JPH0114540B2 - - Google Patents
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- JPH0114540B2 JPH0114540B2 JP54044589A JP4458979A JPH0114540B2 JP H0114540 B2 JPH0114540 B2 JP H0114540B2 JP 54044589 A JP54044589 A JP 54044589A JP 4458979 A JP4458979 A JP 4458979A JP H0114540 B2 JPH0114540 B2 JP H0114540B2
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、下記一般式〔〕
A1−ｓ−ｓ−Ｘ−ｓ−ｓ−A2 〔〕
（ただし、式中、A1およびA2のいずれか一方は
酵素またはそのチオール化修飾誘導体のチオール
残基、他方は免疫関連物質またはそのチオール化
修飾誘導体のチオール残基、Ｘは炭素数２〜15分
子のスペーサー基を示す）で表わされる酵素−免
疫関連物質結合体を含有する免疫測定用組成物に
関する。 本発明等は、先に一般式〔〕 （ただし、式中、Ｒは２−ベンゾチアゾリル基ま
たは２−ピリジル−Ｎ−オキサイド基、Ｘは炭素
数２〜15分子のスペーサー基を示す）で表わされ
る新規な化合物（以下化合物〔〕という）が、
チオール基を有する化合物、例えば酵素、ハプテ
ン、抗原、受容体などの免疫関連物質、蛋白質担
体、不溶性担体などの担体、またはそれらのチオ
ール化修飾誘導体に対して、ほぼ等モル反応にお
いて、その反応は、まず第一段の反応としてその
Ｒに結合するｓ−ｓ基とチオール基を有する化合
物のチオール基とがｓ−ｓ交換反応を行ない、次
いでその第一段の反応の後別のチオール基を有す
る化合物に対して、その２−ピリジル基に結合す
るｓ−ｓ基とｓ−ｓ交換反応を行う。２段階のｓ
−ｓ交換反応性を示す、極めて良好な化合物であ
ることを見い出した。即ち、水性媒体中、化合物
〔〕に対し、チオール基を有する化合物を反応
せしめてなるもので、次式の反応にて略示され
る。 （ただし、式中、A1−SH、A2−SHはチオール
基を有する化合物、Ｒ、Ｘは前記と同じ基を示
す） さらに、上記の２−ピリジル基の代りにその他
４−ピリジル基などとなしたものでも、同様に反
応し得るものである。 このようにして得られる各々の化合物は、新規
な化合物であつて、またその中間体として示され
る化合物は、対応する最終目的物を得るに当つて
有用な反応性の化合物であり、さらに最終目的物
は、そのチオール基を有する化合物を選択、組合
せることにより、例えば、酵素と免疫関連物質と
の結合体たる免疫測定用の標識物質としての有用
性を有するものが得られるもので、これは免疫測
定用としての試薬組成物として有用に提供し得る
ものである。 本発明は、上記の種々の知見に基いて完成され
たもので、下記、一般式〔〕 A1−ｓ−ｓ−Ｘ−ｓ−ｓ−A2 〔〕 （ただし、式中、A1、A2、Ｘは前記と同じ基を
示す）で表わされる酵素−免疫関連成分結合体を
含有する免疫測定用組成物であつて、種々の有用
な化合物、キツトを提供するものである。 まず、本発明の一般式〔〕で表わされる酵素
−免疫関連成分結合体（以下、化合物〔〕とい
う）を得るに当つては、上記した新規な化合物
〔〕またはその類似化合物、即ち一般式〔〕 R1−ｓ−ｓ−Ｘ−ｓ−ｓ−R2 〔〕 （ただし、式中、R1、R2は異なるｓ−ｓ交換反
応性を示すヘテロ環または芳香環残基を示す）で
表わされる化合物が用いられる。この一般式
〔〕で表わされる化合物において、そのｓ−ｓ
交換反応性を示せば次の通りである。 （ただし、PH7.5におけるグルタチオンに対する
ｓ−ｓ交換反応速度） （ただし、PH7.5における牛血清アルブミンに対
するｓ−ｓ交換反応速度） 一般式〔〕で表わされる化合物における、そ
のR1、R2に結合するｓ−ｓ基の交換反応速度は、
上記の如くであつて、適宜、例示された基でもつ
て一般式〔〕で表わされる化合物を使用すれば
よく、好ましくは、そのR1として２−ベンゾチ
アゾリル基またはピリジル−Ｎ−オキサイド基、
R2として２−ピリジル基として表わされる、前
記化合物〔〕で示されるものが良好なｓ−ｓ交
換反応速度の差異を有する、有効に利用されるも
のである。さらにＸとして示される炭素数２〜15
分子のスペーサー基としては、好ましくはアルキ
レン基や少なくとも１ケ以上のアミド基などの結
合基やエーテル結合基を有するアルキレン基など
で、炭素数２〜15分子でさらに直鎖状または分枝
鎖状であつてもよく、また水酸基、アミノ基、カ
ルボキシル基などの基を有してよい。このスペー
サー基は、一般式〔〕で表わされる化合物を得
る方法によつて、適宜変更しうるもので、特にそ
のｓ−ｓ基に少なくとも１〜２原子の炭素原子か
らなるアルキレン基を直結せしめてなるものであ
ればよい。 また、本発明に使用されるチオール基を有する
化合物、A1−SH、A2−SHで表わされる化合物
としては、酵素またはそのチオール化修飾誘導
体、免疫関連成分またはそのチオール化修飾誘導
体が挙げられる。これらはチオール基を有する化
合物であれば何んら限定されるものでなく、あら
かじめチオール基を有する化合物、チオール化し
てチオール基を導入したチオール化修飾誘導体が
挙られる。またチオール化修飾誘導体となすに当
つては、例えばアミノ基を有する酵素や免疫関連
成分を不活性媒体中ｓ−アセチルメルカプトサク
シニツク・アンハイドライドを反応せしめるか
（Archives of Biochemistry and Biophysics、
96．605〜612（1962））、反応性ジスルフイド誘導
体を反応せしめ、そのｓ−ｓ基を開裂せしめれば
よい（特願昭53−85900号）。特に、反応性ジスル
フイド誘導体を用いるに当つては、酵素や免疫関
連成分のアミノ基以外に、水酸基、カルボキシル
基、アミド基などをもつて、その反応基と反応せ
しめればよく、次いでジチオスライートなどの還
元剤やPH９〜11程度にてｓ−ｓ基を開裂せしめて
チオール化修飾誘導体となすもので、この反応に
ついて例示すれば次の如く示される。 （ただし、式中、Ａは各々の官能基を有する酵素
−免疫関連成分の残基、X1は少なくともｓ−ｓ
基に直結するアルキレン基を有するスペーサー
基、X2はスペーサー基、Ｒは前記と同じ基を示
す） さらにチオール化修飾誘導体としては、蛋白質
担体、例えばアルブミンを還元剤にて処理してそ
の分子内のｓ−ｓ基を開裂せしめてチオール基を
導入せしめたものであつてもよい。 従つてまた、その免疫関連成分、酵素またはそ
れらのチオール化修飾誘導体として本発明に使用
されるものは、例えばヘロイン、コデイン、ジヒ
ドロコデイン、モルフイン、エストラジオール、
コルチコステロン、フルオシノロン、バルビター
ル、ニトラゼパム、Ｌ−ドーパ、トリヨードチロ
ニン、チロキシン、エルゴタミン、その他抗生物
質、毒物、農薬、インスリン、アルブミン、成長
ホルモン、カルチトニン、プロラクチン、
ACTH、PTH、グルカゴン、ガストリシン、セ
クレチン、α−フエトプロテインまたはこれらの
フラグメント、IgG、IgA、IgMまたはそれらの
フラグメント、さらに抗体に対する抗体即ち第二
抗体、ニコチニツク・アセチルコリンレセプタ
ー、プロゲステロンレセプター、コレカルシフエ
ロールレセプターなどのハプテン、抗原、受容体
などの免疫関連成分や、ペルオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオ
キシダーゼ、グリコースオキシダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ、コリンデヒドロゲナーゼ、コ
レステロールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ラク
テートデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲナ
ーゼ、ピルベートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オ
キシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼなどの酸
化還元酵素、アルカリフオスフアターゼ、ホスフ
オリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、リポプロテイ
ンリパーゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼ、α−
ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペニ
シリンアミダーゼ、リゾチームなどの加水分解酵
素、その他シクロデキストリン・グリコシルトラ
ンスフエラーゼなどの転位酵素、イソメラーゼ、
リガーゼなどの酵素が使用できる。これらの免疫
関連成分や酵素は、あらかじめその官能基、例え
ばアミノ基、水酸基、カルボキシル基、ニトリル
基、アミド基などを、必要に応じて活性化せし
め、これにスペーサーを導入して前処理してもよ
く、これらのスペーサー導入に当つては通常多官
能性化合物、例えばε−アミノカプロン酸、ε−
アミノヘプタン酸、ヘキサメチレンジアミン、ド
デカメチレンジアミン、グルタル酸、アジピン
酸、グルタルアルデヒド、ビスジアゾベンジジ
ン、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエン
ジイソシアナート、Ｎ，N′−エチレンビスマレ
イミドなどの官能基を２以上有するを、一種また
は２種以上用いて酵素や免疫関連成分の官能基と
反応せしめればよく、またその反応に当つては公
知の反応性の組合せを選択組合せればよく、例え
ば酵素や免疫関連成分中の官能基たるアミノ基に
対してはグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジ
イソシアナート、トルエンジイソシアナートやグ
ルタル酸、アジピン酸の酸アジド、酸クロライ
ド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ
−ニトロフエニルエステルなどの活性エステルな
どのそのカルボキシル基の反応性誘導体などの遊
離のアミノ基に反応し得る多官能性化合物との組
合せ、またはアミノ基にイソチオシアナートを反
応せしめてイソシアナート基となし、この活性化
した基に対してε−アミノカプロン酸、ε−アミ
ノヘプタン酸、ヘキサメチレンジアミン、ドデカ
メチレンジアミンなどの多官能性化合物との組合
せ、さらにこの多官能性化合物との反応によつて
結合されたスペーサーの末端に有するアルデヒド
基、アミド基、カルボキシル基はさらにこれを酵
素や免疫関連成分中の官能基とみなして同様にそ
れに対する多官能性化合物を反応せしめてスペー
サーを導入してもよく、また酵素や免疫関連成分
中のカルボキシル基に対してはこのカルボキシル
基を反応性誘導体、例えば酸アジド、酸クロライ
ド、活性エステル、酸イミダゾリド、イソシアナ
ートなどに変換せしめ、ヘキサメチレンジアミ
