JPH01131125A - トキソプラズマ ゴンディの特異的排出−分泌抗原、それらの発現産物、それらの製法及びそれらの診断及び予防用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトキソプラズマゴンディ （Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ３ｏｎｄｉｉ）　　（ＴＧ）の
タキゾイト（ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ）により排出−分泌
された抗原並びに上記寄生虫のタキゾイト及びブラデイ
ゾイト（ｂｒａｄｙｚｏｉｔｃ）に共通する抗原の同定
に関する。

また本発明はこれら抗原の翻訳生成物及び上記抗原及び
その翻訳生成物の用途、殊にＴＧタキゾイトに対する免
疫保護及びトキソプラズマ症殊に先天性トキソプラズマ
症の初期診断に対する用途に関する。。

原虫類寄生虫であるトキソプラズマは、胞子虫類綱球虫
類に属し、宿主となる哺乳動物の各種細胞内で繁殖する
細胞内寄生虫である。この生物に起因する人に対する最
も重要な疾病は成長する胎児及び免疫不全症（ＡＩＤＳ
等）の患者に表われる。トキソプラズマ症は、重大な視
覚及び脳の疾病の原因となり、経胎盤ルートを通して汚
染された新生児や免疫不全患者にとっては致命的なもの
となる。

人に対しては２種の形態の寄生虫が明かにされている。

１つは「タキゾイト」であり、これは疾病の急性相の過
程で増殖する形態であり、他は「ブラディゾイト」で神
経組織中に被嚢してとどまり再感染に対する耐久免疫の
保持に影響を与える耐性形態のものである。

この寄生虫は人に対してのみならず獣医学に於ても重要
な病原体で、地理的に広く分布し、全世界で約５億の人
々が感染に対する血清反応で陽性を示すとされている。

「微生物学及び免疫学に於ける最近の話題」［ＣＵＲＲ
ＥＮＴ　ＴＯＰＩＣ８ＩＮ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
　ＡＮＤＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　、　ｖｏｌ　１２０　
（１９８５）　、　　ｐ１０５−１３９］１：於ｒ　ヒ
！　−、（（）ｌｔｌＧ）ＩＥｓ）　ハ種々の血清診断
法を論評している。サビン及びフェルトマンの染色法は
、ベバリー及びビートルにより標準化され（１９５８）
、フェルトマン及びラムにより改良（１９６６）、更に
ワルドランド及びパルフォー等により改良された（１９
８２）ものであるが、この方法は、生きている寄生虫と
大量の正常ヒト血清と熟練した専門家とを必要とする。

免疫螢光法による抗体の検出法は、レミントンにより発
展され（１９６８）カリム及びラドラムにより改良され
たものであるが、上記染色法と同じ欠点をもつ。また血
球凝集法は結果を得るのに時間がかかりすぎ、殊に妊婦
の寄生虫の存在を確認する場合には顕著である。固相酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）はテストマイクロプレート
上でその場でＩｇＭを単離することによりトキソプラズ
マ抗体を検出する方法である（ライラード等、１９８３
）。しかしこの方法は血清学的テストに於て、トキソプ
ラズマタキゾイトを水で細胞溶解し、凍結及び解凍し或
は超音波で破砕して得られる可溶性抗原を用いるもので
あり、上記技術はテスト系に膜抗原が存在するのを確認
するにとどまりしかも膜抗原が水又は緩衝液に易溶性で
あるか又は最終の遠心分離の段階で溶液中に懸濁する膜
片を殆んど残さない場合に限られる。

従来行われてきた種々の試験法は、種々の抗原を検出す
るための抗体の形成に基づいている。抗体は上記抗原を
同定して試験の信頼性と感受性を改善するのに重要であ
る。トキソプラズマの三種の抗原がコルデイ等により同
定され［」。

ＩＭＭＵＮＯＬ、９３　（１９６４）、ｐ１０３４−１
０４４１、次いでヒユーズ及びパルフォアにより確認さ
れ［ＰＡＲＡＳＩＴＥ　ＩＭＭＵＮＩＬ、　　３　（１
９８１）　。

ｐ２３５−２４８１その細胞の起源が確立された。

超音波、５ＤＳ−ＲＡＧＥ及び１２５Ｉで標識されたコ
ンカナバリン固定法により処理された生物由来のトキソ
プラズマポリペブタイドの分析により、分子量２０００
０〜９８０００でグリコジル化されていない寄生虫由来
の９種の細胞内ポリペプチドの存在が明かにされた。後
になって超音波処理し次いでマウス免疫血清で沈降させ
ることにより、１０種のポリペプチドが明かとなった。

リンパ系細胞によるハイブリッド化についてのコーラ及
びミルスタインの方法は、モノクローナル抗体を発展さ
せトキソプラズマの抗原構造を検知することを可能とし
た。ヒユーズ（前掲。

１９８５）では、その発表時点で３２のモノクローナル
抗体が明かにされており、それらはトキソプラズマの膜
抗原と反応すると述べている。全ての抗体は血清学的見
地から明かにされている。４つの抗体は膜成分及び細胞
質成分の双方に対し反応性を有し、２８の抗体は膜抗原
の認識試験でのみ活性である。これらのモノクローナル
抗体に対し適用された免疫沈降及びＳＤＳ　−ｒ’ＡＧ
Ｅ試験により大多数の抗体は分子量３５ｋＤ、２７ｋＤ
及び１４ｋＤの抗原と反応することが明かとなった。

クローン３Ｅ６及び２Ｇ１１から得られる抗体は共に分
子量３５ｋＤ及び１４ｋＤの抗原を沈降させ［ハンドマ
ン等Ｊ、１ＭＭＵＮＩＬ　（１９８０）　、　　ｐ２５
７８−２５８３１　、ジョンソン等により開発されたモ
ノクローナル抗体ＦＭＣ１８，ＦＭＣ２２及びＦＭＣ２
３も同様である［Ｊ、Ｅｘｐ、ＢＩＯＬ。

ＭＥＤ、ＳＣＩ　、５９　　（１９８１）、ｐ３０３−
３０６３゜これらの抗体は全てタキゾイトの膜に特異的
である。キャスパー等は分子ｆｆ１２２ｋＤ　（Ｐ２２
）及び３０ｋＤ　（Ｐ２Ｏ）の２種の沈降性抗原の沈降
を記述している。［Ｊ、ＩＭＭＵＮＩＬ　　（１９８２
）　。

１２９、ｐ１６９４−１６９９及び（１９８３）。

１３０、ｐ２４０７−２４１２１゜ 更にジョン’）ン等［Ｊ、ＰＲＯＴＯＺＯＯＬ　　＜　
１９８３　）、３０、ｐ３５１−３５６］は同一の膜抗
原と反応するモノクローナル抗体は異種のエピトープを
認識することを示しており、ヒユーズ（前掲、ｐｌ１）
は、これらの最近の研究を関連付けることにより同様の
研究が共通の抗原を認識する他のモノクローナル抗体に
対し行われ、耐連するエピトープの分子構造が明かにさ
れ得ることを示唆している。

ヒユーズ（前掲）はその論評において体液中を循環する
抗原の検出の重要性を強調している。トキソプラズマに
よる感染は正常には先に挙げた様な血清学的試験により
実証可能な急速な体液性応答を導くが、この様な試験は
早急の診断をしかも単一の血清試料から急性感染を精密
に検知しなければならない臨床閃にとっては満足できる
ものではない。これは殊に伝染の危険性のある免疫不全
症患者や低γ−グロブリン血症の場合に重要である。抗
原血症の検出により急性相感染の間と同様に上記ケース
での確認が可能となれば、先天性トキソプラズマ症での
活性感染の確認、羊水又は脳を髄液等の体液中の抗原の
検出は、トキソプラズマにより感染の重大な課題に対し
示唆を与え且つ結論的には採用されるべき治療及び予知
を決定する。

急性トキソプラズマ症に感染したマウス血清中に検出さ
れた循環抗原が、水に溶解されたトキソプラズマ抽出物
と共通成分を有し、易熱性蛋白質（５６℃／３０分間）
であり且つその分子ｆｆ１（アフィニティクロマトグラ
フィーにより単離収得）は１０万以上であり、感染ラッ
ト血清中の循環抗原と同様であることが二重拡散法によ
り明かにされた。

循環抗原は、寄生虫に−よる活性分泌又は免疫検定の何
れかの方法により遊離できる。循環抗原は単純な水性抽
出物や腹腔洸液と免疫的に一致しないことが明かにされ
ており、これは抗原血症が死亡した寄生虫や感染細胞か
らの抗原の遊離に単純によるものでないことを意味して
いる。しかしシーゲル及びジョントン［ＣＬＩＮ、　Ｅ
ＸＰ、ＩＭＭＵＮＯＬ。

（１９８３）５２．ｐ１５７−１６３）に記述された循
環免疫複合体中に存在する抗原は未だ明かにされていな
い。

更にジョンソン［ＰＡＴｌｌｏＬＯＧＹ　　（１９８５
）、１７、ｐ９−１９１は、トキソプラズマ症感染の自
然ルートは猫にのみ認められる接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ
）中のスポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）や組織の
女子中のブラディゾイトの経口摂取であるにも拘らず、
上記問題に対する多数の研究は抗原源として寄生虫のタ
キゾイト形態を用いていると指摘している。トキソプラ
ズマの生゛命サイクルの５つの形態［シゾンテ（ｓｃｈ
ｌｚｏｎｔｅ　）　、ゲメトサイト（ｇａａ＋ｅｔｏｃ
ｙｔｅ）　、スポロゾイト、タキゾイト、ブラディゾイ
ト］に共通する抗原が存在すること及び螢光物質で標識
され且つタキゾイトに対して産生じた抗血清が特異的に
４つの他の形態と反応することが証明されている。他の
著者［ルンデ及びヤコブス、Ｊ、ＰＡＲＡＳＩＴＯＬ　
　（１９８３）　６９．　　ｐ８０６−８０８１はタキ
ゾイトとブラディゾイトとの間に抗原性の相異があるこ
とを示している。

即ち螢光物質で標識された抗ブラディゾイト抗血清はブ
ラディゾイトとのみ反応し、一方抗タキゾイト抗血清は
タキゾイト及びブラディゾイトの双方と反応する。同様
にキャスパー等による試験（Ｊ、ＩＭＭＵＮＯＬ　　（
１９８４）　、　　１３２．　　ｐ４４３−４４９）は
この結果を確認しており、スポロゾイト及びタキゾイト
間での抗原性の相違はトキソプラズマによる２つの感染
経路間の相違に適合した、診断法の展開を予想すること
を可能にする。

ヒユーズ（前掲）によればジョンソン等（前掲）により
単離された抗体ＦＭＣ１９及びＦＭＣ２２を用いてアフ
ィニティークロマトグラフィーにより単離された抗原が
防御性で体液性応答の誘発に適当している場合には、ト
キソプラズマ症に対するりクチン（死亡生物又は猛毒化
生物を用いるワクチン）はこれ迄の試み以上の成功を収
めればモノクローナル抗体によってだけでも可能となる
。

実際には、これ迄に報告された結果はこの問題を解決す
るに充分なものではない。ジョンソン等（１９８３、前
掲）は、モノクローナル抗体ＦＭＣ１９及びＦＭＣ２２
がＰＭ３５ｋＤ及び１４ｋＤの抗原と反応することによ
り、トキソプラズマの病原性及び強病源性株に対し防御
性を誘発することを見出した。しかし同一抗原を沈降さ
せる他のモノクローナル抗体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
）は、同程度の防御性を呈さず、その為に著者はこれら
抗体は同−抗原上の異なるエピトープを認識していると
仮定している。防御性を誘発する２種のモノクローナル
抗体は夫々イソタイプＩ　ｇＧ３及びＩｇＧ１である。

有意な防御性を誘発しない２種のモノクローナル抗体は
夫々イソタイプＩｇＧ１　（ＦＭＣ２３）及びＩ　ｇＧ
２ａ　（２Ｇ１１）である。ＦＭＣ２Ｂに関して、防御
性の欠如が実際にＦＭＣ１９又はＦＭＣ２２に関連して
認識されたエピトープ間の相違に起因するならば、２Ｇ
１１についてもまたサブクラスＩｇＧ１及び１ｇＧ３に
関連するサブクラスＩｇＧ２ａの異なる特異性によるも
のとし得る。

