JPH01128996A - ヌクレオシド誘導体、特に２′−デオキシシチジン及びオリゴヌクレオチド合成へのそれらの使用 - Google Patents

ヌクレオシド誘導体、特に２′−デオキシシチジン及びオリゴヌクレオチド合成へのそれらの使用

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JPH01128996A
JPH01128996A JP63253624A JP25362488A JPH01128996A JP H01128996 A JPH01128996 A JP H01128996A JP 63253624 A JP63253624 A JP 63253624A JP 25362488 A JP25362488 A JP 25362488A JP H01128996 A JPH01128996 A JP H01128996A
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Didier Molko
デイデイエ・モルコ
Andre Roget
アンドレ・ロジエ
Jean-Claude Schulhof
ジヤン−クロード・シユルホフ
Robert Teoule
ロベール・トウール
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Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なヌクレオシド誘導体及びオリゴヌクレオ
チド合成へのそれらの使用に関する。
より特定的には、特にオリゴヌクレオチド、中でもシト
シンすなわち環外Ｎｌ２基を有するピリミジン塩基のひ
とつから形成されるオリゴヌクレオチドの合成に有用な
ヌクレオシド誘導体に関する。
オリゴヌクレオチド合成は、ヌクレオシド間をリン酸基
で結合してＤＮＡ　（デオキシリポ核Ｍ）鎖又はＲＮＡ
　（リボ核酸）鎖を形成することからなる。この組立反
応では、ヌクレオチド間のリン酸基によって１つのヌク
レオシドの３′位のヒドロキシル基ともう１つのヌクレ
オシドの５′位のヒドロキシル基とが結合される。従っ
て、この合成反応中は、ヌクレオシドの３′及び５′末
端のみが反応に関与し、使用した核酸塩基（プリン又は
ピリミジン塩基）はこの反応に関与してはならない。
塩基が環外Ｎｌ２基を有しているときには、矛蝉≠喘用
オリゴヌクレオチドの合成中これらのＮｌ２基を保護す
る必要がある。これは、このようなオリゴヌクレオチド
が反応性でありすぎ、合成反応を妨害するかもしれない
からである。
環外Ｎｌ２基の保護はいくつかの要件に従わなければな
らない。すなわち： （ａ）選択的かつｌ容易に実施できなければならない： （ｂ）ヌクレオシドの他の部位の反応性を変化させｌて
はならず、オリゴヌクレオチド合成の全段階／を通じて
ずつと安定でなくてはならない；そして（Ｃ）合成後オ
リゴヌクレオチドを破壊することなく緩和な条件下で除
去可能でなければならない。
ヌクレオシドの環外Ｎ８２Ｍは、例えば、１１゜５ｃｈ
ａｌｌｃｒらがＪ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｌ、　Ｓｏｃ
、、　１９６３．第８５巻、　３８２１〜３８２１ペー
ジに記載したようにアデニン及びシトシンの場合にはベ
ンゾイル又はアニソイル基により、そしてｔｌ、　Ｂｕ
ｃ旧及びＩ＋、にｈ　Ｏｒ　ａ　ｎ　ａがＪ、　Ｍｏｌ
　Ｒｉｏｔ、、　１９７２．第ｒ２３　、　２５１〜２
８８ページに記載したようにグアニンの場合にはイソブ
ブーリル基により、アミドの形で保Ｉ！されることが最
も多い。
これらの保護基は、合成の最後に６０℃で１７時間、２
８％アンモニアを作用させることにより除去することが
できる。しかしながら、プロトンのＮＭＲによって示さ
れるように、これらの条件下ではグアニンの全てのイソ
ブチリル基が除去されることはない。従って、この場合
は反応時間を６０℃で７２時間に延長するのが好ましい
。
この保護基除去法の使用条件は、例えば５．６−シヒド
ロチミジンの場合のようにアルカリ性媒質中ではあまり
安定でない修飾ヌクレオチドが使用できるほどには十分
緩和ではなく、そのためこの方法の欠点となっている。
更に、支持体上での合成法により不安定なヌクレオシド
からオリゴヌクレオチドを合成するために特に使用でき
る、より容易に除去しうる他のアシル基の使用の可能性
に関連した研究もなされてきている。この場合の合成法
は、−殻内にはシリカから出来ている支持体に鎖の第一
のヌクレオシドを固定し、次に、第一のヌクレオシドに
他のヌクレオシドを所望の順序で固定するために順次縮
合サイクルを実施することからなる。より容易に除去し
うるアシル基を使用すると脱保護収量もより良くなりつ
るが、不完全に脱保護した塩基の存在は得られた産物の