ン、ドデカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジ
イソシアナートなどのカルボキシル基の反応性誘
導体と反応し得る多官能性化合物との組合せ、ま
た水酸基に対しては臭化シアンにて一旦活性化
し、これにヘキサメチレンジアミン、ドデカメチ
レンジアミンなどの多官能性化合物を反応せしめ
る組合せや、さらにカルボジイミド試薬やウツド
ワード試薬などを用いてスペーサーを導入せしめ
てもよい。従つて、これらのスペーサーを導入し
た酵素や免疫関連成分はそのスペーサーの末端の
官能基に基いて、前記のチオール化剤を反応せし
めてチオール化修飾誘導体となせばよく、このよ
うにして種々の酵素や免疫関連成分またはこれら
のチオール化修飾誘導体が使用される。 次いで、前記の一般式〔〕で表わされる化合
物に、不活性媒体中、A1−SHで示されるチオー
ル基を有する化合物を反応せしめるのであるが、
用いられる不活性媒体としては、例えば水、緩衝
液、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサンまたはそれらの水性媒体などが挙
られる。またその反応条件としては通常10〜40℃
程度、10分〜40時間程度にて、必要に応じて撹拌
せしめ、さらに窒素気流中にて行なえばよい。さ
らにこれらの使用比率としては、等モル程度の割
合にて使用すればよい。 このようにして得られる反応生成物は、必要に
応じて等電点沈澱、塩析、酸・アルカリ・溶剤に
よる転溶、抽出、ゲル過、分配クロマトグラフ
イー、固液分離にて回収、精製すればよい。 さらに目的に応じて、上記の反応生成物を、単
離し、または単離することなく、上記と同様の不
活性媒体中、A2−SHで示されるチオール基を有
する化合物を等モル程度の割合にて加え、通常10
〜40℃、10分〜40時間の条件下反応せしめ、反応
終了後、同様に公知の単離、精製手段を用いて回
収すればよい。 また、上記の各反応においては、そのｓ−ｓ基
に結合する基、例えば２−ベンゾチアゾリル基、
２−ピリジル−Ｎ−オキサイド基、２−ピリジル
基などによるｓ−ｓ交換反応であるために２−メ
ルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトピリ
ジン−Ｎ−オキサイド、２−メルカプトピリジン
などを遊離するものであることより、これらの遊
離する化合物をそれらの極大吸収波長にて吸光度
を測定するか、薄層クロマトグラフイー（TLC）
にて確認するかして、その反応を終了すればよ
い。 また、このようにして得られる目的物は、その
チオール基を有する化合物を選択、組合せること
により、次の如くの有用性のあるものが得られ
る。 【表】 また、上記の一般式〔〕で表わされる化合物
を得るに当つては、次式の反応の如くして得られ
るものである。 【表】 上記の反応における一般式〔〕で表わされる
化合物の例はその一例であつて、その反応に関し
て、適宜チオール基をトリチル基にて一旦保護
し、反応後酸処理して脱離せしめてもよい。 さらに、本発明の化合物〔〕は、種々の用途
を有するもので、その用途において組成物となす
ものである。 まず、化合物〔〕における酵素免疫測定法の
標識物質は、免疫成分たるハプテン、抗原または
抗体などの定性、定量分析を行なうに当つて利用
されるもので、酵素標識ハプテン、酵素標識抗
原、酵素標識抗体として使用されるもので、通常
これらの標識物質と特異的に免疫結合する対応す
る免疫成分、例えば酵素標識ハプテンや酵素標識
抗原の使用の場合は競合反応法による分析手段で
は特異的に免疫結合する対応する免疫成分として
その抗体が使用され、これに免疫反応媒体中血
清、尿や唾液などのハプテンや抗原含有試料を加
えて競合反応せしめてなるもので、また必要に応
じて抗体を不溶性担体に結合した固相体を用いて
なる固相法や、第二抗体を用いる二抗体法を利用
してなるものであり、また酵素標識抗体の使用の
場合はサンドイツチ法による分析手段では特異的
に結合する免疫成分として抗体またはその固相体
が用いられ、これに試料を加えて免疫反応を行な
い、さらにこれに該酵素標識抗体を加えてサンド
イツチ法にて分析せしめるに用いられるものであ
つて、これらの種々の分析手法に基いて適宜必要
な各成分、例えば対応する抗体、またはその固相
体、第二抗体、免疫反応媒体を選択組合せればよ
く、さらに、その標識たる酵素の活性測定をその
分析結果として測定するものであるために、酵素
活性測定用試薬を併用すればよく、またこの酵素
活性測定用試薬とは、使用した酵素の基質特異
性、その作用機序に応じて公知の酵素反応に基く
必要な各成分を有しているもので、例えば酸化酵
素をその標識とした場合には消費される酸素、生
成する過酸化水素を酸素電極、過酸化水素電極に
て計測するか、ペルオキシダーゼと４−アミノア
ンチピリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはフ
エノールなどの指示薬をもつて呈色せしめて、こ
れを比色計測するもので、また加水分解酵素をそ
の標識とした場合には好ましくは酵素作用にて分
解生成する物質を比色などにて計測すればよく、
これらの使用する酵素に対応する基質を使用し、
その計測に必要な各成分を適宜使用するものであ
つて、従つて、酵素免疫測定法における酵素標識
ハプテン、酵素標識抗原、酵素標識抗体たる酵素
標識免疫成分は、そのキツト化するに当つて、そ
の免疫測定の手段、その酵素の活性測定手段によ
り適宜選択組合せればよく、また組成物中に包含
される各量は、試料中の定性、定量する免疫成分
の存在量に基いて適宜変更されるもので、通常
0.01nｇ〜10μｇ程度の免疫成分を測定するに足る
各成分を有していればよく、また１テスト当り１
ml程度の反応系としての測定がよく、通常１キツ
ト当り50〜100テスト用組成物として製造すれば
よい。 また、受容体の１種であるレセプターを用いる
酵素標識レセプターを使用する場合も、上記と同
様に行なつて、酵素レセプターアツセイを行なえ
ばよい。 これらの本発明の目的物は、新規な化合物であ
つて、酵素免疫測定に有用に利用されるもので、
かつその酵素や免疫関連成分に対して、Ｓ−Ｓ交
換反応にて良好に結合せしめてなるものであり、
極めて有用な化合物である。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何んらこれにより限定されるもので
はない。 実施例 １ (1) インスリン−β−カラクトシダーゼ結合体 (イ) ２，2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
40ｇをベンゼン1.5に溶解し、これに３−
メルカプトプロピオン酸8.0ｇを滴下し、70
℃、３時間撹拌した。その後反応液を室温ま
で冷却し、これを減圧濃縮し、さらに５℃、
一晩静置して析出した粗結晶を取し、この
粗結晶をベンゼンにて再結晶化して３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ン酸の結晶16.25ｇを得た（構造式： m.p.163 164℃）。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオン酸8.13ｇをジメチルホ
ルムアミド80mlに溶解し、氷冷下、撹拌しな
がらＮ−ヒドロキシスクシンイミド3.45ｇお
よびジシクロヘキシルカルボジイミド6.8ｇ
を加えて１時間氷冷下撹拌し、さらに２時間
室温下撹拌した。その後生成したジシクロヘ
キシル尿素を別した液を10倍量の水に加
えてその析出物を取し、これを減圧下にて
乾燥し、この乾燥物9.94ｇをベンゼンを用い
て再結晶を繰り返して３−（2′−ベンゾチア
ゾリル−ジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシ
ンイミドエステル7.18ｇを得た（構造式）： m.p.122〜123℃ λnax270nｍ（ジメチルホル
ムアミド：リン酸緩衝液（0.1M、PH7.5）＝
１：９）Rf値：0.53（ベンゼン：酢酸エチル
＝３：１によるシリカゲル薄層クロマトグラ
フイー））。 また、２−メルカプトエチルアミン・塩酸
塩10.0ｇを水40mlに溶解し、氷冷下撹拌しな
がら30％過酸化水素水4.5mlを滴下し、30分
間撹拌し、さらに30％過酸化水素水9.0mlを
滴下した後室温下24時間静置した。次いで室
温にて反応液を減圧濃縮し、シロツプ状物を
得、これに無水エタノールを添加して結晶化
を行ない、粗結晶10.7ｇを得た。さらにこれ
を氷酢酸を用いて再結晶を行ない白色針状晶
の２−アミノエチル2′−アミノエタンチオー
ルスルホナート・２塩酸塩9.77ｇを得た（構
造式：H2N−CH2−CH2−SO2−Ｓ−CH2−
CH2−NH2・2HCl、m.p.165〜160℃（分
解））。 次いで、この２−アミノエチル2′−アミノ
エタンチオールスルホナート・２塩酸塩7.71
ｇを、濃塩酸３mlを含む水溶液12mlに溶解
し、これに、２−メルカプトピリジン3.33ｇ
を溶解したエタノール溶液12mlを室温下撹拌
しながら滴下した。20時間撹拌した後反応液
より減圧下エタノールを留去せしめ、これに
クロロホルムを加えて未反応物を抽出除去
し、さらにこの溶液に氷冷下、冷却した水酸
化カリウム8.4ｇ含有水溶液を加え、クロロ
ホルムを加えて抽出し、さらに２回抽出し、
これらの抽出液は直ちに濃塩酸を用いて転溶
せしめ、その塩酸層を回収し、併合し、これ
を濃縮してシロツプ状物を得た。次いでこれ
に無水エタノールを加えて析出した粗結晶
4.91ｇを得、さらにこれを無水エタノールよ
り再結晶化して、２−ピリジル2′−アミノエ
チルジスルフイド・２塩酸塩3.68ｇを得た
（構造式 m.p.150℃（分解））。 さらに、２−ピリジル2′−アミノエチルジ
スルフイド・２塩酸塩2.0ｇを水20mlに溶解
し、これを1N水酸化カリウム水溶液にてPH
10に調整した後酢酸エチルを加えて抽出し、
この酢酸エチル層を回収し、これを水洗した
後芒硝を加えて脱水した。次いで、この酢酸
エチル層を−15℃に冷却下、酢酸エチルに溶
解した３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル
2.27ｇ溶液を撹拌滴下し、90分間反応せしめ
てその析出物を取し、これを乾燥した。さ
らにこれをクロロホルムに溶解し、氷冷下５
％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、水洗
し、さらに芒硝で乾燥した後そのクロロホル
ム層を濃縮した。この濃縮液にヘキサンを加
えて下記構造を有する目的物2.07ｇを得た。 構造式： Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオンアミド λmax282nｍ、Ｅ１％ １cm＝235（ジメチルホル
ムアミド：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）＝
１：９） Rf値：0.41（クロロホルム：酢酸エチル＝
１：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフ
イー）0.12（ベンゼン：酢酸エチル＝３：１
