JPH01128793A - ブドウ球菌の莢膜性多糖類の製造方法、得られた多糖類、これらの多糖類の使用及び前記方法を実行するための菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
）の莢膜性多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃ
ｃｈａｒｉｄｅｓ）の製造方法に関し、より特定的には
、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａ
ｕｒｅｕｓ）に特有の莢膜性多糖類の製造方法に関する
ものである。

〔従来の技術〕

黄色ブドウ球菌は、多くの毒素及び酵素をも含めて、非
常に多数の細胞外及び細胞内抗原を生成する。これらの
代謝産物が食中毒及び膿瘍の発生に関係していることは
、充分に立証されている。その一方で、これらの抗原の
存在と、黄色ブドウ球菌の侵入性、即ち敗血症を引き起
こす性質との間に何らかの関係を確立することはできな
かった。

莢膜性多ｔＪ！Ｉは、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌
および髄膜炎菌などのような細菌の場合の病原性の因子
であることが周知である。このことは、ブドウ球菌の莢
膜化された菌株を単離しようとする多くの試みが何故に
行われてきたかの理由である。幾つかの莢膜化された菌
株は、文献に記載されている（菌株　スミス、エム・ア
ンド・ティー）。しかしながら、患者から単離された黄
色ブドウ球菌は、寒天ゲル上でコロニーを調べた場合、
或いは微生物を顕微鏡で観察した場合に莢膜を欠いてい
るという事実があり、これが殆どの研究者を、この細菌
は莢膜化されていないという結論に導いていた。

それにもかかわらず、１９７０年以降に発行の刊行物で
カラカワ氏（Ｗａｉｔｅｒ　Ｌ　Ｋａｒａｋａｗａ）は
、−方では幾つかのブドウ球菌の臨床分離物について莢
膜性多糖類の存在を示し、他方では莢膜抗原が細菌を多
形核白血球による食菌作用から保護しているということ
を示した。１９８０年に、カラカワ氏及びパン氏（Ｗｉ
ｌｌｉｅ　Ｖａｎｎ）は、本質的に免疫学的な規準によ
って、黄色ブドウ球菌の少なくとも８つの莢膜種の存在
を立証した（ロビンズ（Ｊ、Ｂ、Ｒｏｂｂｉｎｓ）　＋
ヒル（Ｊ、Ｃ６Ｈｉｌｌ）及びサドフ（Ｊ、Ｃ，Ｓａｄ
ｏｆｆ）ｍ集、ニューヨークのシーム・ストラットン社
（Ｔｈｉｅｍｅ　５ｔｒａｔｔｏｎ　Ｉｎｃ、）発行の
伝染病セミナー第４巻、細菌ワクチン所載、第２８５か
ら２９３頁、黄色ブドウ球菌の莢膜性多糖類）。

タイプ８の莢膜性多糖類の精製、並びに生化学的及び免
疫学的特性指摘は１９８４年に実行され（フォルニエ（
Ｊ、Ｍ、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）その他、感染と免疫（Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　Ｉｍｎ＋ｕｎ、）４５号、８７−９３頁）
、また黄色ブドウ球菌の莢膜の類型付けについては１９
８５年に記載されている（カラカワその他、臨床微生物
語（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　２２
号、４４５−４４７頁）。

患者から単離された多数の黄色ブドウ球菌の菌株につい
て実施された疫学的研究が示すところによれば、これら
の菌株の７０から８０％が莢膜性多１１１１５及び８の
一方又は他方を有している（例えばアルバイト（Ｒ，Ｄ
、　Ａｒｂｅｉ　ｔ）その他、微生物伝染病の診断（Ｄ
ｉａｇｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、）　２号、８５−９１頁、１９８４年）。

莢膜性多糖類５及び８に対する特異な単分技系（ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａυ抗体は既に調製されている（ホッヒケッ
ペル（Ｈ，に、Ｈｏｃｈｋｅｐｐｅｌ）その他、臨床微
生物語２５号、５２６−５３０頁、およびネルス（Ｍ、
Ｊ。