使用にとって不利になるので、このことは非常に重要で
ある。
これらの研究の間に、ピリミジン石塁（シトシン）又は
プリン塩基（アデニン、グアニン）から形成したヌクレ
オシドの環外ＮＨ２１は式：［式中、Ｒは水素原子又は
アルキル基を表わし、Ｒｂは水素原子、アルキル基、ア
ルコ１キシ基又はアリールオキシ基を表わし、これらは
置換されていてもよい］のアシル基で保護しうろことが
発見された。特にこの基はグアニン及びアデニンがら形
成したヌクレオシドに対してはフェノキシアセデル基で
あり、シトシンから形成したヌクレオシドに対してはイ
ソブチリル基でありうる。これらの新しい保護基を使用
すると、室温で２時間のアンモニア処理によって完全な
脱保護が得られ、脱保護操作条件は顕著に緩和される。
□ しかしながら、（Ｎ−６−フエツキシアセチル）＝２゛
−デオキシアデノシン誘導体及び（Ｎ−２−）１ノキシ
アセヂル）−２゛−デオキシグアノシン誘導体と比べる
とＮ−４−イソブチリル−２°−デオキシシチジンは安
定であり過ぎるために、シトシンから形成したヌクレオ
シドについてはある種の特別な問題点が存在する。実際
、２°−デオキシグアノシン誘導体では１５分、２°−
デオキシアデノシン誘導体ではたった７分で充分である
のに対し、シヂジン誘導体を半分脱保護覆るのには３０
分が必要である。
更に、Ｎ−４−イソブチリル−２°−デオキシシチジン
誘導体の製造にはいくつかの難点があった。
実際、この誘導体は塩化イソブチリルと２°−デオキシ
シチジンとの反応によって製造するのであるが、これら
の条件下では出発ヌクレオシドの三保″：ａ誘導体、す
なわち、イソブチリル基が環外Ｎ１１□基のみでなくデ
オキシリボース残基の（２つの）ヒトＯキシル基をも保
護している誘導体が得られる。そして、この三保護誘導
体を加水分解し、次に、加水分解後に得たー保護誘導体
を反応媒質及びそれが含有する多くの塩から分離しなけ
ればならない。これは適当な有機溶媒による抽出によっ
て実施しうるが、明らかにイソ酪酸及び所望の誘導体の
各々の水に対する溶解度によりこの段階には再現性がな
い。又、水相に残存する不純物は結晶化による保護ヌク
レオシド誘導体の精製にとって有害である。
更に、これらの欠点を除去しつるようにする、２−デオ
キシシチジンの環外ＮＨ２基の他の保護基を発見すると
いう観点で研究が続けられてきた。
本発明は特に、イソ酪酸基よりも除去が容易な保護基を
有し、又、良好な純度での製造がより容易な、シトシン
から形成された新規なヌクレオシド誘導体に関する。
これらのヌクレオシド誘導体は式： ［式中、Ｒ１は式ニ ーＣｏ−ＣＨ−Ｃ（Ｒ２Ｒ３）−Ｒ’ ［式中　Ｒ２とＲ３とは同じでも異っていてもよく、水
素原子又はアルキル基を表わし、Ｒ４は非置換の又はＮ
ｏ２．ＣＮ、アルコキシ、アリールル及びＳＲ（但し、
Ｒはアルキル又はアリール基を表わす）の群から選択し
た１つ以上の基で置換されたアリール基である１の基を
表わし、Ｒ５は水素原子、酸性媒質中で不安定な基又は
式Ｒ１の拮を表わし、Ｒ６は水素原子、リン含有基又は
基Ｒを表わし、Ｒ７は水素原子又は（保護又は非保護）
ＯＨ基を表わす１に従う。
本発明に従い前記の式のｍ　Ｒ１を使用すると、オリゴ
ヌクレオチド合成に使用した後にヌクレオシド誘導体を
Ｒ１基から脱保護するに要する１１．１間を短縮するこ
とができる。更に、前記基Ｒ１により、良好な条件下で
、高純度、７０％以上の収率で２°−デオキシシチジン
の一保護誘導体を得ることができる。
実際、前記基Ｒでは、置換基Ｒ、Ｒ及びＲが存在するこ
とにより環外Ｎｌ２基が保護されているヌクレオシドと
基Ｒ１に相当する炭酸ととの間の溶解度の差を広げるこ
とができる。従りて、保護ヌクレオシドは水相中に保持
するに十分極性のままである一方、エーテル相によりカ
ルボン酸をより容易に抽出できる。
更に、カルボニル基のβ位に置換基Ｒ、Ｒ及びＲ４が存
在することは、加水分解速度の増加を限定し、従ってヌ
クレオシド誘導体が不安定になりすぎるのを防ぐに充分
大きい、活性中心と置換基との間の距離に対応する。実
際、同じ保１基で保護されていると、２°−デオキシシ
チジン誘導体はプリン同類体より２０〜５０倍速く脱保
護される。
本発明Ｃは、ヌクレオシドの脱保護時間を減少させて、
Ｎ　−６−（フェノキシアセチル）−２′　　−デオキ
シアデノシンのような他のヌクレオシド誘導体を脱保護
するに必要な時間に匹敵させられるように置換基及びそ
の位置を選択する。
従って、本発明により、７０％以上の収率で保護誘導体
を迅速に得ることができ、標準条件下での本発明ヌクレ
オシド誘導体の平服保護時間は８分、すなわち、同じ条
件下でＮ　−６−（フェノキシアセチル）−２°−デオ
キシアデノシン（７分）及びＮ−２−フェノキシアセチ
ル−２°−デオキシグアノシン（１５分）について得る
