂｒｉｃａｎｔｏ）　
Ｒ。

Ｎ１、デ・ラル：２　（Ｄｅ　　Ｌａｒｃｏ）　Ｊ、　
Ｅ、およびトダロ（Ｔｏｄａｒｏ）　Ｇ　、　Ｆ　、　
、条件下ニオケルヒト哺乳動物細胞上の神経増殖因子受
容体、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７４．５６５−５６９．１９７７］
。前述の最初の２つの細胞系（ＬＢ６およびＣＨＯ）は
ｐｒｏ−ｕＰＡを産生しないが、最後のもの（Ａ４３１
）はそれを産生ずる。一般に、確立された細胞系、例え
ば、ＣＨＯ，ＣＯ５，ＬＴＫ、Ｈｅ１ａおよびＣＮ−１
は、本発明の方法において適当に使用できる。

ＧＡＳＧＡ産生性１産生性１細ＣＨＯ細胞系て再クロー
ニングすると、ｕＰＡ産生能力を保持する誘導された細
胞系を得ることができ゛、これは、また、懸濁液中で自
己複製することができる。培養の容易さおよび発酵質量
単位当りの高い産生収率によって表わす、このような細
胞系の利点は、当業者にとって明らかである。培地中の
懸濁液中で増殖できる、これらのＧＡＳＧＡ細胞系は、
本発明の好ましい実施態様を表わす。

発現ベクターは、任意の便利な手段、例えば、マイクロ
インジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トラン
スフェクション、リン酸カルシウム沈殿り、ＮＡトラン
スフェクションおよび電気泳動によって宿主中に導入す
ることができる［参照、バナージ（Ｂ　ａｎｅｒｊ　ｉ
）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）　、３３．７２９−７４０　（
１９８３）；グラハム（Ｇ　ｒａｈａｍ）Ｆ、Ｌ、およ
びファン・デル・エフ゛（Ｖａｎｄｅｒ　　Ｅｂ）　Ａ
、　Ｊ、　、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌ、　）、５２．４
５６−４６７　（１９８３）およびボッター　（Ｐ　ｏ
ｔｔｅｒ）　Ｈ、ら、プロシーデインダス・オン・ナシ
ョナル・アカデミ−・オン・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　
ＳＡ、８１，７１６１−７１６５　（１９８４）］。

トランスフェクション後、細胞を適当な培地、例えば、
１０％〜２０％の不活性化ウシ胎児血清を含有するダル
ベツコ（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ）の変性イーグル（Ｅ　ａ
ｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、ここでこれら
の細胞は安定に維持され、次いで適当な選択剤、例えば
、抗生物質を導入する。

選択した細胞を反復してクローニングし、そしてＧＡＳ
ＧＡのそれらの産生を通常のアッセイ、例えば、線維素
溶解アッセイまＩ；は免疫アミド溶解（ｉｍｍｕｎｏａ
ｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）アッセイ（ＩＡＡ）によって評価
する。

このアッセイは、タンパク質ＧＦＤを認識しないか、あ
るいはそれに特異的に結合しない、５Ｃｕ−ＰＡ８よび
／またはｕＰＡに対して特異的なモノクローナル抗体を
使用して実施しなく他はならない。適当なモノクローナ
ル抗体は、八−鎖を認識しないでｕＰＡのＢ−鎖を認識
するもの、例えば、へりオン（Ｈｅｒｉｏｎ）　Ｐ　、
ら、バイオサイエンス・リポート（Ｂ　１ｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ　　Ｒ５ｐｏｒｔｓ）　ｌ、８８５−８９２　（１
９８１）、サレルノ　（Ｓ　ａｌｅｒｎｏ）　、Ｍ　−
Ｇ　、ら、プロシーデインダス・オン・ナショナル・ア
カデミ−・オン・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ。

１９８４．８１，１１０−１１４、またはカルトフト（
Ｋ　ａｌｔｏｆｔ）ら、プロシーデインダス・オン・ナ
ショナル・アカデミ−・オン・サイエンシス（Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　５ｃ−ｉ、　）　
Ｕ　Ｓ　Ａ１１９８２．７９．３７２０−３７２３、に
記載されるもの、またはノリ（Ｎｏｌｌｉ）ら、トロン
ボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ　、　　
Ｈａｅｍ。

５ｔａｓ、　）、１８６．５６．２１４−２１８に記載
され、そしてＧＦＤ領域に結合しないでｕＰＡの［クリ
ングル（Ｋ　ｒｉｎｇｌｅ）　Ｊ領域に結合するＭＡ８
　５Ｂ４である。次いで、単離したＧＡＳＧＡ産生クロ
ーンを大量培養して、実質的な量のＧＡＳＧＡを生産す
る。

大量培養において、好ましい実施態様はアプロチニンの
添加によって代表される。もとの培地中あるいは培養の
間のこの物質の添加の結果、ｐｒｏ−ｕＰＡがより多い
量で回収される。典型的には、アプロチニンはｌＯ〜５
　Ｑ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは２０〜２５１Ｕ／
ｍｌの濃度で添加される。

リーダー配列が保持されかつ産生物が分泌できるかどう
かに依存して、培地は連続的にまたは反復的に交換し、
そしてｐｒｏ−ｕＰＡを培地から分離することができる
。リーダーが保持されずかつ産生物が細胞内に維持され
る場合、細胞を収穫し、殺し、溶解し、そして産生物を
分離することができる。分離および精製のため、通常の
技術、例えば、アフイニティクロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ，逆相ＨＰＬＣを適用することができる。便利な親
和クロマトグラフィーの精製は、タンパク質ＧＦＤを認
識しないか、あるいはそれに特異的に結合しない、抗ｓ
ｃｕ−ＰＡまたはｕＰＡのモノクローナル抗体、例えば
、八−鎖を認識しないでｕＰＡのＢ−鎖を認識するもの
、あるいは「クリングル（Ｋ　ｒｉｎｇｌｅ）　Ｊ領域
においてのみＡ−鎖に結合するもの（上を参照）の使用
を包含する。

便利には、へりオン（Ｈｅｒｉｏｎ）　Ｐ、　８よびボ
レン（Ｂｏｌｌｅｎ）　Ａら、バイオサイエンス（Ｂ　
１ｏｓｃｉｅｎｃｅ）　１９８３．３．３７３−３７９
にきさいされる免疫吸着剤ならびにＭＡ８　５Ｂ４（ノ
リ（Ｎｏｌｌｉ）ら、上を参照）を使用できる。

得られる化合物が実際にｕＰＡ　　ＧＦＤに結合しない
ことを確証する便利な手順は、免疫アミド分解アッセイ
によって代表される［参照、コルチ（ＣＯ「Ｌｉ）う、
トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ　
、　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）、１９８６．５６．４
０７−４１０；また、参照、下の１゜６．２］。この手
順は、ＧＦＤを含まないタンパク質領域を認識しないか
、あるいはそれと結合しないモノクローナル抗体（これ
らの抗体のいくつかの特定の例について、上を参照）を
使用して、前把タンパク質領域を認識しないか、あるい
はそれと結合しないモノクローナル抗体（例えば、ＭＡ
Ｂ　　ＣＤ、またはＣＤ、　、それ以上の詳細について
は下を参照）を使用する免疫アミド分解アッセイと平行
にあるいは系統的に実施する。

この特異性をもつモノクローナル抗体は、既知の細胞融
合技術に従って、適切な選択方法を適用することによっ
て調製することができる。免疫化剤は、ｓｃｕ−ＰＡ、
ＡＴＦまたはそれらの混合物であることができ、そして
通常の免疫化スケジュールに従うことができる。抗原受
容体は、この技術において使用する実験動物、好ましく
はげつ歯頚、例えば、ラット、マウスまたはウサギのい
ずれであることもできる。処置した動物からの肺細胞と
融合すべき安定化された細胞系は、既知の＼現在入手可
能な細胞系、例えば、好ましくは腫瘍細胞系、例えば、
マウス骨髄腫ＮＳＯ（Ｐ３／ＮＳｔ／Ｉ　　Ａｇ−４，
１の下位系統、ＡＴＣＣＴＩＢ　　１８）のいずれであ
ることもできる。要求する特徴をもつＭＢＳ類の選択は
、はぼ位置４におけるｕＰＡ配列から位置４３における
グルタミン酸残基までのｕＰＡ配列に相当し、こうして
ｕＰＡのいわゆるＧＦＤに相当する（その関連する部分
であるかそれを含む関連する部分である）アミノ酸配列
である、見掛けの分子量を有するペプチド断片である。

この断片は、グルタミン酸の残基に近接するタンパク質
配列を切断できる酵素、例えば、スタフィロコッカス・
アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅ
ｕｓ）誘導グロテアーゼＶ８でＡＴＦを調節して処理す
ることに、よって得られる。この選択系における積極的
な調節として、時には、ＡＴＦをＶ８地理して得られる
それ以上の断片、例えば、すなわち、や＜１１０００の
見掛けの分子量および本質的にｕＰＡｒクリングル」領
域に相当する配列を有するＢｌｌという名称の断片、お
よび同一手順によって得られ、アミノ酸５２およびアミ
ノ酸５３の間のクリライビング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を
除外して、本質的にｕＰＡｒクリングル」領域に相当す
る配列を有するＦｌｌという名称の第３断片を必要に応
じてを導入することが便利である。

例えば、免疫親和性または免疫プロット実験において、
「クリングル」領域（断片Ｂ、□）または触媒領域（Ｂ
−鎖）に結合しないで、断片Ｆ６に、ならびにｕＰＡ（
ｓｃｕＰＡおよび／またはｔｃｕＰＡ）に結合するＭＡ
Ｂ類は、例えば、親和クロマトグラフィーまたはイオン
交換クロマトグラフィーによって精製し、そして単離す
る。それらは、ｕＰＡ　　ＧＦＤ領域を認識するか、あ
るいはそれに選択的に結合するという所望の特徴を有す
る。

本発明のＧＡＳＧＡ誘導体がｕＰＡレセプター例えば、
ストッペリ（Ｓ　ｔｏｐｐｅｌｌｉ）　Ｍ　Ｐら、プロ
シーデインダス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　　ｌ　９８５．８２．４９３
９−４９４３に記載されるＵ　９３７単球に結合しない
ことを立証するために、この文献に記載されている実験
を反復するが、ｕＰＡの代わりに本発明のＧＡＳＧＡ誘
導体を使用することを含むアッセイを実施することがで
き、前記ｕＰＡはこの実験においで陽性の対照としての
み導入することができる。このアッセイＥＯ系列のＧＡ
ＳＧＡ誘導体の結合能力は非常に低かった。一般に、そ
れは１０％より低いｕＰＡ結合能力であった。　Ｕ９３
７単球を使用する代わりに、あるいはそれに加えて、上
の実験は、アジャー（Ａｊｊａｒ）　ＫＡら、ジャーナ
ル・オン・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ　、　
　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈａｍ、　）、１９８６．２６１．
１１６５６−１１６６２に記載されているヒトｍ静脈内
皮細胞を使用することによって実施することができる。

本発明の化合物の生体内活性は、動物モデルについての
実験、例えば、コウレン（Ｃａｌｉｅｎ）　Ｄ　。

ら、ジャーナル・オンΦクリニカル・イムノロジー　（
Ｊ　、　　Ｃ１１ｎ、　　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、１
９８３．７３．３６８−３７６に記載される、麻酔した
ウサギにおける凝固物溶解によって立証することができ
る。したがって、本発明のＧＡＳＧＡ誘導体は、これら
の物質、例えば、血栓溶解剤についてこれまで案出され
てきた、治療上の用途におけるｓｃｕ−ＰＡまたはｕＰ
Ａのための可能な代物として使用できる。この目的に、
それはそのままで、あるいは好ましくはそれ自体既知の
技術に従って配合することができ、これらは、例えば、
次の文献に記載されている：レミントンの製薬科学（Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　　Ｐ　ｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、１９８５
、フック・パブリジング・カンパニー（Ｍａｃｋ　　Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏ、　）　。とくに、それら
はｕＰＡまたはｓｃｕ−ＰＡの現在の配合と同様に配合
することができる。

したがって、好ましい治療学的応用は、血栓溶解剤とし
て、可能ならば梗塞または塞栓、例えば、心臓の梗塞、
肺の塞栓または抹消動脈の塞栓の早期の段階においてで
ある。投与の道筋は好ましくはｉ、ｖ、であり、そして
投与のモードは濃縮塊または潅流によることができる。

好ましくは、本発明の化合物の一血栓溶解有効量のｉ、
ｖ、濃縮塊投与を実施し、次いで、必要に応じて、比較
的短い時間にわたって少ない投与量の潅流を実施する。

毎日に投与量は、患者の年令、大きさ、状態とともに大
きく変化し、そして梗塞および関連する治療のため、そ
れは正常（７０ｋｇ）のヒトの患者について一般に２−
３０ｍｇ／ダイ（ｄｉｅ）の範囲、好ましくは２−２０
　ｍｇ／ダイの範囲、最も好ましくは２−２０　ｍｇ／
ダイであることができる。この特定の治療の分野におい
て知られているように、。

適当な投与量および投与の計画は、場合に応じて医師に
よってしばしば決定される。

ｕＰＡ、ｓｃｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡについて記載され
て要る通常の安定剤を含有する投与単位は、約５０，０
００〜２００，０００のｕＰＡ／単位に相当する０、５
−２ｍｇ／単位の範囲でＧＡＳＧＡを含有する。

ｉ、ｖ、注射のための２ｍｌの無菌の生理的食塩水中に
再構成するための、凍結乾燥した製薬学的配合物は次の
通りである： ＧＡＳＧＡ　（凍結乾燥した）　　　５ｍｇマンンニト
ール　　　　　　　２０ｍｇ酢酸ナトリウム　　　　　
　　　２ｍｇリン酸塩緩衝液　　　　　　　十分量 本発明の化合物は、単独で、あるいは組み合わせた治療
において、凝固防止剤、例えば、ヘパリンまたはアスピ
リンと、あるいは他のＰＡ、例えば、ｓｃｕ−ＰＡ、ｕ
ＰＡまたはｔ−ＰＡ、またはそれらの修飾した形態、例
えば、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）２３１８８３号欧州特
許出［（ＥＰ−Ａ）２３６０４０号に記載されて要るも
の、ストレプトキナーゼまたはそれらの混合物と組み合
わせて投与することができる。

実施例 次の実施例は、本発明およびそれを利用できる方法の例
示のみを意図し、本発明の範囲を限定するものと解釈す
べきではない。理解をいっそう容易とするために、実施
例の前の節（１，ｌ−１゜６．５）において、技術およ
び方法（例えば、酵素修飾、ＤＮＡ沈殿、蛋白質の精製
など）を報告し、これらは、本質的に同一の方法で、異
なる実施例において適用する。これらの実施例において
、事実、全体の手順を反復する代わりに、それが記載さ
れている節をしばしば言及する。

１．１．使用する細胞は商業的に入手可能であるか、そ
うでなければ学会および承認された受託機関を通じて入
手可能である。

１．２．細胞は適当な培地、例えば、１０％の熱不活性
化胎児仔ウシ血清を含有するダルベツフ変性イーグル培
地（ＤＭＥＭ）中で増殖する。

１．３０分子生物学のための培地、緩衝液および溶液。

入手可能であるとき、試薬はすべての場合においてｒＤ
ＮＡ／ＲＮＡ等級」および「分析等級」である。特記し
ないかぎり、バクテリアおよびファージの増殖のための
液体および固体の培地、緩衝液および溶液は、マニアチ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ、、７リツシユ（Ｆ　ｒｉｔ
ｓｈ）　Ｅ　、　Ｆ　−、サムプルツク（Ｓ　ａｍｂｒ
ｏｏｋ）　Ｊ　、　、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、実験室のマニュアル、
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、（１９８２）（以後、「マニアチス
ら」と呼ぶ）に示されているように、調製し、貯蔵し、
そして使用する。特記しないかぎり、ガラス製品、プラ
スチック製品および実験室硬質製品は、同一文献に示さ
れているように、調製し、貯蔵し、そして使用する。脱
イオン／蒸留水を使用し、酵素の緩衝液中に使用する場
合、オートクレーブ処理する。

１．４−分子生物学のための酵素 制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素およびＲＮア
ーゼは商業的に入手可能である。ベーリンガ−（Ｂ　ｏ
ｅｈｉｎｇｅｒ）　、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
−（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌ　
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　　（ＢＲＬ）、コラポレイ
ティブ・リサーチ（ＣｏｌｌａｂｏｒａＬｉｖｅ　　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）　、ニュー０イングランド・バイオラ
プス（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　ｉ。

１ａｂｓ）およびファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ
）から購入したものを使用した。リゾチームおよびウシ
血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）は、また、商業的に入手
可能である。リゾチームはシグマ（Ｓ　ｉｇｍａ）から
購入し、モしてＢＳＡはベーリンガー（１３ｏｅｈｉｎ
ｇｅｒ）から購入した。普通に使用されたいる緩衝溶液
を各酵素反応のために使用する。それらの組成および調
製は一般に知られており、そして便利には、それらは各
酵素に付随する情報に従って調製し、調製物はフィルタ
ー滅菌し、そしてアリコートで一２０°Ｃにおいて貯蔵
する。現在使用されている多くの緩衝液は、また、濃厚
物として商業的に入手可能である。合成用ＤＮＡリンカ
−ならびにｔ　−ＲＮ　Ａおよびニシン精子ＤＮＡは商
業的に入手可能である。合成用ＤＮＡリンカ−はＰ−Ｌ
ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）または二ニー・
イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｂ　ｉ。

ｊａｂｓ）から購入し、一方ｔＲＮＡおよびニシン精子
ＤＮＡはベーリンガ−（Ｂ　ｏｅｈｉｎｇｅｒ）から購
入し　Ｉこ　。

１．５−ｒＤＮＡ技術 以下の実施例において特記しないかぎり、ｒＤＮＡ技術
１ま（マニアチスら）およびその中に含まれるもとの文
献に記載されるように実施する。

１．５．１−制限消化およびＤＮＡの酵素の修頭 単一および複数の制限消化およびＤＮＡの酵素の修飾は
、この分野において知られているようにして実施し、そ
して、また、商業的に入手可能な製造業者の小冊子およ
び（マニアチスら）、第４章に報告されている。「加熱
不活性化」は、酵素を７０°Ｃで１０〜１５分間不活性
化し、次いでこの混合物を１０〜１５分間室温に放置し
、そしてエラペンドル７　（Ｅ　ｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠
心機で遠心することを意味する。好ましくは、制限消化
および酵素のＤＮＡ修飾の結果は、１００ポルトで１〜
２時間操作する１％のアガロースゲルを含有する０、５
マイクログラム／ｍｌの臭化エチジウム上で検査する（
マニアチスら、第５章参照）。

１．５．２−フェノール／クロロホルム抽出好ましくは
、核酸水溶液からの蛋白質の７エノール／クロロホルム
抽出は、マニアチスら、４５８−４５９ページに記載さ
れるように実施する。

反応体積が２００マイクロリツトルより小さいとき、Ｄ
ＮＡを「逆抽出」する。

１．５．３−ＤＮＡ沈殿 好ましくは、ＤＮＡ沈殿は、０．１体積の３モルの酢酸
ナトリウムｐＨ５，２および２．５体積のエタノールを
添加することによって実施する（−２０°Ｃにおいて）
。次の実施例において示されているときにのみ、２０〜
４０マイクログラムのＬＲＮＡを添加する。この混合物
をドライアイス／エタノール浴中に１５〜３０分間ある
いは一２０°Ｃにおいてｌ夜装置し、次いで４℃におい
て１５分間１１０００Ｘでエツペンドル７マイクロ遠心
機（Ｅ　ｐｐａｎｄｏｒｆ　　ｎ＋ｉｃｒｏｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇｅ）またはソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心機
内で遠心する。ＤＮＡのＬｋ１７０％のエタノールで１
回洗浄し、次いで１００％のエタノールで１回洗浄し、
最後にソバント（’３　ｏｖａｎＬ）真空遠心機内で乾
燥する。

１．５．４−５’脱リン酸化 好ましくは、５’　ＤＮＡは商業的に入手可能な仔つシ
腸ホスファターゼ［ＣＩ　Ｐ、ベーリンガー（Ｂ　ｏｅ
ｈｉｎｇｅｒ）から購入した］　を使用して３７°Ｃお
よびｐＨ８において１時間脱リン酸化する。ＣＩＰは、
フェノール：クロロホルム抽出によって、あるいはＥＧ
ＴＡ、［エチルビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢
酸］を約５０ミリモルの最終濃度に添加し、そして６８
℃に４５分間加熱することによって除去する。

１．５．５−ＤＮＡのライゲイジョン ＤＮＡのライゲイジョンはこの分野において知られてい
るようにして実施する。便利には、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
製造業者の指示に従う。便利には、リガーゼ反応は、合
成用リンカ−を使用するとき、８℃において、他のすべ
ての場合において、１４〜１６℃において実施する。平
滑末端のＤＮＡをライゲイジョンすべきとき、ＰＥＧ１
５００またはＰＥＧ４０００を１０％の最終濃度に添加
する。便利には、次の組成のｌＯ×ライゲイジョン緩衝
液を使用する：０．６６モルのトリス−Ｈｅｌ　　ｐＨ
７，６，５０ミリモルのＭｇＣ＋、、５０ミリモルのジ
チオスレイトールおよび５ミリモルのＡＴＰ。

１．５．６−ＤＮＡのリンカ− 好ましくは、マニアチスら、１２５−１２６ページに示
されているように、リンカ−のＤＮＡを使用し、リン酸
化し、そして検査し、そして３９２ページ以降に示され
ているように使用する。リンカ−単独および結合したＤ
ＮＡ断片のキナーゼ反応、ライゲイジョンおよび制限は
、電気泳動によって検査するニリンカーを２％のアガロ
ースゲル上に１０〜２０分間（結合したＤＮＡ断片の場
合において１〜２時間）適用し、次いで、マニアチスら
１７２ページに示されているように、オートライジオフ
ラフィーによってＤＮＡを可視化する。

１．５．７−調製用ゲル電気泳動 好ましくは、調製用ゲル電気泳動は、１ｘＴＢＥ緩衝液
（０，０８９モルのトリス、０．０８９モルのホウ酸お
よび０．００２モルのＥＤＴＡ、マニアチスら、１５６
ページ）中に０．５マイクログラム／ｍｌの臭化エチジ
ウムを含有する０、７％〜０．８％のアガロースゲル上
で実施する。ＤＮＡを２５ボルトで最初に２時間および
５０ボルトで１６〜２０時間展開する。ＤＮＡ断片は３
０５ｎｍのＵＶトランスイルミネーターで可視化し、そ
してＤＮＡのバンドを切出し、そして０．１ＸＴＢＥ中
の電気溶離系（ＩＳＣＯ）中で４００ボルトにおいて１
０〜１５分間電気溶離する。ＤＮＡをエルチップ（Ｅ　
１ｕｔｉｐ）　−Ｄカラム［シュレイチャー・アンド・
シュネル（Ｓ　ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　＆Ｓ　ｃｈｎｅ
ｌｌ）　　（低い塩の緩衝液中で調製しかつすすいだ）
で精製し、そして高い塩の緩衝液で溶離する。典型的に
は、カラムを０．２モルのＮ　ａ　Ｃ１゜２０ミリモル
のＴＲｌ５−ＭＣｌ　　ｐＨ７，３−７，５（ＴＲＩ　
Ｓは２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロ
パンジオールである）および１．０ミリモルのＥＤＴＡ
中で調製する。この緩衝液は、また、すすぎに使用する
が、溶離用緩衝液は１．０モルのＮａＣｌ、２０培地の
トリス−ＭＣＩ　　ｐＨ７，３−７，５および１．０ミ
リモルのＥＤＴＡを含有する。最後に、ＤＮＡを１．５
゜３に示すように沈殿させる。