Ｎｅ１１ｅｓ）その他、感染と免疫４９号、１４−１８
頁、１９８５年）。

コアギュラーゼ陽性（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｐｏｓｔ　
ｔｉｖｅ）なブドウ球菌（凝固酵素陽性なブドウ球菌）
、即ち遊離コアギュラーゼを生成する（バージ−便覧（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ）を参照のこと）ブド
ウ球菌である黄色ブドウ球菌に加えて、コアギュラーゼ
陰性（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）なブド
ウ球菌、即ち遊離コアギュラーゼを生成しないブドウ球
菌の多くの種が知られている。これらのコアギュラーゼ
陰性な種は、クルース氏（Ｋｌｏｏｓ）及びシュライフ
ァー氏（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ）によって分類されている
（細菌学システム誌（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）　２５号、５０−６１頁、６２−
７９頁）。

それらのコアギュラーゼ陰性な種のうち、次のものにつ
いて言及しておく： スタフィロコッカス・シムランス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｍｕｌａｎｓ）
スタフィロコッカス・キシロサス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｘｙｌｏｓｕｓ）ス
タフィロコッカス・コーニー （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｈｎｉｉ）スタ
フィロコッカス・サブロフィティクス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ　５ａｐｒｏｐｈｉｔｉｃｕｓ）スタフ
ィロコッカス・ハエモリティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）スタフィロコ
ッカス・ワルネリ （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｗａｒｎｅｒｉ）ス
タフィロコッカス・ホミニス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ）表
皮ブドウ球菌 （ｓｔａｐｈｙｌｏｃ、ｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓ）スタフィロコッカス・キャビテイス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｐｉｔｉｓ）こ
れらのコアギュラーゼ陰性なブドウ球菌は、通常はヒト
及び動物に対して病原性はない。黄色ブトろ球菌に関し
て記述されたのと同じ莢膜性多糖類は、コアギュラーゼ
陰性なブドウ球菌の菌株においては識別されていない。

逆に、前述のネルス氏（Ｍ、　Ｊ、　Ｎｅ１ｌｅｓ）ら
は表皮ブドウ球菌のうち３つの菌株は、タイプ５又はタ
イプ８の莢膜性多糖類を生成しないということを示して
いる。

〔発明の解決しようとする課題〕

本発明者は、コアギュラーゼ陰性なブドウ球菌のある種
の菌株は、黄色ブドウ球菌の莢膜性多糖類と同じ莢膜性
多糖類！類を、しかも通常は黄色ブドウ球菌よりも多量
に生成するということを見出した。ヒトにおけるこのよ
うな菌株の単離頻度は約２％である。

従って本発明の課題は、黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性
多糖類を調製するための方法であって、かかる莢膜性多
糖類の単離のためにブドウ球菌のコアギュラーゼ陰性な
菌株を使用することを含む方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

かかる課題を解決するために本発明が主題とするところ
は、特定的に言えば、 ａ−ブドウ球菌のコアギュラーゼ陰性な菌株から、黄色
ブドウ球菌に特有の莢膜性多糖類を生成する菌株を選択
すること、 ｂ−選択した菌株を培養すること、 Ｃ−莢膜性多糖類を抽出すること、及びｄ−莢膜性子Ｉ
Ｊ！類を精製すること からなる方法を提供することである。

本発明の別の主題は、特にこれらの多糖類を黄色ブドウ
球菌に対するワクチンとして適用すること、並びに診断
用試薬として、及び黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性子＊
ａを生成するための単離され選択された菌株として適用
することである。

黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性多１７！類を生成する菌
株の選択は、 −溶液中において使用されるか又は例えばうテックス粒
子の如き支持体に予め結合されている、黄色ブドウ球菌
の莢膜性多糖類に対して特異な抗体、特に前述の如き特
定の単分岐系抗体によって細菌浮遊液を凝集させること
により無傷の細菌から； −　あるいは、例えば細菌の洗浄により、又は圧熱滅菌
若しくはリソスタフィンの如きブドウ球菌用の特定の酵
素を使用することにより行われる細菌の溶解の後に得ら
れる細菌抽出物において、莢膜性子ｔｌ！ｇを検出する
ことにより；容易に行うことができる。

これらの細菌抽出物において、莢膜性多糖類！類の存在
は、免疫学的方法又は物理化学的の方法によって立証す
ることができる。

免疫学的方法の中では、次のものに言及しておく　ニ ー　アガロースゲル内における免疫沈降法（二重拡散法
）。

−ロケット免疫電気泳動法（特に、前述したフォルニエ
（Ｊ　、Ｍ、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）その他及びホッヒケッ
ペル（Ｈｏｃｈｋｅｐｐｅｌ）その他の論文参照）。