時間と近い値であり得る。
従って、Ｎ−４−イソブチリル−２°−デオキシシチジ
ンで以前に必要であった３０分間と比較すると顕著な改
善である。
本発明のヌクレオシド誘導体のＲ１基中で、Ｒ２とＲ３
は水素原子又はアルキル基を表わしてよく、Ｒ４は適宜
置換されているアリール基である。
使用しうるアルキル基は分校でも直鎖でもよく、一般に
１〜４個の炭素原子を有している。
使用するアリール基は特にフェニル基であるが、水素原
子を除去することにより核から誘導される他の基、例え
ばナフチル、アンスラセニル及び同様の基も使用しうる
。このアリール基はＮＯ２゜ＯＮ、アルコギシ、アリー
ルオキシ、ＣＪ）、Ｆ。
Ｃ（０）ＯＲ，Ｃ（０）Ｒ，５ｏ２Ｒ，Ｓ　（０）Ｒ，
ＰＯ３Ｒ２、アルキル及びＳＲ（但し、Ｒはアルキル又
はアリール括を表わす）から選択した１つ以上の基を有
してもよい。置換基として使用するアルキル基はＲ及び
Ｒ３と同じ型でありうる。置換基として使用しつるアル
コキシ基は一般に１〜４個の炭素原子を有しており、分
校でも直鎖でもよい。
置換基として使用するアリール基はフェニル。
ナフチル又はアンスラセニル基でありうる。
好ましくは、本発明により、Ｒ及びＲ２は水素原子を表
わし・、Ｒ４はフェニル基を表わす。
本発明のヌクレオシド読導体では　Ｒ５を形成するのに
使用しつる酸性媒質中で不安定な基は特に、式： ［式中、Ｒ、Ｒ及びＲ１０は同じでも責っていてもよく
、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基を表わす］の
トリチル基例えばモノメトキシトリチル基又は式（Ｖ）
　［式中、Ｒ及びＲ９はメトキシ基を表わし、Ｒ１０は
水素原子を表わす］のトリチル基、ビキシル（Ｐｉｘｙ
ｌ）　Ｍ及び９−フェニル−キサンテニル基のようなオ
リゴヌクレオチド合成に使用しうる基である。
本発明ヌクレオシド誘導体中、式（Ｉ）の化合物中でＲ
６を形成するのに使用されうるリン含有基も又、例えば
式： ％式％） 式： 式： のリン酸基のようなオリゴヌクレオチド合成に使用しう
る基である。一般に、式（ＩＶ　）の基を使用する。
本発明によれば、Ｒ７が保１０１−１　基を表ねずとき
には、ＯＨの保護基はりボヌクレオチド合成に慣用され
る基からなる。
従って、本発明ヌクレオシド誘導体は、（１）シトシン
により形成された塩基及び■リボース又はデオキシリボ
ースの結合産物であり、ヌクレオシドは少なくともＲ基
によりシトシンの環外ＮＨ２基上が修飾されている。こ
れらは、又、前記の同じ基によりデオキシリボースの３
゛及び５゛位又はリボースの２゛、３°及び５゛位玉で
修飾されえ、あるいは、リボース又はデオキシリボース
の３°及び５°位は他の基、すなわちリボース又はデオ
キシリボースの５°位については不安定なＲ５基及び３
°−位についてはＲ６リン含有基で修飾されうる。
本発明に使用する式： ％式％） のアシル基は、例えば、支持体上での合成法を使用した
ときに、オリゴヌクレオチドをその上に合成した支持体
からのオリゴヌクレオチドの遊離も同時に行いつる、室
温で２時間のアンモニア処理により、操作の最後に容易
に除去できるのでオリゴヌクレオチド合成に特に遊離で
ある。この時間は基： で保護したヌクレオシドに必要な時間に匹敵する。
また、室温で脱保護するため、緩和な反応条件下で操作
することが可能であり、この容易に除去しうる保贋基を
使用することにより、オリゴヌクレオチド合成の間に、
例えば抗体に感受性のリガンドを含有するＤＮＡ断片合
成のためのより過酷なアルカリ性条件に感受性の修飾し
た核酸塩基を取り込むことが可能となる。
本発明はリボース由来のヌクレオシド及びデオキシリボ
ース由来のヌクレオシドに適用されるが、デオキシリボ
ース由来のヌクレオシド、すなわち、Ｒ７が水素原子で
ある式（Ｉ）の誘導体に使用するのが好ましい。
本発明のヌクレオシド誘導体は、主としてアデニン又は
シトシンから成るヌクレオシドにベンゾイル及びアニソ
イル基を固定するのに使用する方法と似た慣用法により
製造できる。これらの方法では、先ず、式Ｒ１Ｃ１の酸
クロリド又は式：の酸無水物とシトシンのヌクレオシド
を反応させる。この反応中に酸クロリド又は酸無水物が
リボース又はデオキシリボースの３′及び５′位のヒド
ロキシル基とは反応しないことを確実にするたメニ・コ
レラノヒドロキシル基をピリジンのような適切な溶媒中
で、トリメチルシリルクロリドでありうる適切な化合物
と反応させることにより先ず保護する。シトシンのヌク
レオシドと酸クロリドＲ’Ｃ１ｌ又は酸無水物（Ｒ’）
２０とを反応させた侵、例えばアンモニア溶液を使用す
る加水分解により、リボース又はデオキシリボースの３
′及び５′位のヒドロキシル基の保；ｌ！を除去する。
Ｒ１基により保護した誘導体の製造の変法によれば、リ
ボース又はデオキシリボースの３′及び５′位のヒドロ