１、５．８−ｃｏｌｉの形質転換 好ましくは、Ｅ、ｃｏｌｔの形質転換［参照、ハナハン
（Ｈａｎａｈａｎ）　Ｄ、　、プラスミドを使用するＥ
。

ｃｏｌｉの形質転換についての研究、ジャーナル・オン
・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）、１５５．５５７−５８０（１，９８３）
］は、それ自体既知であるか、あるいは製造業者の小冊
子中に要約されている技術に従い、商業的に入手可能で
あるか、あるいは他の方法で入手可能なコンピテント細
胞、例えば、ＢＲＬ　［ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リ−（Ｂ６ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）　　（ＢＲＬ）　］の株ＤＨ１，Ｄ
Ｈ５またはＨＢＩＯＩを使用して実施する。ＤＮＡ断片
を異なるプラスミド中に挿入するとき、１００マイクロ
リツトルの（Ｂ　ＲＬ）プロトコルを使用するが、制限
部位をＤＮＡリンカ−によって転化するとき、小さい規
模の２０マイクロリツトルの（Ｂ　ＲＬ）プロトコルを
使用する。

抗生物質を使用しないでインキュベージコンした後、細
胞を寒天ＬＢ平板（マニアチスら、４４〇−４４４ペー
ジ）上に配置し、そして適当な抗生物質の存在下に３７
℃で１夜インキユベーシヨンする。

１．５．９−形質転換した細胞のスクリーニングましく
は、ＤＮＡ形質転換したコンピテントＥ、ｃｏｌｉ細胞
からの抵抗性コロニーは、分離したコロニーを５ｍｌの
ＬＢおよび適当な抗生物質中で３７°Ｃにおいてｌ夜増
殖させ（マニアチスら、４４０ページ）、そしてマニア
チスら、３６６−３６７ページに報告されているように
沸点法に従い、永代培養物の試料（１，５ｍ１）を分析
することによってスクリーニングする。便利には、次の
変法を導入することができるニ ー　反応体積を１．５＠にする； −Ｅ、ｃｏｌｉ株ＤＨＩを６０秒間沸騰させる；−ＤＮ
Ａ沈殿は、塩を添加しないが、１体積のイソプロパツー
ルを添加し、そして試験管を一２０°Ｃに２０〜２５分
間放置することによって実施する； −沈殿したＤＮＡを１ｍｌの７０％のエタノールで１回
洗浄し、次いで１ｍｌの１００％のエタノールで１回洗
浄する； −ＤＮアーゼ不含ＲＮアーゼを１０マイクログラム／　
ｍ　Ｉに添加し、そしてＤＮＡを２０分間７０’Ｃでイ
ンキュベーションする。

１．５．ｔｏ−プラスミドの大規模調製好ましくは、プ
ラスミドの大規模調製は、マニアチスら、第３章に記載
されているように実施する。好ましくは、アルカリ性溶
解法を用いてプラスミドのＤＮＡを回収しく参照、マニ
アチスら、９０−９１ページ）、プラスミドのＤＮＡを
ＣｓＣ１の勾配を含有する臭化エチジウムで２回精製し
、次いでこの混合物をイソアミルアルコールで抽出し、
水性ＤＮＡ含有相を分離し、そしてＴＥｐＨ８に対して
透析しくマニアチスら）および４℃で貯蔵する。

１．６−得られたＧＡＳＧＡの精製および特性づけ １．６．１−化学物質 すべての化学物質は、広く商業的に入手可能であるか、
あるいは商業的に入手可能な生成物から容易に調製され
る。例えば、次のリストは以下の実施例およびにおいて
使用したいくつかの化学物質およびそれらの源を包含す
る：Ａｆｆｉ−Ｇｅ１１０（活性化アガロース）、アク
リルアミド、ビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、クマッシーブリリアントブルー（Ｃｏｍａｓｓｉ
ｅ　　Ｂ　ｒｉｌｌｉａｎｔ　　Ｂ　Ｉｕ）は、バイオ
・ラド（Ｂ　ｉｏ　　Ｒａｄｓ米国リッすモンド）から
購入した；　ＣＮＢｒ活性セファローズ（Ｓ　ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）　、低分子量蛋白質のための電気泳動カリブ
レイションキットは、７アーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃ
ｉａ、スエーデン国つプサラ）から購入した；アンホリ
ンはＬＫＢ　　ＡＢ（スエーデン国ブロンマ）から購入
した：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コーンフラクシ
ョンＶ１ブタトリプシン、ブタプラスミン、フィブリノ
ゲンフラクションＩタイプＩＶ１ベンズアミジンは、シ
グマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌＣＯ８、米国セントルイス、Ｍｏ　　６３１７
８）から購入した；アプロチニンはバイエル（Ｂａｙｅ
ｒｓ西ドイツ国レーフエルし−ゼン）から購入した；グ
リコペプチダーゼＦはベーリンガ＝（Ｂｏｅｈ　ｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　　ＧｍｂＨ，’ＦＲＧ）から購
入した；Ｓ−２４４４はカビ（Ｋａｂｉ　　ＡＢ％　ス
エーデン国ストックホルム）から購入した。高分子量の
ウロキナーゼ（ＨＭ　Ｗ　−ｕ　Ｐ　Ａ　）およびいわ
ゆるアミン末端断片（ＡＴＦ）は、レベチット・リサー
チ・ラボラトリーズ（Ｌｅｐｅｔｉｔ　　Ｒｅ５ｅａｃ
ｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　Ｓ　ｐＡ　、イタ
リー国ミラノ）によって製造された。Ｓ　ｃｕ　−Ｐ　
Ａ　（ｐｒｏ−ｕＰ　Ａ）は、スタンプ（Ｓｔｕｍｐ）
　Ｄ、　Ｃ，、チェンポイント（Ｔ　ｈｉｅｎｐ。

ｉｎｔ）Ｍ、’、コウレン（Ｃｏｌｌｅｎ）　Ｄ、　、
ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）、２６１．１２６７
−１２７３．１９８６、に記載されている手順に実質的
に従って調製できる。Ａ４３１　ｓｃｕ−ＰＡは、コル
チ（Ｃｏｒｔｉ）　Ａ　８、ノリ（Ｎｏｌｌｉ）　Ｍ。

Ｌ９、ソフィエンチニ（Ｓ　ｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ）　
Ａ　、　、カッサイ（Ｃａｓｓａｉ）　Ｇ、　、トロン
ブ・ヘモスタス（Ｔ　ｈｒｏｍｂ　　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓ）、１９８６；５６．２１９−２２４に記載されてい
る方法に従って得られる。すべての試薬は、メルク・ダ
ーマスタツド（Ｍｅｒｋ　　Ｄａｒｍａｓｔａｄ、西ド
イツ国）またはカル口・エルバ（Ｃａｒｌｏ　　Ｅ　ｒ
ｂａｌ　イタリー国）から商業的に入手可能な分析等級
の生成物であった。

１．６．２−免疫学的および活性のアッセイ線維素溶解
アッセイは、フィブリン板の方法によって実施する［ア
ストラップ（Ａ　５ｉｒｕｐ）　Ｔ　、、ヌラーツ（Ｍ
ｕｌｌｅｒｔｚ）　Ｓ、　、線維素溶解活性を推定する
ためのフィブリン板の方法、アーチープス・オン・バイ
オケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａ　ｒ
ｃｈ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　）
、４０　：　３４６−３５１　（１９５２）］。ウロキ
ナーゼ参参照率を使用して各アッセイをカリブレイショ
ンする。活性は、主標準として、インターナショナル・
し７アランス・プレバレイジョン（Ｉ　ｎｅｔｅｒｎａ
ｉｉｏｎａｌ　　Ｒｅｆｅｒｎｃｅ　　Ｐ　ｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ）に関して国産単位（ＩＵ）で測定する。ｓ
ｃｕ−ＰＡ（細胞産生−末鎖ウロキナーゼ９の線維素溶
解潜在活性は、次のように活性化後決定する：プラスミ
ン（ｌ　Ｏｍｇ）をＣＮＢｒ活性化セファロース（架橋
しｌ；アガロース）　　（２，５ｍ１）と、カップリン
グ緩衝液として０．５モルの炭酸ナトリウム緩衝液を使
用してカップリングする。０．１５モルの塩化ナトリウ
ム、０．０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４
中のグラスミンーアガロース（Ｑ、９ｍ１）の１０：１
懸濁液を、ｓｃｕ−ＰＡ試料（０、１ｍｌ）と混合し、
そして２０℃において１時間おだやかに回転する。プラ
スミン−アガロースを１１０００Ｘで２分間遠心するこ
とによって除去し、そして上澄みをフィブリン板のアッ
セイによって試験する。

蛋白質濃度をロウリイ（Ｌ　ｏｗｒｙ）の方法に従って
測定したＥロウリイ（Ｌｏｗｒｙ）　Ｏ、ロウズブロウ
（Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ）　Ｈ、、パール（Ｐａｒｒ）
Ａ、、ラングール（Ｒａｎｄａｌｌ）　Ｒ，７ｔリンフ
エノール試薬を使用する蛋白質の測定、ジャーナル・オ
ン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　　　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、）、１９３．２６５−２７５　（１９５１）
］、アミド溶解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）アッセイは、
合成基質ｐｔｒｏ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡ、　Ｓ　−２４４４の加水分解速度、を測定するこ
とによって実施する［クラエソン（ＣＪａｅｓｏｎ）　
Ｇ　、　、７リバーガー（Ｆ　ｒｉｂｅｒｇｅｒ）　Ｐ
　、　、ノス（Ｋｎｏｓ）Ｍ、、エリクソン（Ｅ　ｒｉ
ｋｓｓｏｎ）　Ｅ　、　、血漿、腺のカリクレインおよ
びウロキナーゼ中のプレーカリクレインの決定方法、ヘ
モスタシス（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、１９７８；７
：７６−７８１゜ 免疫吸収−アミド溶解アッセイ（ＩＡＡ）は、コルチ（
Ｃｏｒｔｉ）　Ａ、　、ノリ（Ｎｏｌｌｉ）　ＭＬ、、
カツサニ（Ｃａｓｓａｎｉ）　Ｇ、　、新しい免疫吸収
アミド溶解アッセイ（ＩＡＡ）による−本鎖および二本
鎖ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターの示差
的検出、トロム・ヘマスタス（Ｔ　ｈｒｏｍＨａｅｍｏ
ｓｔａｓ）　ｌ　９８６．５６：４０７−４１０、に記
載されるように実施する。このアッセイは、２つの蛋白
質の抗原性質および酵素性質の両者を利用して、イムノ
アッセイの選択性と酵素活性のアッセイの特異性とを結
合する。　　　　　別のアッセイにおいて、２つのタイ
プのモノクローナル抗体を使用する： ａ）タンパク質の触媒部分またはクリングル（例えば、
ＭＡＢ　　ｃＤ、またはＤＣ，）を認識しないで、ＧＦ
Ｄドメインを含むタンパク質領域を認識するモノクロー
ナル抗体、 ｂ）酵素活性を妨害しないでかつＧＦドメインを含む領
域（例えば、上の説明において引用したもの）を認識し
ないで、タンパク質触媒ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体。

ＧＡＳＧＡは上のａ）のモノクローナル抗体に結合する
が、ｂ）のＭＡＢ類に結合し、これに対し、ｓｃｕＰＡ
／１ｃｕＰＡは両者の系列のＭＡＢ類に結合する。ＧＡ
ＳＧＡＳＡＴＦおよびｓｃｕＰＡ／１ｃｕＰＡはクリン
グルを認識するＭＡＢｌ例えば、ＭＡＲ５Ｂ４に結合す
る。

１．６．３−逆相ＦＰＬＣ 逆相クロマトグラフィーは、ｐｒｏ　−ＲＰ　ＣＨＲ５
／１０逆相クロマトグラフィーのカラム（微小多孔質、
微小シリカ、結合したＣｒ／、Ｃａ基をもつ）を使用す
る、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ　　ＰｒｏｔｅｉｎＬ　１ｑｕ
ｉｄ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）系［７アーマ
シア・ファイン・ケミカルス（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　
　Ｆ　ｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）〕中で実施する
。溶離用緩衝液：緩衝液Ａ、氷水中０．１％のトリフル
オロ酢酸、および緩衝液Ｂ１アセトニトリル中の０．１
％のトリフルオロ酢酸；溶離モード：１００％のＡｌ２
Ｏ分間、Ａ中の０〜６０％のＢの直線の勾配、６５分間
、１００％の８１２５分間；流速０．３ｍｌ／時間。

１．６．４−電気泳動の手順 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）は、ラエムミ（Ｌ　ａ６ｍｍｌｉ）ＵＫ［バ
クテリオファージＴ４のヘッドのアセンブリーの間の構
造蛋白質の開裂、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　　Ｉ　
　９７０、２２７　　：　　６８０−６８５コに従い、
ゲルスラブ１−５Ｘ１２０Ｘ１５０ｍｍ中で実施する。

スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）および分離のゲルは
、それぞれ、３％および１２．５％のアクリルアミドを
含有した。分子量決定のための商業的に入手可能な電気
泳動カリブレイションキットのマークー蛋白質（アンホ
リン類）［７アーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）］を
、各ゲル中で展開する。２−メルカプトエタノールを還
元剤として使用し、そしてクーマツジ−ブリリアントブ
ルーＲ２５０をゲルの着色に使用する。異なるアクリア
ミド含量をもつゲルを使用するとき、それは一般にカッ
コの間で示す。イムノブロッティングは本質的に知られ
ているように［参照、サレルノ（Ｓ　ａｌｅｒｎｏ）Ｇ
ｏ、ベルブ（Ｖｅｒｄｅ）　Ｐ　、　、ノリ（Ｎｏｌｌ
ｉ）　ＭＬ１コルチ（Ｃｏｒｔｉ）　Ａ、　、スゾッツ
（Ｓ　ｚｏｔｓ）Ｈ８、メオ（Ｍｅｏ）　’ｒ、　％　
ジョンソン（Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）Ｊｏ、ブロック（Ｂｕ
ｌｌｏｋ）　Ｓ、　、カッサニ（Ｃａｓｓａｎｉ）　Ｇ
、　、ブラシ（Ｂｌａｓｉ）　Ｆ、　、ヒトウロキナー
ゼに対するモノクローナル抗体は一末鎖ブローウロキナ
ーゼ前駆体を同定する、プロシーデインシス・オン・ナ
ショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、１
９８４．８１：１ｌＯ−１１４１、モノクローナル抗体
を使用して実施し、このモノクローナル抗体はＧＦＤを
含有する領域を認識しないか、あるいはそれに結合しな
いもの、例えば、Ａ−鎖を認識しないでｕＰＡ　　Ｂ−
鎖を認識するもの、例えば、へりオン（Ｈｅｒｉｏｎ）
ら、バイオサイエンス・リポート（Ｂ　１ｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ）Ｌ　　８８５−８９２　　（
１９８１）、サレルノ（Ｓ　ａｌｅｒｎｏ）　Ｍ　、　
Ｇ　、ら、プロシーデインダスーオン・ナショナル・ア
カデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、１９８
４．８１，１１０−１１４、またはカルトフト（Ｋａｌ
ｔｏｆｔ）ら、プロシーデインシス・オン・ナショナル
・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｔ、　）　ＵＳＡ、１
９８２．７９．３７２０−３７２３に記載されているも
の、または「クリングル」領域、例えば、ＭＡＲ５Ｂ４
においてのみ八−鎖に結合するモノクローナル抗体であ
る［上を参照、ノリ　（Ｎｏ　　Ｉ　　１　　ｉ）　　
ら１　。

１．６．５−ＧＡＳＧＡ類の精製 ＧＡＳＧＡは、細胞培養上澄み液から、Ａ４３１１１１
瘍細胞上澄み液からのＡ４３ｌ−ｕＰＡの晴製について
前述したように、免疫クロマトグラフィーおよびイオン
交換ＦＰＬＣによって精製する［コルチ（Ｃｏｒｔｉ）
　Ａ、ノリ（Ｎｏｌｌｉ）　Ｍ、Ｌ、、ソフィンチニ（
Ｓ　ｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ）　Ａ　、　、カッサニ（Ｃ
ａｓｓａｎｉ）　Ｇ、　、ヒトＡ４３１細胞からの一末
鎖つロキナーゼ型プラスミノゲンアクチペーター（ブロ
ーウロキナーゼ）の精製および特徴づけ、トロンボシス
・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）　ｏ　ｌ　９８６．５６．２
１９−２２４］。八−鎖に結合しないでｕＰＡ　　Ｂ−
鎖に結合するモノクローナル抗体を有するアガロース変
性マトリックス［例えば、へりオン（Ｈａｒｉ。

ｎ）ら、バイオサイエンス・リポート（Ｂ　１ｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ）　３．３７３−３７９　
（１９８３）に記載されているＭＡＢ　　ＡＡＵ２］　
は、０．１５モルの塩化ナトリウム、および１％のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を含有する０、
０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４と平衡化
する。カラムに２リツトルの細胞上澄み液を５０ｍ１／
時間の流速で４°Ｃにおいて装入し、次いで平衡化緩衝
液で洗浄する。脱着を１モルの塩化ナトリウムおよび１
％のＰＥＧを含有する０゜ｌモルの酢酸で実施する。す
べての分画をＩＡＡによって実施しく参照、１．６．２
）ＧＡＳＧＡを含有する分画を集め、それらの含量に従
ってプールし、さらに精製し、ＦＰＬＣ中のイオン交換
クロマトグラフィー（急速タンパク質液体クロマトグラ
フ（−）系（７エーマシア・ファイン・ケミカルス、ス
ウェーデン）により、０．５モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ４で前もって平衡化したＭｏｎｏ　　Ｓ　　Ｈ
Ｒ１５カラム（狭い分子量分布をもつ親水性樹脂に基づ
く強イオン交換体；帯電した基は−ＣＨ，Ｓｏ、Ｈであ
る）を使用して濃縮する。試料は、一般に、希釈した水
で２倍に希釈して、イオン強度を減少し、次いでカラム
に装入する。平衡化緩衝液で洗浄した後、結合したタン
パク質を緩衝液Ａ（０，０５モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ４）およびｂｆ（１モルの塩化ナトリウム、０
．０５モルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）の塩／ｐＨ直線
勾配の混合物で、Ａ中の３０〜７０％のＢで５０分、次
いで１００％のＢで２０分、６０ｍ　ｌ／時間の流速で
溶離する。酵素的に活性なＧＡＳＧＡおよび酵素的に不
活性な、プラスミン活性化可能なＧＡＳＧＡｖｃ原の細
胞上澄み液含量を、免疫吸着−アミノ分解アッセイによ
って測定する（ＩＡＡ）（参照、１．６．２）。

最終生成物中の酵素的に活性なＧＡＳＧＡは、合計の約
９５％であった。ＧＡＳＧＡの逆相ＦＰＬＣ分析は、２
８０ｎｍにおいて吸収の単一のピークを与えた。

あるいは、上の手順は、コルチらによって記載されるセ
ファローズ（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　−Ｍ　Ａ　８　
５Ｂ４マトリツクスである親和マトリックスで実施する
（上を参照）。精製の効能は、上に報告したものに類似
する。

実施例ＥＯ ヒトゲノムライブラリー バクテリオファージラムダシャロン２８中のヒト遺伝子
ＤＮＡのライブラリーは、この分野において知られてい
る技術によって調製する［参照、ヒエター（Ｈ１ｅｔｅ
ｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　　Ｖｏｌ、　　２２．１９７−２０
７　（１９８０）およびマニアチスら］。組換えラムダ
リゼイトをＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株ＬＥ３９２上で滴
定する（マニアチスら、５０４ページ）。ファージの滴
定ならびにファージライブラリーをニック翻訳したグロ
ーブでスクリーニングするための技術は、また、この分
野において知られており　［参照、例えば、マニアチス
ら）そして次の実験において実質的にそのまま適用する
。スクリーニングのため、リゼイトの１０００倍の希釈
物の１０マイクロリツトルを、ｌＯミリモルのＥ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ１２　　ＬＥ　　３９２の２．５倍の濃縮培
養物上に吸着させ、そして３７℃で２０分間インキュベ
ーションする。７ｍｌの０．７％のアガロースを添加し
、混合物全体をＮ２ＭＭＣ寒天を含有する１５０ｍｍの
プラスチック板（カゼインのＡ型加水分解物　１０ｇ／
ｌ；ＮａＣ１５ｇ／ｌ；酵母エキス　５　ｇ／　ｌ　；
カサミノ酸　１ｇ／ｌ；オヨびＭｇ５ｏ４−７Ｈｚ０　
２ｇ；ｐＨ７，５４℃調節した；参照、マニアチスら）
上に層状に配置する。リゼイトの１Ｏ−３希釈物の合計
０．４１ｍ１を使用す、合計４１枚の板である。１日の
インキュベーション後、平均１．５Ｘ１０’のプラーク
／板が観測される。４１枚の板中に観測された合計６Ｘ
ＩＯ’のプラークはすぐれた表示である。各板のすべて
のプラークを２枚のニトロセルロースフィルター［シュ
レイチャー・アントシュネル・カンパニー（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ　　＆　　５ｃｈｎｅｌｌ　　Ｃｏ、）］に
移す。フィルターを乾燥し、洗浄し、真空ベーキングし
、そして通常のように予備ハイブリダイゼーションする
（参照、マニアチスら）。ハイブリダイゼーションは、
ヒトウロキナーゼｃ　ＤＮＡから分離したＤＮＡ断片か
ら成るニック翻訳したプローブを使用して実施する［ベ
ルブ（Ｖ　ｅｒｄｅ）Ａ、ら、プロシーデインダス・オ
ン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）
ＵＳＡｘ８１ｓ４７２７−４７３１　（１９８４）］。

Ｅｏ、１−二ック翻訳 プラスミドｐＨＵＫ−Ｉ［ベルブ（Ｖｅｒｄｅ）　Ａ。

ら、グロシーデインダス・オン・ナショナル・アカデミ
−・オン・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　　　Ｓｃｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ１８　１、４７
２７−４７３１　（１９８４）］は、ヒトウロキナーゼ
のためのｍＲＮＡに対して相補性の組換えインサートを
含有する。Ｐｓｔｌ制限酵素で処理して切断し、アガロ
ースゲルの電気泳動によって分離し、対応するゲル領域
を切出し、そして電気溶離（参照１゜５．７）によって
ＤＮＡ断片を回収した、１．５ｋｂのＰｓｔｌ断片は、
ヒトウロキナーゼｍＲＮＡの解読領域の約７５％を含有
する［ベルブ（Ｖ　ｅｒｄｅ）　Ａ　、ら、プロシーデ
インダス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイ
エンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　
　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ１８１．４７２７−４７３１　　（
１９８４）］。この１．５ｋｂのＰｓｔＩ断片（５，０
マイクログラム）の均一な標識付けは、２００マイクロ
Ｃｉのα３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびα”−ｄＧＴＰの各々
の存在下にベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−（Ｂ　ｅ
ｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）のニック翻訳キットを使用して実施する
（参照、マニアチスら）。

標識したＤＮＡの収量は１．８−２．９Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃ
ｐｍ／マイクログラムである。

Ｅｏ、２−ｕＰＡ遺伝子陽性ファージの分離フィルター
の４１の対を、ニック翻訳したＰｓｔ−■断片とハイブ
リダイゼーションする。８フイルターの群を、単一のプ
ラスチックのエンベロープ中の４０ｍ１のハイブリダイ
ゼーション溶液中で約１０　’ｃｐｍの標識したＤＮＡ
とハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーショ
ンは４２℃において１７ヒト２ＸＳＳＣ，０，１％のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で実施する（マニア
チスら、４４７ページ）。フィルターを２ＸＳＳＣ０，
１％のＳＤＳ中で１５分間室温において４回洗浄し、モ
してｌＸ５ｓｃ　　Ｏ，，１％のＳＤＳ中で２時間６８
°Ｃにおいて１回洗浄する。乾燥後１．フィルターをＸ
線フィルム（コダック）に１２〜２４時間露光し、そし
て現像する。このスクリーニングから、両者の反復実験
のフィルター（３枚）上に同一の−に陽性のハイブリダ
イゼーションスポットを与えることがわかったプラーク
を、小さい体積のＮ２ＭＭＣブロス（マニアチスら〕で
取り上げ、異なる希釈でＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｌ　３
９２を感染するために使用し、そしてＮＺＹＭＣ−寒天
のｌｏａｍの板上に広げる。次いで、５００〜５０００
プラークを与える板を、選択し、そして再スクリーニン
グする。これらのプラークを反復実験のニトロセルロー
スフィルター［シュレイチャー・アン、ド・シュネル・
カンパニー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　＆　　５ｃｈｎ
ｅｌｌ　　Ｃｏ、　）　］上に移し、そしてフィルター
を処理し、そして前述のヒ）ｕＰＡ　　ｃＤＮＡのニッ
ク翻訳した１、５ｋｂのＰｓｔ−１断片とハイブリダイ
ゼーションする。実際に、すべてのプラークは、約１０
’の濃縮因子（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　　ｆａｃｔｏｒ
）で、陽性のハイブリダイゼーションシグナルを与える
。３つの陽性のプラークの単一のプＬ−アク分離物を、
ラムダ−ｕＰＡ−１，ラムダ−ｕ　Ｐ　Ａ　−２および
ラムダ−ｕＰＡ−３と命名した。