キャスパー等［Ｊ、ＩＭＭＵＮＯＬ　　（１９８５）、
１３４、ｐ３４２６−３４３１１は精製したトキソプラ
ズマのタキゾイト膜蛋白である。蛋白Ｐ３０による免疫
マウスに対する試み及び該抗原に対するモノクローナル
抗体を記載している。キャスパー等は処置マウスに非免
疫対照マウスと比較した死亡率の統計的に有意な増加が
あることを認め、且つワクチン処置したマウスに対照群
と比較して脳内組織貰子数の増大を認めている。同様な
結果が抗原Ｐ３０に対するモノクローナル抗体の移植に
よる受動免疫でも得られた。ブラディゾイトは抗原Ｐ３
０も抗原Ｐ２２も含有しないので、著者らは、この失敗
は抗タキゾイト抗体に対する寄生虫の抵抗性によるとす
る。

この分野での最も新しい研究は、１９８６年１月にＵＣ
ＬＡにより編集されたｒ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ３ＴＲＡ
ＴＥＧＩＥＳ　ＯＦ　ＰＡＲＡＳＩＴＩＣＩＮＶＡＳＩ
ＯＮＪ　ｇ：発表された下記アブストラクトである。

ブースロイド、ブルグ、ネーゲル、オッソリオ、ペレル
マン、キャスパー、ウェア、プリンス、シャルマ及びレ
ミントン（アブストラクトＣ１９）は、トキソプラズマ
症の生物学的性質及び誘発性をよりよく理解するために
組換ＤＮＡ及びモノクローナル抗体を用いる技術を使用
した。この目的の為に、彼等は寄生虫の主要表面抗原に
対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を使用し
夫々の遺伝子を単離し特徴付けた。彼等は成る種のこれ
ら遺伝子の部分的乃至完全なヌクレオチド配列を作成し
、且つトキソプラズマ中の単一例にのみ存在するα−及
びβ−チューブリンの遺伝子をクローン化し且つ部分配
列を明かにした。後者はネーゲル及びブースロイドによ
るアブストラクトＣ５９中の報告により一層よく特徴付
けられる。

ブルグ、ペレルマン及びブースロイド（アブストラクト
Ｃ８５）は、トキソプラズマのゲノムＤＮＡを用いてフ
ァージλＧｔｌｌに於ける発現ライブラリーの展開とト
キソプラズマ感染マウスからの免疫血清による上記ライ
ブラリーからの該寄生虫の主要性抗原決定基に対するコ
ーディングポテンシャルを有する配列即ち遺伝子ＴｇＢ
ｌの単離とを記述する・。上記配列はトキソプラズマに
特異的と考えられており、クローンＴｇＢ１λｇｔ１１
に於て生成した抗原決定基はマウス、ラット及びヒトの
免疫血清により認識される。

これらの著者達はトキソプラズマのｃＤＮＡ発現ライブ
ラリー（ファージλｇｔｌｌよっても構築される）をス
クリーニングし、精製された抗原表面蛋白Ｐ３０及びＰ
２２に対するポリクローナル抗血清による寄生虫の表面
に存在する抗原をコードする配列を単離することを記述
する。ノーザンイムノトランスファー（Ｎ　ｏｒｔｈｅ
ｒｎｉｍｍｕｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ）でプローブとして
Ｐ２２抗原のｃＤＮＡを用いることにより彼等は約１６
００のヌクレオチドを含む単一のＲＮＡ種を検出した。

「プリンス、レミントン及びシャルマ（アブストラクト
Ｃ１０６）は、マウスに長期（９ケ月以上）に亘る防御
免疫を与えるモノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｆ３　Ｇ３
により認識されたトキソプラズマ抗原を特徴付けた。ト
キソプラズマ抗原をコードする遺伝子のクローニングは
発現ベクターλｇｔｌｌ中のタキゾイトのｃＤＮＡライ
ブラリーを展開しスクリーニングすることにより達成さ
れる。スクリーニングは抗原Ｆ３Ｇ３に対するマウスポ
リクローナル抗体による。

単一特異性抗体プローブによりスクリーニングすること
によって単離された組換クローンは、無処理蛋白の１／
８をコードするトキソプラズマＤＮＡインサートを含有
し且つこれらクローンから得られる組換抗原はまた（ｍ
ａｂ）Ｆ３　Ｇ３により認識される。

トキソプラズマ症の分野で行われた研究は主に次のこと
を明かにした。■共通のエピトープを示すタキゾイト段
階及びブラディゾイト段階の抗原を同定し同時免疫を確
立する必要性があること；■タキゾイトによる排出−分
泌抗原の同定及び防御免疫に於けるその役割の重要性の
評価に対する必要性；並びに■トキソプラズマ症に対す
る防御免疫に於けるクラスＩｇＥ抗体の約割を証明する
必要があること。

本発明の目的は、トキソプラズマゴンディ　（ＴＧ）の
抗原を提供することにあり、該抗原はＴＧのタキゾイト
の排出−分泌抗原（ＥＳ）により構成されていることに
より特徴付けられる。

本発明者は、ヒト寄生虫性疾病殊にトキソプラズマ症の
分野での研究に於て、これら疾病の作動因子及び免疫調
節因子の機構を確認するのに成功し、殊に防御免疫応答
の展開に於ける排出−分泌抗原の重要性を確立すること
ができた。但し膜抗原は作動及び抑制双方のイタイブの
誘発に特に関連する。

これらの発見に基づき本発明者は特にトキソプラズマ症
に対するワクチンを開発するという目的の為に、上記排
出−分泌抗原を単離した。

本発明によれば、トキソプラズマのタキゾイトから単離
されたＥＳ抗原は、抗原群を構成し、その内の所要な２
０は検出されておりその分子量は夫々略々１８５ｋＤ、
１７０ｋＤ、１５５ｋＤ。

１０５ｋＤ、９８１ｃＤ、８４ｋＤ、６８ｋＤ。

５７ｋＤ、５３ｋＤ、４５ｋＤ、４３ｋＤ、３９ｋＤ、
３５ｋＤ、３４ｋＤ、３１ｋＤ、３０ｋＤ。

２６１ｃＤ、２５ｋＤ、２４ｋＤ及び２０ｋＤであるこ
とにより特徴付けられる。

本発明の有利な特徴は分子ｆｆ１１８５ｋＤ。

１７０ｋＤ、１５５ｋＤ、１０５ｋＤ、５７ｋＤ。

５３ｋＤ、４５ｋＤ、４３ｋＤ、３９ｋＤ、３５ｋＤ、
３４ｋＤ、３１ｋＤ、３０ｋＤ、２６ｋＤ。

２５ｋＤ及び２４ｋＤの抗原は慢性相に於て認識される
ことである。

本発明の他の有利な特徴は、分子ｆｆ１１０５ｋＤの抗
原は慢性期（ｃｈｒｏｎｌｃ　ｐｈａｓｅ　）の標識と
して同定されることである。

更に本発明の他の特徴は、分子量８４ｋＤの抗原は慢性
期の一時的標識として同定されることである。

本発明の他の特徴は、分子量２４ｋＤの抗原は慢性期の
遅発性標識（ｌａｔｅ　１ａｂｅ１）として又防御免疫
の標識として同定されることである。

また本発明の他の特徴は分子量９８ｋＤの抗原は急性期
軸ｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅ　）の標識として同定されるこ
とである。

更に本発明の他の特徴は分子量６８ｋＤの抗原は、抗原
９８ｋＤ程特異的ではないが、急性期の標識として同定
されることである。

本発明の特徴によれば、ＴＧのＥＳ抗原は、トキソプラ
ズマタキゾイトの懸濁液をヒト又は動物起源の補体除去
血清を１０％含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で約３時
間培養し、遠心分離し次いで上澄を限外濾過し、更に必
要に応じ濃縮、遠心分離及び−７０℃での凍結処理をし
て得た上澄から単離される。斯くして得られるＥＳ抗原
はトキソプラズマ症に対する防御体液性応答を誘発し得
る。

また本発明によればトキソプラズマの抗原はトキソプラ
ズマのブラディゾイトの抗原により構成されていること
によって特徴付けられる。

殊に本発明の有利な特徴は、トキソプラズマの抗原がト
キソプラズマのタキゾイト及びブラディゾイトに共通の
抗原によって構成されていることにより特徴付けられる
。

本発明者によれば、後者は、タキゾイト及びブラディゾ
イト抗原場合によっては双方又は一方或はこれら抗原の
翻訳生成物（好ましくは放射標識したもの）により血清
反応陽性として認識された補乳動物血清殊にヒト又は動
物血清（特定のＩｇＭを含−釘する急性期、ＩｇＭ及び
ＩｇＧの双方を含む亜急性期又はＩｇＧを含有する慢性
期の何れか）の免疫沈降、得られた免疫沈降物の解離、
引続くポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）　、ゲルのオートラジオグラフィー及びそ
の現象により同定される。

本発明の好ましい態様によれば、タキゾイトにより排出
−分泌され、適当な方法で単離され、タキゾイト及びブ
ラディゾイトに共通のトキソプラズマ抗原は約４３ｋＤ
の分子量を有し、糖蛋白であり、且つ抗ＥＳ血清、抗ブ
ラディゾイトマウス血清及び患者のヒト血清により認識
されることにより特徴付けられる。

他の本発明の好ましい態様によれば、タキゾイトにより
排出−分泌され適宜単離されたタキゾイト及びプラディ
ゾイトに共通のトキソプラズマ抗原は約２５−２４ｋＤ
の分子量を有し、且つタキゾイト中の位置が抗ブラディ
ゾイト、血清による免疫沈降により確認できることによ
り特徴付けられる。

本発明によればトキソプラズマのブラディゾイト抗原は
、殊にトキソプラズマの慢性形態により感染されたマウ
スのような哺乳動物の組織粉砕物から得られる受子（シ
スト、ｃｙｓｔｅｓ）より単離される。上記受子乃至シ
ストは適当な勾配（ｇｒａｄｉｃｎｔ）で精製し、超音
波処理し次いで凍結状態で粉砕し、遠心分離して細胞質
、抗原（フラクションＳ１）を含有する上澄と膜抗原（
フラクションＳ２）を適当なデタージエントにより解離
するペレットとを収集する。

本発明の目的はまたタキゾイトのｍ　ＲＮ　Ａ翻訳生成
物を提供することにあり、該翻訳生成物はトキソプラズ
マのＥＳ抗原により認識されるエピトープを有している
ことにより特徴付けられる。

本発明の特徴によれば、これらの翻訳生成物は次のよう
にして得られる。遠心分離したタキゾイト溶解産物（１
ｙｓａｔｅ）からＲＮＡを沈降させ（該溶解産物から適
当な抽出剤によりペレットが抽出されＲＮＡを沈降する
）、クロマトグラフィーにより全ＲＮＡからポリＡ＋Ｒ
ＮＡの分離を行いｍ−ＲＮＡを精製し、Ｌ−メチオニン
を欠損し３５Ｓ−メチオニンを含有するアミノ酸混合物
の存在下に網状赤血球の溶解度物中緩衝媒体中でｍ　Ｒ
Ｎ　Ａを試験管内で翻訳し、次いでＶＭＡ逆転写酵素を
作用させてタキゾイトｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡを合成
する。斯くして得られるｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングしｃＤＮＡの挿入により抗ＥＳ抗体により認識
されるエピトープを有する蛋白又は蛋白フラクションの
生成能を有する組換ファージを同定し且つそれからヒト
血清により認識されるＥＳクローンを選択する。維持さ
れたクローンは抗体選択により特徴付けられる。

本発明の目的はまたトキソプラズマ症殊にタキゾイトに
対するトキソプラズマ症に対して有意な防御能を発揮す
るＩｇＥ抗体に富んだ血清を提供することにあり、斯か
る血清はＥＳ抗原で免疫された動物から得られることに
より特徴付けられる。

更に本発明の目的はモノクローナル抗体を提供すること
にあり、該モノクローナル抗体はＥＳ抗原により免疫さ
れた動物の細胞と腫瘍細胞との融合により得られるハイ
ブリドーマの培養により産生される。

また本発明の目的はトキソプラズマ症に対する有意な防
御に適合したワクチンを提供することにあり、該ワクチ
ンは、活性構成成分としてポリクローナルまたはモノク
ローナル抗ＥＳ抗体を含有することにより特徴付けられ
るる。