キシル基を保護せずに反応を行い、その後に三保蹟した
ヌクレオシド誘導体を選択的に加水分解する。
Ｒ５が式（Ｉ）のトリチル基、例えばジメトキシトリチ
ル基を表わし、Ｒ６が水素原子を表わす式（Ｉ）のヌク
レオシド誘導体は、適当な溶媒中で予め得られたヌクレ
オシド誘導体と対応の塩化トリデルとを反応させること
により製造することができる。
Ｒ５がジメトキシトリチル基又はメトキシトリチル基を
表わし、Ｒ６が式（ＩＩＩ）の基１式（ＩＶ　）の基又
は式： ［式中、Ｒ、Ｒ及びＲ１３は同じでも異っていでもよく
、アルキル暴、例えばエチル基を表わす］のいずれかを
表わす式（Ｉ）の本発明ヌクレオシド誘導体は、Ｒ５が
ジメトキシトリチル又はメトキシトリチル基を表わし、
Ｒ６が水素原子を表わす式（Ｉ）のヌクレオシド誘導体
から慣用法で製造できる。
Ｒ６が例えば式（Ｉ［［）の基を表わす誘導体を製造す
るためには、前記ヌクレオシド誘導体を適当な溶媒中で
４−クロロフェニルホスホリルピストリン゛ アゾリゾートと反応させる。ＩＩＡキサン中のトリアゾ
ールとトリエチルアミンの懸濁液に４−クロロフエニル
ジクロロホスフェートを加えることにより４−クロロフ
ェニルホスホリルビストリアシリデートを製造できる。
Ｒ６が例えば式（ＩＶ）の基を表わす誘導体を製造する
ためには、ジイソプロピルエチルアミンの存在下に適当
な溶媒中でβ−シアンエチル−モノクロローＮ、Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスホロアミダイトと、又はテトラ
ゾール及びジイソプロピルアミンの存在下でβ−シアノ
ニブル−ビス−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−ホ
スファイトとヌクレオシド誘導体とを反応させることが
できる。
Ｒ３が例えば式： ％式％ ［式中、Ｒ、Ｒ及びＲ１３は同じでも異っていてもよく
、アルキル基である］の基を表わ寸ヌクレオシド誘導体
を製造するためには、ヌクレオシド誘導体を２−クロロ
ベンゾ−（５，６−ａ）−［１，３−ジオキソ−２−ホ
スホル−４−イノン］と反応させ、次にトリエチルアン
モニウムアレテートのＪ、うなトリアルキルアンモニウ
ム塩と反応させることができる。
これらの３つの方法で得たヌクレオシド誘導体は　Ｒｅ
が式（Ｉ［ｒ）の基の場合のホスホトリエステル合成に
よる、又はＲ６が式（ＩＶ）の基の場合のホスホ［１７
ミダイト合成による、又はＲ６が式のすの場合のＨ−ホ
スホネート合成によるオリゴヌクレオチド合成に使用で
き、この際、例えば他のヌクレオシドのオリゴヌクレオ
ヂド鎖を組立てるには、チミジン又は２゛−デ第４ニジ
ウリジンに対応するヌクレオシド又はアルカリ性溶媒中
で不安定な塩基を有しているヌクレオシド又はアルカリ
性溶媒中で不安定な他のヌクレオシドを同時に使用する
。
本発明のオリゴヌクレオチド合成法は、（１）　　ヌク
レオシド誘導体上又はオリゴヌクレオヂド上に式： ［式中、Ｒ１は式ニ ーＧｏ−ＣＨ−Ｃ（Ｒ”　Ｒ３）−Ｒ’［式中、Ｒ２と
Ｒ３とは同じでも異っていてもよく、水素原子又はアル
キル基を表わし、Ｒ１′は非　′打換又はＮｏ２．ＣＮ
、アルコキシ、アリールオアルキル及びＳＲ（但し、Ｒ
はアルキル又はアリ−塩基を表わす）から選択した１つ
以上の基で置換されたアリール基を表わす］の基を表わ
し、ヌクレオシド誘導体を縮合する少なくとも１つの綜
合サイクル、 ■　式Ｒ１の保１ｇを除去する段階 とからなる。
この段階は例えば室温でオリゴヌクレオチドとアンモニ
アとを接触させて実施しうる。
オリゴヌクレオチド合成は溶液中での方法又は支持体上
での合成法のいずれかにより実施できる。
場葭４　　≠隼ν 間に収量を偏ｉＬとなくより不安定な ヌクレオシドの使用により適しているので支持体上での
合成法の方が好ましい。
従って、本発明ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮΔ断片断
片用成用基生成物として有利に応用しうる。又、ＤＮＡ
のγ−放射線分解産物及び光分解産物に特に関係しつる
もろい修飾塩基を合成オリゴヌクレオチドに取り込むに
も好適であり得る。
本発明ヌクレオシドを利用すると抗ウィルス活性を有す
る新規な分子及び新規なりＮＡプローブも入手しつる。
本発明のヌクレオシドの製造及び使用に関する以下の実
施例は、明らかに、本発明を説明するために非限定的に
提供するものである。
２０ミリモルのデオキシシチジンを乾燥させ、次に１０
０ｄの無水ピリジンに溶解させる。次いで、この溶液に
塩化トリメチルシリル１Ｏ−（８０ミリモル）を加え、
常温で２５分間反応させる。次に無水フェニルプロピオ
ン酸１４．６９　（５０ミリモル）を加え、４℃で１７
時間反応を続ける。
こうして、ヌクレオシドが形成されるが、この３′及び