によるシリカゲル薄層クロマトグラフイー） ○ロ 10mgのインスリン（ウシ）を、酢酸0.2ml
に溶解し、次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.2）0.8mlを加えた後0.1M水酸化ナトリウム
水溶液にてPHを6.2に調整し、これに2.5mgの
ｓ−アセチルメルカプトサクシニツクアンハ
イドライドを加え、そのPHを0.1M水酸化ナ
トリウム水溶液でPH6.0〜6.3に調整しなが
ら、室温下30分間撹拌した。次いで反応後、
その反応液を、セフアデツクスＧ−25（フア
ルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）のカ
ラム（1.5×75cm、溶媒：0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0））を通じて、65
mlから75mlの280nｍの吸収を有する溶出フ
ラクシヨン（インスリン分画）10mlを得た。 次いで、この分画に、１mlの0.5Mヒドロ
キシルアミンを加えて、30℃、20分間放置し
て脱アセチル化せしめた後、この１mlを分取
して、再び上記カラムを通じて、インスリン
１分子当り0.76分子のチオール基を導入した
チオール化したインスリンを含有する分画
7.5mlを得た（インスリン含量650μｇ、イン
スリンのＢ鎖リジンのアミノ基にアミド結合
にて【式】基を導入（約85 ％））。 ○ハ 上記のチオール化したインスリンを含有す
る分画５mlに、100ｍMEDTA水溶液50μ
とＮ−〔２−〔2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオンアミド24μｇ含有ジメチルホルム
アミド0.56mlを加えて室温下30分撹拌せしめ
た（311nｍおよび346nｍにおける２−メル
カプトベンゾチアゾール、２−メルカプトペ
リジンの吸収より、チオール化したインスリ
ンの98％が反応したもので、その内95.4％が
ベンゾチアゾール基に結合しているｓ−ｓ基
と反応し、4.6％がピリジル基に結合してい
るｓ−ｓ基と反応した）。 ○ニ 次いで、上記の反応液0.5mlを分取し、
0.1M水酸化ナトリウム水溶液でPHを8.5に調
整し、これに、β−ガラクトシダーゼ2.2mg
含有0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5）1.0mlを加えて室温下30分間撹拌し
た（反応液中、２−メルカプトペリジン
4.7nmoleがその吸収より確認され、反応率
96.4％であつた。また２−メルカプトベンゾ
チアゾールの吸収はほとんど変化なかつ
た。）。次いで、この反応液は、0.15M
NaCl、0.2％牛血清アルブミン（BSA）、
0.05％アジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）を展開溶媒とするセフアデ
ツクスＧ−100（フアルマシア・フアイン・ケ
ミカルズ社製）のカラム（1.5×80cm）にチ
ヤージして、β−ガラクトシダーゼ活性分画
を得た（47ml〜53ml区分、活性収率87％、結
合したβ−ガラクトシダーゼと遊離のβ−ガ
ラクトシダーゼの比＝92.6：7.4、略示構造
式： ；以下インスリン−β−ガラクトシダーゼ結
合体と称す） (2) 分析用キツト ○イ 下記のインスリン測定用の〔（ナイロンビ
ーズ）−（抗IgG抗体）−（インスリン抗体）〕
で略示される１ビーズ当り2.0±0.11nｇのイ
ンスリン抗体を有するビーズ１粒を含有する
5.0ml容容器。 ●上記のインスリン−β−ガラクトシダーゼ
結合体／リン酸緩衝液50μ（インスリン
含量1nｇ／ml）。 ●ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％
アジ化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭメ
ルカプトエタノール、10％メタノール含有
（PH6.7）200μからなるβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体。 ●0.2Mグリシン緩衝液（PH10.4）2.5mlの反
応停止液。 ●脱インスリンの牛血清100μからなる反
応媒体。 ●0.1％アジ化ナトリウム、0.15M NaCl、
0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2）からなる反応用洗浄液。 上記の各系を組合せて１テスト用のインス
リンの固相法測定用キツトとなす。 なお、上記の〔（ナイロンビーズ）−（抗
IgG抗体）−（インスリン抗体）〕は次の如く
して得たものである。 まずインスリン抗体について、 インスリン（ウシ）１mgを、0.15M NaCl
含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）0.5mlに溶
解し、これにFreund′s adjuvantを加えてホ
モゲナイズして、その１mlを得、これを２週
間に１回の割にてモルモツトに皮下注射し、
８回投与して感作した後採血し、これを
3000rpm、15分間遠心分離して、インスリン
の抗体を含有する血清を得た。この血清は、
次の如く精製法にて免疫グロブリン成分たる
抗インスリンのIgG成分を得た。 精製法１：上記の血清50mlに、等量の
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2）を加え、さらに飽和硫安水溶液を加え
て50％飽和にせしめてその沈澱物を得、次い
でこの沈澱物を0.15M NaCl含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2）に加えて100mlとなし、こ
れに20％飽和になるように硫安を加えて生じ
る沈澱物を去し、さらに35％飽和になるよ
うに硫安を追加し、これを遠心分離
（8000rpm、15分間）して、そのIgG画分を
得（収率70％）、さらにこのIgG画分を0.15M
NaCl含有リン酸緩衝液（PH7.2）10mlに溶解
し、これをセフアデツクスＧ−100を充填し
たカラム（径２×70cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて展開せし
めて、脱塩されたその素通り区分を得、さら
にその活性画分をDEAEセルロースを充填し
たカラム（径１×30cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて展開せし
めて、その素通り区分を集めて、抗インスリ
ンのIgG画分を得た（収率59％、抗体含量1.7
％）。 精製法２：臭化シアンで活性化したセフア
ロース4B（商品名）２ｇに、ヘキサメチレン
ジアミンの10％水溶液（PH11）２mlを加えて
撹拌下60分間反応せしめ、次いで洗浄した後
これに５％グルタルアルデヒド水溶液（PH
８）２mlを加えて反応せしめ、さらに0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）で洗
浄し、次いでこれにインスリン10mgを加え
て、〔（セフアロース4B）−NH−（CH2）6−Ｎ
＝CH−（CH2）3−CH＝（インスリン）〕で略
示されるセフアロース4Bの水酸基とインス
リンのアミノ基とによるインスリン固定化セ
フアロース4Bを得た。次いでこのインスリ
ン固定化セフアロース4Bに、上記の抗イン
スリンのIgG画分を加えて一夜撹拌してイン
スリン固定化セフアロース4Bのインスリン
と、その抗体成分たるIgGとを結合せしめ、
これを0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）で十分洗浄後0.1Mグリシン・HCl緩
衝液（PH2.5）にて溶出してアフイニテイ−
クロマトグラフイーを行なつて、その活性画
分を得た（収率37％、抗体純度66％）。 これをインスリン抗体とした。 さらに、抗IgG抗体（モルモツトのIgGに
対する抗体）について、 モルモツトのIgG3mgを用いて、上記と同
様にして、上記のモルモツトの代りにウサギ
を用いて感作、採血して、その血清を得た。 さらにこの血清は、上記と同様にして得ら
れたモルモツトIgG固定化セフアロース4Bを
用いてアフイニテイ−クロマトグラフイーを
行ない、0.1Mグリシン・HCl緩衝液（PH2.5）
にて溶出して、ウザギのモルモツトの抗イン
スリンIgGに対する抗体として得た（収率37
％、純度72％）。 なお、このモルモツトのIgGに対する抗体
を得るに当つては、モルモツトとは別種の動
物を用いて感作等せしめればよいものであつ
て、その際ウザギに限定されるものでなく、
牛や馬などを用いてもよく、この場合には牛
または馬のモルモツトのIgGの抗体が得られ
るものである。 さらに、ナイロンビーズを用いて以下の通
り行なつた。 6.6ナイロンビーズ（径５mm）500粒を５塩
化リン４ｇとピリジン４ｇを含むベンゼン60
ml中で２日間撹拌した後４回ベンゼンにて洗
浄してイミクロライド化した6.6ナイロンビ
ーズを得、これに１ｇのヘキサメチレンジア
ミンを含む炭酸緩衝液（PH11）50mlを加えて
室温下24時間撹拌反応せしめ、１％重ソウ
100mlで４回洗浄し、さらにこれに２％グル
タルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
８）50mlを加えて１時間室温で反応せしめて
0.1Mリン酸緩衝液（PH８）で洗浄し、さら
に同様にして再度ヘキサメチレンジアミンお
よびグルタルアルデヒドの順にて処理して、
該ナイロンビーズにスペーサーを導入せしめ
た。次いで、このスペーサーを導入したナイ
ロンビーズ150粒に、上記に記載した通りの
ウザギのモルモツトの抗インスリンIgGに対
する抗体（抗IgG抗体）155γを0.15M NaCl
含有0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）中に加え
て５℃、一夜反応せしめて、〔（該ナイロン）
−（抗IgG抗体）〕にて略示される結合物を得
（450〜590nｇ抗IgG抗体／１ビーズ）、次い
で、これに上記に記載した通りのモルモツト
のインスリンの抗体を含有する血清の10000
倍希釈液（0.1％アジ化ナトリウム、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍＭ EDTA含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）よりなる希釈
液）15ml（350nｇの抗インスリンIgGを含
む）を加えて５℃、一夜撹拌して〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG抗体）−（インスリンの抗体）〕
にて略示されるインスリン測定用のビーズを
得た。本品のインスリンの抗体活性を測定し
た結果、１ビーズ当り2.0±0.11nｇのインス
リン抗体活性を有していた。（本品の理論的
インスリン抗体活性値は2.25nｇである。） ○ロ 上記○イの測定用キツトにおいて、そのビー
ズの代りに、0.4nｇの抗体を含有するインス
リン抗体（モルモツト）、4γのIgGを含有す