本発明の目的はまたトキソプラズマ症の治療の為の治療
組成物を提供することにあり、該組成物は活性構成成分
としてＥＳ抗原、殊にタキゾイト及びブラディゾイトに
共通のエピトープ及び決定基を何するＥＳ抗原を含有す
ることにより特徴付けられる。

更に本発明の目的は先天性トキソプラズマ症を含むトキ
ソプラズマ症に対する診断用製品を提供することにあり
、これは活性構成成分としてＥＳ抗原を含有することに
より特徴付けられる。

これらの特徴の他に本発明は以下の記載から派生する他
の特徴を有する。

以下に実施例を挙げて本発明の特徴とするところをより
一層明かにする。実施例はオキソプラズマ抗原、殊にＥ
Ｓ抗原の調製、その特徴及び抗ＥＳ抗体の調製を記述す
る。

実施例は本発明を具体的に説明するためのものであって
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ タキゾイトの排出−分泌抗原（ＥＳ抗原）の調製 ａ）排出条件： 寄生虫の生存能力は、エリスロシンＢによる予備生存テ
ストにより、評価される。顕微鏡による観察の直前に、
タキゾイトの懸濁液３０μＱと、ＰＢＳ緩衝液（０，Ｏ
ＩＭ、ｐＨ７，２）中にｍｌ当り４ｍｇを含むエリスロ
シンＢ溶液３０μＱとを氷浴ヒで５分間接触させた。次
いで、染色されておらず、屈折性を示す生きたタキゾイ
トのパーセンテージと、エリスロシンにおかされ、ピン
ク色に染色された死んだタキゾイトのパーセンテージと
を測定した。

この生存テストは、最適生存条件が、寄生虫の溶解によ
る細胞質性抗原の放出を伴なうことなく、活性な排出に
対応することを確立することを可能とした。

ＥＳ抗原は、ヒトまたは動物起源の補体除去された血清
を１０％含むＲＰ旧　１６４０媒体中でタキゾイトを３
時間インキュベートすることにより（排出媒体１．５ｍ
ｌのチューブにつき１．８Ｘ１０Ｂ個のタキゾイトの割
合で）、得られた。

種々の起源の血清の存在下における排出動態（ｅｘｃｒ
ｅｔｌｏｎ　ｋｌｎｅｔｌｃｓ）の比較により、最善の
結果は、下降順に、それぞれヒト、牛胎児、ラビットお
よびマウスからの血清により得られることが判明した。

これらの異なる血清の存在下に排出された抗原は、性質
的には、同等のものである。

３時間のインキュベイジョンの後、２８００ｒｐｍで１
０分間遠心分離すると、ＥＳ抗原を含有する上清液を分
離することが出来た。これらの上清液は、ミリポアー膜
（０，２２μｍ）により濾過され、次いでＣｅｎｔｒｉ
ｃｏｎ　１０チユーブ（Ａｍｉｃｏｎ）中５００Ｏｒｐ
ｍで４０分間遠心処理することにより、１０倍に濃縮さ
れた。これらのＥＳ抗原調製物は、下記の組成を有する
プロテアーゼ阻害剤の溶液を添加した後、−７０℃で凍
結して、保存された。

一１０ｍＭ、ｐＨ７，２のＰＢＳ緩衝液１００ｍ１当り
ニ ーフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＰ）
（Ｓｉｇｍａ　）　　；無水アルコール中４０ｍＭの溶
液１００μＱ −Ｎ−ｐ−）シル−し一リジンークロロメチルケトン（
ＴＬＣＫ）　　（Ｓｉｇｍａ　）　７．　３ｍｇ−エチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（Ｐｒｏ
ｌａｂｏ　）　７５ａｇ −Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン−クロロメチルケ
トン（ＴＰＣＫ）　　（Ｓｌｇｍａ　）　７ｍｇｂ）３
５Ｓメチオニンによる代謝的ラベリングヌクレボアー膜
（３μｍ）上での濾過およびＲＰ則液液媒中の洗浄の後
、タキゾイトは、ｍｌ当り１．２Ｘ１０日個の割合でＲ
ＰＭＩ１６４０Ｐ体中に懸濁された。該媒体は、メチオ
ニンおよびシスチンを含まず、５６℃で３０分間加熱す
ることにより、補体除去された血清１０％を含む。該血
清は、あらかじめ９％ＮａＣ９溶液を使用して、４℃で
一晩透析され、ミリポアー膜（０，２２μｍ）により濾
過されたものである。

タキゾイト分散液は、１．５ｍｌの容積で、３７℃に保
持された溶血素チューブ（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ　ｔｕｂ
ｅｓ）に分配され、３０分分間中かに攪拌された。

次いで、この培地にラベルされたメチオニンを加え（チ
ューブ当り２２５マイクロキユリー）、緩やかな攪拌下
に３７℃で再度インキュベートした。１時間後、チュー
ブを３７℃で１時間３０分攪拌するに先立ち、各チュー
ブにメチオニン１５ｍ１およびＢＰＭＩ　　キット（Ｄ
ｌｆｃｏ　）からの冷シスチン１５ｕＱを加えたｏ２８
０ｏｒｐｍで１０分間遠心処理した後、異なった方法で
処理するために、ＥＳ抗原を含む上清液を全寄生虫によ
り構成されるペレットから分離した。

ミリポアー膜（０，２２μｍ）により濾過し、セファデ
ックスＧ２５　　Ｍ（ＰＤＩＯファルマシア）上を通し
て、遊離のメチオニンを除去した後、上清液は、Ｃｅｎ
ｔｒｌｃｏｎ　１０チユーブ（Ａｓｉｃ′ｏｎ）中５０
０Ｏｒｐｍで４０分間遠心処理することにより、１０倍
に濃縮された。ＥＳ抗原は、前述と同様のプロテアーゼ
阻害剤の溶液を添加した後、−７０℃で凍結して、保存
された。

Ｃ）ペレットに含まれる抗原の３５８メチオニンによる
ラベリング： 上記のようにして得られたペレットは、ＰＢＳ（０，Ｏ
ＩＭ、ｐＨ７，２）により２回洗浄され、６回にわたる
凍結サイクル（液体窒素内）および解凍（３７℃の水浴
中）に繰返し供されるに先立ち、再び蒸溜水に加えられ
た。

再度の遠心処理（２８０Ｏｒｐｍで１０分間）により、
上清液（細胞質性抗原を含む）が、さレットから分離さ
れ、該ペレットからは、膜性抗原が抽出された。

膜性ペレットの抽出および可溶化は、Ｎｏｎｄ　ｉ　ｅ
ｔＰ４０またはＣＨＡＰＳ　　（［（３−コルアミド−
プロピル）ジメチルアンモニオ］−プロパンースルホネ
ートｌ　　（ＩコＬＬＩＫＡ　）で処理し、次いで５０
００ｒｐｍで遠心処理することにより、行われた。可溶
化した膜性抗原は、上清液に含まれていた。

細胞質性および膜性抗原は、プロテアーゼ阻害剤溶液の
存在下に一７０℃で凍結することにより、保存された。

ｄ）タキゾイトの膜性抗原の　　Ｉ　　（ＩＯＤＯ−Ｇ
ＥＮ）によるラベリング 採用したラベリング方法は、ハワードらにより開示され
たｌ０ＤＯ−ＧＥＮを使用する方法（ハワードら、ジャ
ーナル　オブ　プロトズーオロジー、（１９８２）２２
．１１４）を修正したものである。Ｔ、ｇｏｎｄｉｉの
Ｒ、１１、株に感染したマウスの腹腔洗浄により得られ
たタキゾイトは、ヌクレオポアー膜（３μｍ）で濾過し
た後、ＰＢＳ　　（０，ＯＩＭ。

ｐＨ７，２）により２度洗浄された。

りｏロホルム１０ｍ１にｌ０ＤＯ−ＧＥＮ　（ピアース
　ケミカル　カンパニー、イリノイ、ロックフォード）
１　ｍｇを溶解し、この溶液６２５μＱをガラスチュー
ブに移した。次いで、窒素流通下に溶剤を乾燥させ、１
０８個のタキゾイトを加えた。４℃で１０分間１２５■
　５００μＣと接触させた後、混合物をＰＢＳ　　（０
，１Ｍ、ｐＨ７，２）およびＮａ１　１０ｍＭを含む他
のチューブに移し、反応を停止させた。次いで、タキゾ
イトをＰＢＳ（０，１Ｍ、ｐＨ７，２）中で３回洗浄し
た。次いで、膜性抗原をＮ０ｎｄｉｅｔ　Ｐ２Ｏまたは
ＣＨＡＰＳにより抽出した。

実施例２ ブラディゾイトの抗原の製造 ａ）ブラディゾイトの生成：抗原の抽出トキソプラズマ
のシスト内型虫体であるブラディゾイトは、トキソプラ
ズマ　ボンブイの“慢性”株７６にのシスト約３０個を
スイス　マウスに腹腔内注射することにより、得られた
。４〜６週間後、各マウスは、大脳内に１０００〜２０
００のシストを６していた。

感染したマウスの脳を捕り潰すことにより回収されたシ
ストは、ナカバヤシおよびマツムラの手法（１９６８）
にしたがって、まずアラビアゴム勾配上で精製された。

採用されたブラディゾイト（シスト中に存在する）の抗
原の抽出方法は、下記の通りであるニジストを超音波に
さらしく１分間で４回）、次いで凍結状態でＸ−Ｐｒｅ
ｓｓを１７回通過させることにより、粉砕した。４℃、
３２００ｇで２時間遠心処理した後、細胞性抗原を含む
上清液（フラクションＳ＋）を集め、ペレットをＣＩＩ
ＡＰＳ洗剤で処理して、膜性抗原を放出させた（フラク
ション８２）。プロテアーゼ阻害剤溶液の存在下に各ス
テップを行った。

ｂ）ブラディゾイト抗原の　　Ｉによるラベリング ラベリングは、ハンターおよびグリーンウッドの方法（
クロラミンＴ）［（１９６２）ネイチャー、ロンドン、
１９４．４９５〜４９６］により、行った。

フラクションＳ１およびフラクションＳ２　　（蛋白質
２５０〜５００μｇを含む）を少量（３００〜４００μ
Ｑ）の燐酸ナトリウムバッファー（０，５Ｍ、ｐＨ７，
４）に加えた。

ラベリング反応は、両フラクションにおいて、同じであ
るニ ー　２　ｍｇ／　ｍｌの割合でクロラミンＴ　（Ｍｅｒ
ｃｋ　）を含む溶液１００μＱに５００μｃＩＮａ　　
　Ｉを加える。

一緩やかな攪拌下に室温で１分３０秒インキュベートす
る。

一ナトリウム　メタビスサルファイド（Ｐｒｏｌａｂｏ
　）を４ｍｇ／ｍｌの割合で含む溶液１００μＱを添加
する。

−ＰＢＳを使用してＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　）上で透析を行ない、遊離のヨウ素を除去する。

実施例３ 免疫沈降および５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による、タキ
ゾイトおよびブラディゾイトに共通するエピトープを有
するＥＳ抗原の単離 ａ）タキゾイトの排出−分泌抗原による免疫ニーフィッ
シャー　ラット １０〜１４日の間隔で行われた４回の皮下注射による免
疫 注射された物質：１０８個のタキゾイトの排出に対応す
る実施例１で得られた３００μＱのＥＳ抗原とこれを補
足するフロイント不完全アジュバント３００μＱ −Ｂａ１ｂ／Ｃ７ウス １０日の間隔で行われた４回の皮下注射による免疫 注射された物質：Ｑ、５／１０８個のタキゾイトの排出
に対応する実施例１で得られた１００μＱのＥＳ抗原と
これを補足するフロイント不完全アジュバント１００μ
Ｑ −ラビット ラビットは、ヴアイトゥ力イティスらの手法により　［
Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｒ、　　（１９７１）　、　　
３３．　９８８〜９９１］、免疫された：４０回の皮内
注射をＥＳ抗原１ｍ１（８／１０８個のタキゾイトの排
出に対応するＥＳ抗原とこれを補足するフロイント完全
アジュバント１ｍ１）を使用して行ない、さらに抗百日
咳ワクチン（Ｖａｘｉｃｏｑ、１ｎｓｔｉｔｕｔ　Ｍｅ
ｒｌｅｕｘ）　１ｍｌを１回筋肉内注射した。筋肉内注
射の３月後、当初の投与量の１／１０の追加抗原刺激を
３週間毎に行なった。