５′位のアルコール官能基はトリメチルシリル基で保護
されており、環外アミン基はアミドの形である。
ｐＨ８となるまで２０ｍの水と濃アンモニア溶液を加え
て３′及び５′のヒドロキシル基をＴｉ餠させる。次に
白色沈殿が得られ、これを濾過して溶液から除く。次に
減圧下で溶媒を蒸発させる。次に、得られたオレンジ色
の油状残渣を５ＧＯｄの水に入れ、この水相をエチルエ
ーテルと酢酸エチルとの８０％／２０％混合物（３ｘ５
００ＩＩＩｌ）で洗浄する。次いで、軽い混濁が生ずる
まで水相を濃縮し、４℃に１７時間置く。濾過により、
Ｎ−４−（３−フェニルプロピオニル）−２゛−デオキ
シシチジン３．８ｇを回収する。母アルカリ液を次に再
度濃縮し、冷所に放置して１，３ｇの生成物の新らしい
両分を得るが、これは全収率７１％に相当する。
薄層クロマトグラフィー質聞分析及び２００ＭＨ２での
プロトンの核磁気共鳴により、生成物を特性化する。得
られた結果は次の通りである。
［：０．７０（クロロホルム−メタノール泳動混合物（
８０／２０）　中）　質ｆｌｕ析（Ｍ−Ｈ）：分子ピー
ク（ｍ／ｅ＝　３５９〜１８％）重水素含有アセトン中
２００ＭＨ２Ｔ”（７）プロトンノ核磁気共鳴：　８．
５５ｐｐｍ（ｄ、　１１１．１１５　）、　７．４４ｐ
ｐｍ（ｄ、　ＩＩＩ、　Ｈ６）　、　Ｇ、　３３Ｄｐｍ
（ｔ、　１１１　。
＋１１’　　）　、　２．５７Ｅ）ｐｌｌ（８木、　　
１Ｈ，＋１２’　　）、２．３０ｐｐ層（６本。
ＩＨ，Ｈ２”　）、４．６０ｐＤｌ（６本、ＩＨ，＋１
３’　　）、４．１３ｐｐｍ（ｑ。
１１１、　１１４’　　）、３．９８Ｅ１１）−（Ｑ、
１１１．　１１５’　　）、３．９１１）Ｉ）ｌ（Ｑ、
１＋ｌ。
Ｈ５“）、３．２０−２．９０ｐｐｎ＋（ｍ、４Ｈ，プ
ロピオニルエヂル）、　７．４２−７．３８ｐｐｍ（ｍ
、　ｓｌｌ、フェニル）。
８ミリモルの化合物１　（３ｇ）を乾燥させ、５０Ｉｎ
ｉの無水ピリジン中に入れる。０℃に冷却し、４゜４′
　−ジメトキシトリチルクロリド３　ｇ（８，８ミリモ
ル）を加える。５℃で１７時間、反応を展開させ、２Ｉ
ｄのメタノールを加える。３０分後に、ロータリーエバ
ポレータでμ媒を排除し、油状残渣を３００ｄの酢酸エ
チルに入れ、重炭酸ナトリウムの５％水溶液１５０ｄ及
び１５０＃１１！の水で２回洗浄する。次に、有機相を
硫酸ナトリウムで乾燥させ、混合物をシリカゲルカラム
で分画する。化合物２を収率４０％で単離する。この化
合物の物理化学的特性は次の通りである： Ｒｆ：０．２５（クロロホルム−メタノール混合物（９
０／１ｏ）　＝０．２５中）’Ｂｍ分析（Ｍ　−Ｈ）　
：　分子ピークｍ／ｅ＝６６０〜８％、５００Ｍ　Ｈｚ
でのプロトンの核磁気共鳴：　８．３９ｐｐｍ　（ｄ、
　１１１．　Ｈ５）、　７．７０−６、９０ｐｐｍ（ｍ
、　１９１１．　Ｈ５＋芳香族）、　６．３１ｐｐａ＋
（ｔ、　ＩＨ。
）１１’　　）、２．６２１）ｌ）１１（８本、　１８
．１１２’　　）、２．３５ｐｐｍ（８木。
Ｉｌｌ、　　Ｈ２“　）、４．６８ｐｐｍ（ｍ、１１１
．　１１３’　　）、４．２３ｐｐｍ（ｑ、１ｔｌ。
Ｈ’　　４）、　　３．５７ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ，８５’
　　、　　ｔ１５”　）、３．９２ｐｐｍ（Ｓ、６Ｎ　
、メトキシル）。
５０ｓｄ！の無水ジクロロメタンを添加し蒸発させて１
．６ｇの化合物２を乾燥させ、アミレーン上に安定化さ
せて、ジクロロメタン５０−に入れる。これをジクロロ
メタン５〇−中のジイソプロピルアミン０、１ｑＩＩＩ
！、テトラゾール８５１１１９及びビス−（ジイソプロ
ピルアミノ）−シアノエチルホスフィン１．０５９を含
有するもう１つの丸底フラスコに加える。常温で３時間
反応させた後、前記有機相を重炭酸ナトリウムの５％水
溶液１００ｍ　（２回）と水１００Ｉｎｉで洗浄する。
次に溶媒を蒸発させ、混合物をシリカゲルカラムで分画
し、６０％クロロホルム、３５％ヘキサン及び５％トリ
エチルアミンの３成分混合物で溶離する。所望の純粋な
生成物を含有する画分を合せ、溶媒を蒸発させ、無色の
油状残渣をトルエン１５−に入れる。これを、予め一８
０℃に冷却した２５０ｄのヘキサンに滴加する。次いで
、化合物３の沈殿を集める（１．３ｇ、６２％）。次の
物理化学的データで特性化される： Ｒｆ：２つのジアステレオ異性体に対応する２つのスポ
ット０，５７及び０．０６４、 質量分析（Ｍ＋Ｈ）：分子ピークｍ／ｅ−８６２−１，
２％２００Ｍ　ＨＺでの核磁気共鳴：このような生成物
の混合物の複合スペクトルの分析は非常に難しい。次の
プロトンの信号のみが確実に特性化できた：　Ｈ１’　
６．３３＋１Ｅ）ＩＩ　（Ｑ）、８３’　４．８５９ｔ
）ｌ（１ｍ）、　＋１４’４．３５１）Ｉ）ｌ（１）、
　８５’及び■５“３．６０１）Ｉ）ｌ（ＩＩ）、　Ｈ