るモルモツト正常血清および4γの抗体（第
二抗体）含有抗モルモツトIgGヤギ血清を用
い、さらにその他は○イの測定用キツトの各系
を用いて、二抗体法用測定キツトとなす。 (3) 分析法 ○イ 上記のインスリンの固相法測定用キツトを
用いて、次の如くしてインスリンの測定を行
なつた。 まず、インスリンの0.2nｇ／ml、0.4nｇ／
ml、0.8nｇ／ml、1.6nｇ／ml、3.2nｇ／ml、
6.4nｇ／ml、12.5nｇ／ml、25nｇ／mlの各濃
度のインスリンを含有する液体を調整して、
インスリン含有液体試料となり、また反応媒
体としては脱インスリンの牛血清100μを
用いた。このインスリン含有液体100μを、
上記のビーズ１粒を含有する5.0ml容容器に
上記インスリン−β−ガラクトシダーゼ結合
体／リン酸緩衝液溶液50μを含有する容器
の内容物とともに注入して、５℃、一夜イン
キユベイトせしめ、その後固相と液相とを分
別し、この固相を反応用洗浄液にて洗浄した
後さらにこの固相の固形物に上記のβ−ガラ
クトシダーゼ活性測定用媒体を加えて44℃で
２時間反応せしめた後、これに上記の該媒体
反応停止液を加えた後、その発色を420nｍ
の波長にてその吸光度を測定して、そのビー
ズに対するインスリンとインスリン−β−ガ
ラクトシダーゼ結合体の競合反応による、そ
のビーズに結合したインスリン−β−ガラク
トシダーゼ結合体のβ−ガラクトシダーゼの
活性とインスリン含有液体試料中のインスリ
ン量との関係を測定した。 その結果、第１図に示す通り、本発明のイ
ンスリン測定用キツトは、極めて良好な定量
曲線を示す有用なものであつた。 ○ロ 上記の二抗体法用測定キツトを用いてなる
インスリン測定方法は次の如くである。 インスリン含有液体試料、反応媒体たる脱
インスリンの牛血清100μ、インスリン−
β−ガラクトシダーゼ結合体／リン酸緩衝液
溶液50μを5.0ml容容器に注入し、これに
0.4nｇの抗体を含有するインスリン抗体を加
えて５℃、一夜インキユベイトし、さらにこ
れに、4γのIgGを含有するモルモツト正常血
清および4γの抗体（第二抗体）含有抗モル
モツトIgGヤギ血清を加えて５℃、一夜イン
キユベイトし、次いでこの反応液を
3000rpm、10分間遠心分離し、その沈澱物ま
たはその上清液を回収し、さらにこれらにβ
−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体を加えて
44℃、２時間反応せしめた後これに反応停止
液を加え、その発色を420nｍにて測定して
各々の酵素活性を測定することにより、イン
スリン含有液体試料中のインスリン量を測定
して、前記と同様に良好な定量結果を得た。 実施例 ２ (1) 不溶性担体−インスリン抗体結合体 ○イ Ａ Ｈ Sepharose 4B（臭化シアン活性化
アガロースへの1.6−ジアミノヘキサン誘導
体：フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製）１ｇを、10mlの0.1M炭酸水素ナトリウ
ム水溶液で膨潤せしめた後これに５％グルタ
ルアルデヒド溶液10mlを加えて室温下30分間
撹拌し、取し、次いで0.5M NaCl水溶液
100mlで洗浄した。さらに、これに２−メル
カプトエチルアミン0.2ｇ含有0.1M炭酸水素
ナトリウム水溶液20mlを加えて室温下60分間
反応せしめ、その後取し、これを0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH８）で洗浄し、さらに0.1M
リン酸緩衝液（PH８）20mlを加え、水素化ホ
ウ素ナトリウム100mgを加えて60分間還元処
理し、これを取し、さらに0.01Mリン酸緩
衝液（PH8.5、0.15M NaCl含有）100mlで洗
浄して、チオール化したＡ Ｈ Sepharose
4Bを得た。 ○ロ The Jounal of Immunology、116(6)1554
（1976）の文献記載に従つて得られた、イン
スリン抗体活性1.2％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、２mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、これに、100ｍＭ EDTA水
溶液25μとＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチ
オ）エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−
ジチオ）プロピオンアミド5.5μｇ含有0.5ml
メタノールを加えて室温下30分間撹拌せし
め、その後この反応液を0.1M水酸化ナトリ
ウム水溶液でPH8.5に調整した。 ○ハ 上記のチオール化したＡ Ｈ Sepharose
4Bに20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）を加
え、これを、上記のPH8.5に調整した反応液
0.22mlに加えて室温下60分間反応せしめ、こ
れを取し、さらに0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2、0.15M NaCl含有）100mlにて洗浄して、
不溶性担体−インスリン抗体結合体（Ａ Ｈ
Sepharose 4B10mg当り、0.17μｇの
Fab′（インスリン抗体2nｇ）を結合）を得
た。 (2) 分析用キツト 実施例１の(2)分析用キツト○イに記載のキツト
におけるインスリン抗体を有するビーズの代り
に、１テスト当り、５mgの上記の不溶性担体−
インスリン抗体結合体を用いて、以下同様の組
成を用いてインスリンの固相法測定用キツトと
なす。 (3) 分析法 実施例１の(3)分析法○イに記載のインスリン測
定における反応において、固相と液相とを分別
する際に、3000rpm、10分間遠心分離せしめ、
この沈澱物を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2、
0.15M NaCl含有）で洗浄し、以下同様にして
酵素活性を測定する。 実施例 ３ (1) インスリン抗体−β−ガラクトシダーゼ結合
体 ○イ インスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.5mlの0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.0、0.15M NaCl含有）に溶解し、これ
に、100ｍＭ EDTA水溶液7μと5.0μｇの
Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕
−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プ
ロピオンアミド含有0.2mlのメタノールを加
えて室温下30分間撹拌反応せしめ、その後PH
8.5に調整し、これに、4.9mgのβ−ガラクト
シダーゼ含有0.5mlの0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5、0.15M NaCl含有）を加えて、さら
に30分間撹拌反応せしめた。次いで反応液
を、バイオゲルＰ−300（商品名）のカラム
（2.5×80cm）にチヤージし0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0、0.15M NaCl含有）を展開溶媒し
て、インスリン抗体−β−ガラクトシダーゼ
結合体の分画を得た（遊離のβ−ガラクトシ
ダーゼ含有率10.8％、活性炭率86％）。 ○ロ 実施例２(1)○イと同様にして得られたチオー
ル化したＡ Ｈ Sepharose 4B1ｇ、および
インスリン抗体Fab′5mgを用いて、実施例２
(1)と同様に行なつて抗体の固相体を得た（チ
オール化したＡ Ｈ Sepharose 4B10mg当
り、42μのFab′を結合）。 (2) 分析用キツト ○イ●上記の抗体の固相体（チオール化したＡ
Ｈ Sepharose 4B10mg当り、42μｇの
Fab′を結合）10mg。 ●上記のインスリン抗体−β−ガラクトシダ
ーゼ結合体（遊離のβ−ガラクトシダーゼ
含有率10.8％）をFab′として50μｇ。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：ｏ
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド
５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％ア
ジ化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭメル
カプトエタノール、10％メタノール含有）
（PH6.7）200μからなるβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体、および0.2Mグリシ
ン緩衝液（PH10.4）からなる該媒体反応停
止液。 ●反応媒体：0.05％アジ化ナトリウム、0.2
％BSA、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）。 ●反応用洗浄液：0.1％アジ化ナトリウム、
0.15M NaCl、0.25％BSA、５ｍＭ
EDAT含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）。 上記の各系を組合せて１テスト用のサンド
イツチ法によるインスリン測定用キツトとす
る。 (3) 分析法 5.0ml容容器に、上記の抗体の固相体10mgを
加え、これにインスリン含有液体試料（インス
リン0.2〜12.5nｇ／ml含有）100μを加え、こ
れに反応媒体200μを加えて５℃で一夜反応
せしめ、次いでこれにインスリン抗体−β−ガ
ラクトシダーゼ結合体を加えて20時間反応せし
めた後遠心分離し、その沈澱物を回収し、反応
用洗浄液にて洗浄後、これにβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体を加えて44℃、２時間反応
せしめ、次いで反応停止液を加えた後、420n
ｍの波長にてその吸光度を測定して、インスリ
ン含有液体試料中のインスリン含量を求めた。 その結果、本発明のキツトは、その定量曲線
において良好な直線性を示す有用なる測定用キ
ツトであつた。 実施例 ４ (1) T3−β−ガラクトシダーゼ結合体 ○イ 実施例１(1)○ロに準じて、T3（トリヨードサ
イロニン）1.1mgを、0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.2）１mlに溶解し、これに2.5mgのｓ−アセ
チルメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イドを加えて反応せしめた後セフアデツクス
Ｇ−10のカラム（1.5×70cm）にチヤージし
て、その60〜66mlの分画を回収し、この溶出
液をヒドロキシアミンにて処理して脱アセチ
ル化せしめて、その0.7mlを分取し、これを
再度上記と同一カラムにチヤージしてチオー