ＥＯ０３−大規模のファージの調製 大規模培養リゼイトを使用してプラークをＥ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＬＥ　　３９２上で増幅し、フ
ァージを塩化セシウム中の反復したバンディング（ｂａ
ｎｄｉｎｇ）により分離し、マニアチスら、第３章に記
載される手順に従い、水性相をフェノールで抽出し、次
いでクロロホルム／イソアミルアルコール（２’４：ｌ
）で抽出し、そして水性相からＤＮＡエタノール沈殿す
ることにより精製する。

実施例Ｅ１ 本質的にＥｏ、３におけるようにして得られたラムダ−
ｕＰＡｌの２００マイクログラムを、８０マイクロリツ
トル中において３０ＵのＳ　ａｍ　１で２５°Ｃにおい
て１時間消化する。この反応をＥＤＴＡ　（最終濃度５
０ミリモル）で停止し、そして０．８％のアガロースゲ
ルを含有する臭化エチジウム上で１００Ｖで１０　ｃｍ
　　ｃｏｍｂを使用して電気泳動する。次いで、ゲルを
紫外線で分析し、第２の最も遅いバンド、ヒトｕＰＡ遺
伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有
する、約７．３ｋｂのＳ　ａｍ　Ｉ断片をゲルから切出
す。含有されるＤＮＡを、１．５．７に記載するように
、電気溶離し、そして精製する。

Ｅｌ、２−ベクターＤＮＡの調製 Ｒ３ＶプロモーターおよびｐＢＲ３２２誘導アンビシイ
ン抵抗性および複製起源を含有するＲ３Ｖ　−ｎｅｏ誘
導断片を、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化、充填、Ｈｐａｌ消
化、ＣＩＰ処理およびアガロースゲル上の断片分離によ
って調製する。

さらに詳しくは、Ｒ５Ｖ−ｎｅｏベクターを次のように
修飾する（参照、第２図）。

Ｅ　１．２−１−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉの消化２０マイク
ログラムのＲＳ　Ｖ　−ｎｅｏプラスミドＤＮＡを、２
０マイクロリツトル中で８０ＵのＨｉｎｄｌｌｌで１時
間３７°Ｃで完全に消化する。

制限酵素を加熱不活性化し、次いでこの混合物を等体積
の７エノール：クロロホルムで抽出し、まなん５０マイ
クログラムのｔＤＮＡ　（１，５，３）を添加してＤＮ
Ａを再沈殿させ、２０マイクロリツトルのＴＥ中に再溶
解する（マニアチスら）。

Ｅｌ、２．２−充填およびＨｐａ　ｒの消化上で調製し
たオープンＢベクターの突起末端を、２５マイクロリツ
トル中のＩＵのクレノー断片ポリメラーゼ■とともにＤ
ＮＡを１時間３７°Ｃでインキュベーションしくマニア
チスら、ｌ１３ページ）およびそれを１．５．１および
１．５．３に示すように精製する。次いで、直線化した
平滑末端のベクターＤＮＡを４０マイクロリツトル中で
８０ＵのＨｐａ　Ｉで１時間３７°Ｃで切離し、そして
同一方法で精製する。これらの操作はネオマイシン抵抗
性遺伝子を切断し、プロモーター領域とポリアデニル化
部位との間で開いたＲ５Ｖ−ＬＴＲを有しかつ複製起源
およびプラスミドｐＢ　Ｒ３２２から誘導されたアンピ
シリン抵抗遺伝子を含有する、直線化平滑末端の３．５
ｋｂの長さのＤＮＡ断片を残す（第２図）。

Ｅｌ、２．３−ＣＩＰ処理 ＤＮＡを１．５Ｕの仔つシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）
で５０マイクロリツトルの反応媒質（最終体積）中でル
理して、ＤＮＡ末端からの５′ホスフエートを除去する
。この酵素は引続いてエチレンビス（オキシエチレンニ
トリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）（最終濃度）の添加および
６８℃における処理により不活性する（参照１．５．４
）。

Ｅｌ、２．４−断片の精製 ＤＮＡ断片を０．６％のアガロースゲル調製様ゲルを、
１．５．ンに示すように、使用して分離する。３．５ｋ
ｂのバンドを含有するゲルの部分を切出し、そしてＤＮ
Ａ断片を電気溶離しく１．５゜７）、得られた混合物を
適当な塩濃度に調節し、モしてＥｌｕｔｉｐ−Ｄカラム
［シュレイチャー・アンド・シュネル・カンパニー（Ｓ
　ｃｈｌａｉｃｈｅｒ　　＆５ｃｈｎｅｌｌ　　Ｃｏ、
　）　］で精製する。溶離後、エタノール、Ｎａ−アセ
テートおよび担体ｔＲＮＡをＤＮＡ溶液に添加し、そし
て１．５．３に記載するように、ＤＮＡを沈殿させそし
て２０マイクロリツトルのＴＥ中に再溶解する。

３ＵのＴ４　　ＤＮＡリガーゼおよび２．５マイクロリ
ツトルのｔＯＸ緩衝液（マニアチスら、２４６ページ）
を、３マイクログラムの脱リン酸化ＤＮＡベクター（上
のＥ、１．２におけるように調製した）および７．５マ
イクログラムｎｏ７．３ｋｂのｕＰＡ断片（上のＥ、１
．１におけるように調製した）に添加する。２５マイク
ロリツトルの反応混合物を１４℃で１６時間インキュベ
ーションしく参照１．５．５）そして１００マイクロリ
ツトルのＨＢＩＯＩ　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　コンピテント
細胞を形質転換するために使用する（参照１．５．８）
。

バクテリアを、５０マイクログラム／ｍｌのアンピシリ
ンを含有するＬＢ寒天平板（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵
母エキス５　ｇ／　１．　ＮａＣｌ　１０　ｇ／　１、
水性水酸化ナトリウムでｐＨ７，５に調節した）上で３
７°Ｃにおいて１夜選択する。分離したクローンを取り
上げ、５ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ中で増殖し、そし
て標準のミニプレプ分析によって処理゛する（１．５．
９）。精製したプラスミドＤＮＡの制限パターンを研究
して、ベクターフレーシフ中のｕＰＡ遺伝子の正しい向
きを確立する。正しい向きを有するこれらのグラスミド
の１つをＲ５Ｖ−ｕＰＡと表示し、分離し、そしてそれ
以上の実験において使用する（第２図）。

Ｅｌ、４．１−）ランスフエクション 上で得らｔｔ／：ＲＳＰ−ｕＰＡを使用して哺乳動物細
胞をトランスフェクションする。使用した手順は、ＧＡ
ＳＧＡベクターを取り扱うとき、したの実施例２に詳述
されている。

Ｅ、１．４．２−大量培養 上に概説したような最高の産生性形質転換細胞を、さら
に再びクローニングし、そルて実施例２の対応する節に
おいて報告する技術に従って大量発酵で培養する。

Ｅ、１．５−ｕＰＡの定量 前述のように培養した細胞系によるｕＰＡの産生は、前
述のようにして得られたＧ４１８抵抗性について直接に
、あるいはこの分野において知られて居るように、カゼ
イン／アガロース／プラスミノダン平板上にＧ４１８抵
抗性細胞の上澄み液の系統的希釈物をスポツティングし
、ＰＡの半径方向の拡散を評価することにより、シュマ
ーカー（Ｓ　ｃｈｕｍａｒｋｅｒ）　Ｇ　Ｆ　Ｂおよび
シル（Ｓｈｉｌｌ）Ｗ。

Ｂ１、アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）　、４８．９．１９７２、およ
びＢ　ｉｅｖｕｍ　　ＯＪ　　ｅｔ　　ａｌｓ　Ｑ　ｕ
ａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩ　ｍｍｕｎｏｅｌｅｃＬｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ、　Ｓ　ｃｎａｄｉｎａｖｉａｎ　　Ｊ
　。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　　５ｕｐｐ１．　２　、　Ｎ　、
　Ｈ、Ａｘｅｌｓｅｎｅｄ、　、　Ａａｓ　　ａｎｄ　
　Ｗａｈｌ、　０ｓｌｏ、　　１９７５　。

８２−８３に実質的に記載されているように、カゼイン
／プラスミノダン含有寒天ゲル中で、−重鎖の場合にお
いてプラスミン活性化後、定量する。

対応する一本鎖の形態に対する活性化二本鎖ＵＰＡの分
析は、ＩＡＡによって実施する（参照、１、．６．２）
。

実施例２ ＧＡＳＧＡ発現ベクターの構成 ＥＯまたはＢ２のＧＡＳＧＡを得るために、プラスミド
Ｒ３ＶｕＰＡ　（参照Ｅ、１．１．３）をイントロンＣ
（エクソンＩＶから５’　、ＥＧＦ様ドノドメイン解読
領域部分を含有する）中に、あるいはイントロンＤ（エ
クソンＩＶから３′）中に独特部位を挿入することによ
って修飾した（第３Ｂ図参照）。得られたプラスミド、
ＲＳＶｕＰＡ、〉、およびＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａｓ＞ｘ
　（第３Ｃ図）を使用して、エクソンのシャフリング（
ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によってヒトｕＰＡ　　ＯＲＦを
突然変異化させることによって、２つのＧＡＳＧＡ発現
ベクターを得る（第３Ｄ図）： ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯ、エクソン■ｖを含有するＥＧＦ様
ドノドメイン失されている： ＲＳＶｕＰＡ−Ｅ２、エクソンＩＶは複製されている。

Ｅ、２．１−Ｒ５ＶｕＰＡｉ＞ｘの構成５マイクログラ
ムのＲＳＶｕＰＡ　　ＤＮＡを、別の反応器中でＢｇｌ
ＩＩで部分的に消化し、ｌＯ〜０．１２Ｕの範囲の酵素
を３７°Ｃで３０分間１２．５マイクロリツトルの緩衝
液（最終体積）中で使用して最も適当な反応条件見いだ
した。反応管をドライアゴース／エタノール浴中に入れ
、ＥＤＴＡをｌＯミリモル（最終濃度）に添加し、そし
て最後に７０℃に２０分間加熱することによって酵素を
不活性化する。容管からの試料をミニゲル上で分析する
。すぐれた結果は、３．３３〜１．１１Ｕの酵素で消化
することによって見いだされた。

これらの反応条件を選択し、そして５マイクログラムの
ＲＳＶｕＰＡ　　ＤＮＡに適用しｔｉ。このようにして
得られた５′突起末端は、２０マイクロリツトル（最終
体積）中でｄＮＴＰ　（最終濃度、各々１ミリモル）の
存在下に、２ＵのＴ４　　ＤＮＡ　ポリメラーゼを使用
して別々に充填した。次いで、７０°０に１５分間加熱
することによって、ポリメラーゼを不活性化する。２マ
イクログラムのホスホリル化Ｘｈｏｌりンカーを添加し
、そして１０％のＰＥＧ　ｌ　５００およびＩＵのＴ４
　　ＤＮＡ　　リガーゼを含有する８０マイクロリツト
ルの緩衝液（最終体積）中で８°Ｃにおいて１６時間プ
ラスミドに結合する。加熱不活性化後、８マイクロリツ
トルのＸｈｏｌ緩衝液、１マイクロリツトルのＸｈｏＩ
および１１マイクロリツトルの水中の８０Ｕを添加し、
そしてＤＮＡを３７℃で３時間消化する；次いで、酵素
を加熱不活性化し、そしてＤＮＡを沈澱させ、５マイク
ロリツトルのＴＥ中に再懸濁させ、１５°Ｃにおいて３
時間ＵのＴ４　　ＤＮＡ　　リガーゼで５０マイクロリ
ツトルの緩衝液中で結合する。この混合物の２．５マイ
クロリツトルを使用して、Ｅ、　　Ｇｏｌｔ　　ＨＢ１
０１能力細胞を形質転換し、そしてアンピシリン抵抗性
コロニーをミニプレブ分析によってスクリーニングする
（１．５．９）。独特Ｘｈｏ１部位に転化されたエクソ
ン■ＶおよびＶの間のＢｇＩ１１部位を有するプラスミ
ド（この修飾された断片は第３′Ｄ図において右側に示
されている）を、単離し、そしてＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａ
ａ＞ｘと命名する（以後、Ｉ）Ｂ＞Ｘと呼ぶ）。

Ｅ、　　２．　２−Ｒ５ＶｕＦ’Ａｐ＞ｓの構成プラス
ミドＲＳＶｕＰＡｓ＞ｘは、Ｒ３Ｖｕ　ＰＡをＰｓｔｌ
で部分的に消化することによって得る。

３７°Ｃで１時間後切断されないＤＮＡのほぼ５０％を
残す制限条件を、５０マイクログラム１５０マイクロリ
ツトルの゛消化（０，０６２５Ｕ／マイクログラム）に
規模を大きくシ、そして、ＤＮＡ沈澱後、５′突起末端
を２ＵのＴ４　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼで３７℃にお
いて１０分間５０マイクロリツトル（最終体積）中で処
理することによって平滑末端とする。次いで、５マイク
ログラムのホスホリル化５ａｌｌリンカ−ＤＮＡを添加
し、８℃において１６時間１００マイクロリツトル（最
終体積）中で２ＵのＴ４　　ＤＮＡ　　リガーゼおよび
１０％のＰＥＧ１５００で結合する。リガーゼを加熱不
活性化し、そしてＤＮＡを８０Ｕの５ａｉ１で３７°Ｃ
において３時間消化する（３００マイクロリツトルの緩
衝液の最終体積）。最後に、得られたＤＮＡを０．７５
％のアガロースゲル上に装入し、そして消化しないおよ
び消化したプラスミドＤＮＡ　（各々５００　ｎ　ｇ）
を使用して並行に展開する。直線化したマーカーに近接
して展開するゲル部分を切り出し、電気溶離し、精製し
く１．５．７）、５マイクロリツトルのＴＥ中に再懸濁
し、そして１５℃において４時間２ＵのＴ４　　Ｄ、Ｎ
Ａ　　リガーゼでｌＯマイクロリットル中で自己結合さ
せる（マニアチスら）。２．５マイクロリツトルを使用
してＥ、　　Ｇｏｌｉ　　ＨＢ１０１能力細胞を形質転
換し、そしてアンピシリン抵抗性コロニーをミニプレプ
分析によって選択する（１．５．９）。エクソンＩＩＩ
およびＩＶの間に位置するＰｓｔ１部位の代わりに独特
５ａ１１部位を有するプラスミド（この修飾された断片
は第３Ｃ図の左側に示されている）を、単離し、そして
ＲＳＶｕＰＡｐ＞ｓと命名する、以後ｐＢ＞Ｓと呼ぶ。

　　Ｅ、２．３−ＲＳＶｕＰＡｌｌ＞、からのＮｄｅｌ
／ＸｈｏＩ　　ＤＮＡ断片の調製１５？イクログラムの
ＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａｍ＞ｘ　　Ｄ　ＮＡを、４０Ｕの
ＮｄｅＩで３時間７３℃において４０マイクロリツトル
（最終体積）中で完全に消化する。この体積を５マイク
ロリツトルの１０×緩衝液（マニアチスら）、ＩＵのＣ
ＩＰおよび水で５０マイクロリツトルにする。ＤＮＡを
３７°Ｃで６０分間リン酸化し、フェノール：クロロホ
ルムで１回抽出し、次いで沈澱させ、そして２０マイク
ロリツトルのＴＥ中に再懸濁する（マニアチスら）。次
いで、直線化したプラスミドを２５マイクロリツトル中
で４０ＵのＸｈｏｌで完全に消化し、そして調製用０．
７５％のゲルで展開する（１．５．７）。形成する２本
のバンドを分離し、電気溶離し、１．５．７に記載する
ように精製し、そして５マイクロリツトルのＴＥ中に再
懸濁する。

Ｅ、２．４−ＲＳＶｕＰＡｐ＞ｓからのＮｄｅＩ／５ａ
ｌｌ　　ＤＮＡ断片の調製 １５？イクログラムのＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａ　ｐ＞　ｓ
　　Ｄ　ＮＡを、４０Ｕの５ａｌＩで３７℃において６
０分間完全に消化する（最終体積、４０マイクロリツト
ル）。反応体積を５マイクロリツトルのＩＯＸ緩衝液、
ｌＵのＣＩＰおよび水で５０マイクロリツトルにし、Ｄ
ＮＡを３７℃で６０分間リン酸化し、前の節に記載する
ようにして精製し、２５マイクロリツトル中で４０Ｕの
Ｎｄｅｌで３７℃において５時間完全に消化し、そして
２つの生ずるＤＮＡ断片を分離し、そして１．５．７に
記載するようにして精製する。

Ｅ、２．５−Ｒ５ＶｕＰＡ−ＥＯの構成上で得られたＲ
　Ｓ　Ｖ　ｕ　Ｐ　ＡＰ＞ｓからの１．５ｋｂの断片の
１マイクログラムを、ＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａａ〉８から
の８．６ｋｂのＸｈｏＩ／ＮｄｅＩ断片の２６５マイク
ログラムと、２Ｕのリガーゼで１５℃において１６時間
結合する。５マイクロリツトルのこの混合物を使用して
、Ｅ、　　Ｃｏ１１　　ＨＢＩＯＩ能力細胞を形質転換
し、そしてアンピシリン抵抗性コロニーのうちで、プラ
スミドＲＳＶｕＰＡ−ＥＯを単離し、ここでｕＰＡ　　
エクソンＩＶはイントロンＣおよびＤの融合によって欠
失されており、そしてＳｅｔ、およびＡＳＩ）ａｓに関
するコドンの残基塩基対の融合によって発生したチロシ
ン単位はＰｒｏ、およびＩ−ＶＳ４＠の間に挿入されて
いる。

Ｅ、２．６−ＲＳＶｕＰＡ−Ｈ２の構成ＲＳ　Ｖ　ｕ　
Ｐ　Ａｓ＞ｘからの１マイクログラムの２．２ｋｂのＮ
ｄｅｌ／Ｘｈｏｌ断片を、Ｒ３Ｖｕ　Ｐ　Ａ　ｐ＞　ｓ
からの２マイクログラムの９．１ｋｂの断片に結合し、
２Ｕのリガーゼとともに１５℃において２０マイクロリ
ツトル中でインキュベーションする。この混合物の５マ
イクロリツトルで形質転換したＥ、　　Ｇｏｌｉ　　Ｈ
ＢＩＯＩ能力細胞からのアンピシリン抵抗性コロニーを
ミニフレプ分析によりスクリーニングしてプラスミドＲ
３ＶｕＰＡ−Ｅ２を単離し、ここでエクソンＩＶおよび
７ランキングイントロンの一部は複製されており、そし
て２つのＥＧＦ様ドノドメイン合コドンによってつくら
れたスレオニンによって接続されている（第３Ｄ図、右
側）。

Ｅ、２．７−ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯを構成する別の方法 、ＥＯＧＡＳＧＡを構成する別の方′法は、プラスミド
、例えば、Ｒ５ＶｕＰＡｉ＞８からエクソンＩＩＩおよ
びＩＶを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびｘ−ｈｏＩで二重消化
することによって、クリップアウトし、そしてそれらを
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片と置換することであり、
ここでＰｓｔ１部位はＸｈｏｌを接合するように便利に
修飾される（参照、第１３図）。簡単に述べると、次の
手順によってプラスミドｐ７１から２７５ｂｐの断片が
得られるニ ー全体のＰｓｔｌ消化ニ ーＴ４　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼによる末端の修飾、
および５ａｌｌリンカ−の添加； −Ｈ４ｎｄｌｌ！消化およびＣＩＰ処理および引き続＜
５ａｌＩ消化ニ ー断片のゲル精製。

この断片は次の手順によってＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａ　ａ
＞、から得られたベクター中に挿入したニ ーＸｈｏＩ消化およびＣＩＰ処理； −Ｈ１ｎｄｌｌＩ消化； 一ゲル精製。

Ｅ、２．７．１−エクソンＩＩＩ含有、２７５ｂｐ断片
の調製 ４００マイクログラムのプラスミドｐ７１を３７℃にお
いて１時間８００ＵのＰｓｔｌで３５０マイクロリツト
ルの緩衝液中で消化しく１．５゜１）、次いでＤＮＡ分
画を抽出し、そして、沈澱させる（１．５．２および１
．５．３）。０．６９ｋｂの断片を単離し、そして１．
２％のアガロース調製用ゲルで精製する（１．５．７）
。この断片をＴ４　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼで４５分
間３７℃において処理し、次いで酵素を加熱不活性化し
、反応条件を１００マイクロリツトル中のＣＩＰ処置に
調節しく１．５．４）そしてＤＮＡを３０分間３７℃に
おいてＩＩＵのＣＩＰでリン酸化し、抽出し、沈澱させ
、そして５ａｌｌ　　８マー　リンカ−に１６時間１２
℃で結合する。その後、ＤＮＡ分画を４００ＵのＨｉｎ
ｄＩＩＩで３７°Ｃにおいて３０分間２００マイクロリ
ツトルの緩衝液中でＨｉｎｄｌｌｌ消化し、次いでさら
に５０Ｕの前記酵素を添加し、そして反応をさらに６０
分間続ける。次いで酵素を加熱不活性化し、反応条件を
ＩＩｃＩＰを含有する４００ｍ１の緩衝液中′のＣＩＰ
条件に調節し、そしてＤＮＡを３７°Ｃにおいて９０分
間リン酸化する。最後に、ＤＮＡを１８０Ｕの５ａｌｌ
で２００マイクロリツトルの緩衝液（最終体積）中で１
６時間３７°Ｃにおいて消化し、そして得られる２７５
ｂｐのＤＮＡ断片を単離し、そして２％のアガロースゲ
ルで精製する。

Ｅ、２．７．２−Ｒ５ＶｕＰＡＢ）、からのｘｈｏ　１
−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片の調製５０マイクログラム
のＲ３ＶｕＰＡａ＞８プラスミドを３５マイクロリツト
ルの緩衝液中でＵのＸｈｏｌで３７°Ｃにおいて２時間
３０分間消化しく１．５．１）、８００マイクロリツト
ルの緩衝液中でＩＩＵのＣＩＰで３７℃において３０分
間、次いで５０°Ｃにおいて６０分間リン酸化し、そし
て最後に抽出しかつ沈澱させ（１，５，２および１．５
．４）、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで３７℃におイテ１時間完
全にい消化する。形成する９、９ｋｂのＤＮＡ断片を単
離し、そして０．８％のアガロース調製用ゲルの手順に
よって精製する（１．５゜７）。

Ｅ、２．７．３−ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯ−４９の構成 Ｅ、２．７．１において調製した２７５ｂｐの断片およ
びＥ、２．７．２において得られたｖＤＮＡを２：１の
モル比で異なる濃度（それぞれ、はぼ６００ｎｇ／ｍ＋
および６０ｎｇ／ｍ＋）混合し、５ＵのＴ４　　ＤＮＡ
　　リガーゼで１６ｘｃにおいて１００マイクロリツト
ルちゅうで６５時間結合し、次いでＤＮＡ分画を沈澱さ
せ、そして２０マイクロリツトルの水中に再懸濁する。

この溶液のアリコートを使用して、Ｅ、　　　Ｃｏ１１
ＤＨ５能力細胞を形質転換する（１．５．８）。

アンピシリン抵抗性コロニーのうちで、１つを選択して
ミニプレプ分析により期待される制限パターンを有する
ことについて分析し、そしてＲＳＶｕＰＡ−ＥＯ−４９
と命名する（参照、第１４図）。