ｂ）ブラディゾイトの抗原による免疫ニーフィッシャー
ラット １０〜１４日の間隔で行われた４回の皮下注射による免
疫 一可溶性抗原（Ｓ１） 注射：ＰＢＳ　　（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）３００μＱ
中の実施例２で得られた可溶性抗原（Ｓ＋）約６０μｇ
＋フロイント不完全アジュバント３００μＱ −膜性抗原（Ｓ２） 注射：フロイント不完全アジュバント３００μＱ中の実
施例２で得られた膜性抗原（Ｓ２）約１３０μｇ −Ｂａ１ｂ／Ｃマウス １０日の間隔で行われた４回の皮下注射による免疫 一可溶性抗原（Ｓ１） 注射：ＰＢＳ　　（１０ｍＭＳｐＨ７，２）７５ｕＱ中
の実施例２で得られた可溶性抗原（Ｓ１）１５μｇ＋フ
ロイント不完全アジュバント７５μＱ−膜性抗原（Ｓ２
） 注射：ＰＢＳ　　（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）７５ｕＱ中
の実施例２で得られた可溶性抗原（Ｓ２　）　６０μｇ
＋フロイント不完全アジュバント７５μＱＣ）スイス　
マウス脳（シスト生成性）の抗原による免疫ニ スイス　マウス脳を捕り潰し、ブラディゾイトと同様に
して、Ｘ−ＰＲＥＳＳを１７回通過させた。可溶性抽出
物によるフィッシャー　ラットおよびＢａ１ｂ／Ｃマウ
スの免疫は、ブラディゾイトの可溶性抗原の場合と同様
にして行なった。

ｄ）ラットおよびマウスの感染手法 −フィッシャー　ラットの感染 ＰＢＳ　　（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）　５００ｕＱ中の
ＲＨ株のタキゾイト１０５〜１０７個による腹腔内感染
。Ｎ　ｕ　／　Ｎ　ｕラットの感染［サントロら。

（Ｃ，Ｒ，ＡＣＡＤ、ＳＣ１，（１９８７）　、　　３
０４．２９７〜３００］。

−Ｂａｌｂ／ＣＢａ１ｂ／Ｃ ７ウス　　（１０ｍＭ、ｐＨ７，２）２５ＯｕＱ中の“
慢性”株７６にのシスト５〜３０個の割合による腹腔内
感染。

ｅ）ヒト血清 リールにあるラボラドワール　サンーカミーユで診断の
目的で集められた７４１種の血清を通常の血清学的テス
トにより特性を調べた：すなわち、２−メルカプト−エ
タノールによる処理（クージノウ法）の前後における直
接凝集作用、ならびにＧ、Ａ、Ｍ、ヒト抗免疫グロブリ
ン山羊血清（ＩＰＰ参照番号、ウエラーおよびクーンズ
法）およびヒト抗ＩｇＭ山羊血清（ＩＰＰ、レミントン
法）による間接免疫螢光検査により調べた。

かくして、本発明者は、使用した３種の方法の少なくと
も２種によって認識される特異的なＩｇＭの存在により
特徴付けられる“急性”血清！Ｌ３９種、特異的なＩｇ
Ｍを含まない“慢性“血清４６２種および全ての方法に
おいて陰性であった血清１４０種の集団を得た。

ｆ）抗原の免疫沈降 ｆ）、１−ミリボアー膜（０，２２μｍ）による濾過に
より予め滅菌された血清サンプルをシリコーン化された
チューブ（エッペンドルフ）内で１０μＱによりアリフ
ォートとした。これらのチューブに吸着バッファー（ト
リス１０　ｍＭ、　ＥＤＴＡ２ｍＭ、　　Ｎａ　ｃ　Ｉ
　　Ｑ、　　１５Ｍ、　ＮｏｎｄｉｅｔＰ４００．５％
、　ｍ１当りアプロチニン　力リフレニン１０単位を含
み、ｐＨ７，４に調整したもの）５００μＱを加え、次
いで当初の調整物中のｃｐ［１１（メチオニン３５ｓで
ラベルしたＥＳの場合４００００ｃｐｍ、メチオニン３
５Ｓでラベルした細胞性または膜性抗原の場合２５００
００ｃｐｍ。

１２５Ｉでラベルしたタキゾイトおよびブラディゾイト
の抗原の場合４０００００ｃｐａ＋、メチオニン３５Ｓ
でラベルした翻訳生成物の場合６００００ｃｐｍ　）の
数に応じて計算されたラベル化抗原の適当ドーズを加え
た。次いで、これを室温で攪拌下に３時間放置した。

ｆ）、２−一方、蛋白質Ａ−セファローズ（ファルマシ
ア）の懸濁液を調製した：分析さるべきサンプル当り生
成物１０ｍｇの割合で、蛋白質Ａ−セファローズを吸着
バッファー中で１時間放置して膨潤させた。懸濁液を新
たな一部のシリコーン化されたチューブに分配し、これ
らのチューブを２つのグループに分けた：第１のグルー
プは、操作を直ちには行わず、蛋白質Ａが前処理されて
はならないグループに対応する。第２のグループは、蛋
白質Ａに吸着されたＩｇＧクラスの抗体に加えて、検知
に工夫を要するＩｇＭクラスの抗体をも検知することが
望まれるサンプルに対応する。従って、第２のグループ
のチューブを遠心処理（１０００ｒｐｍで１分間）し、
上清液を除去した。ペレットに吸着バッファー２００μ
ＱおよびＩｇＧクラスの抗体で抗ＩｇＭ特異性を有する
もの５０μｇを加えた。この抗体の固定は、室温で１時
間の接触時間により、確実なものとした。蛋白質Ａ−セ
ファローズのビーズを取り出し、吸着バッファーにより
２回洗浄した。

使用の直前に２つのグループのチューブを遠心処理し、
上清液を除去した。これらのチューブに免疫沈降物を移
し入れ、緩やかな攪拌下に４°Ｃで一晩接触放置した。

次いで、吸着バッファー１ｍｌによる８回の洗浄からな
るサイクルを行なった。洗浄の程度は、８回目の上清液
の放射性を測定することにより、チエツクした。もし放
射性が高すぎる場合には、追加の洗浄を行なった。次い
で、全てのペレットにトリスバッフｙ　−（１２５ｍＭ
、　ＳＤ８３％、サッカロース　２０％、ブロモフェノ
ール　ブルー０゜１％およびβ−メルカプトエタノール
２０％）６０μＱを加えた。

攪拌後、ジアスティック攪拌（Ｖｏｒｔｅｘ）を間に挾
んで、チューブを２回の沸騰（１分３０秒）に供した。

次いで、全てのチューブを３００Ｏｒｐｍで１５分間遠
心処理し、分離した免疫沈降物を含む上清液を新たな一
部のチューブに移し入れた。上清液のそれぞれ５μＱの
放射性を測定した。これは、血清抗体により捕獲された
量の大体の値を示すものである。全てのサンプルは、次
いで、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に供され
た。

ｇ）免疫沈降物の電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）とオー
トラジオグラフィー ポリアクリルアミドゲル（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）上での電
気泳動け、レムリ［（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）２５６．４９５−４９７コの方法により、
バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）垂直電気泳動装置を使用し
て、行なわれた。

処理されたサンプルは、均一な１０％ポリアクリルアミ
ドゲル（寸法：１４Ｘ１６ｃｍ）中で分離された。電気
泳動は、トリス−グリセリンバッフｙ　−（ｐＨ８，３
，ＳＤＳ　１％含有）中で７ｍＡの電流値で１６〜１８
時間行われた。

メタノールと酢酸との混合物による蛋白質の固定の後、
ゲルをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）ペーペー上で脱
水した（減圧下バイオラドドライヤー）。

抗原が、３５Ｓメチオニンでラベルされている場合には
、ゲルに写真エマルジョン（Ａｍｐｌｉｆｙ　ＡＭＥＲ
８ＩＩＡＭ）を含浸させた。

ゲルのオートラジオグラフィーは、コダックＸ−Ｏｍａ
ｔＲＰフィルムに対して行われ、該フィルムは、−７０
℃で３日（■でラベルされた抗原）または６０（３５Ｓ
メチオニンでラベルされた抗原）露出された。

ｈ）抗原の分子量の算出 ゲルは、既知の分子量を有する予め染色された蛋白質混
合物（米国ＢＲＬ社により市販されている）を基準とし
て、測定された。ゲル中の電気泳動時のこれら蛋白質の
移動距離が測定された。得られた値から、標準線を確立
することが可能となり（ｄ＝１ｏｇＭＭ）、分析された
サンプル中の蛋白質の分子量を決定することが可能とな
った。

下記第１表に示す抗原の分子量は、３０種のゲルから求
めた平均値である。

第　　　１　　　表 トキソプラズマ症の過程において認識されたＥＳ抗原分
子量　　　　　　　特異性 １７００００　　　　　　　　慢性段階で認識１０５０
００　　慢性段階のラベル　　　　慢性段階を特徴付け
る９８０００　　急性段階のラベル　　　　“ダブレッ
ト”８４０００　　慢性段階の過渡的ラベル５０ＤＤ ３５０００　　慢性段階での認識 慢性段階の後期ラベル； ２４０００　　保護免疫のラベル 実施例４ 動物血清によるＥＳ抗原の認識の呈示 異なる動物血清で免疫沈降された３５Ｓメチオニンによ
りラベルされたＥＳ抗原（実施例１．　　ｂに示した）
は、下記の第２表に示すように、これら血清により認識
された。

この表において、アンダーラインされた数値は、主バン
ドに対応する。

また、該表に示された数値は、認識されたＥＳ抗原の分
子量（ドルトン）と関連づけられている。

第　　　２　　　表 血清により認識されたＥＳＡ（８３５メチオニン）のバ
ランス実施例５ クラスＩｇＥの抗体の誘導及びラットの実験的トキソプ
ラスマ症におけるそれらの役割正常フィッシャーラット
（Ｆｉｓｃｈｅｒ　ｒａｔ　）において、非免疫無防備
状態の哺乳類ホストの大部分と同様に、トキソプラスマ
　ボンブイによる感染は、永久免疫を誘導する。

免疫的メモリーのメカニズムは、Ｔ−依存であり、脳被
嚢形態（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｅｎｃｙｓｔｃｄ　ｆｏｒ
ｍｓ　）（ブラディゾイト）の存続を維持することを要
することが知られている。

しかしながら、この永久免疫の誘導について原因となる
メカニズムのすべては完全には理解されていない。

免疫無防備状態のモデルを表わすＮ　ｕ　／　Ｎ　ｕフ
ィッシャーラットにおいて、Ｉ、　Ｐ、を注入されたト
キソプラスマ　ボンブイのＲＨ株の１０５タキゾイトは
、１２〜１５日で１００％の動物を殺すのに充分である
。

１０〜１２週のフィッシャーラットをトキソプラスマ　
ボンブイのＲＨ株の１０７タキゾイトで感染させた。排
出／分泌抗原（ＥＳ）の役割をより良く示すように、生
存タキゾイト、照射タキゾイト（１０分間に１００００
ラツド照射）又は前記調製されたＥＳ抗原のいずれかが
動物に接種された。

特異的１ｇＥレベルの増加が、血清中において〔ラジオ
アレルゴソルベントテスト （ｒａｄｉｏａｌｌｃｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ　ｔｅｓｔ
）又はＲＡＳＴにより測定〕及びある種の血球表面にお
いて〔フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏａ＋
ｅｔｒｙ）により分析〕一定間隔で求められた。

更に、これらの特異的１ｇＨの保護能力は、１０５トキ
ソブラスマ　ボンブイでの感染前の、Ｎ　ｕ　／　Ｎ　
ｕ免疫抑制ラットにおける移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に
より検討された。