ル化したT3の分画6.5mlを得た（T31分子当
り、0.72分子のチオール基を含有、チオール
化T3含量0.11nｇ） ○ロ 上記のチオール化したT3の溶液５mlに、
63μのＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）
エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミドを含むジメチルホルム
アミド１mlを加えて室温下、30分間撹拌反応
せしめ、その0.5mlを分取し、次いでこの反
応液を0.1M水酸化ナトリウム水溶液でPH8.5
に調整した後β−ガラクトシダーゼ4.5mg含
有0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5）１mlを加えて室温下30分間撹拌し、
この反応液を、0.15M NaCl、0.2％BSA、
0.05％アジ化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）を展開溶媒とするセフアデツ
クスＧ−100のカラム（1.5×80cm）にチヤー
ジして、β−ガラクトシダーゼ活性分画を得
た。本分画は遊離のβ−ガラクトシダーゼを
14.9％含有し、またチオール化したT3とβ−
ガラクトシダーゼが１対１にて結合した下記
の略示構造式で示されるT3−β−ガラクト
シダーゼ結合体を含有するものであつた。 略示構造式： (2) 測定用キツト及び測定法 ●後述の実施例８に記載の如くして得られた
T3−アルブミン結合体を用い、常法により
モルモツトよりのT3の抗体を得、かつモル
モツトのIgGに対する抗体たる抗IgG抗体を
用いて、前記実施例１(2)○イ記載の方法に従つ
て、T3測定用のビーズ（略示すれば；〔（ナ
イロンビーズ）−（抗IgG抗体）−（T3の抗
体）〕、１ビーズ当り3nｇのT3の抗体含有）
を得た、１ビーズ含有5.0ml容容器。 ●T3として0.1nｇを含有する上記のT3−β−
ガラクトシダーゼ結合体0.2％BSA、0.15M
NaClを含む0.01MPH7.2リン酸緩衝液100μ
。 ●ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド
５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％アジ
化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭ メルカ
プトエタノール、10％メタノール含有）（PH
6.7）200μからなるβ−ガラクトシダーゼ
活性測定用媒体。 ●0.2Mグリシン緩衝液（PH10.4）2.5mlの反応
停止液。 ●0.05％アジ化ナトリウム、0.2％BSA、0.15M
NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）か
らなる反応媒体。 ●0.1％アジ化ナトリウム、0.15M NaCl、0.25
％BSA、５ｍＭ EDAT含有0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）からなる反応洗浄液。 上記の各系を組合せて１テスト用の固相法に
よるT3測定用キツトとなす。 次いで、上記のT3測定用キツトを用いてな
る測定法について述べる。 まず、T3の0.1nｇ／ml、0.2nｇ／ml、0.4n
ｇ／ml、0.8nｇ／ml、1.6nｇ／ml、3.2nｇ／ml、
6.4nｇ／mlの各濃度のT3含有液体（0.2％BSA、
0.05％アジ化ナトリウム0.15M NaCl含有PH7.2
0.01Mリン酸緩衝液）を調整してT3含有液体試
料となし、この各100μを用い、上記のビー
ズ１粒を含有する5.0ml容容器に、上記のT3−
β−ガラクトシダーゼ結合体含有リン酸緩衝液
100μおよび反応媒体100μとともに加えて
５℃、一夜インキユベイトせしめ、その後その
固相を分別し、洗浄液にて洗浄した後にこの固
相に上記のβ−ガラクトシダーゼ活性測定用媒
体を加えて44℃、２時間反応せしめ、その後反
応停止液を加え、その発色を420nｍの波長に
て測定した。その結果、第２図に示す通り、良
好な測定結果を示した。 実施例 ５ (1) テストステロン−ペルオキシダーゼ結合体 ○イ テストステロン20mg、ヘキサメチレンジア
ミン40mgを水酸化カリウム−メタノール溶液
１mlに溶解し、室温下150分間撹拌した後溶
媒を留去し、これに水を加えて撹拌し、さら
にこれを遠心分離してその沈澱物を回収し、
乾燥して６−アミノヘキサメチレンイミノテ
ストステロン（ベンゼン：メタノール＝９：
１によるシリカゲル薄層クロマトグラフイー
によるRf＝0.31）24mgを得た。この0.66mgを
分取し、これをジメチルホルムアミド0.5ml
に溶解し、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.2）１ml
を加え、さらに塩酸でPH6.2に調整し、これ
に2.4mgのｓ−アセチルメルカプトサクシニ
ツクアンハイドライドを加えて30分間反応せ
しめた後、さらにヒドロキシアミンを加えて
脱アセチル化せしめ、反応後酢酸エチル20ml
を加え、20mlの水で８回洗浄した後酢酸エチ
ルを留去し、その残渣を１mlのメタノールに
溶解した（１分子当りチオール基の導入率は
0.65分子であつた）。 ○ロ ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）6.7mgを、
PH6.2の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶解し、こ
れに0.1mgのｓ−アセチルメルカプトサクシ
ニツクアンハライドを加えて上記と同様に反
応せしめ、さらにヒドロキシルアミンにて脱
アセチル化して、5.63mgのチオール化したペ
ルオキシダーゼの分画を得た（１分子当りチ
オール基の導入率は1.07分子であつた）。 ○ハ 上記のチオール化したテストステロン74μ
ｇを含むメタノール20％含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）２mlに、100ｍＭ EDTA水溶
液20μとＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）
エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミド45μｇ含有メタノール
溶液200μを加えて室温下30分間反応せし
めた。次いでその１mlを分取し、これに上記
のチオール化したペルオキシダーゼ1.6mg含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）0.5mlを加え
て、さらに水酸化ナトリウム水溶液にてPHを
8.5に調整して室温下、反応せしめ、次いで
その反応液を、セフアデツクスＧ−50のカラ
ム（1.5×75cm）にチヤージしてその活性画
分を得、テストステロン−ペルオキシダーゼ
の結合体を得た（活性収率74％、遊離のペル
オキシダーゼ17％、略示構造式： 実施例 ６ (1) インスリン−β−ガラクトシダーゼ結合体 ○イ ２，2′−ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキ
サド）5.05ｇを、クロロホルム200mlに溶解
し、これに３−メルカプトプロピオン酸2.55
ｇを滴下し、40℃、１時間撹拌し、その後反
応液を室温まで冷却して折出物を取し、さ
らにこの析出物をクロロホルムにて再結晶化
して、３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド
−ジチオ）プロピオン酸3.72ｇを得た（Rf
値：0.63（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：
１：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフ
イー） また、前記実施例１(1)○イと同様にして得ら
れた２−ピリジル2′−アミノエチルジスルフ
イド・２塩酸塩2.0ｇを水20mlに溶解し、氷
冷下1N水酸化ナトリウム水溶液にてPHを10
に調整した後クロロホルムにて抽出し、その
クロロホルム層を回収し、水洗した後芒硝を
加えて乾燥し、さらにこれを減圧濃縮した。 さらに、上記の３−（2′−ピリジル−Ｎ−
オキサイド−ジチオ）プロピオン酸1.19ｇ
を、テトラヒドロフラン50mlに溶解し、この
溶液に、氷冷下撹拌しながら、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド1.06ｇ含有テトラヒドロ
フラン溶液２mlを滴下した。20分後、この溶
液と、上記の濃縮液とを氷冷下撹拌しながら
合し、１時間撹拌した後室温下、３時間撹拌
し続けた。 反応後生成したジシクロヘキシル尿素を
去し、その液に水を加え、さらにクロロホ
ルムを加えて、そのクロロホルム抽出液を回
収した。さらにこのクロロホルム層を、５％
塩酸、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の
順にて洗浄した後、芒硝を加えて乾燥し、ク
ロロホルムを留去して、下記構造を有する目
的物1.46ｇ（純度91％）を得た。 構造式： Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド−
ジチオ）プロピオンアミド Rf値：0.55（ｎ−ブタノール：ピリジン：
酢酸：水＝10：３：0.1：11の上層液による
シリカゲル薄層クロマトグラフイー） ○ロ 前記実施例１(1)○ロと同様にして得られたチ
オール化したインスリン590μｇを含む0.01M
リン酸緩衝液（PH7.0、0.15M NaCl含有）５
mlに、100ｍＭ EDTA水溶液60μと38μｇ
のＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド−
ジチオ）プロピオンアミドを含むジメチルホ
ルムアミド１mlを加えて室温下30分間撹拌反
応せしめた（その結果、チオール化したイン
スリンのチオール基に対して94％が反応、導
入され、そのうちの97％がそのピリジル−Ｎ
−オキサイド基に結合しているｓ−ｓ基と反
応したものであつた）。次いでこれに、0.1N
水酸化ナトリウム水溶液を加えてPH8.5に調
整した。 ○ハ 上記の反応液0.3mlを分取し、これに、2.4
mgのβ−ガラクトシダーゼを含む0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.5、0.15M NaCl含有）0.5ml
を加え60分間室温で反応せしめ、次いで反応
液をセフアデツクスＧ−100のカラムにチヤ
ージして0.15M NaCl、0.2％BSA、0.05％ア
ジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）にて展開溶出せしめて、インスリン
−β−ガラクトシダーゼ結合体の活性分画を
得た（活性収率83％、遊離のβ−ガラクトシ
ダーゼ含有率14％）。 また、本化合物のインスリン−β−ガラク