Ｅ、２．８−哺乳動物細胞中のＧＡＳＧＡの発現 ＧＡＳＧＡ発現ベクターをマウスＬＢ６細胞中でリン酸
カルシウム沈澱技術によってトランスフェクションし、
そして次の手順によってＧＡＳＧＡ産生クローンを分析
するニ ーカゼイン溶解アッセイ、ピペルノーグラネリおよびレ
イヒ（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、ｌ　４８　：　２２３−２
３４．１９７８）、ＰＡ産生クローンを分析しかつ培地
中で選択したＰＡの量を定量するため； 一フィブリン板方法、’Ａｓｔｒｕｐ　Ｔ　、　、　Ｍ
ｕｌｌｅｒｔｚＳ、、アーチーブス・オン・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａ　ｒｃｈ、
　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　ｈｉｏｐｈｙｓ、　）、１
９５２．４０．３４６−３５１１に記載されている； −ＩＡＡ、（参照、１．６．２）、活性化した、二本鎖
ＰＡ類に対する一本鎖の相対量を確立するため； 一レセプター結合アッセイ　［Ｍ、Ｐ、ストツペリ（Ｓ
　ｔｏｐｐｅｌｌｉ）ら、プロシーデインダス・オン・
ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏ
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ。

８２．４９３９−４９４３．１９８５］、エンドテリア
ル（ｅｎｄｏｔｅｌｉａｌ）　ｕ　Ｐ　Ａレセプターと
同一であるかあるいはそれに類似すると考えられるＵ９
３７上のｕＰＡレセプターに結合するＧＡＳＧＡの能力
を評価するため。

Ｅ２．８．１−．１−ランスフエクショントランスフエ
クションの１日前に、細胞［ネズミＬＢ６、コルサロ（
Ｃｏｒｓａｒｏ）　Ｃ８Ｍ　、およびパールソン（Ｐ　
ｅａｒｓｏｎ）　Ｌ　、　Ｍ　、　、ツマチック・セル
・ジエネチクス（Ｓ　ｏｍａｔｉｃ　　Ｃｅｌｌ　　Ｇ
　ｅｎｅｔｉｃｓ）　、７．６０３．１９８１）］を、
ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）　、ストレプトマイシン（
５０マイクログラム／ｌｌｌ１）、２ミリモルのグルタ
ミンおよび加熱不活性化仔ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を
補充したダルベツコ変性イーグル培地［ＤＭＥＭ。

７０−・ラボラトリーズ・・・インコーホレーテッド（
Ｆ　ｌｏｗ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　Ｉ　ｎ
ｃ、　）　］中で約１０’マイクロリツトル／培地２の
濃度で配置する。

トランスフェクシヨンの日に、細胞は対数増殖期にあり
、ＤＮＡ添加の前に３時間再供給する。リン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈法は、形質転換についてのものに本質的
に従う［グラハム（Ｇ　ｒａｈａｍ）およびファン拳デ
ル・ニブ（Ｖａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｂ）、ウィルス学（
Ｖｉｒｏｌ、）　５２．４５６．１９８３］。

リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿は、２モルのＣａＣ１２（
０，２５ｍ１、最終体積）中のＤＮＡ溶液（この場合、
Ｒ５Ｖ−ｕＰＡ、Ｅ　ｌ　、３参照、およびＲ３Ｖ−Ｎ
ｅｏｌＥｌ、２参照、約１対ｌ）を２ＸＨＢＳ　（１３
７ミリモルのＮａＣ１，０，７ミリモルのＮ　１２　Ｈ
Ｐ　０４％　２１ミリモルのＨＥＰＥＳ、４−　（２−
ヒドロキシエチル）−１−ピペリジンエタンスルホン酸
、ｐＨ７，１）（０，２５ｍ１）に添加することによっ
て調製する。次いで、このＤＮＡ共沈混合物を細胞に添
加する。３７℃で３時間後、沈殿を細胞から除去し、こ
れをＤＭＥＭ　（胎児仔ウシ血清を含まない）で２回洗
浄し、１．５のＨＢＳ中のグリセロールの１５％溶液を
添加し、細胞を３７°Ｃで１〜２分間インキュベーショ
ンし、そしてＤＭＥＭ　（胎児仔ウシ血清を含まない）
で洗浄することによってグリセロール、を除去する。

次いで、細胞に上に報告した完全ＤＭＥＭを供給しく細
胞の培養を取扱うとき）そして約３７℃で４８時間放置
し、非常におだやかにトリプシン処理し、そしてＤＭＥ
Ｍ＋　１０％の加熱不活性化ＦＣ５＋５０Ｕ／ｍｌのペ
ニシリン、５０マイクログラム／ｍｌのストレプトマイ
シン、２ミリモルのグルタミン＋０．８マイクログラム
／ｍｌのＧ４１８［ゲネチシン（Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｉｎ
）　、ギブコ（Ｇ　１ｂｃｏ）　］中に約１０’結合細
胞／平板の濃度で配置する。次いで、細胞を約２〜３週
間インキュベーションし、培地を３日毎に交換する。

Ｅ２．８．２−ＧＡＳＧＡ産生クローンりＡＳＧＡクロ
ーンを前述のカゼインまたはフィブリンのアッセイによ
って選択する（Ｅ、２゜８）。カゼイン溶解アッセイは
、培養物を各板について次のように調製したカゼインー
プラスミノゲンーアガロースのオーバーレイで覆うこと
によって実施する： ０．２５ｍ１の無脂肪ドライミルク（８％Ｗ／ｖ１沸騰
する浴中で３０分間加熱する）；−０，５０ｍ１の２Ｘ
ＤＭＥ培地； ＝５０マイクロリットルの７．５Ｕ／ｍｌのプラスミノ
ゲン、０．２２マイクロメートルのフィルターで滅菌し
た； −Ｑ、２ｍｌの５％のオートクレーブ処理した溶液から
のアガロース。

これらの成分を４８℃の浴中に保持したアガロース溶液
に添加し、培地を除去した後、培養細胞上に層状に配置
する。細胞を、湿潤した５％のＣＯ□を含有するインキ
ュベーター内で３７°Ｃにおいてインキュベーションし
、モして２．４および８時間に不透明の層中の透明な区
域の出現について監視する。最高のＰＡ活性を示すクロ
ーンを、はぼ０．５％のＤＭＥを前もって充填したパス
ツールピペットで、それらを吸引することによって取り
上げ、激しく再懸濁し、そして２４水ウエルの平板中に
配置する。次いで、細胞を全面増殖に増殖させ、トリプ
シン処理し、そして同一タイプの平板中に１１５で再配
置する。４８時間後、上澄み液を下に詳述するように試
験する。

フィブリン平板のアッセイを同様な手順で実施するが、
ただし上に列挙した試薬の代わりに、ｌＸＤＭＥ　（上
を参照）中のフィブリン−アガロースの２．５ｍ　ｌ／
ｌ　Ｏ０ｍｍ平板の調製物（参照、Ａｓｔｒｕｐ　　Ｔ
、　、引用しＩ；引例）。

Ｅ２．８．３−ＧＡＳＧＡの定量 ａ）ＰＡの含量を定量するため、ＧＡＳＧＡ発現性クロ
ーンからの上澄み液ならびにＡ４３１細胞からの上澄み
液（陽性の対照）を、前の節に記載するようであるが、
最終のアガロース濃度が１．８％でありかつ各１００ｍ
ｍの平板に５ｍｌを使用して、調製したカセインープラ
スミノゲンーアガロース上のｕＰＡの標準濃度の希釈物
と比較する。パスツールピペットで吸引することによっ
て、穴を規則正しい間隔であける。集めた上澄み液を緩
衝液で系統的にｌ：２で希釈し、そして各希釈物のｌＯ
マイクロリットルを平板に適用する。ｕＰＡの標準の希
釈物をまず水中で２×で調製し、次いで２ｘＤＭＥで約
４００ＵＩ／ｍ＋の最終濃度にｌ：ｌで希釈する。この
溶液から、ｌ：２の系統的希釈物をＤＭＥ中でつくり、
そしてそれらの各々の１０マイクロリツトルを平板に適
用する。ＧＡＳＧＡ産生性クローンを３つの異なるクラ
スにおいて等級つけ、そして標準のｕＰＡ調製物の系統
的希釈物との比較によってＧＡＳＧＡ濃度を推定する。

ｂ）あるいは、Ｇ４１８クローンを計数し、２４ウエル
の平板中に移し、飽和まで増殖させた後、上澄み液をア
ッセイする。ＧＡＳＧＡの有用なレベル（０，５マイク
ログラム／ｍｌより大きい）を立証したクローンを、加
熱不活性化した胎児径ウシ血清を１０％のＤＭＳＯと一
緒に補充した後、液体窒素中に凍結原料として貯蔵する
。これらの細胞は、また、再クローニングして、高い産
生性体を選択し、そしてこれらをまた前述のように凍結
乾燥する。

ＧＡＳＧＡを最高に産生ずるクローンを再クローニング
し、そして大量培養する。ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　　
Ｈａｍｓｔｅｒ　　Ｏｖａｒｙ）を使用する実験の結果
を、下表１に報告する。

Ｅ２．８．４−大量培養 溶解酸素張力、ｐＨおよび温度を自動的に制御する４リ
ツトルの細胞反応器を使用して、上の実施例に記載する
手順に従って得られた最高の生成物転換性クローンの接
種物を増殖する。培地は、５％の加熱不活性化ＦＣＳ、
１ＣＳ上１ミグルタミン、２５Ｕ／ｍｌのペニシリン、
２５マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン、４０
０マイクログラム／ｍｌのＧ４１８および２７Ｕ／ｍｌ
のアプロチニンを含有するＤＭＥＭまたはＤＭＥＭおよ
びＦＩＯ［７０−・ラボラトリーズ・インコーホレーテ
ッド（Ｆ　ｌｏｗ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　
Ｉ　ｎｃ、　）　］、ｌ：１の比、を含有し、２７１Ｕ
／ｍｌのアプロチニン、アルブミン、インスリン、トラ
ンスフェリン、メタツルアミン、クロリン、ビタミン類
および微量金属を補充した血清不合配合物である。細胞
の接種物は、１５０ｃｍ”のフラスコ内で、ＤＭＥＭ＋
　ｌ　０％の加熱不活性化ＦＣ５，２ミリモルのグルタ
ミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０マイクログラム
／ｍ＋のストレプトマイシン、４００マイクロダラム／
ｍｌのＧ４１８中で増殖させ、溶液細胞をサイトデクス
（Ｃｙｔｏｄｅｘ）マイクロキャリヤー［ファーマシア
（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　］で収穫する。

細胞は２．５　Ｘ　ｌ　Ｏ’／ｍｌの最高集団密度に到
達し、そしてｐｒｏ−ｕＰＡを培養に気管を通じて合成
し、そして既知の方法、例えば、線維素溶化またはＩＡ
Ａのアッセイ（１，６，２参照）によってアッセイする
。２０マイクログラム／ｍｌの最高濃度がＩＡＡによ−
る試験によると到達された。

Ｅ２．８．５−活性化ＧＡＳＧＡの定量ＧＡＳＧＡ産生
性クローンまたはｕＰＡ産生性Ａ４３１細胞（陽性の対
照）の培養物中の活性化、二本鎖ＰＡの相対的量を定量
するため、前記培養物からの上澄み液をＩＡＡアッセイ
（１，６，１）において、酵素活性を妨害しないでかつ
ＧＦＤに結合しないで、ｕＰＡ触媒ドメインまたはクリ
ングルを認識するマウスモノクローナル抗体を使用して
試験する。

結果が示すように、一般に、二本鎖の活性化ＰＡの量は
合計のＰＡの２０〜５０％の範囲であり、そして、プロ
テアーゼ阻害剤を生長培地に添加したとき、それは次い
で５％より少なかった。

Ｅ２．９−レセプター結合アッセイ ＧＡＳＧＡ産生性クローンまたはＡ４３１からの上澄み
液を、Ｕ９３７上のｕＰＡレセプターへの放射線標識し
た”’Ｉ−ＤＦＰ−ＵＫの結合について競争する能力に
ついて試験する。

ＰＡ様活性物質を分泌するコロニーをＥ２．８゜２に記
載するようにピックアップし、全面生長に増殖させ、そ
して上澄み液を前述のようにして試験した。高い産生性
クローン（参照、表１）ｉｉよびＡ４３１細胞を別々に
１０’細胞／ｍｌで平板培養する。ＰＡ濃度を、上のＥ
２．８．５に記載さいするように、モノクローナル抗体
を使用して上澄み液の試料について測定する。ｌ：２の
希釈物を培養について使用したのと同一の培地中で調製
して、Ｃｕｂｅｌｌｉｓ　　ａｔ　　ａｌｓジャーナル
・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　　　Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｍ、）、２６１，１５８１９−１５８２２．１
９８６に実質的に記載されているように、レセプター結
合アッセイを実施する。簡単に述べると、２００マイク
ロリツトルの希釈物の各々を使用し　　　　゛て、ｌ−
２ｘｌＯものＵ９３７細胞を再懸濁しく上を参照）、そ
して細胞懸濁液の各々に、約２００００−８００００ｃ
ｐｍ　（約５０ｐＭの最終ｓｃｕ−ＰＡ濃度）に相当す
る量の活性を有するＩ２’Ｉ−ＤＦＰ−ＵＫを添加する
。

代表的な実験の結果を第１３図に示し、そしてこれらが
立証するように、Ｒ３ＶｕＰＡ−ＥＯトランスフェクシ
ョンしたクローンからの上澄み液はｕＰＡレセプターへ
の結合についてヨウ素化ｔｃｕＰＡと競争するこあがで
きない。

Ｅ２．１Ｏ−ＧＡＳＧＡ−ＥＯ産生物の精製アプロチニ
ンの存在下に増殖するＣＨＯ産生性細胞からの上澄み液
を集め、そしてＧＡ　Ｓ　ＧＡ　−ＥＯを１．６．５に
記載するように免疫クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーおよび逆相液体クロマトグラフィーに
よって精製する（１．６．３）。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動によると、９５％より高い）。

−Ｅ２．１１−ＧＡＳＧＡの生化学的および免疫学的特
性づけ 精製したＧＡＳＧＡ−ＥＯは、還元性および非還元性条
件下に約５０ｋＤの見掛けの分子量を示す。プラスミン
による活性化後（１，６，２）、還元した産生物は、、
ｔｃｕＰＡのＢ−鎖として移動する３０ｋＤの鎖および
ｔｃｕＰＡのＡ−鎖より速く移動する２０ｋＤ鎖によっ
て形成された二本鎖のタンパク質である。期待されるよ
うに、イムノプロッティングにより分析すると、ＧＡＳ
ＧＡ−ＥＯはｍＡＢ　　５Ｂ４（ｒクリングル」領域を
認識する）および全体のマウス抗ｕＰＡ血清と反応する
が、ＧＦＤ領域を認識するｍＡＢｓ　　ＤＣ，またはＣ
Ｄ、と反応しない（「調製」参照）。

Ｅ２．１２−Ｎ−末端アミノ酸配列の分析Ｎ−末端アミ
ノ酸配列の分析は、アプライド・バイオシステム（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍ）　４７０型気相
タンパク質配列決定装置を使用して実施して、次の結果
を得た： Ｑ　　　　　　　　　　０ 番号はＧＡＳＧＡ−ＥＯおよびｕＰＡの配列を意味する
ＨｕＰＡ中のＴｙｒｅ、は、Ｒ３ＶｕＰＡ−ＥＯ組み換
えプラスミド中のエクソンＩＩＩおよびＶの間で分けあ
っているコドンの結果として、ＧＡＳＧＡ−ＥＯのＴｙ
　ｒｓにより置換されており（第３図参照）そしてエク
ソンＩＩＩ上に完全にエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）され
た最後のアミノ酸（ｕＰＡ　　Ｐｒｏｐ）をエクソンＶ
上に完全にエンコードされた最初のアミノ酸（ｕＰＡ　
　Ｐｒｏｓ）と接続する。サイクル９におけるアミノ酸
の同定は明瞭ではなく、シたがって、クエスションマー
クで示されている。サイクル１４は、検出可能なアミノ
酸の存在を示さず、期待するように、ＣｙＳ残基の存在
を示す（この残基は、前もってカルボメチル化によって
保護しないかぎり、この分析において使用した配列決定
装置では検出不可能である）。

ＲＳＶ−ｕＰＡ−ＢＰＶベクターによるＧＡＳＧＡの産
生 Ｒ５ＶｕＰＡプラスミドＤＮＡにおいて、制限エンドヌ
クレアーゼＮ　ｄｅ　ＩおよびＡｐａｌは各１回のみ切
断するだけであり（第３図）、第１はＲ３■プロモータ
ーに隣接するｐＢＲ３２２誘導領域においてであり、そ
して第２はｕＰＡポリアデニル化部位に対して３′の領
域においてである。これらの２つの部位をＸ　ｈｏ　Ｉ
のライゲイジョンによって修飾して、Ｘ　ｈｏ　Ｉ消化
後、Ｘ　ｈｏ　ＩまたはＳａｌ■の部位を有するベクタ
ー中でそれをクローニングするために適した、Ｒ８Ｖプ
ロモーター／　ｕ　ＰＡ解読領域を含有する断片が得ら
れる。

Ｅ３．１．１−　　　− ７０マイクログラムのＲＳＶ−ｕＰＡ　　ＤＮＡを、３
００マイクロリツトル中において３７℃で２４時間４２
０ＵのＮｄｅｌで完全に消化する（アッセイ条件：１５
０ミリモルのＮａＣ１゜ｌＯミリモルのトリス−ＨＣｌ
　　ｐＨ７，８，７ミリモルのＭｇＣ１□、６ミリモル
の２−メルカプトエタノール、１００マイクログラム／
ｍｌのＢＳＡ）。加熱不活性化後、ＮａＣ１濃度をＡｐ
ａ■条件に調節しく６ミリモルのＮａＣ１，６ミリモル
のトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，４，６ミリモルのＭｇＣ
ｌ２．６ミリモルの２−メルカプトエタノール、１００
マイクログラム／ｍｌのＢＳＡ）そしてＤＮＡを４００
マイクロリツトル（最終体積）中で１６０ＵのＡ’ｐａ
ｌで３０℃において４時間完全に切断する。次いで、Ｄ
ＮＡを１．５．３におけるように精製しかつ沈殿させ、
２０マイクロリツトルのＴＥ中に再溶解し、Ｎｄｅｌ突
起末端に５ＵのＥ、ｃｏｌｉ　　ポリメラーゼ■を充填
し、ＤＮＡ（最終体積２５マイクロリツトル）を３７℃
で１時間インキュベージコンし、次いで酵素を加熱不活
性化する（マニアチスら、１１３ページ）。

Ｅ３．１．２ 上で得られたＮｄ、　ｅ　Ｉ　／　ＡｐａＩ消化した平
滑末端のＲＳＶ−ｕＰＡプラスミドを、リン酸化Ｘｈｏ
ｌリンカ−ＤＮＡ　（モル比的１：１５）と混合し、そ
して、１．５．５に示すように８℃で１８時間インキュ
ベーションしく最終体積５０マイクロリツトル）、次い
でリガーゼを加熱不活性化する。次いで、ＤＮＡを２０
０マイクロリツトル中７７）ｌ、％１”　１２０　Ｕ（
７）ＸｈｏＩ　？３７’Ｏ！：おいて４時間消化し、そ
してＸｈｏＩを加熱不活性化する。

Ｅｌ、３ 上で得られｆ：、　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を、０．７５％のア
ガロースゲルを含有する臭化エチジウムの電気泳動によ
り分離し、そして３５ボルトで２０ヒト展開しく詳細に
ついて、１．５．７参照）、得られたバンドをＵＶトラ
スイルミネーターで検出し、最大は８．３５ｋｂのＲ５
Ｖプロモーター／　ｕ　Ｐ　Ａ解読領域の断片に相当し
、そして最小は２．４５ｋｂのアンピシリン抵抗性およ
び複製起源含有断片に相当する。２つのバンドを１．５
．７におけるように切出し、そして精製する。最小のバ
ンドを、３ＵのＣＩＰで３７°Ｃにおいて３０分間処理
し、５６°Ｃにおいて３０分間処理し、そして１．５゜
２および１．５．３に記載するように、精製および沈殿
させる。大きい断片および小さい断片的ｌ＝１〜約４＝
１の異なるモル比の範囲で混合し、１４°Ｃで３時間ラ
イゲイジョンし、そして１．５゜８におけるように、各
反応混合物の分画を使用しＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨＩコン
ピテント細胞を形質転換する。バクテリアを１夜アンピ
シリン含有寒天平板上で増殖し、分離したコロニーから
のプラスミドを適当な制限断片パターンについて分析し
、それらの１つ（ヒトｕＰＡ遺伝子がＲＳＶプロモータ
ーの翻訳制御下に配置された）をプラスミドｐ７１とし
てを選択し、Ｘｈ、　ｏ　Ｉによる切断によってプラス
ミドの残部から切除する（第３図、下部）。

Ｅ３．１．４−ＢＰＶ−制限部位修飾 ｐＢＰＶ　　２３０．８　（第４図）を３つの異なる部
位（それぞれ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉまたは
５ａｌｌ）において、独特Ｘ　ｈｏ　１部位の挿入によ
って修飾し、これはＲ５Ｖ−プロモーター／ｕＰＡ解読
領域（ＲＳＶｕＰＡ）の挿入を容易とする。

各実験において、過剰量の適当な制限酵素（Ｂ　ａｍＨ
ｌまたはＨｉｎｄｌｌｌＳａｌｌ）を使用して、ｌθマ
イクログラムのＢＰＶ２３０．８ＤＮＡを３７℃におい
て１００マイクロリツトル（最終体積）において３時間
完全に消化する。酵素を加熱不活性化し、ＤＮＡを１．
５．３に記載するように精製し、ｌＯマイクロリットル
の緩衝液（マニアチスら、１１３ページ）中に再溶解し
、５ＵのＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡ　　ポリメラーゼＩの
クレノー断片で３７℃で２ヒト処理することのよって平
滑末端とする。ポリメラーゼを加熱不活性化した後、Ｄ
ＮＡを５０マイクロリツトル（最終体積）中で５ＵのＣ
ＩＰで３７℃において３０分間および５６℃においてさ
らに３０分間脱リン酸酸化する。

最後に、この酵素をＥＧＴＡの存在下に加熱することに
よって不活性し、そしてＤＮＡを１．５゜２および１．
５．３に記載するようにして精製する。再溶解した平滑
末端の直線状のＢＰＶ２３０゜８に、標識したＸ　ｈｏ
　Ｉリンカ−ＤＮＡを添加しくモル比２００：ｌ）そし
て２．７ＵのＴ４　　ＤＮＡリガーゼの存在下に８°Ｃ
で１５時間５０マイクロリツトル（最終体積）中でライ
ゲイジョンする（１．５．４）。リガーゼの加熱不活性
化後、約１％のライゲイジョンしたＤＮＡを含有する試
料を８ＵのＸ　ｈｏ　Ｉで消化し、ライゲイジョンの前
および後に採取した等量のアリコートで電気泳動し、そ
して１．５．６におけるように分析する。