２“２゜４９１）ｐｍ（１）、　８５８．４０ｐｐｍ（
ｄｄ）、メトキシル３．９０ｐｐｍ（ｍ）、メチル１．
２−１．４　ｐｐｍ（ｍ）。
史［４ この実施例は次の配列ニ ー　５′　＾へＴ　　ＣＡＧ　　ＡＴＣＴＡＣＧＡＡ　
　ＴＴＣＴ　　　３’　　（１９ｍｅｒ）−５′＾ＴＣ
ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＡＣＣＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧ
ＣＴＣＣ＾＾ＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴ
　　丁　　３’　　　（４９ｍａｒ）　　。
−５’　ＴＧＣＡＧＴ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＴＣＧ　ＴＣ
Ａ　ＣＧＴ　ＣＣＣＴＧＧＧＴＧ　　ＴＡＣＡＣＧ　　
ＡＧＧ　　ＴＴＣＣＴＣＡＧ＾　八ＡＴ　　ＡＧＣＣＧ
Ａ　　ＣＧＡＡＡＧ　丁ＣＴ　ＡＴＧ　Ｃ１丁３’　　
（７２ｍｅｒ）　、をもつオリゴヌクレオチドを合成す
るための化合物３の使用を説明している。
これらの配列中、Ａはアデニンから形成されるヌクレオ
チドを表わし、王はチミンから形成されるヌクレオチド
を表わし、Ｃはシトシンから形成されるヌクレオチドを
表わし、Ｇはグアニンから形成されるヌクレオチドを表
わす。これらの合成を実施するために、化合物３をシト
シンに対応するシントン（５ｙｎｔｈｏｎ）として使用
する。アデニン。
グアニン及びチミンに対応するシントンは次の方法で製
造する。
Ａ）アデニンに対応するシントン このシントンは次の式： に従うアデニンのフェノキシアセデル化誘導体である。
これは次の段階を行うことにより２゛−デオキシアデノ
シンから製造する。
！ｌＮ−６−フエツキシアセヂル）−２°−−オキシア
ー１０２５ｊ！ｇ（４ミリモル）のデオキシアデノシン
を乾燥させた債、無水蒸留ピリジン２０ｄに溶解し、次
に氷水浴中に置いた丸底フラスコに入れる。０℃で、ピ
リジン２０ｄ中に溶解した無水フェノキシ酢酸８当ＭＡ
　（９，５ｇ；　３２ミリモル）をゆっくりと加える。
室温で９０分間反応を続けると、黄色が徐々に現われる
。この途中で三保護された誘導体が形成される。
次に過剰の酸無水物を０℃で３ｄの蒸溜水を加えること
により破壊し、次に１００ｉｄのクロロホルムで反応溶
媒を希釈する。クロロホルム相を５％の重炭酸ナトリウ
ム水溶液５０ａｌ！で４回洗い、溶媒を蒸発させると黄
色の残渣が得られる。これをピリジン１００ｄに溶かし
、溶液を氷水浴中に置いた後、０℃で０．２Ｎンーダ１
（ｌａｄを加えて１５分間アデノシンの３′及び５′位
を選択的に加水分解する。次に媒質を、ピリジニウムの
形のＱｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８カチオン交換樹脂により中
和する。樹脂を濾過し、すすいでからＰ液を蒸発乾固す
る。
これによりＮ−６−（フェノキシアセチル）−２’−デ
オキシアデノシン（化合物４）が得られ、これを、クロ
ロホルム−メタノール勾配（１０Ｇ−０−９６−４）を
使ったシリカカラムクロマトグラフィー（直径４ｃＩｉ
、長さ１０α）で精製する。次に、所望の生成物を含有
する両分を蒸発させ、この方法で１０１０ηの白色粉末
を得る。これは６５％収率に相当する。
次にこの生成物を薄層クロマトグラフィー、質量分析及
び２５０Ｍ　ＨＺでの核磁気共鳴により特性化する。得
られた結果は次の通りである：Ｒｆ：０．６６（クロロ
ホルム−メタノール泳乃混合物（８０／　２０容畿比）
２５０ＭＨ７ｔ’の核磁気共鳴：’ＩＩ−ＮＨＲ（ピリ
ジンｄ５）：　２．７−３．３（ａｔ、２Ｈ，Ｉｆ、、
　。
Ｈ２）：　４．１−４．３５（１８，２Ｈ，＋１５１＋
５）：　４．６（Ｉｌｌ。
Ｈ４）；５．２５（ｍ、１１３）；５．６５（Ｓ、２１
１．ＣＨ２）；　７．０（ｍ。
Ｈｌ）：　　６．９−７．４　（ＩＩＩ、５１１．　Ｃ
６Ｈ３）；８．７５及び９．０５（ｓ、Ｉｆ２及びＨ８
）。
質量分析：　（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ　：３８
６−１６％）：フエノキシアセチル化アデニン（ｍ　／
　ｅ　：　２７Ｇ−６６％）。
無水ピリジンを連続して加えて蒸発さけることにより２
．５ミリモルの化合物４を乾燥させた後、ピリジン２５
ｍに入れ、０℃に冷却し、０℃でピリジン２５Ｉｄ中の
４．４′　　−ジメトキシトリチルクロリド２．１５ミ
リモル（１，１当吊）を加える。５℃で１７時間反応を
続け、反応ｉｎにメタノール２ａｅを加える。３０分侵
に、ロータリーエバポレータで溶媒を除去し、油状残渣
を１００ｍの酢酸エチルに入れ、５％Ｎ　ａ　ＨＣＯ３
水溶液５０ｍで３回、２回蒸留した水５０ｄで１回洗う