トシダーゼ結合体の略示構造式は、実施例１
に示されるそれと同一であり、従つてまた実
施例１と同様に、分析用を使用し得るもので
ある。 実施例 ７ (1) １−34h−PTH−β−ガラクトシダーゼ結合
体 ○イ ２mgの１−34h−PTH（Proceeding of the
National Academy of Sciences of the
USA、71(2)384−388（1974）の記載に従つて
合成した、１−34のアミノ酸配列からなるヒ
トの副甲状腺ホルモン、以下単にPTHとい
う）を0.01Mベロナール緩衝液（PH8.0）0.2
mlに溶解し、これに、100ｍＭ EDTA水溶
液15μとｓ−アセチルメルカプトサクシニ
ツクアンハイドライド260μｇ含有ジメチル
ホルムアミド0.1mlを加えて室温下60分間反
応せしめ、反応後セフアデツクスＧ−25のカ
ラム（1.0×50cm）にチヤージして、その
PTH含有分画を得、次いでこの分画に、0.2
mlの0.5Mヒドロキシルアミンを加えて脱ア
セチル化し、上記と同様のカラムにチヤージ
して、チオール化したPTHを含む分画を得
た（PTH1分子当りのチオール基は0.33分子
であつた）。 ○ロ 上記で得られたチオール化したPTHを含
む分画0.5ml（0.15mg含有）に、Ｎ−〔２−
（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕−３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ンアミド5.2μｇ含有ジメチルホルムアミド
0.1mlを加えて室温下30分間反応せしめた。 ○ハ 次いで、上記の反応後の溶液0.3mlを分取
し、これに、2.5mgのβ−ガラクトシダーゼ
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）２mlを加え
て室温下60分間撹拌反応せしめ、次いでこの
反応液を、セフアデツクスＧ−200のカラム
（1.5×75cm）にチヤージして0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2、0.15M NaCl含有）にて溶出せ
しめ、β−ガラクトシダーゼ活性分画を回収
して、PTH−β−ガラクトシダーゼ結合体
を得た（活性収率87％、遊離のβ−ガラクト
シダーゼ含有率35％）。 実施例 ８ (1) 不溶性担体−インスリン抗体結合の実施例２
への応用 ○イ Ａ Ｈ Sepharose 4B1ｇを0.1M炭酸水
素ナトリウム水溶液10mlで膨潤せしめ、次い
で５％グルタルアルデヒド10mlを加えて室温
下30分間撹拌反応せしめ、これを取し、
0.5M NaCl水溶液100mlで洗浄した。次いで
これに、メルカプトエチルアミン0.2ｇ含有
0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液20mlを加え
て室温下60分間反応せしめた。反応後取
し、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で洗浄し、
さらにこれに20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）を加え、またこれに水素化ホウ素ナト
リウム100mgを加えて60分間還元処理し、反
応後これを取し、0.15M NaCl含有0.01M
リン酸緩衝液（PH8.5）100mlで洗浄して、チ
オール化したＡ Ｈ Sepharose 4Bを得た。 ○ロ インスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0）２mlに溶解し、これに、
5.3μｇの１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）−６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサン
を含有するジメチルホルムアミド溶液0.2ml
を加えて30分間撹拌反応せしめ、その反応後
反応液を0.1N水酸化ナトリウム水溶液にて
PH8.5に調整した。 ○ハ 次いで、上記のチオール化したＡ Ｈ
Sepharose 4Bに、20mlの0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.5）を加えて懸濁
せしめ、これを、上記のPH8.5に調整した反
応液0.2mlに加えて室温下60分間撹拌反応せ
しめ、反応後取し、0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）100mlで洗浄
し、Ａ Ｈ Sepharose 4B10mg当り0.38μｇ
のFab′が結合した不活性担体−インスリン
抗体結合体を得た。（また本品は、前記実施
例２と同様にして使用されるものである） なお、上記の１−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）−６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘ
キサンは次の如くして得られる。 ２，2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
20mgを40％エタノール含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.4、１ｍＭ EDTA含有）３に溶
解し、これに２，2′−ジチオビス（ピリジ
ン）397mgを溶解した上記と同一緩衝液１、
および1.6−ジメルカプトヘキサン9.0mgを溶
解した上記と同一緩衝液１を室温下撹拌し
ながら加えて60分間反応せしめた。反応後減
圧下エタノールを留去し、次いでクロロホル
ムにて３回抽出し、そのクロロホルム層を回
収し、併合し、これに芒硝を加えて乾燥した
後濃縮した。さらにこの濃縮液を、シリカゲ
ル充填カラム（径1.0×40cm）にチヤージし、
ベンゼン：酢酸エチル＝20：１の溶出溶媒に
て溶出せしめ、その目的物を含むフラクシヨ
ンを回収し、これを減圧乾固して、１−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）６−（2′−
ピリジル−ジチオ）ヘキサン16.5mgを得た。 本品のλmax＝279nｍ（ジメチルホルムア
ミド：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）＝１：
９）、Rf＝0.51（ベンゼン：酢酸エチル＝10：
１によるシリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー）であり、構造式としては次の通りであ
る。 また上記の１、６−ジメルカプトヘキサン
の代りに、１、２−ジメルカプトエタン、
１、４−ジメルカプトブタン、１、８−ジメ
ルカプトオクタン、１、９−ジメルカプトノ
ナン、１、10−ジメルカプトデカン、ジ（２
−メルカプトエチル）エーテル、ジチオエリ
スリトール、ジチオスレイトールを等モル量
使用することにより、各々、下記の化合物が
得られた。 また、これらの化合物はいずれも、上記の
１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−６−
（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサンと同様に
ｓ−ｓ交換反応性を示すもので、上記と同様
に使用されるものである。 実施例 ９ (1) インスリン抗体−酵素結合体 インスリン抗体活性11％を含むモルモツトの
Fab′0.5mgを、0.5mlの0.15M NaCl含有0.01M
リン酸緩衝液（PH0.7）に溶解し、これに、
5.3μｇの１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサンを含む
ジメチルホルムアミド溶液0.2mlを加えて室温
下30分間撹拌反応せしめ、反応後その溶液のPH
を8.5に調整し、これに4.8mgのβ−ガラクトシ
ダーゼ含有0.5mlの0.15M NaCl含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.5）を加えて室温下30分間撹拌
反応せしめた。反応後反応液を、セフアデツク
スＧ−200充填カラム（1.5×80cm）にチヤージ
し、0.15M NaCl、0.2％BSA、0.05％アジ化ナ
トリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて
展開溶出せしめ、その45〜52mlのフラクシヨン
を回収して、インスリン抗体−β−ガラクトシ
ダーゼ結合体の活性分画を得た（遊離β−ガラ
クトシダーゼ含量7.5％、活性収率82％）。
酵素またはそのチオール化修飾誘導体のチオール
残基、他方は免疫関連物質またはそのチオール化
修飾誘導体のチオール残基、Ｘは炭素数２〜15分
子のスペーサー基を示す）で表わされる酵素−免
疫関連物質結合体を含有する免疫測定用組成物に
関する。 本発明等は、先に一般式〔〕 （ただし、式中、Ｒは２−ベンゾチアゾリル基ま
たは２−ピリジル−Ｎ−オキサイド基、Ｘは炭素
数２〜15分子のスペーサー基を示す）で表わされ
る新規な化合物（以下化合物〔〕という）が、
チオール基を有する化合物、例えば酵素、ハプテ
ン、抗原、受容体などの免疫関連物質、蛋白質担
体、不溶性担体などの担体、またはそれらのチオ
ール化修飾誘導体に対して、ほぼ等モル反応にお
いて、その反応は、まず第一段の反応としてその
Ｒに結合するｓ−ｓ基とチオール基を有する化合
物のチオール基とがｓ−ｓ交換反応を行ない、次
いでその第一段の反応の後別のチオール基を有す
る化合物に対して、その２−ピリジル基に結合す
るｓ−ｓ基とｓ−ｓ交換反応を行う。２段階のｓ
−ｓ交換反応性を示す、極めて良好な化合物であ
ることを見い出した。即ち、水性媒体中、化合物
〔〕に対し、チオール基を有する化合物を反応
せしめてなるもので、次式の反応にて略示され
る。 （ただし、式中、A1−SH、A2−SHはチオール
基を有する化合物、Ｒ、Ｘは前記と同じ基を示
す） さらに、上記の２−ピリジル基の代りにその他
４−ピリジル基などとなしたものでも、同様に反
応し得るものである。 このようにして得られる各々の化合物は、新規
な化合物であつて、またその中間体として示され
る化合物は、対応する最終目的物を得るに当つて
有用な反応性の化合物であり、さらに最終目的物
は、そのチオール基を有する化合物を選択、組合
せることにより、例えば、酵素と免疫関連物質と
の結合体たる免疫測定用の標識物質としての有用
性を有するものが得られるもので、これは免疫測
定用としての試薬組成物として有用に提供し得る
ものである。 本発明は、上記の種々の知見に基いて完成され
たもので、下記、一般式〔〕 A1−ｓ−ｓ−Ｘ−ｓ−ｓ−A2 〔〕 （ただし、式中、A1、A2、Ｘは前記と同じ基を
示す）で表わされる酵素−免疫関連成分結合体を
含有する免疫測定用組成物であつて、種々の有用
な化合物、キツトを提供するものである。 まず、本発明の一般式〔〕で表わされる酵素
−免疫関連成分結合体（以下、化合物〔〕とい
う）を得るに当つては、上記した新規な化合物