第１図は、異なる処理後の正常フィッシャーラットにお
ける血清（ｓｃｒｉｃ）　Ｉ　ｇ　Ｅの出現の動力学を
示す。

生存タキゾイトは、特異的ＩｇＥ応答を誘導する。この
応答は、非常に早く、感染後７日目から見出される。最
大の応答は２１１日口観察される。

また、ＥＳ抗原の正常ラットへの注入も、有効なＩｇＥ
応答を示す。

ＥＳ抗原は、同種の応答を引き起こすが、その程度は小
さいことが判る。しかし、最初の注入−カ月後のブース
ター注入後に、特異的ＩｇＥの増加は、より大きくなる
。ＥＳと共に、ＩｇＥ応答のアジュバント（百日咳菌）
を用いると、−時応答において、ＩｇＥの有効な増大を
引き起こすが、一方、アジュバントだけを注入しても特
異的応答を生じないことが判る。

第２図は、Ｎ　ｕ　／　Ｎ　ｕフィッシャーラットにお
ける異なる種類の血清の移入の結果を示す。用いられた
すべての血清は、２日口に、第一次応答の間にサンプリ
ングされた。

動物が生存タキゾイトで感染された正常ラット、又はＥ
Ｓ抗原により免疫された正常ラットからの特異的１ｇＥ
に富んだ血清２＋１１ｆｌｌを受けた時、生存期間の増
加は、照射タキゾイトで免疫されたラットからの血清を
受けた動物又は生理血清を受けた動物に比して大きいこ
とが判る。

免疫吸着による除去により生存期間が対照の生存期間に
近似する値となるので、生存期間の延長は、実際に、Ｉ
ｇＥによるものである。

第３図は、生存タキゾイトで感染した動物又はＥＳによ
り免疫された動物からの血小板（ｐｌａｑｕｃｔｔｅｓ
）　　（Ｐ　Ｌ　）が対応する動物の血清と同種の保護
をＮ　ｕ　／　Ｎ　ｕラットに与えることを示す。照射
タキゾイトで免疫された動物からの血小板はＮｕ／Ｎｕ
ラットを有効に保護しないことが判る。

第４図は、血小板の表面でのＩｇＥの出現の動力学が血
清ＩｇＥのそれと同等であることを示す。

血小板表面でのＩｇＥレベルは、血清１ｇＥと同様の態
様で使用する抗原の種類に応じて変る。生存期間は、投
与量に依存し、５Ｘ１０７セルの投りが有効な保護のた
めに充分である。

血小板によって与えられる保護は、抗体依存細胞障害作
用（ＡＤＣＣ）の現象に関連すると思われる。実際に、
死菌タキゾイトによらず、生存タキゾイトにより感染し
た正常動物又はＥＳにより免疫された正常動物からの血
小板は、インビトロでタキゾイトを破壊できることを観
察することができる（第５図参照）。この破壊のメカニ
ズムは、まだ明らかではない。

実施例６ ヒト　トキソプラスマ症の急性、亜急性及び慢性期にお
けるＥＳ抗原に対する体液応答適用技術：放射線免疫沈
降反応及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％ポリアクリルア
ミドゲル）での免疫沈降反応の分析。

抗原：　３５Ｓメチオニンでラベルされたタキゾイトの
細胞質及び膜ＥＳ抗原。

使用血清：病気の異なった時期：急性、亜急性、慢性に
おいて採取されたヒト血清。結 果を第６図に示す。

０ラベルされたＥＳ抗原は、採取ヒト血清〔急性期（ト
レース１）、亜急性期（トレース２）、慢性期（トレー
ス３）〕及び陰性血清（トレース７及び８）によって免
疫沈降された。

０比較として、細胞質抗原（水で溶解したタキゾイトの
溶性抽出物）及び膜抗原（ＮＰ４０抽出）を、慢性期の
血清で免疫沈降した（トレース５：細胞質抗原、トレー
ス６：膜抗原）。

Ｏ認識された最初の抗原は、急性及び亜急性期に存在す
る抗原６８及び９８ｋＤである（パートＡ）。

Ｏ慢性期において、患者の血清は、１０５．８４．５７
．４５．３９．３５．２５及び２４ｋＤの近似重量の抗
原を認めた（パートＢ）。

１０５ｋＤバンドは、９８ｋＤバンドとともに、慢性期
の特異的“二重線（ｄｏｕｂｌｅｔ　）”を形成する。

実施例７ タキゾイトにより排出−分泌されたブラディゾイト及び
タキゾイトに共通の４３ｋＤ抗原の証明（＋２Ｊでラベ
リング後）。

Ｏ免疫沈降抗原ニ ー　”　！’　（Ｉ　ｏｄｏ−Ｇｅｎ）でラベルされた
タキゾイトの脱油出物。

＋２Ｊ（クロラミンＴ）でラベルされたブラディゾイト
の溶性抗原（Ｓ１）。

−ＣＨＡＰＳで抽出され、＋２５Ｉ（クロラミンＴ）で
ラベルされたブラディゾイトの膜抗原（Ｓ２）。

０使用血清ニ ーＥＳ抗原で免疫されたラビット血清。

−ブラディゾイトの膜抗原（Ｓ２）で免疫されたＢａＱ
ｂ／Ｃマウス血清。

一スイスマイス（Ｓｗｉｓｓ　ｍ１ｃｃ）の脳細胞の抗
原により免疫されたＢａＱｂ／Ｃマウス血清（脳細胞で
汚染されたスイスマイスからのブラディゾイト）。

結果を第７図に示す。

０トレース１及び２；抗ＥＳラビット血清による免疫沈
降反応ニ ータキゾイトの膜抗原（トレース１）。

−ブラディゾイトの膜抗原（Ｓ２）（トレース２）。

Ｏトレース３〜５　：　ＢａＱｂ／Ｃマウス抗−ブラデ
ィゾイト（画分Ｓ２）の血清による免疫沈降反応。

一タキゾイトの脱油出物（トレース３）。

−ブラディゾイトの溶性抽出物（画分５１）（）レース
４）。

一ブラディゾイトの脱油出物（画分５２）（トレース５
）。

○トレース６〜８：Ｂａ９ｂ／Ｃマウス抗−脳血清によ
る免疫沈降反応。

一ブラディゾイトの溶性抽出物（Ｓ１）（トレース６）
。

一ブラディゾイトの脱油出物（Ｓ２）（トレース７）。

一タキゾイトの脱油出物（トレース８）。

抗−ＥＳ血清及び抗−ブラディゾイトにより認識された
ブラディゾイト及びタキシ、イトの４３ｋＤ抗原は、更
に、ヒト血清により認識された。

抗−脳マウス血清により認識された約５５ｋＤの抗原は
、ブラディゾイトの特異性を表わさない。

実施例８ タキゾイトにより排出−分泌されたブラディゾイト及び
タキゾイトに共通の約２５　ｋ　Ｄの抗原の証明（Ｍｅ
ｔ　　３５Ｓでのラベリング後）。

−免疫沈降抗原（３５Ｓメチオニンでラベル）：ＯＥＳ
抗原。

Ｑタキゾイトの細胞質抗原（Ｈ２０両分）。

０タキゾイトの全抗原（全寄生体のＣＨＡＰＳでの処理
）。

一使用血清 ０ブラデイゾイトの溶性（Ｓ１）又は膜（Ｓ２）抗原で
免疫されたＢａＱｂ／Ｃマイスの血清。

０スイスマイスの脳細胞の抽出物で免疫されたＢａＧ！
ｂ／Ｃマイスの血清。

０ブラデイゾイトの溶性（Ｓ１）又は膜（Ｓ２）抗原で
免疫されたフィッシャーラットの血清。

結果は、第８図に示す。

一トレース１〜３：抗−ブラディゾイトＢａＱ　ｂ／Ｃ
マイス血清（画分８２）による免疫沈降反応。

ＯＥＳ抗原（トレース１）。

Ｏタキゾイトの細胞質抗原（Ｈ２０両分）（トレース２
）。

０タキゾイトの全抗原（ＣＨＡＰＳ画分）（トレース３
）。

一トレース４〜６：抗−ブラディゾイトＢａＱ　ｂ／Ｃ
マウス血清（画分Ｓ１）による免疫沈降反応。

ＯＥＳ抗原（トレース４）。

Ｏタキゾイトの細胞質抗原（トレース５）。

Ｏタキゾイトの全抗原（トレース６）。

−トレース７〜９：スイスマイス抗−脳細胞ＢａＱ　ｂ
／Ｃマウス血清による免疫沈降反応。

ＯＥＳ抗原（トレース７）。

Ｏタキゾイトの細胞質抗原（トレース８）。

Ｏタキゾイトの全抗原（トレース９）。

−トレース１０〜１２：抗−ブラディゾイトフィッシャ
ーラット血清（画分８２）による免疫沈降反応。

０タキゾイトの全抗原（トレース１０）。

０タキゾイトの細胞質抗原（トレース１１）。

ｏＥｓ抗原（トレース１２）。

実施例９ ４３ｋＤ抗原の糖タンパクの性質の証明’　２Ｊ　（Ｉ
　ｏｄｏ−Ｇｅｎ）でラベルされたタキゾイトの表面抗
原は、下記の方法でＣｏｎＡ−セファ０−ス（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　）又はＷＧＡ−ウルトロゲル（υｌｔｒｏ
ｇｅ１）に吸着された。

レクチンでの固定は、コールマン（ＣＯＬＭＡＮ）他［
（１９８１）　ＥＵＲ，Ｊ、　ＢＩＯＣＨＥＭ、、１１
３．３３９−３４８）に記載の方法で行なった。

カップリングバッファー（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｂｕｆｆ
ｅｒ　）１５０ｍＭ　　ＮａＣＱ ０．７ｍＭ　　ＭｇＣＱ２ １ｍＭ　　ジチオトレイトール ０．７ｍＭ　　ＭｎＣｌ２２ ０、　７ｍＭ　　ＣａＣＱ２ ０．０５％　ドデシル硫酸ナトリウム ２０ｍＭ　　トリス／ＨＣＱ　ｐＨ７，５レクチン：コ
ンカナバリンＡ：ＣｏｎＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍ
ａｅｉａ　） コムギ胚芽凝集素＝ＷＧＡ−ウルトロゲル（ＩＢＦ） 抗原： １）”　５Ｉ　（Ｉ　ｏｄｏｇｅｎ）でラベルされたタ
キゾイトの脱油出物（ＮＰ４０）。

２）３５ＳメチオニンでラベルされたタキゾイトのＨ２
０抽出物。

３）３５３メチオニンでラベルされたタキゾイトの脱油
出物（ＣＨＡＰＳ）。

適用方法： 反応は、エペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｔ
ｕｂｅ）中で行われた。

一抽出物１）１５０μＱ又は抽出物２）及び３）２００
μＱへの、カップリングバッファー１−の添加。

一固定バッファー中で予備平衡化されたゲル２５０μＱ
　　（ＣｏｎＡ−セファロース又はＷＧＡ−ウルトロゲ
ル）。

室温で、反復攪拌による接触を１５分間行った後、チュ
ーブを遠心分離した。上澄液は、非保持抗原を含有する
。次いでカップリングバッファー中でペレットを３回洗
浄した後、コンカナバリンＡに固定した場合には、各々
０．４Ｍ０−メチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド（ｍａ
ｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｃ）（ＩＢＦ）を含有し、Ｗ
ＧＡの場合には、各々０．２ＭＮ−アセチル−グルコサ
ミン （ｇｌｕｃｏｓｕ惺１ｎｃ）　（シグマ）を含有するカ
ップリングバッファー３ｘ２００μＱで抽出した。これ
らの３回の連続抽出物は、溶出液１，２及び３とする。

種々のサンプルの放射能を計測し、未処理抗原、非保持
画分及び溶出液（１＋２）を別種の血清により免疫沈降
した。

二つのレクチンへ保持された両分（溶出液）及び出発抗
原は、健康ラビット血清及び抗−ＥＳラビット血清で免
疫沈降された。

第９図は、下記のことを示す。

一トレース１．３及び５：抗−ＥＳラビット血清による
免疫沈降。

一トレース２，４及び６：健康ラビット血清による免疫
沈降。

−トレース１及び２：処理前のタキゾイトの膜抗原。

一トレース３及び４：ＣｏｎＡ−セファロース溶出液（
固定抗原）。

一トレース５及び６：ＷＧＡ−ウルトロゲル溶出液。

トレース３及び５は、４３ｋＤ抗原がコンカナバリンＡ
に固定され、ＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素）に（弱く）固
定されていることを示し、その糖タンパクの性質を証明
する。