。次に有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する
。シリカゲルカラム上での分画により化合物５を単離す
る。
ピリジン、トルエン及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）
の共蒸発により３ミリモルの化合物５を乾燥させる。残
渣を１２ミリモルのＮ、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミンの存在下にＴＨＦ１５ｄに入れた後、シアノエチ
ル−モノクロローＮ。
Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト６ミリ 後、アミン塩化物の沈殿形成が観察される。３５分間反
応を続け、反応の１＆後には沈殿をｅ遇する。
次に、Ｐ液を蒸発乾固させて、酢酸エチル１５０ｉｄ中
に入れる。１０％Ｎ８２Ｃ０３氷水溶液で洗浄する。次
に有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させ
る。
（７られた化合物は、ＣＨ　　ＣＩ　　−ヘキサン−ト
リエチルアミン混合物（　７０／　２０／　１０容聞比
）を溶出に使用し、大きさＢのＭｅｒｋ　　”　Ｌ　ｏ
ｂａｒ”　ｈ　−７ム上での低圧クロマトグラフィで精
製する。１！７られた化合物を最少間のジクロロメタン
又は］：チルアセテートに入れ、−８０℃でへ↑サン中
で沈殿させる。これにより、アデニンに対応するシント
ン（化合物６）が（りられる。
（以下余白） Ｂ）グアニンに対応するシントン このシントンは式： のフェノキシアセチル化誘導体である。
これは、アデニンに対応するシントンの合成の手順と同
じ手順を行って２゛−デオキシグアノシンから製造する
。
Ｃ）アミンに対応するシントン チミジンを出発物質として前記したと同じ手順を行い、
段階（ａ）は行わずにこのシントンを得る。
Ｄ）オリゴヌクレオチドの合成 これらの合成はＡ　ｐｐｌｉｅｄ　　［３　ｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ　Ａ　Ｂ　Ｓ３８０Ａ装置を使用し、製造者に
よるプロトコールに従い、製造者から供給された化学試
桑と次の品のシントンとを使用して実施するニ ーアデノシン　シントン（化合物６　）　：４００ＷＪ
（無水アセトニトリル４．　４８ｄに溶解）−グアニン
　シントン（化合物７　）　：４００■（無水アセトニ
゛トリル４．　６４＋ｄ！に溶解）−シトシン　シント
ン（化合物３　）　：４００■（無水アセトニトリル４
．　７２ｄに溶解）−アミン　シントン＋４００■（　
ｊｊ！，（水アセトニトリル５．２８ｍ溶解）。
チミジン（０，２マイクロモル）をグラフトした支持体
カートリッジを装置に載置し、製造者の指示す るプロトコールに従って縮合サイクルを連続的に実施す
ることによりオリゴヌクレオチド配列を組立てる。
操作の最後に、オリゴヌクレオチド含有カートリッジを
室温で２時間園アンモニアの作用下におくことによりオ
リゴヌクレオチドを脱保護する。
この処理により支持体からオリゴヌクレオチド又はＤＮ
Ａ断片も離す。次に液相を蒸発乾固した侵、排除ゲルカ
ラム上で生成物の混合物の塩を除去する。
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いるリン３２放射
活性ラベルにより、合成したＤＮＡ断片が所望の長さを
有することをポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に
より確認される。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｒ＾１は式： −ＣＯ−ＣＨ＿２−Ｃ（Ｒ＾２Ｒ＾３）−Ｒ＾４［式中
    、Ｒ＾２とＲ＾３とは同じでも異っていてもよく、水素
    原子又はアルキル基を表わし、Ｒ＾４はアリール基を表
    わし、該アリール基は非置換又はＮＯ＿２、ＣＮ、アル
    コキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、Ｆ、▲数式、化学式、
    表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
    、ＳＯ＿２Ｒ、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼、アルキル及びＳＲ （但し、Ｒはアルキル又はアリール基を表わす）から選
    択した１つ以上の基で置換されている］の基を表わし、
    Ｒ＾５は水素原子、酸性媒質中で不安定な基又はＲ＾１
    基をあらわし、Ｒ＾６は水素原子、リン含有基又はＲ＾