莢膜性多糖類に対して特異な抗体が、緩衝剤でｐＨ８，
６（抗体が移動しないｐＨ）に平衡されたアガロースゲ
ル内に含まれる。細菌抽出物はゲルに開けられたウェル
に置かれ、次いで電界の作用を受ける。これにより、抽
出物中に存在する莢膜性子ｔｉｎの移動が生ずる。

移動するにつれて、莢膜性子Ｆ’ｌｌｌは抗体と結合し
て沈降物を形成する。沈降物の前線は、残存する遊離し
た莢膜性多糖類がなくなるまで移動を行う。ゲルの乾燥
、固定および染色の後に、観察される距の高さを測定す
ることにより、細菌抽出物の中に存在する莢膜性釜＃Ｍ
類の量を決定することが可能になる。

−ＥＬＩＳＡ型の酵素免疫反応。

物理化学的方法のうち、莢膜性多糖類ｉ類の一つ又はそ
れ以上の成分の存在を示す方法について言及しておくニ ー　ガスクロマトグラフィー −高圧液体クロマトグラフィー −イオン交換クロマトグラフィー −ゲル濾過 −親和性クロマトグラフィー −アミノ＃Ｍ類の化学的分析 選択された菌種から出発して、莢膜性多糖類は次の３段
階により得られるニ ー　細菌の培養 −莢膜性多糖類の抽出 −莢膜性多糖類の精製 １）細菌の培養 培地として、特に液体又は固体の（固体の培地上で培養
された細菌によれば莢膜性多糖類の生成は増大）コロン
ビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）培地（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ
）社製）が使用され、培養期間は例えば３７°Ｃにおい
て一晩にわたる。

２）　莢膜性多糖類の抽出 圧熱滅菌及びリソスタフィンによる細菌の溶解という、
二つの方法を採用することができる：ａ）圧熱滅菌によ
る抽出： 固体の培地上で培養した細菌を緩衝された生理的食塩水
（ＢＰＳ）　（直径９ｃｍのペトリ皿について５ｄ）に
浮遊させ、次に１２１°Ｃで１時間圧熱滅菌する。２５
０００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を取り出し、
得られたペレットを同じ条件の下に再び抽出する。２５
０００ｇで２０分間遠心分離した後、得られた二つの上
清を混注（ｐｏｏｌ）　Ｌ、蒸留水に対して透析し、凍
結乾燥する。かくして粗抽出物（ＣＥ）が得られる。

１００個のペトリ皿から、大体Ｌｏｇの湿潤細菌ペレッ
ト及び２ｇのＣＥが得られる。

液体培地で培養した細菌はフェノール及びエタノール（
１，５χ、実験室温度で２４時間）の添加によって殺滅
され、次いで２５０００ｇで２０分間の遠心分離により
、又は例えばミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から入
手できる０、４５ミクロンのＨＶ型のデュラポア（Ｄｕ
ｒａｐｏｒｅ：商品名）フィルター上で限外濾過するこ
とにより回収される。

細菌ペレットはＢＰＳに再度浮遊され（ＢＰＳ　１　ｄ
当たり０．１ｇの湿潤ペレット）、次いで前述したと同
じ条件の下で圧熱滅菌することにより抽出される。

ｂ）　リソスタフィンによる抽出： 細菌ペレットは、１リツトル当たり２５■のりソスタフ
ィンを含有しているＢＰＳ（０，５ｇ／　Ｉｒｄｌ）に
浮遊される。この浮遊液は３７°Ｃにおいて一晩攪拌さ
れ、次いで２５０００ｇにおいて２０分間遠心分離され
る。上清は蒸留水に対して透析され、次いで凍結乾燥さ
れる。

３）莢膜性多糖類！類の精製 以下に述べるのは精製について有利な方法である： ａ）　　ＣＥの酵素処理： ＣＥをＢＰＳ（１０■／ｄ）中に取り、ＤＮアーゼ及び
ＲＮアーゼで処理（０，１■／ｄ、３７°Ｃで６時間）
し、次いでプロテアーゼで処理（１■／ｄ、３７°Ｃで
一晩）する。生成物は次いで蒸留水に対して透析され、
凍結乾燥される。２ｇのＣＥは、はぼ０．７ｇの酵素処
理抽出物（ＥＴＥ）を与える。この処理は、蛋白質及び
核酸の殆どを除去することを可能ならしめる。