実施例１０ タキゾイトのメツセンジャーＲＮＡ５の翻訳生成物（ｔ
ｒａｎｓｌａｔｌｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　）の調製。

ａ）　全ＲＮＡの抽出：オウフレイ（ＡＵＦＦＲＡＹ）
及びルージオン（ＲＯＵＧＥＯＮ）の方法を適用した（
　（１９８０）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｍ、　　
１０７．３０３〕。タキゾイトは、ＬＬＣ（２３Ｍ、ヘ
パリン（ｌ（ｅｐａｒｉｎ　）　２００　ｔｔ　ｇ　／
　ｍＱ　；酢酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ５；５Ｄ８０
．１％の溶液の添加（寄生体（ｐａｒａｓｌｔｅ）ペレ
ットの１０倍容量）によって、溶解された。

ボッター法（Ｐｏｔｔｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ　）による均
質化及び４℃での一晩保存を行ない、ＲＮＡ５を沈澱さ
せた後、溶解産物を、４℃で４０分間１６３００ｇで遠
心分離した。ペレットはＬ　ｉ　Ｃ９４Ｍ、尿素８Ｍの
溶液中に再懸濁することによって、２回洗浄し、次いで
再度４℃で４０分間１６３００ｇで遠心分離した。次い
で、ペレットをＲＮＡ５ｅを含有しないＨ２Ｏ中に溶解
した。この溶液を酢酸ナトリウム０．１Ｍ　　ｐＨ５，
５ＤＳ０．１％に導入し、フェノール飽和耳、０の同量
、及びフェノール−クロロホルムの同量で連続的に抽出
した。最後に水層を、酢酸ナトリウム０．２ＭｐＨ５に
導入し、２．５倍容量の無水エタノールを用いて、−２
０℃−晩で、ＲＮＡを沈澱させた。

ｂ）　メツセンジャーＲＮＡ５の精製：アルネマン（Ａ
ＲＮＥＭＡＮＮ）他の方法が適用された［　（１９７７
）　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、４゜４０２
３−４０２６）。

この方法は、オリゴ（ｄＴ）セルロースでの２回の連続
クロマトグラフィーにより全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡ
５を分離することからなる。

Ｃ）　インビトロ（１ｎ　ｖｉｔｒｏ）でのラビット網
状赤血球の溶解産物中でのｍＲＮＡ５の翻訳／ベルハム
（ＰＥＬＨＡＭ）およびジャクソン（ＪＡＣＫＳＯＮ）
、（１９８６）　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、６７．２４７゜ ｍＲＮＡ５　（０，５μｇ）は、酢酸カリウム（１１０
ｍＭ）、酢酸マグネシウム（１ｍＭ）。

Ｌ−メチオニンを含有しないアミノアシッドの混合物（
５０ｍＭ）及び３５３メチオニン５０μＣｉ　（ＡＭＥ
Ｒ５ＨＡＭ）の存在下に、網状赤血球の溶解産物（Ｎ−
１５０ＡＭＥＲ８ＨＡＭ）３０μＱ中に翻訳された。

ｄ）　翻訳生成物の免疫沈降反応。

免疫沈降反応は、上記実施例３−ｄ）に記載の方法と同
様にして行なった；即ち、翻訳生成物の血清（１０μ１
２）での培養（６００００ｃｐｍ）後、免疫複合体をＡ
−セファロースプロティン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　
１０＋ｇに吸着、溶離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した
。（ラエムリ　（ＬＡＥＭＭＬ１）、１９７０．ネイチ
ャー（ＮＡＴＵＲＥ）。

２２７、　６８０）。

実施例１１ タキゾイトのｍＲＮＡ翻訳生成物の免疫沈降反応。

ｍＲＮＡ５は、上記実施例１０の方法（第１１図のトレ
ース１及び３）又はサーブイン（ＣＨＩＲＧＷＩＮ）他
の方法（（１９７８）Ｂｌｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ、　　
１８．　５２９４−５２９９３　　（第１１図のトレー
ス２及び３）により調製した。また、この図は、感染の
慢性期のヒト血清により免疫沈降された翻訳生成物の曲
線も示す（トレース３及び４）。

２種の血清により認識された翻訳生成物２４ｋＤ、３７
ｋＤ及び８０ｋＤは、矢印により示される。

更に、比較として慢性期及び急性期の一連のヒト血清に
よる翻訳生成物の免疫沈降反応、特に、−慢性期の一連
のヒト血清（ＩｇＧ）による免疫沈澱（トレース１，３
．４．５．６） −急性期の終期におけるヒト血清（Ｉ　ｇＧ＋　Ｉ　ｇ
Ｍ）による免疫沈降（トレース２） −陰性ヒト血清による免疫沈降（トレース７）を第１２
図に示す。

すべての慢性期血清による翻訳生成物２４ｋＤ及び３７
ｋＤの認識は、矢印によって示される。

これらの２種の抗原は、急性期の血清では認められない
。

実施例１２−２４ｋＤ抗原の特徴付け ２４ｋＤ抗原の蛋白質的性質の実証 ３５Ｓメチオニンで標識したタキゾイトの全抽出物（Ｃ
ＨＡＰＳ抽出）を、ＣｏｎＡ−セファ０−ス（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　）又はＷＧＡ−ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏ
ｇｅ１）上に吸着させた。最初の抽出物及び２つのレク
チンの溶出物を、抗−ＥＳラビット血清で免疫沈降させ
た。

得られた結果を第１０図Ａに示す。

３５Ｓメチオニンで標識された抗原は、ＷＧＡ上に保持
されなかった。

トレース１は、タキゾイトの全抽出物の免疫沈降物を示
す。

トレース２は、溶出物ＣｏｎＡ−セファロースの免疫沈
降物を示す。

成る種の抗原（特に、重量１７０ｋＤ、３９ｋＤ及び２
５ｋＤのもの）は、コンカナバリンＡに固定されるグリ
コジル化基を有している。他方、２４ｋＤ抗原は、保持
されない。

第１０図Ｂ＝この図面は、２４１ｃ　ＤのＥＳ抗原とタ
キゾイトｍＲＮＡの主要翻訳産物との間の分子量の同一
性を示すものである。

トレース１は、抗−ＥＳマウス血清による、３５Ｓメチ
オニンで標識されたＥＳ抗原の免疫沈降を示す。

トレース２は、抗−ＥＳラビット血清による３５Ｓメチ
オニンで標識された翻訳産物の免疫沈降を示す。

２４ｋＤ抗原の蛋白質的性質（第１０図Ａ）及びそれが
翻訳産物の泳動の近傍へ泳動することを考慮すると、こ
れら２つの分子が同一であると強く推定される。

実施例１３−抗−Ｅｓラビット血清についての２％ＳＤ
Ｓで抽出されたブラディゾイト抗原とタキゾイトの翻訳
産物との間での免疫競合 （ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　）免疫競合は
、第１３図に示されている。第１３図において、 ・トレース１は、５０μｇのブラディゾイト抽出物の存
在下で翻訳産物の免疫沈降を示す。

・トレース２は、５０μｇのニス、マンソーニ（Ｓ、　
ａ＋ａｎｓｏｎｌ　）抽出物の存在下での翻訳産物の免
疫沈降を示す。

・トレース３は、翻訳産物単独の免疫沈降を示す。

ブラディゾイト抗原は、翻訳産物２４ｋＤ及び３７ｋＤ
の抗−ＥＳ抗体による固定化を行なうことができる。

一方、診断の目的の研究を、３５０の充分特徴付けられ
た血清のセロチク（５ｅｒｏｔｈｅｑｕｅ）を用いて行
なった、該血清のうちのいくつかは、トキソプラズマ症
の異なるフェーズにおいてサンプリングされたものであ
り、血清変換を示し；他は、後に、抗体応答の追従（ｆ
ｏｌｌｏｗｉｎｇ　）を許し；他は、また、母−子“ペ
アー”　（ｍｏｔｈｅｒ−ｂａｂｙ　　ｐａｉｒｓ”）
に対応し、出生前期、周産期及び出生後期においてサン
プリングされたものである。

ＥＳ抗原（３５Ｓメチオニンで標識）のこれら血清によ
る免疫沈降により、抗体発生の動態が確立され、特に下
記の事項が示される。

−急性期血清（ＩｇＭ）は、体細胞抗原又は膜抗原より
も、はるかに強（Ｅｓ抗原を認識する。

−重量的９８０００及び６８０００の大量に且つ非常に
早く認識される２つのＥＳ抗原は、血清変換標識として
使用し得る。

−ずっと後で認識される他の抗原、特に重量２４０００
の抗原は、対照的に、トキソプラズマ症における免疫の
真の標識となるように思われる。

この重量２４０００の抗原は、グリコジル化されていな
いものと思われ（コンカナバリンＡ及びＷＧＡ上に固定
化されない）、重量２４のタキゾイトＲＮＡ翻訳産物に
対応するものと思われる。

この翻訳産物は、事実、ヒト感染後期血清（ｈｕｍａｎ
　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　１ａｔｅ　ｓｅｒｕｍｓ　）に
より免疫沈降され、初期血清（ＩｇＭ＋ＩｇＧ）によっ
ては免疫沈降されない。

実施例１４−翻訳産物のクローニング ａ）タキゾイトｍＲＮＡ５からのｃＤＮＡバンクの調製 ｃＤＮＡの合成は、グブラー（ＧＵＢＬＥＲ）及びホフ
マン（ＨＯＦＦＭＡＮ）［（１９８３）、ジーン（ＧＥ
ＮＥ）　、２５．２６３〕の方法により行なう。最初の
相補性ＤＮＡ鎖を、ＡＭＶの逆転写酵素の作用により合
成する。該ＤＮＡを、ＨＲＮＡｓｅ及びＩポリメラーゼ
の両方の作用により二重鎖とし、次いで、Ｔ、ＤＮＡポ
リメラーゼで処理してその端部をフリーとする。酵素Ｅ
ｃｏＲＩメチラーゼでメチル化後、ＥｃｏＲＩ　　“リ
ンカ−“をｃＤＮＡの端部に、Ｔ、ＤＮＡリガーゼによ
り付加する。次いでｃＤＮＡを、ＥｃｏＲｒ酵素で消化
し、ＡＣＡ３４　（０，２ｘ０．３０ｃｍ）上クロマト
グラフィーにより精製する〔ワトソン、シー、ジエイ、
　　（ＷＡＴＳＯＮ、Ｃ，Ｊ、）及びジャクソン、ジエ
イ、エフ、　　（ＪＡＣＫＳＯＮ、Ｊ、Ｆ、＞（１９８
５）　、イン　グローバーデイ−エム　イーデイ−（Ｉ
ｎ　Ｇｌｏｂｅｒ　Ｄ、Ｍ、、ｅｄ、）：　　Ｉ［ＮＡ
クローニング（ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　Ｊ、第
１巻、ア・プラクティカル・アプローチ（Ａｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）；オフスフオード（Ｏｘ
ｆｏｒｄ）　。

ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）　　：アイアール
エル　プレス（ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ）、第４９頁〕。

次いで、これらｃＤＮＡ　（５００〜７００ｐｂ）を、
ＧＴ１１ファージのＥｃｏＲ１サイト中に挿入する〔フ
ィン（ＨＵＹＮＨ）ら、（１９８５）、イングローバー
　デイ−、エム、イーデイ−１“ＤＮＡ　　クローニン
グ（Ｉｎ　Ｇｌｏｂｅｒ　Ｄ、Ｍ、、ｃｄ。

“ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”　）　、Ｖｏ　１．　
　Ｉ　　ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ　ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）：オクスフオード、
ワシントン（Ｏｘｆｏｒｄ。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）　　：アイアールエル　プレス
（ＩＲＬＰｒｅｓｓ　）　、第４９頁〕。

ライゲーション後、組換ファージをイン・ビトロで、パ
ッケージ化する。こうして３Ｘ１０Ｇフアージのバンク
を構成する。

ｂ）バンクのスクリーニング及び“ＥＳ”候補の選択 ＧＴ１１ファージの誘導体は、ｃＤＮＡとイー。

コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子
とを融合後、Ｌａｃプロモーターの制御下に外来遺伝子
の発現を可能とする（ヤング（Ｙｏｕｎｇ　）及びデー
ビス（Ｄａｖｉｓ　）　、１９８３）。