次いで、塩濃度を１００ミリモルのＮ　ａＣ１に調節し
、モしてｐＨを約７．５に調節し［マニアチスら、１０
４ページ、分子生物化学の生化学物質；ベーリンガー・
マンヘイム（Ｂｏｅｈｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）　、ミュンヘン　１９８５］　、ＤＮＡのすべてをＸ
　ｈｏ　Ｉで３７℃において１時間２００マイクロリツ
トル中で切断し、０．６％のアガロースゲルに適用し、
電気泳動にかけ、直線化したプラスミドに相当するバン
ドを切出し、そして１．５゜７におけるように電気泳動
および精製する。直線化したＤＮＡをライゲイジョンに
より自己アニーリングし、そしてコンピテントＥ、ｃｏ
ｌｉ　　ＤＨ５細胞（Ｂ　Ｂ　Ｌ）を形質転換するため
に使用する（参照１．５．８）。アンピシリン含有寒天
平板上の１夜のインキーユベーション後分離したコロニ
ーからのプラスミドを、ミニプレプ分析（１，５゜９）
により、新しいＸ　ｈｏ　１部位の存在についてスクリ
ーニングする。次のｐＢＰＶ２３０．８誘導プラスミド
が得られた（第５図、中央）ニー　　ｐＢＢ、Ｘｈｏ１
部位はＢａｍＨＩ位置においてつくられ、そして２つの
ＢａｍＨＩによって７ランキングされている； −ｐＢ５１Ｘｈｏ１部位は５ａｌＩ位置においてつくら
れ、そして２つの５ａｌｌによって７ランキングされて
いるニ ー　　ｐＢＨ％ＸｈｏＩ部位はＨｉｎｄｌｌ！位置にお
いてつくられている。

Ｅ３．１．５ 異なる実験において、ｐＢＢ、ｐＢＨおよびｐＢＳのＤ
ＮＡの各々の５０マイクログラムを５０マイクロリツト
ル中で３７℃において２ヒト過剰のＸｈｏｌ（ｐＢＳの
場合において５ａｌＩ）で完全に消化し、酵素を加熱不
活性化し、反応条件は反応体積を２倍にするために必要
なように濃縮した緩衝液（１，５，１）で変更し、そし
て直線化プラスミドＤＮＡをＩＵのＣＩＰで１．５．４
に記載するように脱リン酸化する。酵素の加熱不活性化
４ｋ、ＤＮＡｔ−０，６％のアガロースゲルをする臭化
エチジウムに適用し、そして３０Ｖで１６時間電気泳動
する。七ツマ−の直線状プラスミドに相当する主要なり
ＮＡバンドを、１．５．７に記載するように、電気溶離
し、精製し、そして再溶解する。同様に、５０マイクロ
グラムのｐ７１プラスミドＤＮＡを８０ＵのＸ　ｈｏ　
Ｉで完全に消化し、酵素を加熱不活性化し、この混合物
を０．６％のアガロースゲルを含有する臭化エチジウム
に適用し、そして３０Ｖで１６時間電気泳動する。Ｒ５
Ｖプロモーター／　ｕ　Ｐ　Ａ解読領域構成を含有する
８、３５ｋｂのバンドをもつゲル部分を、１．５゜７に
記載するように、電気泳動し、精製しおよび再溶解する
。ＢＰＶベクターＤＮＡ　（第６図、中央）およびイン
サートＤＮＡ　（第５図、下部）を２：ｌ−１：４の変
化する比で混合し、そして１５℃において２４時間はぼ
２．０マイクログラム／マイクロリツトルのＤＮＡ濃度
で２Ｕ／試料のＴ４　　ＤＮＡリガーゼでライゲイジョ
ンする。

反応媒質を緩衝液で調節し、そしてライゲイジョンした
ＤＮＡを３７℃で１時間２０Ｕ（７）ＸｈｏＩで１５マ
イクロリツトル（最終濃度）中において消化する。（ア
ッセイの条件＝５０ミリモルのＮａＣ１，６ミリモルの
トリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，９，６ミリモルのＭｇＣｌ
＊、１００マイクログラム／ｍｌのＢＳＡ）、この酵素
はＲＳ　Ｖ　／　ｕ　Ｐ　Ａ構成を切断せず、そしてＢ
ＰＶ２３０．８誘導ベクターを１回だけ切断する。Ｘ　
ｈｏ　Ｉの加熱不活性化後、得られた混合物を水で１〜
５倍に希釈し、ＩＯＸライゲイジョン緩衝液を添加し、
そして２．５ＵのＴ４　　ＤＮＡとともに１４℃で２時
間インキュベーションする。実験の各々からの５マイク
ロリツトルの試料を使用して、Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＤＨ
５コンピテント細胞を形質転換する（１．５．８）。

これらのバクテリアをアンピシリン含有寒天平板上で１
夜増殖させ、そして生じたコロニーからの試料をミニプ
レブ分析により分析する（参照ｌ。

５．９）。適切な制限パターンをもつコロニーから分離
したプラスミドを選択する（１．５．９、第６図、下部
）。

Ｅ３．２−ＢＰＶ誘導発現ベクター中のｕＰＡ転写単位
の修飾 ７．３ｋｂのＳ　ｍａ　Ｉ断片を含有するｕＰＡ　　Ｏ
ＲＦにおいて、制限酵素ＨｓｓＨＩおよび５ｃａＩは１
回だけ切断し、各々は、それぞれ、ｎｔ４１３に５”末
端およびｎｔ　　４３４４に３′末端を発生させる。こ
の断片はｕＰＡのＧＦＤ解読領域を含み、これに対して
Ｒ９ＶｕＰＡ誘導ＧＡＳＧＡプラスミド中の対応する断
片（第３図参照）はＧＦＤ、およびＧＦＤ！領域を含有
する。

こうして、すべてのＢＶＰベクター中のＢｓ５ＨＩ　／
　Ｓ　ｃ　ａ　Ｉ断片は、ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯまたをＲ
ＳＶｕＰＡ−Ｅ２からのＢ　ｓ　ｓ　ＨＩ　／　Ｓ　ｃ
　ａＩ断片で置換して、次のものを得るニ ーＥＯ系列のベクター、エクソンＩＶ欠失ＯＲＦを有す
る； −Ｅ２系列のベクター、エクソンｔＶ複製ＯＲＦを冑す
る； 簡単に述べると、２つの系列を次のようにして調製する
： ａ）ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯまたはＲＳＶｕＰＡ−Ｅ２から
のＤＮＡをＢｓ５ＨＩで完全に消化し、ＣＩＰで処理し
、５ｃａＩで完全に消化し、そして最小のＤＮＡ断片を
ゲルで精製する；ｂ）ＢＰＶ誘導ｕＰＡ発現ベクターか
らのＤＮＡを同様に５ｃａｌで完全に消化し、ＣＩＰで
処理し、Ｂｓ５ＨＩで完全に消化し、そして最小の、断
片をゲルで精製する； Ｃ）エクソンＩＶが欠失したあるいはエクソンＩＶが複
製したＢ　ｓ　ｓ　ＨＩ　／　Ｓ　ｃ　ａ　Ｉ断片を上
で得られたエピソームのベクターＤＮＡの各々中に挿入
する。

Ｅ３．２．１−　ｒＥＯＪまたはｒＥ２ＪＢｓｓＨ１／
５ｃａｌカセットの調製 ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯまたはＲＳＶｕＰＡ−Ｅ２からの５
０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを、６４０のＢｓ
５ＨＩで７５マイクロリツトル（最終体積）中で２時間
３７°Ｃにおいて完全に消化する。次いで、酵素を加熱
不活性化し、そしてＤＮＡを１５０マイクロリツトル（
最終体積）中で２．５ＵのＣＩＰで脱リン酸化する。次
いで、ＤＮＡフェノール／クロロホルム精製しく１．５
゜２）、沈澱させ（１，５，３）、そして１００マイク
ロリツトルの緩衝液中に再懸濁させて、それを８０ｔＪ
の５ｃａｌで３７℃において３時間消化刷る。「ＥＯ」
カセットを含有する断片または「Ｅ２」カセットを含有
する断片が、それぞれ、得られ、そしてアガロースゲル
で精製刷る（１゜５．８）。

Ｅ３．２．２−ＢｓｓＨＩ／５ｃａｌ　　ＢＰＶ誘導ベ
クターのフレームの［１ ｐＢＶＰ２３０．８誘導ｕＰＡ発現ベクターの各々から
のＤＮＡの２０マイクログラム（参照、第６図、下部）
を、５０マイクロリツトル（最終体積）中で３７°Ｃに
おいて３時間４−ＯＵのＳｃａＩで完全に消化し、次い
で酵素を加熱不活性化し、そしてＤＮＡを１００マイク
ロリツトル（最終体積）中で２ＵのＣＩＰで脱リン酸化
する（１．５゜４）。抽出および沈澱後（１，５，２，
１，５゜３）、ＤＮＡを１００マイクロリツトルの緩衝
液中に再溶解し、そして４０ＵのＢｓ５ＨＩで３７°Ｃ
において２時間消化する。Ｂ　ｓ　ｓ　ＨＩ　／　Ｓ　
ｃ　ａＩ　　ＥＧＦ含有領域において欠失された最大の
断片を、アガロースゲル上で単離する（１．５゜８）。

Ｅ３．２．３−ＢＰＶ／Ｒ３Ｖ／ｕＰＡ７レーム中の「
ＥＯ」または「Ｅ２」カセットの挿入この手順は、ＢＰ
Ｖ誘導ｕＰＡ発現ベクター中でＧＦＤｅ　　（ｒ（Ｎ　
）またはＧＦＤ、（ｒ２Ｊ　）系列を発生させるために
使用する： ａ）前述のようにして調製したＧＦＤ、またはＧＦＤ２
カセット（Ｅ３．２．１）のいずれかを含有する、１マ
イクログラムのＢｓ５ＨＩ脱リン酸化／５ｃａｌ　　Ｄ
ＮＡ断片を、ＢＰＶ／ＲＳＶフレームを含有する４マイ
クログラムの５ｃａｌ脱リン酸化／　Ｂ　ｓ　ｓ　ＨＩ
ベクターのＤＮＡに、１５℃において１６時間、２Ｕの
ＤＮＡリガーゼで２０マイクロリツトル（最終体積）中
で結合する； ｂ）アンピシリン抵抗性コロニーをミニプレプ分析によ
りスクリーニングしく１．５．９）、そして期待される
制限パターンを示すプラスミドを単離する。

プラスミドのｐＢｖＰ２３０．８誘導ｓｃｕ−ＰＡ産生
性系列の各々から出発して、この手順を反復することに
よって（第７Ａ図）、ＢＰＶ誘導ＧＡＳＧＡ発現ベクタ
ーの２系列を得るニー系列ｒＱＪ　、ＥＧＦ様ドメイン
の少なくとも一部分が欠失されている（添加字ＥＯ；第
７Ｂ図）一系列ｒＥ２Ｊ　、ＥＧＦ様ドメインの大部分
が複製されている（添加字Ｅ２：第７Ｃ図）。

Ｅ３．３−ＧＡＳＧＡ産生物の発現および分析上で得ら
れたＢＰＶ誘導ＧＡＳＧＡ発現ベクターを、ＬＢ６マウ
ス細胞またはＣＨＯ細胞中においてＲ５Ｖ−Ｎｅ　ｏを
使用して同時トランスフェクションしく参照、Ｅ、１．
４）モしてＧ４１Ｂ抵抗性クローンを選択し、モしてＥ
２．８に記載するように分析する。

得られたタンパク質のＰＡ酵素の性質、免疫学的特性お
よびｕＰＡレセプター結合性質は、Ｒ５ＶｕＰＡ−ＥＯ
およびＲ３ＶｕＰＡ−Ｅ２で得られたものを反映する（
上を参照）。

実施例Ｅ４ ヒトｕＰＡプロモーター領域の修飾した誘導体構成 Ｅ４．ｌ−ｕＰＡ２プラスミドの構成 Ｅ０．３に記載されているように調製したラムダ−ｕＰ
ＡＩ　　ＤＮＡの５０マイクログラムを、１００マイク
ロリツトル（最終体積）で、適当な緩衝液中の３０Ｕの
Ｓ　ａｍ　Ｉで３０℃において６０分間消化する。得ら
れたＤＮＡの５００ｎｇを１％のアガロースゲルを含有
する臭化エチジウム上で分析するが、残部は一２０℃で
貯蔵する。次いで、酵素を６８℃（１０分）加熱不活性
化し、そして生ずるＤＮＡ調製物を０．８％の調製用ア
ガロースゲルを含有する臭化エチジウム上に適用する。

電気泳動的分離はＴＢＥ緩衝液中で５０Ｖで２０時間実
施しくマニアチスら、第５章）そしてＤＮＡバンドを中
程度の波長のＵＶトラスイルミネーターで可視化する。

ｐｒｏ　−ｕ　Ｐ　Ａを含有するほぼ２．３８ｋｂのバ
ンドを切出し、そして１．５．７に記載されているよう
にＤＮＡを電気溶離しかつ精製する。５０マイクログラ
ムのｐＥＭＢＬ８ＣＡＴ　　ＤＮＡ（第８図）を、２５
マイクロリツトル中の３ＵのＳ　ａｍ　Ｉで３０℃にお
いて１時間同様に薄化する。６７マイクロリツトルの水
、１０マイクロリツトルのＣＩＰ　　ｌおＸ緩衝液およ
び１マイクロリツトル（最終体積）中のＣＩＰを添加し
、そして反応混合物を３７°Ｃで６０分間さらにインキ
ュベーションする。ＣＩＰを１．５．４に記載するよう
にＥＧＴＡの添加および加熱によって不活性化し、ＤＮ
Ａを同二条件下に０．８％のアガロースゲルを含有する
臭化エチジウムで精製する。１．５マイクログラムの２
．３ｋｂのラムダ−ｕＰＡｌ誘導断片および５００ｎｇ
の４上で調製した直線化脱リン酸化ｐＥＭＢＬ８ＣＡＴ
　　ＤＮＡを一緒に混合し、１０％のＰＥＧおよび２Ｕ
のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する適当な緩衝液の２０マ
イクロリツトル中で１４℃において２０時間ライゲイジ
ョンする。次いで、５マイクロリツトルのこの反応混合
物を使用して、１．５．８に記載するようにコンピテン
トＥ、ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。アンピシリン抵抗
性のコロニーを分析し、これらのなかで、インサートを
正しい向きで含有するものを選択し、そしてｐｕＰＡ２
と表示する（第８図、右）。

Ｅ４．２−ｐｕＰＡ２／４１プラスミドの構成上で調製
したｐｕＰＡ２　　ＤＮＡのＳ　ａｍ　１部分的消化し
直線化した形態を得る最適な条件を、２５０ｎｇのこの
プラスミドを、適当な緩衝、液のｌＯマイクロリットル
（最終体積）中の、それぞれ、１．０．２．０．３．０
および４．ＯＵのＳ　ａｍ　１で消化することによって
研究する。反応混合物の各々の５０％（Ｖ　／ｖ　）異
なる管に移し、３０°Ｃで６分間反応した後、ドライア
イス／エタノール浴中で凍結するが、残の蛋白質は９分
だけ長くインキュベーションした後凍結する。次いで、
凍結した試料の各々をＥＤＴＡでｌＯミリモルにし、酵
素を加熱不活性化し、次いでＤＮＡを１％のアガロース
ミニゲルを含有する臭化エチジウムで分析する。すぐれ
た結果は、２Ｕとともに１５分間および３Ｕとともに６
分間インキュページ目ンすることによって達成される。

次いで、調製用消化を次のように開始する：５マイクロ
グラムのｐｕＰＡ２　　ＤＮＡを４０ＵのＳ　ａｍ　Ｉ
で５０マイクロリツトルの適当な緩衝液中で消化し、こ
の反応を１マイクロリツトルの５００ミリモルのＥＤＴ
Ａの添加および凍結によって停止する。添加した酵素の
加熱不活性化後、このｐｕＰＡ２　　ＤＮＡ調製物を２
．２５マイクログラムのＸ　ｈｏ　Ｉリンカ−と混合し
、１．５．６に記載するようにリン酸化し、そして１０
％のＰＥＧ　　１５００および２．５ＵのＴ４　　ＤＮ
Ａリガーゼを含有する８６マイクロリツトルの反応混合
物中でライゲイジョンし、まず７℃において６時間イン
キュベーションし、次いで１７℃に温度をゆっくり上げ
、そしてさらに１０時間インキュベーションする。ライ
ゲイジョン酵素を加熱不活性化し、ライゲイジョンした
ＤＮＡの１０％を５５ＵのＸ　ｈｏ　Ｉで３７℃におい
て、２０マイクロリツトル（最終体積）中のＰＲＴの存
在下に消化し、次いでこの酵素を加熱不活性化し、そし
て１．５．３に示すようにＤＮＡを沈殿させる。沈殿し
たＤＮＡを４マイクロリツトルのＴＥ中に再溶解しくマ
ニアチスら）、１マイクロリツトルのＩＵのＴ４　　Ｄ
ＮＡリガーゼ含有５Ｘライゲイジヨン緩衝液（マニアチ
スら）を添加し、この混合物を１５℃で２時間３０分間
自己ライゲイシゴンさせ、次いでＨＢ　Ｉ　０１コンピ
テントＥ　、　ｃｏｌｉＪＩ胞の形質転換に使用する（
１゜５．８）。アンピシリン抵抗性コロニーをミニプレ
プ分析分析でスクリーニングする。これらの１つは、Ｘ
　ｈｏ　１部位に転化されたＳａｍ１部位（これは２．
３８ｋｂのインサートを含有するｕＰＡプロモーターの
５°末端でフランキングする）を有しく第８図）をｐｕ
ＰＡ２／４１と命名する。

Ｅ４．３−ＣＡＴ分析 ｐｕＰＡ２、その誘導体ｐｕＰＡ２／４１およびＲ５Ｖ
−ＣＡＴを、ＣＡＴ遺伝子の転写を推進するそれらの能
力について試験する。プラスミドのＤＮＡを、腎臓癌か
ら誘導されたヒトＡＩ２５ｌ細胞系（１，１）［ストツ
ベリ（Ｓ　ｔｏｐｐｅｌｌｉ）Ｍ、Ｐ、、ベルブ（Ｖｅ
ｒｄｅ）　Ｐ、　、グリマルヂ（Ｇ　ｒｉｍａｌｄｉ）
　Ｇ　、　、ロカテリ（Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ）　Ｅ　。

Ｋ９、ブラシ（Ｂ　Ｉａｓｉ）　Ｆ　、　、ジャーナル
・オン・セル・バイオロジー（Ｊ　、　　Ｃｅ１１．　
　Ｂｉｏｌ、　）、１９８６．１０２．１２３１−１２
４１１中に、リン酸カルシウム沈殿手順によってトラン
スフェクションし、そしてトランスフェクションした細
胞中で多分産生されるＣＡＴ蛋白質のレベルを６４±４
時間後に測定する。

Ｅ４．３．１−プラスミドＤＮＡの精製プラスミドＤＮ
Ａは、各バクテリアのクローンの４００ｍ１のＬＢブロ
スの１夜の培養から、バーンボイム（Ｂ　ｉｒｎｂｏｉ
ｍ）　Ｈ、Ｃ、およびドリイ（Ｄｏｌｙ）Ｊ、　、ｌ　
９７９、核酸の研究（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　　Ｒａｓ、　）、１５１３に記載されるア
ルラリセイ溶菌方法（また、マニアチスら、°９０ペー
ジに報告されている）に従い精製する。このようにして
得られたプラスミドＤＮＡを臭化エチジウムのＣｓＣ１
勾配で２回精製し、それを含有するバンドを穿刺により
集め、そしてイソアミルアルコールで広範に抽出する（
参照、マニアチスら、９３−９４ページ）。次いで、Ｄ
ＮＡ含有ＣｓＣ１水溶液を水で１＝４に希釈し、そして
ＤＮＡを０．１体積の３モルの酢酸ナトリウムｐＨ５，
２および３体積のエタノールの添加により沈殿させる。

この混合物を一２０℃に３０分間放置した後、ＤＮＡ＋
７）分画を１１００００Ｘで４°Ｃにおイテ１５分間遠
心し、７０％のエタノールで１回および１００％のエタ
ノールで１回洗浄し、乾燥し、２ｍｌのＴＥ中に溶解し
、同一方法で再沈殿および洗浄し、最後に１ｍｌのＴＥ
中に再溶解する（マニアチスら）。０Ｄ２６゜を測定し
、濃度を約５００ｎｇ／マイクロリットルに調節し、ミ
ニゲル上り検査し、そして再び分光光度測定によって測
定する。

最後に、プラスミドＤＮＡを無水エタノールでｌ：ｌに
希釈し、そして−２０℃で貯蔵する。

Ｅ４．３．２−リン酸カルシウム手順による沈殿 トランスフェクションすべき各６０ｍｍのペトリ血につ
いて、ＩＯマイクログラムのＤＮＡに等しい、４０マイ
クロリツトルのＤＮＡエタノール／ＲＥ溶液を、サバン
ト真空遠心機で乾燥し、そして２２０マイクロリツトル
の水中に再溶解する。

３０マイクロリツトルの２モルのＣａＣ１，［？リンク
ａ−７ト（Ｍ　ａｔ　１ｉｎｋｒｏｄＬ）またはメルク
（Ｍｅｒｃｋ）から］を添加し、そして急速に混合する
。２５０マイクロリツトルの２ＸＨＢＳ　（１０ｇ／ｌ
のＨＥＰＥＳ、４−　（２−ヒドロキシエチル）−１−
ピラジンエタンスルホン酸）およヒ５マイクロリットル
の１００ＸＰＯ４（７０ミリモルのＮ　ａ　！ＨＰ　０
．８よび７０ミリモルのＮａＨＩＰＯ，、無菌）を混合
し、そしｆＤＮＡ／ＣａＣ１，溶液をゆっくり嫡々添加
し、その間パスツールピペットで広範に泡だでる。次い
で、この混合物を室温で３０分間放置する〔グラハム（
Ｇｒａｈａｍ）およびファン・デル・ニブ（Ｖａｎ　　
ｄｅｒ　　Ｅｂ）、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌ、　）　５
２．４５６．１９８３］。

Ｅ４．３．３−Ａ１２５１細胞のトランス７エクシ鱈ン Ａ１２５１細胞は、トランスフエフシコン前に、完全培
地［１０％の仔ウシ胎児血清（Ｈｙｃ　１ｏｎｅ）およ
び１％の抗生物質（ギプコ）を補充したＤＭＥ培地（ギ
ブコ）］中で５％のＣＯ，湿潤化インキュベーター内で
３７℃において２４時時間面増殖に増殖させ、細胞を６
０ｍｍのベトリ皿に１０’細胞／皿で分割し、そしてト
ランスフェクションの６モル比前に新鮮な培地を再供給
する。ｔｏにおいて、沈殿しありＮＡを添加し、この混
合物を１６〜１８時間インキュベーター内に放置する。

ｌ夜のインキュベーション後、細胞をＤＭＥ（７，２）
で１回洗浄し、次いで完全培地を再補充し、インキュベ
ーター内に放置してインキュベーションを完結し、そし
て収穫する。３回反復した実験において、引続く工程の
すべてにおいて、乾燥したＤＮＡの溶解を各試料につい
て別々に実施する。収穫した試料を引続く工程において
使用する。

沈殿したＤＮＡの添加後６４±４時間に、細胞（Ｅ４．
３．３におけるように調製した）をＣａ中十を含有しな
いリン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（８０ｇのＮａＣ１
１２ｇのＫＣＩ、ｌ　１．５ｇのＮ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ
４・２　Ｈ！　Ｏｓ　　２　ｇのＫＨ２ＰＯ４／１の蒸
留水、Ｉ）Ｈ７，２）で３回洗浄し、次いで１ｍｌの５
ＴＥ（１００ミリモルのＮａＣ１１１０ミリモルのトリ
ス、１ミリモルのＥＤＴＡ）を添加し、そしてこの混合
物を室温に５分間放置する。

次いで、細胞をゴムのポリスマンで引掻いて集め、エツ
ペンドルフ管中に入れ、マイクロ遠心機で４℃において
３分間遠心し、そしてｌＯＯマイクロリットルのトリス
２５０ミリモル　ｐ　Ｈ７，８中　。

に再懸濁させる。細胞の懸濁液を１５分間ドライアイス
／エタノール浴中に放置し、次いで３７℃の浴に移す。

この凍結／融解のサイクルを２回反復し、細胞核をマイ
クロ遠心機内で４℃において５分間遠心し、そして上澄
みを新鮮な管に移す。

平板毎の細胞数の可能なわずかの差により試料の各々の
蛋白質含量の小さい差を克服するために、蛋白質濃度は
ロウリイ（Ｌ　ｏｗｒｙ）　　（参照Ｅ１．６）の方法
に従って試料の各々からの１０マイクロリツトルを評価
することによって決定する。リゼイトの残りの部分をＣ
ＡＴアッセイにおいて使用するまで一２０℃で貯蔵する
。