〔〕またはその類似化合物、即ち一般式〔〕 R1−ｓ−ｓ−Ｘ−ｓ−ｓ−R2 〔〕 （ただし、式中、R1、R2は異なるｓ−ｓ交換反
応性を示すヘテロ環または芳香環残基を示す）で
表わされる化合物が用いられる。この一般式
〔〕で表わされる化合物において、そのｓ−ｓ
交換反応性を示せば次の通りである。 （ただし、PH7.5におけるグルタチオンに対する
ｓ−ｓ交換反応速度） （ただし、PH7.5における牛血清アルブミンに対
するｓ−ｓ交換反応速度） 一般式〔〕で表わされる化合物における、そ
のR1、R2に結合するｓ−ｓ基の交換反応速度は、
上記の如くであつて、適宜、例示された基でもつ
て一般式〔〕で表わされる化合物を使用すれば
よく、好ましくは、そのR1として２−ベンゾチ
アゾリル基またはピリジル−Ｎ−オキサイド基、
R2として２−ピリジル基として表わされる、前
記化合物〔〕で示されるものが良好なｓ−ｓ交
換反応速度の差異を有する、有効に利用されるも
のである。さらにＸとして示される炭素数２〜15
分子のスペーサー基としては、好ましくはアルキ
レン基や少なくとも１ケ以上のアミド基などの結
合基やエーテル結合基を有するアルキレン基など
で、炭素数２〜15分子でさらに直鎖状または分枝
鎖状であつてもよく、また水酸基、アミノ基、カ
ルボキシル基などの基を有してよい。このスペー
サー基は、一般式〔〕で表わされる化合物を得
る方法によつて、適宜変更しうるもので、特にそ
のｓ−ｓ基に少なくとも１〜２原子の炭素原子か
らなるアルキレン基を直結せしめてなるものであ
ればよい。 また、本発明に使用されるチオール基を有する
化合物、A1−SH、A2−SHで表わされる化合物
としては、酵素またはそのチオール化修飾誘導
体、免疫関連成分またはそのチオール化修飾誘導
体が挙げられる。これらはチオール基を有する化
合物であれば何んら限定されるものでなく、あら
かじめチオール基を有する化合物、チオール化し
てチオール基を導入したチオール化修飾誘導体が
挙られる。またチオール化修飾誘導体となすに当
つては、例えばアミノ基を有する酵素や免疫関連
成分を不活性媒体中ｓ−アセチルメルカプトサク
シニツク・アンハイドライドを反応せしめるか
（Archives of Biochemistry and Biophysics、
96．605〜612（1962））、反応性ジスルフイド誘導
体を反応せしめ、そのｓ−ｓ基を開裂せしめれば
よい（特願昭53−85900号）。特に、反応性ジスル
フイド誘導体を用いるに当つては、酵素や免疫関
連成分のアミノ基以外に、水酸基、カルボキシル
基、アミド基などをもつて、その反応基と反応せ
しめればよく、次いでジチオスライートなどの還
元剤やPH９〜11程度にてｓ−ｓ基を開裂せしめて
チオール化修飾誘導体となすもので、この反応に
ついて例示すれば次の如く示される。 （ただし、式中、Ａは各々の官能基を有する酵素
−免疫関連成分の残基、X1は少なくともｓ−ｓ
基に直結するアルキレン基を有するスペーサー
基、X2はスペーサー基、Ｒは前記と同じ基を示
す） さらにチオール化修飾誘導体としては、蛋白質
担体、例えばアルブミンを還元剤にて処理してそ
の分子内のｓ−ｓ基を開裂せしめてチオール基を
導入せしめたものであつてもよい。 従つてまた、その免疫関連成分、酵素またはそ
れらのチオール化修飾誘導体として本発明に使用
されるものは、例えばヘロイン、コデイン、ジヒ
ドロコデイン、モルフイン、エストラジオール、
コルチコステロン、フルオシノロン、バルビター
ル、ニトラゼパム、Ｌ−ドーパ、トリヨードチロ
ニン、チロキシン、エルゴタミン、その他抗生物
質、毒物、農薬、インスリン、アルブミン、成長
ホルモン、カルチトニン、プロラクチン、
ACTH、PTH、グルカゴン、ガストリシン、セ
クレチン、α−フエトプロテインまたはこれらの
フラグメント、IgG、IgA、IgMまたはそれらの
フラグメント、さらに抗体に対する抗体即ち第二
抗体、ニコチニツク・アセチルコリンレセプタ
ー、プロゲステロンレセプター、コレカルシフエ
ロールレセプターなどのハプテン、抗原、受容体
などの免疫関連成分や、ペルオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオ
キシダーゼ、グリコースオキシダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ、コリンデヒドロゲナーゼ、コ
レステロールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデ
ヒドロゲナーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ラク
テートデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲナ
ーゼ、ピルベートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オ
キシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼなどの酸
化還元酵素、アルカリフオスフアターゼ、ホスフ
オリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、リポプロテイ
ンリパーゼ、リパーゼ、グルコアミラーゼ、α−
ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペニ
シリンアミダーゼ、リゾチームなどの加水分解酵
素、その他シクロデキストリン・グリコシルトラ
ンスフエラーゼなどの転位酵素、イソメラーゼ、
リガーゼなどの酵素が使用できる。これらの免疫
関連成分や酵素は、あらかじめその官能基、例え
ばアミノ基、水酸基、カルボキシル基、ニトリル
基、アミド基などを、必要に応じて活性化せし
め、これにスペーサーを導入して前処理してもよ
く、これらのスペーサー導入に当つては通常多官
能性化合物、例えばε−アミノカプロン酸、ε−
アミノヘプタン酸、ヘキサメチレンジアミン、ド
デカメチレンジアミン、グルタル酸、アジピン
酸、グルタルアルデヒド、ビスジアゾベンジジ
ン、ヘキサメチレンジイソシアナート、トルエン
ジイソシアナート、Ｎ，N′−エチレンビスマレ
イミドなどの官能基を２以上有するを、一種また
は２種以上用いて酵素や免疫関連成分の官能基と
反応せしめればよく、またその反応に当つては公
知の反応性の組合せを選択組合せればよく、例え
ば酵素や免疫関連成分中の官能基たるアミノ基に
対してはグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジ
イソシアナート、トルエンジイソシアナートやグ
ルタル酸、アジピン酸の酸アジド、酸クロライ
ド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ
−ニトロフエニルエステルなどの活性エステルな
どのそのカルボキシル基の反応性誘導体などの遊
離のアミノ基に反応し得る多官能性化合物との組
合せ、またはアミノ基にイソチオシアナートを反
応せしめてイソシアナート基となし、この活性化
した基に対してε−アミノカプロン酸、ε−アミ
ノヘプタン酸、ヘキサメチレンジアミン、ドデカ
メチレンジアミンなどの多官能性化合物との組合
せ、さらにこの多官能性化合物との反応によつて
結合されたスペーサーの末端に有するアルデヒド
基、アミド基、カルボキシル基はさらにこれを酵
素や免疫関連成分中の官能基とみなして同様にそ
れに対する多官能性化合物を反応せしめてスペー
サーを導入してもよく、また酵素や免疫関連成分
中のカルボキシル基に対してはこのカルボキシル
基を反応性誘導体、例えば酸アジド、酸クロライ
ド、活性エステル、酸イミダゾリド、イソシアナ
ートなどに変換せしめ、ヘキサメチレンジアミ
ン、ドデカメチレンジアミン、ヘキサメチレンジ
イソシアナートなどのカルボキシル基の反応性誘
導体と反応し得る多官能性化合物との組合せ、ま
た水酸基に対しては臭化シアンにて一旦活性化
し、これにヘキサメチレンジアミン、ドデカメチ
レンジアミンなどの多官能性化合物を反応せしめ
る組合せや、さらにカルボジイミド試薬やウツド
ワード試薬などを用いてスペーサーを導入せしめ
てもよい。従つて、これらのスペーサーを導入し
た酵素や免疫関連成分はそのスペーサーの末端の
官能基に基いて、前記のチオール化剤を反応せし
めてチオール化修飾誘導体となせばよく、このよ
うにして種々の酵素や免疫関連成分またはこれら
のチオール化修飾誘導体が使用される。 次いで、前記の一般式〔〕で表わされる化合
物に、不活性媒体中、A1−SHで示されるチオー
ル基を有する化合物を反応せしめるのであるが、
用いられる不活性媒体としては、例えば水、緩衝
液、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラ
ン、ジオキサンまたはそれらの水性媒体などが挙
られる。またその反応条件としては通常10〜40℃
程度、10分〜40時間程度にて、必要に応じて撹拌
せしめ、さらに窒素気流中にて行なえばよい。さ
らにこれらの使用比率としては、等モル程度の割
合にて使用すればよい。 このようにして得られる反応生成物は、必要に
応じて等電点沈澱、塩析、酸・アルカリ・溶剤に
よる転溶、抽出、ゲル過、分配クロマトグラフ
イー、固液分離にて回収、精製すればよい。 さらに目的に応じて、上記の反応生成物を、単
離し、または単離することなく、上記と同様の不
活性媒体中、A2−SHで示されるチオール基を有
する化合物を等モル程度の割合にて加え、通常10
〜40℃、10分〜40時間の条件下反応せしめ、反応
終了後、同様に公知の単離、精製手段を用いて回
収すればよい。 また、上記の各反応においては、そのｓ−ｓ基
に結合する基、例えば２−ベンゾチアゾリル基、
２−ピリジル−Ｎ−オキサイド基、２−ピリジル
基などによるｓ−ｓ交換反応であるために２−メ
ルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトピリ
ジン−Ｎ−オキサイド、２−メルカプトピリジン
などを遊離するものであることより、これらの遊
離する化合物をそれらの極大吸収波長にて吸光度
を測定するか、薄層クロマトグラフイー（TLC）
にて確認するかして、その反応を終了すればよ
い。 また、このようにして得られる目的物は、その
チオール基を有する化合物を選択、組合せること
により、次の如くの有用性のあるものが得られ
る。 【表】 また、上記の一般式〔〕で表わされる化合物
を得るに当つては、次式の反応の如くして得られ
るものである。 【表】 上記の反応における一般式〔〕で表わされる
化合物の例はその一例であつて、その反応に関し
て、適宜チオール基をトリチル基にて一旦保護
し、反応後酸処理して脱離せしめてもよい。 さらに、本発明の化合物〔〕は、種々の用途
を有するもので、その用途において組成物となす
ものである。 まず、化合物〔〕における酵素免疫測定法の
標識物質は、免疫成分たるハプテン、抗原または
抗体などの定性、定量分析を行なうに当つて利用
されるもので、酵素標識ハプテン、酵素標識抗
原、酵素標識抗体として使用されるもので、通常
これらの標識物質と特異的に免疫結合する対応す
る免疫成分、例えば酵素標識ハプテンや酵素標識