ＧＴｌｌのバンクの１つのサンプルを、イー。

コリＹ１０９０株上に、直径９０１のデイツシュ当りＩ
　Ｘ　１０４のファージの希釈度で、接種する。

Ｌａｃプロモーターの制御下での蛋白質の発現誘導を４
２°Ｃにて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）の存在下に開始させる。

合成蛋白質をニトロセルロースフィルター上に吸収させ
、前記実施例３．ａ）に記載の方法で得られた抗−ＥＳ
ラビット抗体の存在下でインキュベートする。

固定化された抗体を、パーオキシダーゼで標識されたラ
ビットの第二の抗−１ｇＧ抗体で検出する：この複合体
を、Ｈ２Ｏ２の存在下４−クロロ−１−ナフトールを用
いて染料により現像する。

この検出により、ｃＤＮＡの挿入が、抗−ＥＳ抗体によ
り認識されるエピトープを有する蛋白質又は蛋白質フラ
クションの合成を指示する組換ファージの同定が可能と
なる。

第１の選択により、１００のクローン（Ｅ　Ｓ）が単離
された。精製後、そのうちの２０を２種のヒト血清を用
いて判別的に再スクリーニングした（第７図参照）ニ一
方の血清ＩｇＧ＋ａは、２４及び３７ｋＤの翻訳産物を
認識し、他方のＩｇＧ２ｏはそれを認識しないものであ
る。３種のクローンＥＳ８．ＥＳＩＯ及びＥＳｌｌを血
清ＩｇＧ１８による認識により単離した。

Ｃ）クローンＥＳ８．ＥＳ１０及びＥＳｌｌの抗体選択
（ａｕｔｉｂｏｄｙ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）による特徴
付は使用した抗体選択法は、オルムステッド（０１＋ｎ
５ｔｃｄ　）　　［（１９８１）　、Ｊ、　　Ｂ　Ｉ　
ＯＬ。

ＣＨＥＭ、、２２６．１１９５５）により記載された方
法である。

各クローンの試料を、イー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＹ
１０９０株上に、直径９０１のデイツシュ当り１０４〜
１０５フアージの割合で接種する。

発現の誘導を、４２°Ｃにて、Ｉ　ＰＴＧの存在下に行
ない、合成された蛋白質をセルロースナイトレートフィ
ルター上に吸収させる。該フィルターを、抗−ＥＳラビ
ット血清（１／１２５　）と共に室温で３時間インキュ
ベートする。

３回洗浄後、融合蛋白質に特異的に結合した抗体を、グ
リココール−ＨＣＱ緩衝後ｐＨ２，８；０、ＩＭ；Ｎａ
ＣＱｏ、１５Ｍの存在下で３分間を要して解離させる。

該溶液を急速にトリス（Ｔｒｉｓ）　Ｉ　Ｍで中和する
。

選択された抗体を１０ｍｇのプロティンＡ−セファロー
ス（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　）上で濃
縮し、翻訳産物の免疫沈降に用いる。前記３種のクロー
ンの融合蛋白質により選択された抗体は、２４　ｋ　Ｄ
翻訳産物を認識する。このことは、第１４図から明らか
である。第１４図は、クローンＥＳ８、ＥＳＩＯ及びＥ
Ｓｌｌにより選択された抗体による翻訳産物の免疫保護
（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を示すものであ
る。

Φトレース１：クローンＥＳ１１により選択された抗−
Ｅ、Ｓラビット血清の抗体。

拳トレース２：クローンＥＳ１１により選択された過免
疫ラビット血清の抗体。

Φトレース３：クローンＥＳＩＯにより選択された抗−
ＥＳラビット血清の抗体。

・トレース４：クローンＥＳ８により選択された抗−Ｅ
Ｓラビット血清の抗体。

実施例１５−ベクターｐＵｃ１３におけるクローンＥＳ
８．ＥＳＩＯ及びＥＳｌｌの“挿入物（ｉｎｓｅｒｔｓ
　）”のサブ−クローニング１）ファージのＤＮＡ　（
ＧＴＩ　１）の調製各クローンに対応するバクテリオフ
ァージをイー、コリＹ１０９０上に室温にて２０分間吸
着させる。次いで、このインキュベート物（１ｎｃｕｂ
ａｔｅ）を、（２００００ｐｆＵ／デイツシユの割合で
）アンピシリンの存在下アガロースデイツシュ上に塗布
する。３７℃で一夜保持した後、バクテリオファージを
ｄｄｕ　　ＳＭ　（ＮａＣ９１００ｍＭ；ＭｇＳＯ４＊
　７Ｈ２０８ｍＭ；Ｔｒ　ｉ　ｓ　　５０ｍＭ　　ｐＨ
７，５；ゼラチン０．０１％）中で溶出する。

溶出物をまずクロロホルムで処理し、次いでＤＮＡａｓ
ｅ及びＲＮＡ　ａ　ｓ　ｅ　（１μｇ／１Ｔｌｉ２）で
処理して、バクテリア成分を除、去する。

次いで、Ｔファージを、１０％ＰＥＧ及びＮａＣＱｌ、
２５Ｍ中４℃にて沈澱させる。

ＣｓＣ１２グラジエント中平衡となるまで超遠心分離を
、２４時間、１０８０００ｇ　（ベックマン（Ｂｅｃｋ
［１Ｉａｎ　）　Ｌ　８　７０　ｏ−ター５Ｗ５５Ｔｉ
）にて行なった。

ファージのバンドは、針により回収され、ファージ溶液
を、Ｔｒｉｓ緩衝液１０ｍＭ　　ｐＨ７゜４　；ＭｇＣ
ｌ２２２０ｍＭ　　ＮａＣＱ　０．１５Ｍに対し、１時
間、２回透析する。次いで、ＴｒｉｓＨＣＱ　　１０ｍ
Ｍ、ＥＤＴＡ　　１ｍＭ及びＳＤＳ　０．１％で処理し
てファージのＤＮＡを得、フェノール／クロロホルムで
抽出して精製する。

“挿入物”は、ＥｃｏＲＩ消化及び低融点アカロースゲ
ル１．２％上での泳動により、ファージＤＮＡから分離
される。該ゲルを、エチジウム　ブロマイド（ｅｔｈｉ
ｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（１０Ｍｇ／−）中で
染色後、消化フラグメントを紫外線で顕現化する。こう
して、泳動距離に応じて各種“挿入物”のサイズを決定
する子とができる：挿入物ＥＳ８は、９００塩基対であ
り、挿入物ＥＳＩＯは、１９００塩基対であり、挿入物
ＥＳ１１は１３００塩基対である。

次いで、これら“挿入物“は、”ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”
　（Ｂｌｏｌ　　０１）テクニックによりアガロースか
ら抽出される。

２）ｐＵｃ１３におけるサブクローニングＥｃｏＲＩ消
化により線型化（１ｉｎｅａｒｉｚｅｄ）されたｐＵｃ
１３プラスミド（ファルマシア）は、５′　リン酸化末
端を有し、該プラスミドの再環化を最小限とする。ｐＵ
ｃ１３と挿入物との間のライゲーション反応は、Ｔ４フ
ァージのＤＮＡリガーゼ（ジェノフィツト（Ｇｅｎｏｆ
ｉｔ　）　）の１ユニツトを用いて行なう。ベクター／
挿入物のモル比は、１のオーダーでなければならない。

次いで、ライゲーション混合物を用いて、ハナハン（Ｈ
ＡＮＡＨＡＮ）（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、（１９８３
）、１６６゜５５３〕の慣用法にて、イー、コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３株を形質転換する。形質転換細胞
を、アンピシリン、ＸＧａ１及びＩ　ＰＴＧの存在下Ｌ
Ｂアガーデイツシュ上に散布する。白色コロニーは、組
換プラスミドを組込んだ細胞である。

クローンＥＳ８、ＥＳｌｏ及びＥＳｌｌの各々について
、本発明者は、白色コロニー：ｐＵＣ１３ＥＳ８、ＥＳ
Ｉｏ、２、ＥＳｌｌ、７を選択した。３種のクローンの
制限チャートは、ｐＵＣ１３ＥＳ８．１０、ＥＳＩｏ、
２、ＥＳＩＩ。

７である。

１）プラスミドＤＮＡの調製 この工程は、バクテリアＤＮＡからプラスミドＤＮＡの
分離を可能とするものであり、ビューラ−（ＢＵＨＬＥ
Ｒ）及びトレイチ（ＴＨＥ　Ｉ　ＣＨ）の方法に従い、
Ｃ５ＣＱの等比重勾配中での遠心分離により行なわれる
（Ｓｅｒｖｌｃｅ　ｄｅ　Ｂｌｏｃｈｉｍｉｅにて実施
されるように）。

２）エンドヌクレアーゼでの消化 精製プラスミドＤＮＡを、次いで、各種の制限酵素（Ｅ
ｃｏＲＩ、Ａｃｃ　Ｉ、ＰｖＵＩＩ及び５ａｃＩ）によ
り消化する。１．２％のアガロースゲル上での消化フラ
グメントの分析後、３つの挿入物の制限チャートを確立
し、第１５図に示した。

第１５図は、プラスミドベクターｐＵｃ１３　（２７０
０ｐｂ）のＥｃｏＲＩサイトにおけるＴＧの３つのクロ
ーンの挿入物、ＥＳ８．１０　（９００ｐｂ）　、ＥＳ
Ｉｏ、２　（１９００ｐｂ）　、ＥＳｌｌ、７　（１３
００ｐｂ）のサブクローニングを示す。

この図において、Ａ＝ＡｃｃＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲ■、Ｐ＝
Ｐｓ　ｔ　Ｌ　Ｐｖ＝ＰｖｕＩＩ、Ｓ＝Ｓ　ａ　ｃＩで
ある。