ｂ）　イオン交換クロマトグラフィー：ＥＴＥを塩化ナ
トリウム（０，１モル）を含有する酢酸ナトリウム緩衝
液（０，０５モル、ｐｌ！６）に取り、次いで同じ緩衝
液で平衡されているイオン交換器（例えばＤＥＡＥ−セ
ルロース）に対して適用する。ＥＴＨに含まれている蛋
白質の殆どはイオン交換器に吸着されず、平衡緩衝液で
イオン交換器を洗浄することによって除去される。一方
、莢膜性多糖類Ｍ類、タイコ酸および核酸は、イオン交
換器に吸着されて残存する。

莢膜性多糖類は、より高い濃度の塩化ナトリウムを含む
緩衝液をイオン交換器に対して適用することによって溶
出される。例えばタイプ５の莢膜性多糖類は、０．１５
モルの濃度の塩化ナトリウムを含んでいる酢酸ナトリウ
ム緩衝液（０，０５モル、ｐｎ６）でもって？容出され
る。タイプ８の莢膜性多糖類を溶出させるためには、塩
化ナトリウムの濃度は０．１８モルでなければならない
。溶出物はフラクションコレクターで回収され、莢膜性
多＊ｉを含有する流出液（特異な抗体を使用する免疫反
応によって検出される）は混注され、蒸留水に対して透
析され、次いで凍結乾燥される。

イオン交換によって精製された抽出物（ＩＲＥ）のほぼ
２０■が、０．７ｇのＥＴＥから出発して得られる。こ
のイオン交換クロマトグラフィーは、蛋白質、核酸及び
タイコ酸の殆どを除去することを可能ならしめる。

Ｃ）　ゲル濾過： ＩＥＥは塩化ナトリウム溶液（０，２モル）に再度溶解
され、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ−ＣＬというゲルを介
して濾過される。免疫反応によって検出される莢膜性多
糖類を含んでいる流出物は、混注され、蒸留水に対して
透析され、次いで凍結乾燥される。凍結乾燥された生成
物は、精製された莢膜性多糖類を構成する。

莢膜性多１！類に混成するのは、１％以下の蛋白質、０
．５％以下の核酸および０．０５％以下のタイコ酸であ
る。２０■のＩＥＥから出発して、はぼ１０■の精製さ
れた莢膜性多糖類が得られる。全体として、１００個の
ペトリ皿から収穫される１０ｇの湿潤細菌ベレットから
出発して、大体１０■の精製された莢膜性多糖類が得ら
れることになる。

〔実施例〕

例として、黄色ブドウ球菌と同じ莢膜性多糖類を生成す
るコアギュラーゼ陰性なブドウ球菌の以下に述べる菌株
が単離された。

黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性多糖類を生成する菌株を
選択するために、細菌浮遊液はこれらの多Ｉｉ類に対し
て特異な抗体との接触下に置かれる。細菌の溶解の後に
得られた莢膜性多糖類の検出は、ロケット免疫電気泳動
法（前述した如くフォルニエ（Ｊ、Ｍ、Ｆｏｕｒｎｉｅ
ｒ）その他により記述された方法）またはＥＬＩＳＡ法
（酵素免疫測定法）によって行われた。

多量の莢膜性多ｔｉｎを生成する各々の菌株は、これら
二つの方法によって特性指摘された。なおＣＮＣＭとは
ＥＰＯにより承認されたフランス国における寄託機関で
ある。

これらの菌株は以下の特性を有し、これらの特性はこれ
らの菌株がアビ・スタフ（Ａｐｉ　５ｔａｐｈ）システ
ムによって生物化学的に識別せられることを可能ならし
めるものである。

＊クルース氏（Ｋｌｏｏｓ）及びシュライファー氏これ
らの菌株は、以下の抗菌スペクトルを示す： Ｒ＝耐性　　Ｓ＝感受性 例として、１０９の細菌の圧熱滅菌により、抽出された
莢膜性多糖類を調製するための手順を実行すると、以下
の表に示す量を得ることが可能となった。莢膜性多糖類
の生成は培養器毎に非常に異なることから、これらの値
は単なる（旨標として与えられているだけである。