Ｅ４．３．５−ＣＡＴアッセイ 試料の各々からの１００マイクログラムの蛋白質を含有
する体積を水で１３３．５マイクロリツトルにし、そし
て２２．５マイクロリツトルの２モルのトリス　ｐＨ７
，８を含有する予備混合した溶液の４４マイクロリツト
ル、２０マイクロリツトルの３ｍｇ／ｍｌのアセチルＣ
ｏＡ　（シグマ）の新しく調製した溶液および１．５マ
イクロリツトルの放射性”’Ｃ−クロランフェニコール
（５０〜６０ｍＣ１／ミリモル、アマ−ジャムから）を
それに添加する。この混合物を３７’Ｏで１ヒトインキ
ユベーシヨンし、次いで反応を１ｍｌの酢酸エチルの添
加および渦形成によって停止する。形成する２相をエッ
ペンドル７マイクロ遠心機で分離しく５分）、有機相を
新しいエツペンドルフ管に移し、ソバント真空遠心機内
で乾燥し、２０マイクロリツトルの酢酸エチル中に再溶
解し、０．２５−１ｍｍのシリカゲル板（コダック）上
のＴＬＣにより評価する。クロマトグラフィーは、２〜
３時間クロロホルム：メタノール（ＨＰＬＣ等級）、９
５：５、を移動相として使用して実施し、そし　　゛て
標識したそして末端に対応する放射性スポットをオート
ラジオグラフィーによって可視化する。

放射性スポットに対応するクロマトグラムの区域を切出
し、５ｍｌの適当なシンチレーション溶液、例えば、エ
コノフルオア（Ｅ　ｃｏｎｏｆ　１ｕｏｒ）　　［二ニ
ー・イングランド・ニュークリアー（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　
ｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）　］　を含むバイア
ル中に入れ、そして放射能をベータカウンターで測定す
る。結果を下の表３に記載する。

Ｅ４．４．１−プラスミドｐｕＰＡ２／１７の構成 ３００ｎｇのｐｕＰＡ２／４１　（Ｅ３．２参照）を４
゜２Ｕの０ｘａＮＩで４時間３７℃におちえ適当な緩衝
液（１００ミリモルのＮａＣｌ、ｌ　０５９モルのトリ
ス−ＭＣＩ　　ｐＨ７，５，１０ミリモルのＭｇＣｌ２
、ｌＯミリモルの２−メルカプトエタノール、１００マ
イクログラム／ｍｌのＢＳＡ）中で完全に消化する。Ｄ
ＮＡの生殖をミニゲルを含有する臭化エチジウム（１，
５，１）で検査し、そして酵素を１０分間６８℃に加熱
することによって不活性化する。次いで、２マイクロリ
ツトルの水、１．５マイクロリツトルのＩＯＸ緩衝液（
参照１．５．５）および１．５マイクロリツトルのＴ４
　　ＤＮＡリガーゼを添加し、そしてこの混合物を１５
℃で１８時間インキュベーションする。２．５マイクロ
リツトルのこの混合物を使用してＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ
ＩＯＩコンピテント細胞を形質転換する（１．５．．８
）。アンピシリン抵抗性コロニーをミニプレプ分析によ
って分析する（１゜５．９）。正しい制限のパターンを
有するものを選択し、そしてそれらの１つをｐｕＰＡ２
／１７と命名する（第１０図）。

Ｅ４．４．２−プラスミドｐｕＰＡ２／２５４の構成 ４マイクログラムのｐｕＰＡ２／４１　　ＤＮＡ（第１
Ｏ図参照）を５ＵのＥｃｏＲＶでｌＯマイクロリットル
の適当な緩衝液（５０ミリモルのＮａＣ１，１０５０モ
ルのトリス−ＭＣＩ、１０ミリモルのＭｇＣｌ２および
１ミリモルのジチオスレイトール）；（マニアチスら）
中で３７℃において２時間完全に消化し、次いで７マイ
クロリツトルの水、２マイクロリツトルの０．５モルの
トリス−ＭＣＩ　　ｐＨ８および１マイクロリツトルの
緩衝液中のＩＵのＣＩＰの混合物を添加する。この混合
物を３７℃で１ヒトインキユベーシヨンし、ＥＧＴＡを
ｌＯミリモルの最終濃度に添加し、そしてこの混合物を
６８℃で４５分間インキュベーションする。ＤＮＡを沈
殿させ、洗浄し、そして１．５．３に記載するように乾
燥し０、そして最後に７．５マイクロリツトルのＴＥ中
に溶解する（マニアチスら）。このＤＮＡを４．２Ｕの
０ｘａＮＩで４時間３７℃においてｌＯマイクロリット
ル（最終体積）中で完全に消化し、５′末端にＩＵのＤ
ＮＡ　　Ｐａ１ｌ　（２０マイクロリツトル、最終体積
）のクレノー断片を３７°Ｃにおいて１時間充填する。

次いで、ＤＮＡを沈殿させ（１，５゜３）そして７．５
マイクロリツトルのＴＥ中に再懸濁する（マニアチスら
）。０．５マイクロリツトルの１００ミリモルのＡＴＰ
、１ミリモルのｌＯ×緩衝液樹液（マニアチスら）およ
び２．５ＵのＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（１マイクロリツ
トル、最終体積）を添加し、そしてこの混合物を１８時
間１５℃でインキュベーションする。次いで、この混合
物の２．５マイクロリツトルを使用してＥ。

ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩコンピテント細胞を形質転換し
く１．５．８）、このバクテリアアンピシリン含有ＬＢ
平板上に配置する（マニアチスら）。正しい制限パター
ンを有するコロニーを選択し、そしてそれらの１つをｐ
ｕＰＡ２／２５４と命名する（第１０図）。

Ｅ４．４．３−ＣＡＴ分析 ｐｕＰＡ２／４１．その欠失誘導体ｐｕＰＡ２／１７お
よびｐｕＰＡ２／２５４ならびにＲ５Ｖ−ＣＡＴを、Ｃ
ＡＴ遺伝子の転写を推進するそれらの能力について試験
する。プラスミドＤＮＡをＡｌ２５１細胞系（１，１）
中でリン酸カルシウム沈殿によってトランスフェクショ
ンし、そしてＣＡＴ細胞内レベルを６４±４時間後測定
する。プラスミドＤＮＡ、　リン酸カルシウムによる沈
殿、細胞トランスフェクション、細胞リゼイトの調製お
よびＣＡＴアッセイを実質的にＥ３．３に記載するよう
に実施する。結果を表２に示す： 表　　２ Ａｌ　２５１ Ｒ３Ｖ−ＣＡＴ　　　　１００ ｐｕＰＡ２／４１　　１２８ ｐｕＰＡ２／ｌ　７　　３０３．８ ｐｕＰＡ２／２５４　　３７８．５ ｅｌａ Ｒ５Ｖ−ＣＡＴ　　　　ｌ　００ ｐｕＰＡ２／４１　　　３２．３ ｐｕＰＡ２／１７　　　７４．３ ｐｕＰＡ２／２５４　　１７４．３ Ｅ４．５−ｕＰＡ誘導発現ベクターの構成バクテリア触
媒遺伝子をプラスミドｐｕＰＡ２／４１．ｐｕＰＡ２／
ｌ　７およびｐｕＰＡ２／２５４から切除して、それら
を発現ベクターとして使用する。好ましくは、修飾はｕ
ＰＡプロモーター誘導配列、ｕＰＡ　　ＴＡＴＡボック
ス、ｍＲＮＡ開始点、およびｐ　ＥＭＢ　Ｌ　８誘導ポ
リリンカーを保存するであろう。これらの領域からなる
ＤＮＡ断片をベクターから切除し、そして異なる遺伝子
より上流に「発現カセット」として挿入することができ
る。前述のプラスミドから、３つのｕＰＡ誘導発現ベク
ターをバクテリア触媒遺伝子を切除することによって得
た：Ｉ）ＬＩＰＡ２／４１からｐＰＰ４１、ｐｕＰＡ２
／ｌ　７からｐＰＰ１７およびｐｕＰＡ２／２５４から
ｐＰＰ２５４゜ Ｅ４．５．１−ｐＰＰ４１の構成 ２５マイクログラムのｐｕＰＡ２／４１　　ＤＮＡを４
ＵのＸ　ｈｏ　Ｉで３７°Ｃにおいて４５分間部分的に
消化し、そして反応をＥＤＴＡの添加（１０ミリモルに
）および加熱不活性化により停止する。

沈殿後（１，５，３）　、ＤＮＡに２．５ＵのＤＮＡ　
　Ｐｏ１Ｉのクレノー断片（最終体積２０マイクロリツ
トル）を３７℃において１時間充填し、５０モル過剰の
５ａｌｌリンカ−（１，５，５および１．５．６）に１
６時間８℃において２Ｕのリガーゼでライゲイジョンし
、酵素を加熱不活性化した後、３７°Ｃにおいて２時間
過剰の５ａｌｔで消化する。ＤＮＡ断片を０．７５アガ
ロースゲル（１，５，７）上で展開し、そして５−６ｋ
ｂの範囲のＤＮＡ断片を含有するゲル部分を切出す。次
いで、このＤＮＡを１．５．７に記載するように抽出お
よび精製し、ｌＯマイクロリットルのＴＥ中に再懸濁し
、そして２マイクロリツトルのこの溶液を１６℃におい
て４時間２Ｕのリガーゼ（最終体積１０マイクロリツト
ル）で自己ライゲイジョンする。次いで、このＤＮＡ調
製４物の２．５マイクロリツトルｗｏ雨５ｉｔｅＤ　Ｈ
５Ｅ　、　ｃｏｌｔコンピテント細胞を形質転換する（
１．５．８−１．５゜９）。アンピシリン抵抗性コロニ
ーのプラスミドｐＰＰ４１．すなわち、欠失されたＣＡ
Ｔ遺伝子より下流の５ａ１１部位とＸ　ｈｏ　１との間
を構成する領域を有するプラスミドをミニプレプ分析に
より選択する（第１１Ｂ図）。

上に概説した手順に実質的に従って、２つの発現ベクタ
ーを、それぞれ、ｌＯマイクログラムのｐｕＰＡ２／１
７　　ＤＮＡまたはＩＯマイクログラムのｐｕＰＡ２／
２５４　　ＤＮＡを、２４ＵのＸｈ。

■で３７°Ｃにおいて２時間完全に消化することによっ
て得る。直線化したプラスミドの５″突起末端にＤＮＡ
　　Ｐｏ１Ｉのクレノー断片（２，５Ｕ）を３７°Ｃで
１時間充填し、次いで５０マイクロリツトル過剰の５ａ
ｌｌリンカ−（１，５，５および１．５．６）に１６時
間８℃において２Ｕのリガーゼでライゲイジョンし、実
施例を加熱不活性化した後、ＤＮＡを過剰の５ａｌｔで
３７℃において２時間完全に消化する。次いで、この酵
素を加熱不活性化し、そしてＤＮＡを沈殿させ（１，５
゜３）そしてｌＯマイクロリットルのＴＥ中に再懸濁す
る。２マイクロリツトルのこのＤＮＡ溶液を１５℃にお
いて１６時間２ＵのＤＮＡリガーゼ（最終体積１０マイ
クロリツトル）でライゲイジョンし、そして２．５マイ
クロリツトルを使用してＤＨ５Ｅ、ｃｏｌｉコンピテン
ト細胞を形質転換する。

アンピシリン抵抗性コロニーのなかから、ｕＰＡ誘導欠
失プロモーターを指示しかつＥ４．５．１においてｐＰ
Ｐ４１について記載した同一の一般的特性を有するプラ
スミドｐＰＰＩ７およびｐｐＰ２５４を選択する（第１
１Ｂ図）。

麦施例Ｅ５ ｕＰＡ解読領域を含有する７、３ｋｂのＳ　ｍ　ａＩ断
片を、Ｅ、１．１に記載するようにしてファージラムダ
−ｕＰＡｌから得た（第１図）。

Ｅ５，２−ベクターＤＮＡの調製 ｐＰＰ４１．ｐＰＰ１７、ｐＰＰ２５４からのプラスミ
ドＤＮＡ　（各々２０マイクログラム、上のようにして
調製）を、それらを別々に５０ＵのＳ　ａｍ　Ｉで２５
°Ｃにおいて３ヒト（最終体積％マイクロリットル）で
消化する。次いで、直線化したプラスミドをＩＵのＣＩ
Ｐで３７°Ｃにおいて１時間脱リン酸化し、０．８％の
アガロースゲルで精製する（参照１．５．３）、２０マ
イクロリツトルのＴＥ中に再懸濁し、そして４℃で貯蔵
する。

Ｅ５．３−ｕＰＡ誘導ミニ遺伝子の調製上（Ｅ５．ｌ）
で得られた直線化脱リン酸化プラスミドＤＮＡの各々を
、１マイクログラムのＵＰＡ−ＯＲＦ　［すなわち、Ｅ
ｌ、ｌに記載するようにして得られたｕＰＡ解読領域を
含有するＳａｍＩ　ＦＲ（７，：ｌｂ）　］　と、ｌＯ
％のＰＥＧ１５００中で２Ｕのリガーゼとともに１６時
間１５℃において混合する。

反応混合物の各々からの２．５マイクロリツトルを使用
して、コンピテントＥ、ｃｏｌｉＤＨ５ｍ胞を形質転換
する（参照１．５．８）。アンピシリン抵抗性コロニー
のうちで、ｐＰＰ４１．ｐＰＰ１７およびｐＰＰ２５４
から誘導されたプラスミドｐＰＰ４１ＸｓＳ　ｐＰＰ１
７ＸｓおよびＩ）ＰＰ２５４ＸＳを、ミニブレプ分析（
参照１．５．９）によって、次の特性を有することにつ
いて選択する（第９Ｃ図）ニ ー　ｕＰＡ解読領域はｕＰＡプロモーター含有ベクター
のＳ　ａｍ　１部位中に挿入されている；−ｕＰＡ　　
ｍＲＮＡ開始部位はヒトｕＰＡ遺伝子と同一であるニ ー　そらはｐ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　８誘導配列を含有する
；＝ｕＰＡ誘導ミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）は、好
ましくはＸｈ、ｏｆおよび５ａｌｌを使用する消化によ
って、そのベクターから切除しかつ異なるベクター中に
挿入することができる；−ｕＰＡ誘導ミニ遺伝子は、そ
のベクターから切除し、そして５ａｌｌ部位またはＸｈ
ｏＩ部位を有するベクター中に挿入することができる； −切除したミニ遺伝子は、適当な宿主中に挿入したとき
、エビソームの形態でそれらを維持できるベクター中に
挿入することができる； −ｐＰＰ４１ＸｓはｕＰＡプロモーターからの２．３５
断片の制御下にあるｕＰＡ解読領域を冑する； −Ｉ）ＰＰ１７ＸＳは、ｐＰＰ４１Ｘｓ中に含有されて
いるが、欠失が２つの０ｘａＮ１　　部位の間につくら
れている、同一のプロモーター断片の制御下にあるｕＰ
Ａ解読領域を有する； −ｐＰＰ２５４ＸＳは、ｐＰＰ４１Ｘｓ中に含有されて
いるが、欠失が５″０ｘａＮＩ部位とＥｃｏＲＶ部位と
の間につくられている、同一のプロモーター断片の制御
下にあるｕＰＡ、　　解読領域を有する。

Ｅ５．４−ＧＡＳＧＡ発現性ミニ遺伝子の構成ｐＤＤ誘
導発現ベクター中のエクソンＩＩからイントロンＪまで
のＢｓ５ＨＩ／Ｓｍａｌ断片の置換（参照、第３Ａ図）
を、実施例Ｅ３においてＧＡＳＧＡ発現性、ＢＰＶ誘導
プラスミドの発生について本質的に記載したように実施
する。

Ｅ５．４．１−ベクターＤＮＡの精製 プラスミドｐＰＰ４１Ｘｓ、ｐＰＰ１７ＸｓまたはｐＰ
Ｐ２５４ＸＳを、５ｃａＩで消化し、ＣＩＰで処理し、
モしてＥ３．４．３に記載するようにＢｓ５ＨＩで制限
する。ｐ　ＥＭＢ　Ｌ　８領域、ｕＰＡプロモーターま
たはそれらの誘導体、およびｕＰＡ　　ＯＲＦの５′お
よび３゛末端を含有するベクターのフレーム（参照、第
１２Ａ図）をアガロースゲルで精製しく１．５．８）そ
してＤＮＡ断片を１０マイクロリツトルのＴＥ中に再懸
濁させる。

Ｅ５．４．２−インサートの精製 プラスミドＲ３ＶｕＰＡ−ＥＯまたはＲ３ＶｕＰＡ−Ｅ
２からのＤＮＡの５０マイクログラムを、Ｅ３．４．１
に記載するように、Ｂｓ５ＨＩで消化し、ＣＩＰで脱リ
ン酸化し、そして５ｃａｌで制限する。「ＥＯ」または
「Ｅ２」解読領域を含有する２つの断片を、アガロース
ゲルでＭＨしく１．５．８参照）そして２０マイクロリ
ツトルのＴＥ中に再懸濁させる。

Ｅ５．４．３−ＧＡＳＧＡ発現性ミニ遺伝子の構成 誘導しｔ；プラスミドの各々について、同一の手順を使
用する： ａ）ベクターＤＮＡ　（Ｅ５．４．１に記載するように
調製した）およびインサートＤＮＡ（ｌＱマイクロリッ
トル（最終体積）中の０．３マイクログラム）をｌ：２
のモル比で混合し、そして１５℃において１６時間２Ｕ
の７４　　ＤＮＡ　　リガーゼで結合する； ｂ）Ｅ、　　Ｇｏ　Ｉ　ｉ　　ＤＨ５能力細胞（１−５
゜８）を２．５マイクロリツトルの上の混合物の各々で
形質転換する； Ｃ）アンピシリン抵抗性コロニーをＢｓ５ＨＩ／　Ｓ　
ｃ　ａ　Ｉインサートを有することについて分析しく１
．５．９）、これらのプラスミドの２つの系列を得る（
第１２Ｂ図および第１２ｃ図）。

Ｅ５．５−ＧＡＳＧＡ産生物の発現および分析前述のよ
うにして得られたｕＰＡミニ遺伝子誘導ＧＡＳＧＡ発現
ベクターを、ＬＢ６マウス細胞およびＣＨＯ細胞中でＲ
ＳＶ−Ｎｅｏで同時トランスフエクションし、モしてＥ
２．８に記載するように分析する。

ＰＡ酵素の性質、免疫学的特性およびｕＰＡレセプター
結合性質は、ＲＳＶｕＰＡ−ＥＯおよびＲＳＶｕＰＡ−
Ｅ２で得られた性質に類似する。

実施例Ｅ６ 「中断されたＪ　ＧＡＳＧＡの産生 Ｅ６．ｌ−制限部位の修ｆｓ二部分的消化プラスミドＲ
５ＶｕＰＡは２つの５ｃａＩ部位を含有し、第１部位は
ｐＢＲ３２２，″Ａ導アンピシリン抵抗性遺伝子中に存
在し、そして第２部位はｕ　ＰＡｉｆｉ伝子のエクソン
ＩＶ中に含有されるＧＦＤ中に存在する。

ＲＳＶｕＰＡを直線化するために最適な条件を発見する
ために、１００ｎＨのプラスミドを５ｃａＩで１０マイ
クロリツトルの緩衝液中で３７℃において１時間消化す
る（参照１．５．１）、酵素の添加昂、は１００Ｕ〜０
，３Ｕだる。最適な結果は５〜２．５Ｕ／１１００ｎで
得られる０反応を両者の濃度について１マイクログラム
まで規模を大きくシ１次いで、消化後、ＥＤＴＡを１０
ミリモルの最終濃度まで添加し、そしてＤＮＡを抽出し
、そして沈殿させる（参照１．５．２および１　、５　
、３）　、このプラスミドＤＮＡを８７−のリン酸化Ｋ
　ｐ　ｎ　Ｉ　／　Ａ　ｓ　ｐ　７１８リンカ−（参照
１１５／６）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；配列ＣＧＧＴＡ
ＣＣＧ）に２０マイクロリツトルのｗ樹液（最駿体Ｍｉ
）中でプラスミド／リンカ−１：１００のモル比で４８
時間５ＵのＤＮＡリガーゼを使用して結合する（参照、
１．５．５）、次いで。

酵素を加熱不活性化し、そしてＤＮＡを４０マイクロリ
ツトルの緩衝液中で３６０ＵのＡＳｐ７１８で消化しく
参照、１．５．１）、沈殿させ（参照、１　、５　、３
）そして０．８％の調製用電気泳動ゲル上に装入し、１
６時間４０Ｖで展開する（参照、１　、５　、７）　、
プラスミドの直線大きさ（１０，８ｋｂ）に相当するＤ
ＮＡバンドを電気溶離し、そして１．５．７におけるよ
うに精製し、ミニゲル上で定徴し、そしてその５０ｎｇ
を２．５Ｕのリガーゼで２４マイクロリツトルの緩衝液
中で自己結合させ、沈殿させ、そして１００マイクロリ
ツトルの受容Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５細胞（参照、１．
５．８）を形質転換するために使用する。アンピシリン
抵抗性クローンの之ちで、期待する制限パターンを有す
るものを選択し、そしてＲＳＶ−Ｇ−Ａｓ　ｐと命名す
る（８ｊｊｌｊ、第１５図）。

中断したＧＡＳＧＡを得ルタメニ、ＲＳＶ−Ｇ−Ａｓｐ
を、ＲＳＶ−ｕＰＡ−Ｔｅ　ｔ−Ａｓ　ｐについて後述
するように（ＥＯ，２）、Ａｓｐ７１８部位の完全な充
填（ＥＯ，３，１に記載するように）によって、あるい
はその部分的充填および引続くプランティング（ｂｌｕ
ｎｔｉｎｇ）（ＥＯ，３，２に記載するように）によっ
て修飾し、こうしてＲＳＶ−３ＶＲＴＤ　（ＥＯ，３，
１）またはＲＳＶ−３ＡＤ　（ＥＯ，３，２）　を発現
することによって得ることのできるものに同等である、
２つのベクター発現性ＧＡＳＧＡ産生物を得ることがで
きる。

ＥＯ，２−制限部位の修Ｓ：全体の消化独特３ｃａ１部
位を有するプラスミドを得るために、テトラサイリン抵
抗性についてアンピシリン抵抗性（参照第１６図）を次
によって置換するニ ーｐＢＲ３２２中のアンピシリン抵抗性遺伝子のＲＲ 大部分を欠失し、Ａｍｐ　　、Ｔｅｔ　　プラスミドｐ
ＢＲ１３Ｔｅｔを得る； −Ｒ３ＶｕＰＡ中のＨｐ　ａ　Ｉ　−Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉ断
片を欠失したｐＢＲ３２２からのＮｄｅＩ−ＰｖｕＩＩ
断片で置換する。

得られたプラスミドにおいて、Ｓ　ｃ　ａ　Ｉ　ｆｆ＆
位はエクソンＩＶ中のｕＰＡ解読領域中にのみ存在し、
そしである数のリンカ−の挿入によって突然変異化する
。

Ｅ６．２．１−欠失したｐＢＲ３２２（ｐＢＲ１３Ｔｅ
　ｔ）の構成 １００ｎｇ（７）ｐＢｌｏｏｎ　　ＤＮＡをＩＯＵの（
１，５，１）で３７℃において５０マイクロリツトルの
４１８１７液（最終体ａ）中で消化し、次いで酵素を加
熱不活性化し、そして反応条件４００マイクロリツトル
の緩衝液（最終体ｍ）中の３７”０（７）１時間ｃ７）
５０Ｕｃ７）Ｈｉ　ｎｄＩ　Ｉ　Ｉによる消化に対して
調節する（１．５．１）、ＤＮＡ分画を抽出し、沈殿さ
せ（１，５，２および１．５゜３）、再溶解し、そして
４ＵのＴ４　　ＤＮＡポリメラーゼ（マニアチスら）を
使用して３７℃で３０分間モ滑末端化する。抽出および
沈殿後、ＤＮＡを２．５ＵのＴ４　　ＤＮＡリガーゼで
自己結合させ（！ＯＯマイクロリットルの緩衝液、最終
体ＪＸ１）、沈殿させ、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５
受容細胞を形質転換するために使用する。テトラサイク
リン陽性コロニーのうちで、正しい制限パターンを有す
ることについてのミニプレプ分析によって１つを選択し
、そしてｐＢＲ１３Ｔｅｔと命名する（第１６Ｂ図）。