    １基を表わし、Ｒ＾７は水素原子又は（保護された又は
    されていない）ＯＨ基を表わす］に従うヌクレオシド誘
    導体。
  2. （２）Ｒ＾１が基−ＣＯ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−Ｃ＿６
    Ｈ＿５を表わす請求項１のヌクレオシド誘導体。
  3. （３）酸性媒質中で不安定な基Ｒ＾５を式：▲数式、化
    学式、表等があります▼（II） ［式中、Ｒ＾８、Ｒ＾９及びＲ＾１＾０は同じでも異っ
    ていてもよく、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基
    を表わす］のトリチル基、ピキシル基及び９−フェニル
    キサンアニル基の群から選択する請求項１のヌクレオシ
    ド誘導体。
  4. （４）リン含有基Ｒ＾６を 式： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） 式： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 又は 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の基の群から選択する請求項１のヌクレオシド誘導体。
  5. （５）Ｒ＾５及びＲ＾６が水素原子を表わす請求項１及
    び２のいずれかのヌクレオシド誘導体。
  6. （６）Ｒ＾５が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を表わし、 Ｒ＾６が水素原子を表わす請求項１及び２のいずれかの
    ヌクレオシド誘導体。
  7. （７）Ｒ＾７が水素原子を表わす請求項１のヌクレオシ
    ド誘導体。
  8. （８）Ｒ＾５が基： ▲数式、化学式、表等があります▼ を表わし、 Ｒ＾６が基： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） を表わす 請求項２のヌクレオシド誘導体。
  9. （９）Ｒ＾７が水素原子を表わす請求項８のヌクレオシ
    ド誘導体。
  10. （１０）（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｒ＾１は式： −ＣＯ−ＣＨ＿２−Ｃ（Ｒ＾２Ｒ＾３）−Ｒ＾４［式中
    、Ｒ＾２とＲ＾３とは同じでも異つていてもよく、水素
    原子又はアルキル基を表わし、Ｒ＾４はアリール基を表
    わし、前記アリール基は置換されていないか又は ＮＯ＿２、ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、
    Ｆ、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学
    式、表等があります▼、ＳＯ＿２Ｒ、 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼、アルキル及び ＳＲ（但し、Ｒはアルキル又はアリール基を表わす）か
    ら選択した１つ以上の基で置換されている］の基を表わ
    し、 Ｒ＾５は酸性媒質中で不安定な基を表わし、Ｒ＾６はリ
    ン含有基を表わし、 Ｒ＾７は水素原子を表わす］のヌクレオシド誘導体をヌ
    クレオシド誘導体又はオリゴヌクレオチド縮合する少な
    くとも１つの縮合サイクルと （ｂ）式Ｒ＾１の保護基を除去する段階とからなるオリ
    ゴヌクレオチドの合成方法。
  11. （１１）Ｒ＾１が基−ＣＯ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−Ｃ＿
    ６Ｈ＿５である請求項１０の方法。
JP63253624A 1987-10-08 1988-10-07 ヌクレオシド誘導体、特に２′−デオキシシチジン及びオリゴヌクレオチド合成へのそれらの使用 Pending JPH01128996A (ja)

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FR8713911A FR2621591B1 (fr) 1987-10-08 1987-10-08 Derives de nucleosides, notamment de desoxy-2' cytidine et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides

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DE3880083D1 (de) 1993-05-13
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