８５０２０６　　Ｓ、　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｌ
　　　５　　　　３０８６０６３８　　Ｓ、　ｈｏａ＋
１ｎｉｓ　２　　　　５　　　　　　４８５００７１　
　Ｓ、　ｈｏａ＋１ｎｉｓ　２　　　　　Ｂ　　　　　
２０８５０２７９　　Ｓ、　ｈｏｍｉｎｉｓ　２　　　
　８　　　　　５コアギユラーゼ陰性なブドウ球菌の菌
株から得られた莢膜性多糖類は、次のものについて使用
することができる： ａ）　ヒト用又は獣医科用の、黄色ブドウ球菌に対する
ワクチンの調製。

これは個体を保護する意図の下に、或いは受動免疫摩沃
において又は当業者には既知の手法により凝集技術、Ｅ
ＬＩＳＡ　、　ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）又はウ
ェスタン・ブロンティングを使用する診断を行うために
使用可能な抗莢膜性多ｔＪＱｉ抗体を調製するよう使用
されうる免疫血清を作り出す意図の下に行われる。

ｂ）ヒト、動物または農産物の診断のための診断用試薬
の調製。

これらの試薬は特に、生物化学的な製品について莢膜性
多Ｉｉ類に対して特異な抗体の検出、及びコアギュラー
ゼ陽性又はコアギュラーゼ陰性なブドウ球菌の化学的単
離物における莢膜性多ＩＩの検出に用いられるものであ
る。

出願人代理人　　　古　谷　　　２ 同　　　溝部孝彦 同　　　古谷　聡

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性多糖類を調製するた
   めの方法であって、これらの莢膜性多糖類の調製のため
   にコアギュラーゼ陰性なブドウ球菌の菌株を使用するこ
   とを含むことを特徴とする方法。 ２　ａ）黄色ブドウ球菌に特有の莢膜性多糖類を生成す
   る菌株をブドウ球菌のコアギュラー ゼ陰性な菌株から選択すること、 ｂ）選択された菌株を培養すること、 ｃ）莢膜性多糖類を抽出すること、及び ｄ）莢膜性多糖類を精製すること を含む、請求項１記載の方法。 ３　黄色ブドウ球菌に特有な莢膜性多糖類を生成するブ
   ドウ球菌のコアギュラーゼ陰性な菌株を選択することは
   、黄色ブドウ球菌の莢膜性多糖類について特異な抗体を
   使用する凝集反応によって行われる、請求項２記載の方
   法。 ４　黄色ブドウ球菌に特有な莢膜性多糖類を生成するブ
   ドウ球菌のコアギュラーゼ陰性な菌株を選択することは
   、菌株の細菌抽出物における莢膜性多糖類の検出によっ
   て行われる、請求項２記載の方法。 ５　前記細菌抽出物は細菌を洗浄することによって得ら
   れる、請求項４記載の方法。 ６　前記細菌抽出物は細菌の溶解の後に得られる、請求
   項４記載の方法。 ７　前記莢膜性多糖類は圧熱滅菌の後に抽出される、請
   求項１から６のいずれか１項に記載の方法。 ８　前記莢膜性多糖類は溶菌剤による細菌の溶解の後に
   抽出される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方
   法。 ９　前記抽出された莢膜性多糖類は酵素処理、及びこれ
   に続くイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過によっ
   て生成される、請求項１から８のいずれか１項に記載の
   方法。 １０　番号Ｉ−６８２、Ｉ−６８３、Ｉ−６８４又はＩ
   −６８５の下にＣＮＣＭに寄託されたブドウ球菌のコア
   ギュラーゼ陰性な菌株の使用を含む、請求項１から９の
   いずれか１項に記載の方法。 １１　請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法に
   より得られた莢膜性多糖類。 １２　請求項１１に記載のブドウ球菌から出発して得ら
   れる、黄色ブドウ球菌に対するワクチン。 １３　請求項１１に記載のブドウ球菌から出発して得ら
   れる、コアギュラーゼ陽性又はコアギュラーゼ陰性なブ
   ドウ球菌の検出のための診断用試薬。 １４　黄色ブドウ球菌に特有な莢膜性多糖類を生成する
   コアギュラーゼ陰性なブドウ球菌の精製された菌株。 １５　番号Ｉ−６８２、Ｉ−６８３、Ｉ−６８４及びＩ
   −６８５の下にＣＮＣＭに寄託された菌株である、請求
   項１４記載の菌株。 １６　黄色ブドウ球菌に特有な莢膜性多糖類の生成のた
   めの、請求項１４又は１５記載の菌株の使用。