ＲＲ Ｅ６　、２　、２−Ａｍｐ　　のＴｅｔ　　による置換
ａ）２マイクログラムｃ７）　ｐ　Ｂ　Ｒ１３Ｔ　ｅ　
ｔを、５０マイクロリツトル（最終体積）中において、
１２ＵのＮｄｅＩで３７℃において１時間消化し１次い
で反応条件を２００マイクロリツトル中の３７℃におけ
る３０分間の２ＵのＣＩＰ処置に対して調節し、ＥＧＴ
Ａを１０８９モルめ最終濃度に添加し、ＤＮＡ分画を抽
出し、沈殿させ、そして１時間３７℃ニオイテ２００　
Ｕ（７）Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ　Ｉで１００マイクロリツトル
緩衝液（最終体積）中で消化し、次いで抽出し、そして
再び沈殿させ、そして最後にｌθマイクロリットルのＴ
Ｅ中に再溶解する。

ｂ）２０マイクログラムのＲ３ＶｕＰＡを１５０マイク
ロリツトル中において１００ＵのＨｐａＩで３７℃にお
いて１時間消化し、次いで反応条件を３００マイクロリ
ツトルの緩衝液中の３７化合物における３０分間の２２
ＵのＣＩＰ処理（１，５，４）に対して調節し、ＥＧＴ
Ａを１０８９モルの最終濃度に添加し、ＤＮＡ分画を抽
出し、沈殿させ、１時間３７℃において６０ＵのＮｄｅ
Ｉで２００マイクロリツトル中において消化し、抽出し
、再び沈殿させ、そして最後に２０マイクロリツトルの
ＴＥ中に再溶解する。

ｃ）３つの異なるライゲーション反応を、２７５マイク
ロリツトルの制限されたｐＢＲ１３Ｔｅｔ（Ｅ４．４ａ
＄照）に、異なるＮ（ｒ）消化したＲ５ＶｕＰＡ　（参
照、Ｅ、４ｂ）を添加しテモル比１：１．１：２および
ｌ：４にすることによって実施する（１．５．５）、ラ
イゲーションを５ＵのＴ４　　ＤＮＡリガーゼで５０マ
イクロリツトルの緩衝液中において１夜実施する０次い
で、酵素を加熱不活性化し、ＤＮＡ分画を沈殿させ、ｌ
Ｏマイクロリットルの水中に１与溶解し、そしてこの混
合物の５マイクロリツトルを使用してＥ、ｃ。

１ｉ　　ＤＨ５受容細胞を形質転換する。テトラサイク
リン陽性コロニーのうちで、正しい制限ノぐターンを有
することについてのミニプレプ分析によって１つを選択
し、そしてＲ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔと命名する（第１６Ｄ
図）。

Ｅ６．２．３−３ｃａＩ部位の修飾 １−Ｆイクログラムｃ７）Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔを１０
０Ｕの５ｃａＩで２００マイクロリツトル中において３
７℃で３時間消化する（１　、５　、１）。

ＤＮＡを抽出し、沈殿させ、そして２０マイクロリツト
ルのＴＥ中に再溶解する（１．５．２および１　、５　
、３）　、別の反応器において、２マイクロリツトルの
このようにして得られた直線化されたＲ３ＶＩＪＰＡ−
Ｔｅｔを、処理前にプラスミド中に存在する部位のいず
れをも含有しない、次のリンカ−の５０モル過剰驕にラ
イゲーションするニ ーＡｓｐ７１８　８マー（配列ＣＧＧＴＡＣＣＧ、Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒから）ニ ーＣａ１Ｉ　　８−Ｆ−（配列ＣＡＴＣＧＡＴＧ、Ｎｅ
ｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓから）；−Ｘ
ｈｏＩ８７−（配列ＣＣＴＣＧＡＧＧ、Ｎｅｗ　　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌ’ａｂｓから）。

ライゲーション反応は１．５．５に記載するように１０
マイクロリツトルの緩衝液中で１２ＵのＴ４　　ＤＮＡ
リガーゼで実施し、ＤＮＡ分画を抽出し、沈殿させ、そ
れぞれ３６０ＵのＡｓｐ７１８．２００Ｕ（７）Ｃａｌ
　ｌ８Ｒ２４０ＵのＸｈｏＩを含有する適当な緩衝液の
３００マイクロリツトル中に３７℃において１６時間再
溶解した。これらの反応混合物からのＤＮＡ分画を別々
に抽出し、沈殿させ、そしてＤＮＡをＩＵのリガーゼと
ともに１００マイクロリツトルの緩衝液中で１６時間自
己アニーリングする。抽出および沈殿後、Ｄ　Ｎ　Ａ　
分画の各々を５マイクロリツトルの水中に＋ｒｆ溶解さ
せ、そして１００マイクロリツトルのＥ、ｃｏｌｉ　　
ＤＨ５受容細胞を形質転換するために使用する。テトラ
サイクリン陽性コロニーのうちで、正しい制限パターン
を有することについてのミニプレプ分析によって１つを
選択し、そして、それぞれＲＳＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓ
ｐ、ＲＳＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ｃ１ａおよびＲＳＶｕＰＡ
−Ｔｅ　ｔ　−Ｘｈ　ｏ　Ｉと命名する（第１７図）。

Ｅ６．３−ＧＡＳＧＡ発現ベクターの調製ヒ）ｕＰＡの
ｕＰＡレセプター結合領域（ＧＦＤ）を、Ｅ６．１およ
び、２に記載されるプラスミドを新しく導入された部位
においてオープニングし、そして生ずる突起末端を充填
することによって破壊する。充填反応の間°に付加され
あヌクレオチドに依存して、１２ｂｐのインサート（す
べてのヌクレオチドが付加されるとき（参照Ｅ６．３．
１））または６ｂｐのインサート（最初のヌクレオチド
が付加され、そして突起末端の残部がＥ、ｃｏｌｉ　　
ＤＮＡポリメラーゼによって消化されるとき（参照Ｅ６
．３．１））が生ずる。これらのＧＡＳＧＡベクターは
ｕＰＡリーディングフレームを維持するが、発現された
蛋白質はその細胞のレセプターへの結合使方を失ってい
る。

Ｅ６．３．１一完全な充填 Ｅ３．２に記載する適用溶液７１８またはｘｈｏＩで修
飾したプラスミドの各々の１マイクログラムを、挿入さ
れたリンカ−において５０マイクロリ、トル中において
３７℃で消化することによって直線化してさらに修飾し
く１．５．１）、こうして４つのヌクレオチド／側面の
突起末端を得ることができる。ＤＮＡを抽出し、沈殿さ
せ（１，５，２および１．５．３）、すべての４つのヌ
クレオチドを含有する５０マイクロリツトルの適当な［
樹液（マニアチスら）中に再溶解し、そして５ＵのＤＮ
Ａポリメラーゼ、クレノー断片で室温において３０分間
処理することができる。

りｉ）られるモ滑末端のＤＮＡは、常法により、抽出し
、そして沈殿させることができる。この沈殿の１０％に
相当する部分を１００マイクロリフト中において（１，
５，５）６ＵのＤＮＡリガーゼで１６ヒト自己ライゲー
シヨンさせる。

抽出および沈殿後、ＤＮＡ分画の各々を５マイクロリツ
トルの水中に再溶解し、そしてＥ、ｃ。

１ｉ　　ＤＨ５受容細胞を形質転換するために使用でき
る。形質転換の各々について、テトラサイクリン陽性コ
ロニーのうちで、正しい制限パターンを右することにつ
いてのミニプレプ分析によって１つを選択し、そして、
それぞれ、次のように命名するニ ーＲ３Ｖ−３ＶＲＴＤ、Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓｐ
中のＡｓｐ７１８の完全な充填からおよびここで新しい
Ｓｎａ　　ＢＩ部位が導入されている； −Ｒ３Ｖ−’５ＳＩＥＤ、Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ｘ　
ｈ　ｏ　Ｉ中のＸｈｏＩの完全な充填からおよびこごえ
新しいＰ　ｖ　ｕ　Ｉ　ｉ’１位が導入されている。

Ｅ°６−３．２一部分的充填および／またはプランティ
ング Ｅ６．２．３に記載するようにＡｓｐ７１ｇまたはＣａ
１Ｉリンカ−で修飾したプラスミド（Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔ
ｅｔ−ＡｓｐおよびＲ５ＶｕＰＡ−Ｔｅ　ｔ−Ｃｌ　ａ
）の各々の１マイクログラムを、挿入されたリンカ−に
おいて、５０マイクロリツトルの緩衝液（最終体ｆり中
で５Ｕの適当な酵素で３７℃において消化して直線化す
ることによってさらに修飾しく１．５．１）、こうして
４または２のヌクレオチド突起末端を得ることができる
０次いで、ＤＮＡを抽出し、沈殿させ（１゜５．２およ
び１．５．３）、Ａｓｐ７１８の場合において２ミリモ
ルのｄＧＴＰのみを含有するか、あるいはＣａ１Ｉのプ
ランティングの場合においてｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの
各々を含有する適当な緩衝液（マニアチスら）の５０マ
イクロリツトル中に再溶解し、モして１２ＵのＥ、ｃ。

１ｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮアーゼ不含；Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）で室温において３０分間処理する。得
られた平滑末端のＤＮＡは常法で抽出し、沈殿させ、そ
して得られた沈殿の１０％を６ＵのＤＮＡリガーゼで１
００マイクロリツトルの適当な緩衝液中で（１，５，５
）１６時間自己ライゲーションさせる。抽出および沈殿
後、ＤＮＡ調製物の各々を５マイクロリツトルの水中に
再溶解し、そして１００マイクロリツトルのＥ、ｃ。

１ｉ　　ＤＨ５受容細胞を温度転換するために使用する
。テトラサイクリン陽性コロニーのうちで、正しいＩＪ
ｌ限パターンを有することについてのミニプレプ分析に
よって１つを選択し、そして、それぞれ、次のように命
名するニ ーＲ３Ｖ−ＳＡＤ、Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓｐ中の
Ａｓｐ７１８部位の部分的充填から、ここで新しいＥａ
ｇＩが導入されている； −Ｒ５Ｖ−５ＹＤ、Ｒ５ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ｃ１ａ中の
ＣａｌＩ部位の平滑末端の形成から、およびここで新し
いＮｄｅＩ部位が導入されている。

Ｅ６．４−ｒ中断されたＪ　ＧＡＳＧＡの発現および分
析 中断されたＧＡＳＧＡ発現ベクター、例えば、Ｅ６．３
に記載するものは、ＣＨＯ細胞中でＲ３Ｖ−Ｎｅｏで同
時トランスフェクシオンすることができ、そしてＲ５Ｖ
−Ｎｅ　ｏ抵抗性クローンを選択し、モしてＥ２．８に
記載するように分析することができる。［中断されたＪ
　ＧＡＳＧＡによるプラスミノゲンの活性化、免疫学的
特性およびｕＰＡレセプターの結合性質はＲ３ＶｕＰλ
−ＥＯを使用して得られたものに類似する０選択したク
ローンを分離し、そして発酵器中で選択的圧力を維持し
なたら増殖することができる（参照、Ｅ２．８）。

Ｅ６．５−二ピソームのベクター中の「中断されたＪ　
ＧＡＳＧＡの発現 「中断されたＪ　ＧＡＳＧＡを発現するエピソームのベ
クター、例えば、ＲＰＶに基づくベクター（参照Ｅ３）
は、Ｅ３に記載するＧＡＳＧＡ発現性、ＢＰＶに誘導プ
ラスミドの調製に本質的に従うことによって、エクソン
ＩＩからイントロンＪに及ぶＢｓ５ＨＩ／５ａｃＩ断片
（参照、第３Ａ図）を、Ｅ６．３に記載するＧＡＳＧＡ
発現ベクターから誘導された類似の断片で置換すること
によって発生させることができる。このようなエピソー
ムのベクターは、Ｅ６．４に記載するように、発言させ
かつ分析することができる。

Ｅ６．６−ＧＡＳＧＡの遺伝情報を指定する転写中位が
ｕＰＡプロモーターまたはその薄導体の転写制御下にあ
る、「中断されたＪ　ＧＡＳＧＡ発現性ミニ遺伝子を構
成する方法は、Ｅ５．４に記載されている０例えば、Ｅ
５に記載されているＧＡＳＧＡ発現性、ｐＸｓａＡ導プ
ラスミド（参照Ｅ４）の調製に本質的に従うことができ
る。このようなミニ遺伝子ｕＰＡ訪導ベクターは、Ｅ６
．４に記載するように発現させかつ分析することができ
る。

調製 ＰＩ−抗ＧＦＤモノクローナル抗体の調製ｔｃｕＰＡ／
ｓｃｕＰＡのＧＦＩ）領域に対して特異的なモノクロー
ナル抗体は、ｓｃｕＰＡ、ｔｃｕＰＡまたはそれらの混
合物で免疫化した動物からＩＩＩＩＩｉａ胞先祖が由来
している。ハイブリドーマから来る抗ｕＰＡ　　ＭＡＢ
の適切な選択によって得ることができる。この選択のた
めの便利なプローブは、Ｆ６と命名するペプチドの断片
であり、これは約６ｋＤの分子量、位置のロイシンの残
基から位置４３におけるグルタミン酸の残基までのｕＰ
Ａ配列に相当するアミノ酸配列を有し。

モしてｕＰＡのいわゆるＧＦＤ　（生長因子様ドメイン
）、すなわち、上皮生長因子の特徴ある配列に高度に騒
動するアミノ酸配列に相当する（包含するか、あるいは
それの一部に関連する）、この区域はｕＰＡがその細胞
表面レセプターへ結合するために原因をなすと考えられ
る。

Ｐｌ、１−モノクローナル抗体の産生 高度に精製された５４，０００ダルトンのウロキナーゼ
１２０　、０００　Ｉ　Ｕ／ｍｇ　（ＰＥＲ３ＯＬＶ＠
Ｌｅｐｅｔ　ｉ　ｔ）を使用して、生後７週の雌のＢａ
１ｂ／Ｃマウスを免疫化する。完全フロインドアジュバ
ント中のｌθマイクログラムのこのウロキナーゼを、融
合前６０日に、動物の腹腔中に注射する。

他のｌＯマイクログラムのウロキナーゼを３０１１後に
動物に与える。融合のｌ　ＯｆＩ　＋ｉＦｊに、抗つロ
キナーゼカ価の慣用のＥＬＩＳＡ方法によって起の静脈
から採取した血液試料中において測定し。

そして融合５日前に、ｌＯマイクログラムのウロキナー
ゼの最後のブースターを１：１０，０００より高い抗体
力価を有する動物にのみ静脈内に与える０次いで、融合
に日に肺臓を取り出し、そして肺細胞（約ｌＸｌ０”）
を約５Ｘ１０７のマウス骨髄Ｊ挿ＮＳＯ（Ｐ３／ＮＳ　
１／ｌＡｇの下位系統、ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ　　１
８）と１０％のＰＥＧ６０００中で融合する。

融合（Ｃ，ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＧ、１ｌｈｌｅｒの
方法に従って実施した）後、１０％の胎児仔ウシ血清を
補充したダルベツコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）お
よびＨＡＴ培地（０，１ミリモルのハイポキサンチン、
０．２５ミリモルの７ミノプテリン、０．０１７ミリモ
ルのチミジン、Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）中に再懸濁させ、そしてマウスマクロファージを含有
する５つの異なるコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）平板（フィ
ーダー層）上に配こする。

ＨＡＴ培墳を３日毎に交換し、そして、融合後１０日か
ら、上澄み液をＥＬＩＳＡイムノアッセイにおいて２〜
３日毎に抗ウロキナーゼモノクローナル抗体の存在につ
いて試験する。

Ｐｌ、２−抗ウロキナーゼモノクローナル抗体産生性ハ
イブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニング パールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉ　ｓｔ　ｒｙ、旦、８７３　（１９７１））の修正
法に従い、柔軟な９６水のマイクロタイタープレート（
Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、リン酸塩緩衝化塩類溶液ｐＨ７
，２（０，０５モルのリン酸ナトリウムｐＨ７，２，０
，５モルの塩化ナトリウムを含有する）中のウロキナー
ゼの２０マイクログラム／ｍｌの溶液の５０マイクロリ
ツトル／水で被覆し、そして室温において１時間インキ
ュベーションする。０．０５％のウィーンを含有するリ
ン酸１１！１衝化塩類溶液で完全に洗浄した後、水をリ
ンｍ塩緩衝化塩類溶液中の３％のウシ試料アルブミンで
室温において３時間飽和させて非特異的結合を排除する
。注意して洗浄した後、ハイブリドーマ培養物の上澄み
液５０マイクロリットル（または同一体積の腹水）を水
に添加し、そして室温において２時間反応させる０次い
で、プレートを洗浄し、そしてセイヨウワサビペルオキ
シダーゼと接合したウサギ抗マウスＩｇ（Ｐ２Ｓ５．Ｄ
ＡＫＯ）のｌ　：　１０００希釈物室温において９０分
間インキュベーションする。よく洗浄した後、プレート
を０．１モルのクエン酸塩緩衝液ｐＨ６，１，７ミリモ
ルのＨ２Ｏ２中の色ｉ体ｏ−フェニレルエチレンジアミ
ン（ＳＩＧＭＡ）の１ｍｇ／ｍｌの溶液の２００マイク
ロリツトル／水とともにインキュベーションする。

色は２０分以内に発生し、そして光学濃度を抗原または
抗体を含まないブランクに対して４９２ｎｍにおいて読
む０色レベルがブランクより４倍高い水は陽性と考える
。

Ｐｌ、３−イムノブロッティングによる抗ＧＦＤモノク
ローナル抗体についてのスクリーニング上のスクリーニ
ング（Ｐ　１　、２）において陽性であるクローンを、
さらに、下のＰ２に記載するようにして得られる、ｓｃ
ｕＰＡ、ｕＰＡおよびｕＰＡ断片Ｆｌ　２　、Ｂｌ配列
およびＦｓの存在下に、イムノブロッティングアッセイ
（Ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔ）によって分析する。こ
れらの参照化合物は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２０％のアク
リルアミドを含有する）実験（参照１　、５　、７）に
おいて並行に展開し、そして上に報告したＥＬＩＳＡア
ッセイにおいて陽性であったクローンの上澄み液に対し
て分析する。

断片ＦＩ２またはＢｌｌに結合しないで、５ＣｕＰＡお
よびｕＰＡ断片Ｆ６に結合するＭＡＲを分離し、そして
産生性クローンをさらに培養して十分な量のそれらを産
生ずる。ＧＦＤ特異性（すなわち、他のｕＰＡ領域に結
合する滝力をもたない）を有するＭＡＲを産生じた２つ
のクローンを分離し、そしてＣＤＩおよびＤＣ６と命名
する（参照、表３）。

Ｐｌ、４−抗ウロキナーゼ産生性ハイブリドーマの大量
培養 抗ウロキナーゼ産生性ハイプリドーマを選択し、制限希
釈によってクローニングし、大量培養において増殖させ
、そして０．５ｍｌのプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ）（
２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）で前もって処置したＢａ１ｂ／Ｃマウスの
１復腔中に注射する。　ｊｆｌ！木を１５日後に集める
。抗ウロキナーゼ抗体の濃度は、１０−２０　ｍ　ｇ　
／　ｍ　ｌである。

それらをプロティンＡ−セファロースまたはウロキナー
ゼ−セファロース親和クロマトグラフィーによって精製
する。

Ｐｌ、５−セファロース−ウロキナーゼの親和クロマト
グラフィーによる抗ウロキナーゼモノクローナル抗体の
精製 ′　セファロース−ウロキナーゼ接合体は、ＣＮＢｒ活
性化セファロース４ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）高分子
量ウロキナーゼ（１２０，０ＯＯＩＵ／ｍｇ）の反応に
よって調製する。カップリング効率は、約２０ｍｇのウ
ロキナーゼ／　ｍ　ｌ膨潤ゲル程度である０次いで、上
のようにして得られた腹水（１ｍｌ／産生性ハイブリド
ーマ）を、０゜０１モルのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
８，０中で予備平衡化したセファロース−ウロキナーゼ
親和カラム（１，６ｃｍＸ１５ｃｍ）・に適用する。

同一緩衝液ですすいだ後、選択的に吸着した抗ウロキナ
ーゼモノクローナル抗体を０．１モルの酢酸ｐＨ３，０
で溶離する。抗体を含有する分画をプールし、そしてＰ
ＳＤＥＯ９００５ミリポア膜を使用する限外ろ過によっ
て濃縮し、そして使用するまで凍結して貯蔵する。

Ｐｌ、６−ゲル−電気泳動によるモノクローナル抗体調
製物の純度および均質度の評価上で得られたモノクロー
ナル抗体を、Ｗ、Ｋ。

Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７．６８０（１９
７０）に記載される方法に従って、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　
（ドデシルリン酸ナトリウム　ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動にかける。ＩｇＧの黴類および軽鎖の相当す
るバンドのみが明らかであり、上の溶離物が純粋な免疫
グロブリンを含有することを示す。

Ｐ２−ｕＰＡ断片Ｆ６．ＢＩＩおよびＦ１２（７）調製 ａ）ＡＴＦの酵素的切断および産生された断片（Ｆ６　
、　Ｂｔ　＋およびＦ１２）の同定ｕＰＡアミノ末端断
片（ＡＴＦ）（１，１ｍｇ）　　［ストッペリ（Ｓｏｔ
ｏｐｐｅｌｌｉ）Ｍ。

Ｐ、ら、プロシーデインゲス・オン・ナショナル・アカ
デミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、１９
８５．８５．４９３９−４９４３に従って調製した］を
、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔ　ａｐｈＶ　
ｌ　ｏｃｏｃｃｕｓ　　ａ　ｕ　ｒ　ｅ　ｕＳ）誘導プ
ロテアーゼＶ８　（５０ミリモル、　　ｐＨ７，８）で
３７℃で９０分間処理する。これらの条件下で、プロテ
アーゼｖ８はＡＴＦをグルタミン酸残基のカルボキシル
側〒切断する。酵素反応を混合物を２分間沸鳴させるこ
とによって遮断し、そしてそのようにして得られた蛋白
質断片を５ＤＳ−ＰＡＧＥ断片（２０％のアクリルアミ
ド）で分析し、そしてもとのＡＴＦと比較する。

ＡＴＦに相当するバンドはもはや存在しないが、所定の
分子量をもつ標準との比較によって決定して、それぞれ
、１２，０００．１１，０００および６０００の見掛け
の分子量をもつ３つのバンドが観測される。

ｂ）断片Ｆ６．ＢＩＩおよびＦＩ２の親和クロマトグラ
フィーの分離 りで得られた混合物を５Ｂ４−７ガロースマトリツクス
上に装入する（このマトリックスはモノクローナル抗体
、５Ｂ４、を有するアガロース変性マトリックスであり
、このモノクローナル抗体は低分子賃の解体に結合しな
いで高分子量のウロキナーゼと結合し、この変性マトリ
ックスは、Ｃｏｒｔｉ　　Ａ、、Ｎｏ１ｌｉ　　ＭＬ、
、５ｏｆｆｉｅｎｔｉｎｉ　　Ａ、およびＣａ５ｓａｎ
ｉＧ０、Ｔｈｒｏｍ、　　Ｈａｅｍａｓｔａｓ。

１９８６．５６，２１９−２２４に記載されるように、
慣用の方法に従って調製した）、この方ラムを０．１５
モルの）１１化ナトリウムおよび１％のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）６０００を含有する０、０５モルの
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４と前もってモ衡化し
た。