Ｌ記から明らかなように、本発明は、前記の実施の方法
、実施態様及び用途に限定されるものではなく、本発明
の範囲を逸脱することなく当業者が想起し得る変更を包
含するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種処理後の正常フィッシャーラットにおけ
る血清ＩｇＥの出現の動力学を示す。第２図は、Ｎ　ｕ
　／　Ｎ　ｕフィッシャーラットにおける血清の移入の
結果を示す。第３図は、Ｎ　ｕ　／　Ｎ　ｕラットにお
ける血小板（ｐｌａｑｕｅｔｔｅｓ）の移入の結果を示
す。第４図は、血小板表面でのＩｇＥの出現の動力学を
示す。第５図は、生存タキゾイトにより感染した正常動
物又はＥＳにより免疫された正常動物からの血小板がタ
キゾイトを破壊できることを示す。第６図は、実施例６
における免疫沈降を示す。第７図は、実施例７における
免疫沈降を示す。第８図は、実施例８における免疫沈降
を示す。第９図は実施例９における免疫沈降を示す。 第１０図Ａは、抗−ＥＳラビット血清による免疫沈降の
結果を示すものであり、トレース１は、タキゾイトの全
抽出物の免疫沈降を、トレース２は、溶出物ＣｏｎＡ−
セファロースの免疫沈降を示す。第１０図Ｂは、２４ｋ
ＤのＥＳ抗原とタキゾイトｍ　ＲＮ　Ａの主要翻訳産物
との分子量の同一性を示す免疫沈降結果を示し、トレー
ス１は、３５３メチオニンで標識化されたＥＳ抗原の抗
−ＥＳマウス血清による免疫沈降を、トレース２は、３
５３メチオニンで標識化された翻訳産物の抗−ＥＳラビ
ット血清による免疫沈降を示す。 第１１図は、実施例１１におけるｍＲＮＡ翻訳生成物に
ついての結果を示゛す。第１２図は、実施例１１におけ
る慢性期、急性期の終期におけるヒト血清及び陰性ヒト
血清による免疫沈降を示す。 第１３図は、抗−ＥＳラビット血清に就いての２％ＳＤ
Ｓで抽出されたブラディゾイト抗原とタキゾイトの翻訳
産物との免疫競合の結果を示す。 第１３図において、 ・トレース１は、５０μｇのブラディゾイト抽出物の存
在下での翻訳産物の免疫沈降を示す。 ・トレース２は、５０μｇのニス、マンソーニ（Ｓ、　
ｍａｎｓｏｎｉ　）抽出物の存在下での翻訳産物の免疫
沈降を示す。 ・トレース３は、翻訳産物単独の免疫沈降を示す。 第１４図は、クローンＥＳ８、ＥＳＩＯ及びＥＳｌｌに
より選択された抗体による翻訳産物の免疫保護（１ｍｍ
ｕｎｏｐｒｏｔｃｃｔｉｏｎ）を示すものである。 ・トレース１：クローンＥＳ１１により選択された抗−
ＥＳラビット血清の抗体。 ・トレース２：クローンＥＳ１１により選択された過免
疫ラビット血清の抗体。 ・トレース３：クローンＥＳＩＯにより選択された抗−
ＥＳラビット血清の抗体。 ・トレース４：クローンＥＳ８により選択された抗−Ｅ
Ｓラビット血清の抗体。 第１５図は、プラスミドベクターｐＵＣ１３（２７００
ｂｐ）のＥｃｏＲＩサイトにおけるＴＧの３つのクロー
ンの挿入物、ＥＳ８．１０（９００ｂｐ）　、ＥＳＩｏ
、２　（１９００ｂｐ）、ＥＳＩｌ、７　（１３００ｂ
ｐ）のサブ−クローニングを示す図面である。 （以　上） 代理人　弁理士　三　枝　英　二、、４：、、　　’、
＼図面の浄ＩＦ（内容に変更なし） ＦＩＧ、６ 几 腎−１で、、、ｒ、’　７に；二；　・ゾ’：、’：Ｔ
ｆ：’ｌ　Ｌ’ｙＩｌｌ　ｊ’＞ＩＰ　’５’（ｒ”ｌ
’Ｇ４ｊ：　ｉ、ｃ　＆　ｒ、ｙ　’＞’ｒ１７．・：
；、・七−ｒ５＝ｒｅｙ１Ｍ　　ｇ　　　３’１．、．
４　　５６ド〜Ｊ ７４−゛、 葡岨叫、”）浄Ｍｊ、　ｌｐｌ：客、ｌ□ψ変更なし鳥
１辷デ、４．　　　　　　　　　、−１８Ａ；ｆ−・・
ρ゛Ｓ、：°≦、、ｌ、、：’ｌ’：’、、、・・・　
５、：−　　　肯 ＝ｙ、　／（、’、　；、ｒ＞’、、↓、：２、）′、
　、・、ｌ・９・、；９７・− ６８・・〜 １８〜 Ｖン゛′シ１゛）、ｊ’Ｆ：：、、ｆ、ｙ！　　・日７
）ＦＩＧ、１３ て 、−’／）タ リフ → 、９″″、・　″ ９７−・〜 ６Ｂ−・〜 ＦＩＧ、１５ ■出願人　　　アンスティトウー　す　　フランス国ジ
オナル　ド　ラ　サ ンテ　エ　ド　ラ　ル シェルシュ　メゾイカ ７５６５４　　パリ　リュ　ド　トルビアク　１０１特
許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　事件の表示 昭和６３年特許願第１９２５７９号 ２　発明の名称 トキソプラズマ　ボンブイの特異的排出−分泌抗原、そ
れらの発現産物、それらの製法及びそれらの診断及び予
防用途 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 アンスティトウー　バストウール （ほか２名） ４代理人 昭和６３年１０月２５日 ６　補正の対象 願書中「特許出願人」の項及び代理権を証明する書面並
びに図面 ７　補正の内容 訂正願書　１通

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. （１）トキソプラズマゴンディ（ＴＧ）のタキゾイトの
   排出−分泌抗原（ＥＳ）から構成されていることを特徴
   とするトキソプラズマゴンディ（ＴＧ）の抗原。
2. （２）一群の抗原を構成しており、そのうちの検出され
   た主要な２０種が、分子量約１８５ｋＤ、１７０ｋＤ、
   １５５ｋＤ、１０５ｋＤ、９８ｋＤ、８４ｋＤ、６８ｋ
   Ｄ、５７ｋＤ、５３ｋＤ、４５ｋＤ、４３ｋＤ、３９ｋ
   Ｄ、３５ｋＤ、３４ｋＤ、３１ｋＤ、３０ｋＤ、２６ｋ
   Ｄ、２５ｋＤ、２４ｋＤ及び２０ｋＤを有することを特
   徴とする請求項１に記載のタキゾイトから単離されたＥ
   Ｓ抗原。
3. （３）分子量１８５ｋＤ、１７０ｋＤ、１５５ｋＤ、１
   ０５ｋＤ、５７ｋＤ、５３ｋＤ、４５ｋＤ、４３ｋＤ、
   ３９ｋＤ、３５ｋＤ、３４ｋＤ、３１ｋＤ、３０ｋＤ、
   ２６ｋＤ、２５ｋＤ及び２４ｋＤの抗原が、慢性期（ｃ
   ｈｒｏｎｉｃ　ｐｈａｓｅ）の過程において認識される
   請求項２に記載のＥＳ抗原。
4. （４）分子量１０５ｋＤの抗原が、慢性期の標識として
   同定される請求項２に記載のＥＳ抗原。
5. （５）分子量８４ｋＤの抗原が、慢性期の一過性標識と
   して同定される請求項２に記載のＥＳ抗原。
6. （６）分子量２４ｋＤの抗原が、慢性期の遅発性標識（
   ｌａｔｅ　ｌａｂｅｌ）及び防御的免疫の標識として同
   定される請求項２に記載のＥＳ抗原。
7. （７）分子量９８ｋＤの抗原が、急性期の標識として同
   定される請求項２に記載のＥＳ抗原。
8. （８）９８ｋＤ抗原よりも特異性は低いが、分子量６８
   ｋＤの抗原が、急性期の標識として同定される請求項２
   に記載のＥＳ抗原。
9. （９）トキソプラズマゴンディのタキゾイト懸濁液を、
   ヒト又は動物由来の補体除去血清１０％を含有するＲＰ
   ＭＩ１６４０培地中で３時間インキュベートし、遠心分
   離後、回収された上清を限外ろ過し、必要に応じて、濃
   縮工程、更に遠心分離工程及び−７０℃での冷凍工程を
   行なうことにより得られた上清から単離され、ＥＳ抗原
   がトキソプラズマ症に対して防御的体液性応答を誘発し
   得ることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載
   の抗原。
10. （１０）トキソプラズマゴンディのブラディゾイトの抗
    原から構成されていることを特徴とするＴＧ抗原。
11. （１１）トキソプラズマゴンディのタキゾイト及びブラ
    ディゾイトに共通の抗原により構成されていることを特
    徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のＴＧ抗原。
12. （１２）分子量が約４３ｋＤであること、糖蛋白の性質
    を有すること並びに抗−ＥＳ血清、抗−ブラディゾイト
    マウス血清及び患者から採取されたヒト血清により認識
    されることを特徴とする請求項１１に記載の抗原。
13. （１３）分子量が約２５ｋＤ〜２４ｋＤであること及び
    タキゾイトにおける位置が抗−ブラディゾイト血清によ
    る免疫沈降により確認されることを特徴とする請求項１
    １に記載の抗原。
14. （１４）タキゾイトの抗原及びブラディゾイトの抗原及
    び／又は場合によっては好ましくは事前に放射標識され
    たこれら抗原の翻訳産物により、（特異的ＩｇＭを含有
    する急性期から又はＩｇＭとＩｇＧとの双方を含有する
    亜急性期から又はＩｇＧを含有する慢性期から）血清反
    応陽性として認識される、哺乳類の血清、特にヒト又は
    動物の血清の免疫沈降を行ない、次いで、生成した免疫
    沈降物を解離し、ポリアクリルアミド上での電気泳動（
    ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ゲルのオートラジオグラフ
    ィー及び現像を行なうことにより、同定されることを特
    徴とする請求項１１乃至１３のいずれかに記載の抗原。
15. （１５）慢性型のトキソプラズマゴンディに感染された
    特にマウス等の哺乳類の組織の磨砕物からシスト（ｃｙ
    ｓｔｓ）を回収し、該シストを適当な勾配により精製し
    、超音波処理を行ない、次いで凍結状態で磨砕し、遠心
    分離を行なって細胞質抗原（フラクションＳ１）を含有
    する上清及びペレットを得、これから適当な洗剤を用い
    て膜抗原を遊離（フラクションＳ２）させることにより
    単離される請求項１０乃至１４のいずれかに記載のＴＧ
    の抗原。
16. （１６）トキソプラズマゴンディのＥＳ抗原によって認
    識されるエピトープを有していることを特徴とするタキ
    ゾイトのｍＲＮＡ翻訳産物。
17. （１７）タキゾイトの溶解産物を遠心分離し、そのペレ
    ットを適当な抽出剤で抽出してＲＮＡを沈澱させ、クロ
    マトグラフィーにより全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを分
    離することによりメッセンジャーＲＮＡを精製し、緩衝
    化媒体中Ｌ−メチオニンを欠損し＾３＾５Ｓメチオニン
    を含有するアミノ酸混合物の存在下で網状赤血球の溶解
    産物中でｍＲＮＡをインビトロで翻訳し、事前に得られ
    たタキゾイトからのｍＲＮＡから、ＡＭＶ逆転写酵素を
    作用させてｃＤＮＡを合成し、こうして生成したｃＤＮ
    Ａライブラリーをスクーリニングして、ｃＤＮＡの挿入
    物が、抗−ＥＳ抗体により認識されるエピトープを有す
    る蛋白質又は蛋白質フラクションの合成を指示する組換
    ファージを同定し、且つそれからヒト血清により認識さ
    れるＥＳクローンを選択し、保持されたクローンを抗体
    選択により特徴付けることにより得られることを特徴と
    するタキゾイトのｍＲＮＡ翻訳産物。
18. （１８）トキソプラズマ症、殊にタキゾイトに対して有
    意な防御を付与するようにされたＩｇＥ抗体に富む血清
    であって、請求項１乃至１７のいずれかに記載のＥＳ抗
    原で免疫化された動物から得られることを特徴とする血
    清。
19. （１９）ＥＳ抗原により免疫化された動物の細胞と腫瘍
    細胞との融合により得られるハイブリドーマの培養によ
    り産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
20. （２０）活性構成成分として、請求項１乃至１７のいず
    れかに記載の抗−ＥＳポリクローナル又はモノクローナ
    ル抗体を含有することを特徴とするトキソプラズマ症に
    対して有意な防御を与えるワクチン。
21. （２１）活性成分として、請求項１乃至１７のいずれか
    に記載のＥＳ抗原、特にタキゾイト及びブラディゾイト
    に共通のエピトープ及び決定基を含有することを特徴と
    するトキソプラズマ症治療用組成物。
22. （２２）先天性トキソプラズマ症を包含するトキソプラ
    ズマ症の診断剤であって、活性成分として、請求項１乃
    至１７のいずれかに記載のＥＳ抗原を含有することを特
    徴とする診断剤。
23. （２３）抗−ＥＳ抗体により認識される１又は２以上の
    エピトープを有する蛋白質又は蛋白質フラクションの合
    成を指示する、タキゾイトのｃＤＮＡ挿入物（ｉｎｓｅ
    ｒｔ）を含有することを特徴とする組換ベクター。
24. （２４）１乃至１７のいずれかに記載の抗−ＥＳ抗体に
    より認識される１又は２以上のエピトープを有する蛋白
    質又は蛋白質フラクションの合成に必要な遺伝情報を有
    することを特徴とする請求項２３に記載の組換ベクター
    。
25. （２５）２４ｋＤ抗原の合成を指示し、ＣＮＣＭに１９
    ８７年７月１６日に番号Ｉ−６７５、Ｉ−６７６及びＩ
    −６７７をもって寄託された請求項２４に記載の組換ベ
    クター。
26. （２６）ＩｇＧ含有ヒト血清により認識され、スクリー
    ニングにより単離され、適当な手段により選択される請
    求項２５に記載の組換ベクター。
27. （２７）ＴＧによる感染の慢性期を標識するための１０
    ５ｋＤのＥＳ抗原を含有する請求項２２に記載の診断剤
    。
28. （２８）ＴＧによる感染の急性期を標識するための９８
    ｋＤのＥＳ抗原を含有する請求項２２に記載の診断剤。
29. （２９）防御的免疫を標識するための２４ｋＤのＥＳ抗
    原を含有する請求項２２に記載の診断剤。