Ｃ）結合しない分画の回収 均衡化緩衝液をカラムに通過させ、そして分画を集め、
紫外線で監視しく２８０ｎｍ）そしてそれらの含量に依
存してプールする。２つの主要なプールした分画が得ら
れ、その１つは１２，０００の見掛は分子量を有するｕ
ＰＡ断片（これをＦＩ２と命名する）であり、そして他
の１つは６０００の見掛は分子量を有するｕＰＡ断片（
これをＦ６と命名する）である、これらの断片を、下の
ｅ）に記載するように、イオン交換クロマトグラフィー
にかけし、次いで逆相クロマトグラフィーにおいて脱塩
することによって精製する。

ｄ）結合した分画の回収 次いで、マトリックスに結合した分画を、１モルの塩化
ナトリウムおよ、び１％のＰＥＧ６０００を含有する０
、１モルの酢酸で溶離する０分画を集め、紫外線（２８
０ｎｍ）で監視し、そしてそれらの金層に従ってプール
する。単一の主要な分画が得られ、これは１１．０００
の見掛は分子量をもつｕＰＡ断片（Ｂ＋＋と命名する）
を含有し、そして下に記載するように精製する。

ｅ）断片Ｂｌ　１　、Ｆ６およびＦｔ’ｚの精製りで得
られた、断片ＢＩ１．ＦＩ２またはＦ６を、別々に、含
有するプールした分画を、さらに、０．０５モルの酢酸
ナトリウム緩衝液ｐＨ４，８で前もって平衡化したモノ
（Ｍｏｎｏ）ＳＨＲ５１５カラム（狭い粒子サイズ分布
をもつ親木性樹脂ビーズに基づく強力チオン交換体；帯
電した基は−ＣＨ２ｓｏ３である）を使用するＦＰＬＣ
（急速蛋白質液体クロマトグラフィー）系（ファーマシ
ア・ファインΦケミカルス、スウェーデン）中のイオン
交換クロマトグラフィーによって精製および濃縮する。

溶離は、０−１モルの水性塩化ナトリウムの直線の勾配
で６０ｍ１／時間で４５分間実施する。

次いで、別々に、断片ＢＩ　Ｉ　、Ｆ６およびＦ１２を
含有する分画を、１．６．３に記載するように７相方ラ
ムクロマトグラフイーにかけて脱塩する。純粋な断片を
、それらを含有する断片から、溶媒の減圧蒸発によって
単離する。

ｆ）Ｆ６．Ｂｌ　＋およびＦＩ２のアミノ酸配列決定 分画Ｆ１２およびＢｌｌのＮ−末端配列は、自動配列決
定装置（アプライド・バイオシステムス、４７０Ａ型、
気相）によって決定し、そして少４（の汚染物質をもつ
主要断片から構成される各ピークが得られ、一方Ｆ６は
単一の蛋白質であった（表４）、断片の配列は、グルタ
ミン酸残基のカルボキシル側においてｖ８によって優先
的に切断されることを示す、断片Ｆ１２および断片８１
１は、位置５２および５３の間のクリッピング（ｃｌｉ
ｐｐｉｎｇ）についてのみ異なる。断片Ｆ６（７）分子
かは、位２１１Ｇｌｕ３およびＧ　Ｉ　ｕａ　３におけ
るＡＴＦをクリッピングすることによって得られるペプ
チドに相当する。したがって、■８はペプチドをＧＦＤ
領域において切断し、そして２つのペプチドはいわゆる
「クリングル」領域に本質的に相当する（切断部位によ
ってのみ異なる）。

マ フ 太 り 工 本発明の主な特徴および態様は、次の通である。

１１変更された生長因子様ドメインを含有する県域を有
するヒト尿プラスミノゲンアクチベーター誘導体。

２、アミノ酸９およびアミノ酸５０の間の領域うζ変更
されている上記第１項記載のヒト尿プラスミノゲンアク
チベーター誘導体。

３、アミノ酸９およびアミノ酸４５の間の領域＞（変更
されている上記第１項記載のヒト尿プラスミノゲンアク
チベーター誘導体。

４、アミノ酸１９およびアミノ酸３２の間の領成が変更
されている上記第１項記載のヒト尿プラスミノゲンアク
チベーター誘導体。

５、自然ｓｃｕ−ＰＡの欠失誘導体である上記Ｋｌ、２
．３または４項記載のヒト尿プラスミノｉンアクチベー
ター誘導体。

６、アミノＭ９からアミノ酸４５までのアミノ虜配列が
チロシン単位で置換されている上記第１頁記載の化合物
。

ａ）ＧＦＤ領域における自然ｓｃｕ−ＰＡまたはｕＰＡ
を化学的に修飾するか、あるいはｂ）前記ＧＦＤの遺伝
情報を指定するｕＰＡ領域を、欠失、挿入または部位特
異的突然変異によって変更する、 ことを特徴とする上記第１１２．３．４．５または６項
記載の化合物を製造する方法。

８、適当な動物細胞中に、タンパク質ＧＦＤの遺伝情報
を指定する領域に欠失をもっゲノム由来のｕＰＡ解読領
域を含有する発現ベクターを挿入し、そして形質転換し
た細胞を培養した後、上記第１，２．３．４．５または
６項記載のヒト尿プラスミノゲンアクチベーターを回収
する工程を含む上記第７項記載の方法。

９、欠失は９〜５０のアミノ酸配列の遺伝情報を指定す
るＤＮＡ領域中に存在する上記第８項記載の方法。

１０、欠失は９〜４５のアミノ酸配列の遺伝情報を指定
するＤＮＡ領域中に存在する上記第８項記載の方法。

１１、欠失は１９〜３２のアミノ酸配列の遺伝情報を指
定するＤＮＡ領域中に存在する上記第８項記載の方法。

１２、欠失はゲノムＤＮＡ解読配列のｂｐｌ。

２７およびｂｐ１７８４の間である上記第８項記載の方
法。

１３、製薬学的に許容されうる担体と混合して上記第１
，２．３．４．５または６項記の化合物を含有する製薬
学的組成物。

１４、薬物として使用するための上記第１，２．３．４
．５または６項記の化合物。

１５、血栓防止処置のための薬物を調製するための上記
第１，２．３．４．５または６項記の化合物の使用。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明をさらに例示することを意図し、そし
て説明および特許請求の範囲における図面の参照は主と
して例示を目的とし、そして本発明の範囲の限定を意図
していない。図面の簡単な説明は、図面および全体とし
て本発明の理解を意図している。 第１図は、ｕＰＡ遺伝子、ｍＲＮＡおよび蛋白質の構造
を示す。 上から下に向かってニ ー　ファージラムダ−ｕＰＡ２中のｕＰＡ遺伝子のイン
サートの制限地図； −ファージラムダ−ｕＰＡｌ中のｕＰＡ遺伝子のインサ
ートの制限地図ニ ー　「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ｊの制
限地図（Ｂａ：　ＢａｍＨＩ　；Ｅ　Ｉ　：ＥｃｏＲＩ
　；Ｓ：ＨＩ　Ｉ　Ｉ　：Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ）　　；
−ヒトｕＰＡ遺伝子のエクソン／イントロンの構造ニブ
ラックボックス（ｂｌａｃｋ　　ｂｏｘ）　：非翻訳５
′および３′領域：シャドウドボックス（ｓｈａｄｏｗ
ｅｄ　　ｂｏｘ）　：翻訳エクソン；線：イシトロン； 一部分的にアンズブライスされたｃＤＮＡクローンｐＨ
ＵＫ１のエクソン／イントロンの構造ニ ー　ｐｒｏ−ｕＰＡ　　ｍＲＮＡにおけるエクソンとア
ミノ酸との間の対応ニ ー　ｐｒｏ−ｕＰＡにおける蛋白質領域とアミノ酸との
間の対応； 第２図は、ＲＳＶ−ｕＰＡの構成を示す。 ラムダＯｕ　ＰＡ　ｌから得られたｕＰＡ　　ｍＲＮＡ
についての完全なＯＲＦを含有するＳｍａｌ　　ＤＮＡ
断片（この図面の上部参照）を、Ｈｉｎｄｌｌ■および
Ｈｐａ［消化によって得られ、バクテリアのプラスミド
の機能およびＲＳＶのＬＴＲを有するプラスミドＲＳＶ
−Ｎｅｏ中に挿入する（この図面の左部分参照）、ＲＳ
Ｖ−ｕＰＡは、Ｒ５ＶＬＴＲ中に含有されるプラスミド
の制御下にｕＰＡ　　ＯＲＦを有し、そして適当な真核
宿主中に挿入されたとき、蛋白質を発現することができ
る。 第３図は、ＧＡＳＧＡの発現ベクターの構成を示す。 次の詳細な制限地図およびエクソン／イントロンの構造
： Ａ）ヒトｕＰＡ　　０ＲＦ（ボックス：エクソン；線：
イントロン）； Ｂ）プラスミドＲ３ＶｕＰＡ中のエクソンＩＶを取り囲
む領域の拡大、これは、また、２つの隣接エクソンなら
びに対応するアミノ酸に分割されたコドン中のヌクレオ
チドを示す。 Ｃ）　ＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａｐｅｓ　（左）およびＲＳ
ＶｕＰＡＢ＞８上と同一の領域（第３図）： Ｄ）Ｒ３ＶｕＰＡ−ＥＯ，（左）および（右）のＯＲＦ
におけるＧＦＤ領域の構造；キメラのプラスミドにおい
てつくられた新しいコドンおよびアミノ酸は地図の下に
示されている；Ｒ３ＶｕＰＡ、〉、から来るエクソンは
ｒｌＪで示されており、一方ＲＳ　Ｖ　ｕ　Ｐ　Ａｍ＞
ｘから来るものは「２」で識別されている。 第４図は、ｐＢＲＶ２３０．８の制限地図を示す。 ｐＢＲ３２２誘導体ｐＭＬ２ｄをＢＰＶ−１ゲノムの独
特ＢａｍＨ１部位に挿入し［セイμ−（Ｓ　ａｖｅｒ）
ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（
Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　）　、５．３
５０７；１９８５）］そして形質転換領域の３′末端に
隣接するＢａｍＨ１部位を５ａｌＩに修飾する。 第５図は、ヒトｕＰＡ発現ベクターの構成を示す。 プラスミドＲ５ＶｕＰＡは、２つの独特制限部位、Ｎｄ
ｅｌおよびＡｐａｌを有し、これらはＸｈｏＩで修飾し
てプラスミドｐ７１を得る。前者から、ｕＰＡ発現カセ
ット（この図面の下を参照）をＸｈｏｌ消化似よって得
ることができる。この断片は、２つのＸｈｏＩおよび／
または５ａｌＩの間に挿入するために適当であり、ヒト
ｕＰＡ遺伝子の転写を誘導することができる。 第６図は、エピソームのベクター中（７）Ｒ５Ｖ−ｕＰ
Ａ構成体の挿入を示す。 プラスミドｐＢＲＶ２３０．８を、３つのウィルス部位
ＢａｍＨＩ　、　Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉおよび５ａｌＩの
１つで置換して修飾して、それぞれ、ｐＢＢ、ｐＢＨお
よびｐＢＳを得る。新しいＸ　ｈｏ　Ｉは、各誘導され
たベクターにおいてボックスで囲われている。 Ｘｈｏｌリンカ−の挿入およびｐＢＢおよびｐＢＳ中の
Ｘ　ｈｏ　１部位のフランキングから得られた新しいＢ
ａｍＨＩおよび５ａｌＩ部位が示されている。３つのプ
ラスミドにおいて、ＲＳＶ／ｕＰＡ構成体（第３図参照
）を、Ｘ　ｈｏ　Ｉ部位中に挿入して、次のプラスミド
を得るニ ー　ｐＢＢｕＰＡａ、ｐＢＨｕＰＡａおよびｐＢＳｕＰ
ＡａｌここでｕＰＡおよびＢＰＶのｍＲＮＡは同一方向
に転写されている； −ｐＢＢｕＰＡｂ、ｐＢＨｕＰＡｂおよびｐＢＳｕＰＡ
ｂ、ここでｕＰＡのｍＲＮＡおよびＢＰＶのｍＲＮＡは
反対方向に転写されている。 第７図は、ＢＰＶ誘導ベクターちゆうのｕＰＡＯＲＦの
修飾を示す。 ｕＰＡ　（Ａ）　、ＧＡＳＧＡ−ＥＯ（Ｂ）およびＧＡ
ＳＧＡ−Ｒ２（Ｃ）を発現するＢＶＰ誘導ベクターのフ
ローチャート。上部にはｐＢＶＰ２３０．８　　Ｘｈｏ
Ｉ誘導体が示されており、左にはＲ５Ｖ／ｕＰＡカセッ
トを与えるＲ３Ｖ−Ｎｅ　。 誘導発現ベクター（ｕＰＡ発現ベクター）（第７Ａ図）
または、それぞれ、Ｒ３ＶｕＰＡ−ＥＯおよびＲ５Ｖｕ
ＰＡ−Ｒ２から誘導するＢｓ５ＨＩ／５ａｃＩ断片（Ｇ
ＡＳＧＡ発現ベクター、第７Ｄ図および第７Ｃ図）が示
されいる。 第８図は、ｐｕＰＡ２の構成を示す。 プラスミドｐＥＭＢＬ８−ＣＡＴは、ｐ　ＥＭＢＬ８か
ら、Ｃ１ａＩとＨｉｉｄｌ　Ｉ　Ｉとの間の断片をバク
テリアのＣＡＴ遺伝子を有する断片で置換することによ
って誘導される［デンテ（Ｄ　ｅｎｔｅ）ら、核酸の研
究（Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、１６
４５−１６５５　；　１９８３］　、ｕＰＡプロモータ
ーを含有するＳ　ｍａ　Ｉ断片をＣＡＴ遺伝子から上流
に挿入して、適切な向きのフレームにプロモーターを有
するプラスミドｐｕＰＡ２（この図面において右側）を
生成する。 第９図は、ヒトｕＰＡプロモーターの配列を示す。 ラムダ−ｕ　Ｐ　Ａ　ｌ　７７−ジＤＮＡからの２．３
３ｋｂのＳ　ｍａ　Ｉ断片の配列が示されており、この
配列はｍＲＮＡ出発点、ＴＡＴＡボックスおよびｕＰＡ
プロモーターの上流の調節領域を含有する。地図上の＋
１ヌクレオチドは、プライマー延長分析を用いて、リチ
オ（Ｒ１ｃｃｉｏ）らが記載されるＵＰＡ　　ｍＲＮＡ
中の第１ヌクレオチドに相当する。 第１Ｏ図は、ｕＰＡプロモーターおよびその誘導体の制
限地図を示す。 ｐｕＰＡ２修飾プラスミドのこの制限地図は、ＵＰＡプ
ロモーターが修飾された場所を示し、とくに次のものを
示すニ ー　　ｐｕＰＡ２／４１．ここでプロモーターの５′末
端におけるＳ　ｍａ　１部位はＸｈｏｌに転化されてい
る； −ｐｕＰ　Ａ　２　／　１７、ここで２つの０ｘａＮＩ
部位の間の領域は欠失されている： ｐｕＰＡ２／２５４、ここで５’０ｘａＮ１部位とＥｃ
ｏＲＶ部位との間の領域は欠失されている。 第１１図はｕＰＡプロモーター誘導ベクターを示す。 第１１Ａ図は、プラスミドｐｕＰ　Ａ　２　／　４　Ｌ
、　ｐｕＰＡ２／１７およびｐｕＰＡ２／２５４の制限
地図を示す。 第１１Ｂ図は、プラスミドｐＰＰ４１．ｐＰＰ１７およ
びｐＰＰ２５４の制限地図を示し、これらのプラスミド
は、それぞれ、プラスミドｐｕＰＡ２／４１．ｐｕＰＡ
２／ｌ　７およびｐｕＰＡ２／２５４から、ＣＡＴ遺伝
子を５ａｌｌ／Ｘｈｏｌ消化による切除および５ａｌＩ
のライゲイジョンによって得られる。これらのベクター
は、ｕＰＡプロモーター（またはその誘導体）　、ＴＡ
ＴＡボックス、およびｍＲＮＡ出発点を含有し、そして
、それらを、例えば、平滑末端のＳ　ｍａ　１部位に挿
入するか、あるいはＭｂｏｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｂｃｌおよ
びＢａｍＨＩ末端を有する断片をもつＢａｍＨ１部位に
挿入することによって、遺伝子またはｃＤＮＡを発現す
るために使用できる。これらの構成体は、Ｘ　ｈｏ　Ｉ
および５ａｌＩを使用する二重消化によって切除するこ
とができる。同一二重消化を使用してプロモーター構成
体を切除して、それを、「発現カセット」として、発現
すべき遺伝子またはｃＤＮＡに対して５′の異なるプラ
スミド中に挿入することができる。黒い円形は複製のプ
ラスミド起源を示す。 第１１Ｃ図は、プラスミドｐＰＰ４１Ｘｓ。 ｐＰＰ１７Ｘｓ８よびｐＰＰ２５４ＸＳを示し、これら
は、それぞれ、ｐＰＰ４１、ｐＰＰ１７およびｐＰＰ２
５４から、ｕＰＡ　　ＯＲＦを含有する７、３ｋｂのＳ
ｍａＩ断片をプラスミドＳ　ｍａ　！部位中に挿入する
ことによって誘導される。 第１２図は、ミニ遺伝子誘導ＧＡＳＧＡ発現ベクターの
構成を示す。 ｕＰＡ発現ベクター（ｐＰＰ：：ＸＳ、第１２Ａ図）を
、ｕＰＡ　　ＯＲＦにおいて修飾して、エクソン■ｖを
欠失しくｐＰＰ：　：ＸＳ−ＥＯ１第１２Ｂ図）、ある
いはそれを複製する（ｐＰＰ：：ＸＳ−Ｅ２、第１２ｃ
図）。 第１３図は、ｕＰＡレセプターの結合アッセイを示す。 この図面は、ＧＡＳＧＡ−ＥＯベクター形質転。 換したＣＨＯ細胞から培養上澄みを添加したときの、Ｕ
９３７上の”Ｊ−ＤＦＰ−ＵＫのｕＰＡレセプターへの
結合の阻害を示す。標識しないＵＰＡは陽性の対照とし
て存在する。 第１４図は、Ｒ３ＶｕＰＡ−４９の構成を示す。 Ｒ５ＶｕＰＡ−４９は、エクソンＩＶに実質的に相当す
る欠失をもつｕＰＡ　　ＯＲＦを含有する発現ベクター
である（すなわち、ＧＦＤ解読領域）（参照、この図面
、右下部分）。それは、プラスミドの大部分を含有する
が、エクソンＩＩＩおよびＩＶを欠（ＲＳ　Ｖ　−ｕ　
Ｐ　Ａｍ＞ｘ断片（この図面、右上部分）をイントロン
Ｂの３′位置からイントロンＣの５′位置へのＨｉｎｄ
ｌ　Ｉ　Ｉ　−５ａｌｌプラスミド断片（参照、この図
面の中央下部）と結合することによって得られる。前述
のＲＳＶ−ｕＰＡ８〉８断片はＲＳ　Ｖ−ｕＰ　Ａｍ＞
ｘのＨｉｎｄｌｌｌおよびＸ　ｈｏ　Ｉ消化によって得
られ（第２図）、これに対してＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−５
ａｌＩ断片（これは実質的にエクソンＩＩＩに対応する
）は、５ａｉｌリンカ−で修飾された末端をもつｐ７１
（第５図参照）のＰｓｔｌ消化から誘導されたグラスミ
ド断片のＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化によって得られる。 第１５図は、プラスミド（ＲＳＶ−Ｇ−Ａｓｐ）（参照
、この図面の下部）は、ＲＳＶｕＰＡ（参照、この図面
の上部）を５ａｌＩで部分的に消化し、末端をＡｓｐ７
１８リンカ−で修飾し、そして適当な制限パターンを選
択することによって構成される。このベクターは、フレ
ームの外に存在する挿入から下流にｕＰＡ　　ＯＲＦを
もつ。 第１６図は、ｐＢＲ１３−Ｔｅｔの構成を示す。 プラスミドｐＢＲ１３Ｔｅｔは、この図面（ｂ）の下部
に表わされている。それは、ｐＢＲ３２２中のアンピシ
リン抵抗性遺伝子の大部分をＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌ
　Ｉ　Ｉによる消化によって欠失し、そして突起する末
端を平滑した後プラスミドを再円形化することによって
得られる。このプラスミド（ｐＢＲ１３Ｔｅｔ、参照ｂ
）から、テトラサイクリン抵抗性遺伝子および複製の起
源を含有するＮｄｅｌ／Ｐｖｕｌ　Ｉ断片は、それ自身
のポリアデニル化部位（ＰＡＳ）に加えてＲ５Ｖプロモ
ーターおよびヒトｕＰＡ遺伝子を含有するＲ　Ｓ　Ｖｕ
Ｐ　Ａ（参照Ｃ）からのＮｄｅｌ／Ｈｐａｌに結合され
ている。 第１７図は、リンカ−修飾Ｒ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ誘導体
の構成を示す。 ｕＰＡエクソンＩＶ中に独特５ａｌＩを含有するプラス
ミドＲ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ（参照、この図面の上部）を
、５ａｉｌで直線化し、モしてＡｓｐ７１８リンカ−で
結合することによって、Ｒ３Ｖｕ　ＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓ
ｐと命名するプラスミド（左下）を得るか、Ｃ１ａｌリ
ンカ−と結合することによってＲ５Ｖｕ　ＰＡ−Ｔｅｔ
−Ｃ１ａと命名するプラスミド（中央下）を得るか、あ
るいはＸｈｏｌりン力−と結合することによってＲＳＶ
ｕＰＡ　−Ｔｅｔ−Ｘｈｏｌと命名するプラスミド（右
下）を得る。これらのプラスミドは、もはやフレーム中
に存在しない挿入から下流のｕＰＡ解読領域を有する。 第１８図は、ＤＮＡおよび中断されたＧＡＳＧＡのアミ
ノ酸配列を示す。 フレーム中に存在しない挿入から下流のｕＰＡ解読領域
を有するグラスミドＲ３ＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓｐ、Ｒ
ＳＶｕＰＡ−ＴｅＬ−Ｃ１ａ、ＲＳＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−
ＸｈｏＩは、ポリリンカー誘導部位に対して特異的な酵
素により消化し、および突起末端を部分的または完全に
充填して適切なリーディングフレームを復元することに
よって修飾される。 欄の上部の「修飾部位」は、出発プラスミドの方法した
部位を意味する（例えば、Ａｓｐ７１８は、出発物質と
して使用して、この図面において報告したプラスミド、
すなわち、部分的充填の場合において、Ｒ５Ｂ−５ＡＤ
、あるいは完全な充填の場合ニオイテ、Ｒ５Ｖ−ＳＶＲ
ＴＤを得た、ＲＳＶｕＰＡ−Ｔｅｔ−Ａｓｐの独特部位
を示す）。この図面は、まｔ；、充填とともに導入され
た制限部位を示す。図面において、（１）はＲＳＶｕＰ
Ａ−Ｔｅｔ誘導体中の部分的に充填されかつ平滑にされ
た部位を示し、（２）はＲＳＶｕＰＡ−Ｔｅｔ誘導体中
の完全に充填された部位を示し、そして（３）はＲ５Ｖ
−ｕＰＡ誘導体中の平滑にされた部位を示す。 ｐｓｐｖ　２３０．８ Ｆｉｇ、　４ ヒトｕＰＡ　プロ七−ター配列 Ｆｉｇ、　９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、変更された生長因子様ドメインを含有する領域を有
   することを特徴とするヒト尿プラスミノゲンアクチベー
   ター誘導体。 ２、 ａ）ＧＦＤ領域における自然ｓｃｕ−ＰＡまたはｕＰＡ
   を化学的に修飾するか、あるいはｂ）前記ＧＦＤの遺伝
   情報を指定するｕＰＡ領域を、欠失、挿入または部位特
   異的突然変異によって変更する、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の化合物を
   製造する方法。 ３、製薬学的に許容されうる担体と混合して特許請求の
   範囲第１項記載の化合物を含有することを特徴とする製
   薬学的組成物。 ４、薬物として使用するための特許請求の範囲第１項記
   載の化合物。 ５、血栓防止処置のための薬物を調製するための特許請
   求の範囲第１項記載の化合物の使用。