抗原の使用の場合は競合反応法による分析手段で
は特異的に免疫結合する対応する免疫成分として
その抗体が使用され、これに免疫反応媒体中血
清、尿や唾液などのハプテンや抗原含有試料を加
えて競合反応せしめてなるもので、また必要に応
じて抗体を不溶性担体に結合した固相体を用いて
なる固相法や、第二抗体を用いる二抗体法を利用
してなるものであり、また酵素標識抗体の使用の
場合はサンドイツチ法による分析手段では特異的
に結合する免疫成分として抗体またはその固相体
が用いられ、これに試料を加えて免疫反応を行な
い、さらにこれに該酵素標識抗体を加えてサンド
イツチ法にて分析せしめるに用いられるものであ
つて、これらの種々の分析手法に基いて適宜必要
な各成分、例えば対応する抗体、またはその固相
体、第二抗体、免疫反応媒体を選択組合せればよ
く、さらに、その標識たる酵素の活性測定をその
分析結果として測定するものであるために、酵素
活性測定用試薬を併用すればよく、またこの酵素
活性測定用試薬とは、使用した酵素の基質特異
性、その作用機序に応じて公知の酵素反応に基く
必要な各成分を有しているもので、例えば酸化酵
素をその標識とした場合には消費される酸素、生
成する過酸化水素を酸素電極、過酸化水素電極に
て計測するか、ペルオキシダーゼと４−アミノア
ンチピリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンまたはフ
エノールなどの指示薬をもつて呈色せしめて、こ
れを比色計測するもので、また加水分解酵素をそ
の標識とした場合には好ましくは酵素作用にて分
解生成する物質を比色などにて計測すればよく、
これらの使用する酵素に対応する基質を使用し、
その計測に必要な各成分を適宜使用するものであ
つて、従つて、酵素免疫測定法における酵素標識
ハプテン、酵素標識抗原、酵素標識抗体たる酵素
標識免疫成分は、そのキツト化するに当つて、そ
の免疫測定の手段、その酵素の活性測定手段によ
り適宜選択組合せればよく、また組成物中に包含
される各量は、試料中の定性、定量する免疫成分
の存在量に基いて適宜変更されるもので、通常
0.01nｇ〜10μｇ程度の免疫成分を測定するに足る
各成分を有していればよく、また１テスト当り１
ml程度の反応系としての測定がよく、通常１キツ
ト当り50〜100テスト用組成物として製造すれば
よい。 また、受容体の１種であるレセプターを用いる
酵素標識レセプターを使用する場合も、上記と同
様に行なつて、酵素レセプターアツセイを行なえ
ばよい。 これらの本発明の目的物は、新規な化合物であ
つて、酵素免疫測定に有用に利用されるもので、
かつその酵素や免疫関連成分に対して、Ｓ−Ｓ交
換反応にて良好に結合せしめてなるものであり、
極めて有用な化合物である。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何んらこれにより限定されるもので
はない。 実施例 １ (1) インスリン−β−カラクトシダーゼ結合体 (イ) ２，2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
40ｇをベンゼン1.5に溶解し、これに３−
メルカプトプロピオン酸8.0ｇを滴下し、70
℃、３時間撹拌した。その後反応液を室温ま
で冷却し、これを減圧濃縮し、さらに５℃、
一晩静置して析出した粗結晶を取し、この
粗結晶をベンゼンにて再結晶化して３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ン酸の結晶16.25ｇを得た（構造式： m.p.163 164℃）。 次いで、この３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオン酸8.13ｇをジメチルホ
ルムアミド80mlに溶解し、氷冷下、撹拌しな
がらＮ−ヒドロキシスクシンイミド3.45ｇお
よびジシクロヘキシルカルボジイミド6.8ｇ
を加えて１時間氷冷下撹拌し、さらに２時間
室温下撹拌した。その後生成したジシクロヘ
キシル尿素を別した液を10倍量の水に加
えてその析出物を取し、これを減圧下にて
乾燥し、この乾燥物9.94ｇをベンゼンを用い
て再結晶を繰り返して３−（2′−ベンゾチア
ゾリル−ジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシ
ンイミドエステル7.18ｇを得た（構造式）： m.p.122〜123℃ λnax270nｍ（ジメチルホル
ムアミド：リン酸緩衝液（0.1M、PH7.5）＝
１：９）Rf値：0.53（ベンゼン：酢酸エチル
＝３：１によるシリカゲル薄層クロマトグラ
フイー））。 また、２−メルカプトエチルアミン・塩酸
塩10.0ｇを水40mlに溶解し、氷冷下撹拌しな
がら30％過酸化水素水4.5mlを滴下し、30分
間撹拌し、さらに30％過酸化水素水9.0mlを
滴下した後室温下24時間静置した。次いで室
温にて反応液を減圧濃縮し、シロツプ状物を
得、これに無水エタノールを添加して結晶化
を行ない、粗結晶10.7ｇを得た。さらにこれ
を氷酢酸を用いて再結晶を行ない白色針状晶
の２−アミノエチル2′−アミノエタンチオー
ルスルホナート・２塩酸塩9.77ｇを得た（構
造式：H2N−CH2−CH2−SO2−Ｓ−CH2−
CH2−NH2・2HCl、m.p.165〜160℃（分
解））。 次いで、この２−アミノエチル2′−アミノ
エタンチオールスルホナート・２塩酸塩7.71
ｇを、濃塩酸３mlを含む水溶液12mlに溶解
し、これに、２−メルカプトピリジン3.33ｇ
を溶解したエタノール溶液12mlを室温下撹拌
しながら滴下した。20時間撹拌した後反応液
より減圧下エタノールを留去せしめ、これに
クロロホルムを加えて未反応物を抽出除去
し、さらにこの溶液に氷冷下、冷却した水酸
化カリウム8.4ｇ含有水溶液を加え、クロロ
ホルムを加えて抽出し、さらに２回抽出し、
これらの抽出液は直ちに濃塩酸を用いて転溶
せしめ、その塩酸層を回収し、併合し、これ
を濃縮してシロツプ状物を得た。次いでこれ
に無水エタノールを加えて析出した粗結晶
4.91ｇを得、さらにこれを無水エタノールよ
り再結晶化して、２−ピリジル2′−アミノエ
チルジスルフイド・２塩酸塩3.68ｇを得た
（構造式 m.p.150℃（分解））。 さらに、２−ピリジル2′−アミノエチルジ
スルフイド・２塩酸塩2.0ｇを水20mlに溶解
し、これを1N水酸化カリウム水溶液にてPH
10に調整した後酢酸エチルを加えて抽出し、
この酢酸エチル層を回収し、これを水洗した
後芒硝を加えて脱水した。次いで、この酢酸
エチル層を−15℃に冷却下、酢酸エチルに溶
解した３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル
2.27ｇ溶液を撹拌滴下し、90分間反応せしめ
てその析出物を取し、これを乾燥した。さ
らにこれをクロロホルムに溶解し、氷冷下５
％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、水洗
し、さらに芒硝で乾燥した後そのクロロホル
ム層を濃縮した。この濃縮液にヘキサンを加
えて下記構造を有する目的物2.07ｇを得た。 構造式： Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオンアミド λmax282nｍ、Ｅ１％ １cm＝235（ジメチルホル
ムアミド：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）＝
１：９） Rf値：0.41（クロロホルム：酢酸エチル＝
１：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフ
イー）0.12（ベンゼン：酢酸エチル＝３：１
によるシリカゲル薄層クロマトグラフイー） ○ロ 10mgのインスリン（ウシ）を、酢酸0.2ml
に溶解し、次いで0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.2）0.8mlを加えた後0.1M水酸化ナトリウム
水溶液にてPHを6.2に調整し、これに2.5mgの
ｓ−アセチルメルカプトサクシニツクアンハ
イドライドを加え、そのPHを0.1M水酸化ナ
トリウム水溶液でPH6.0〜6.3に調整しなが
ら、室温下30分間撹拌した。次いで反応後、
その反応液を、セフアデツクスＧ−25（フア
ルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）のカ
ラム（1.5×75cm、溶媒：0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0））を通じて、65
mlから75mlの280nｍの吸収を有する溶出フ
ラクシヨン（インスリン分画）10mlを得た。 次いで、この分画に、１mlの0.5Mヒドロ
キシルアミンを加えて、30℃、20分間放置し
て脱アセチル化せしめた後、この１mlを分取
して、再び上記カラムを通じて、インスリン
１分子当り0.76分子のチオール基を導入した
チオール化したインスリンを含有する分画
7.5mlを得た（インスリン含量650μｇ、イン
スリンのＢ鎖リジンのアミノ基にアミド結合
にて【式】基を導入（約85 ％））。 ○ハ 上記のチオール化したインスリンを含有す
る分画５mlに、100ｍMEDTA水溶液50μ
とＮ−〔２−〔2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオンアミド24μｇ含有ジメチルホルム
アミド0.56mlを加えて室温下30分撹拌せしめ
た（311nｍおよび346nｍにおける２−メル
カプトベンゾチアゾール、２−メルカプトペ
リジンの吸収より、チオール化したインスリ
ンの98％が反応したもので、その内95.4％が
ベンゾチアゾール基に結合しているｓ−ｓ基
と反応し、4.6％がピリジル基に結合してい
るｓ−ｓ基と反応した）。 ○ニ 次いで、上記の反応液0.5mlを分取し、
0.1M水酸化ナトリウム水溶液でPHを8.5に調
整し、これに、β−ガラクトシダーゼ2.2mg
含有0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5）1.0mlを加えて室温下30分間撹拌し
た（反応液中、２−メルカプトペリジン
4.7nmoleがその吸収より確認され、反応率
96.4％であつた。また２−メルカプトベンゾ
チアゾールの吸収はほとんど変化なかつ
た。）。次いで、この反応液は、0.15M
NaCl、0.2％牛血清アルブミン（BSA）、
0.05％アジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）を展開溶媒とするセフアデ
ツクスＧ−100（フアルマシア・フアイン・ケ
ミカルズ社製）のカラム（1.5×80cm）にチ
ヤージして、β−ガラクトシダーゼ活性分画
を得た（47ml〜53ml区分、活性収率87％、結
合したβ−ガラクトシダーゼと遊離のβ−ガ
ラクトシダーゼの比＝92.6：7.4、略示構造
式： ；以下インスリン−β−ガラクトシダーゼ結
合体と称す） (2) 分析用キツト ○イ 下記のインスリン測定用の〔（ナイロンビ
ーズ）−（抗IgG抗体）−（インスリン抗体）〕
で略示される１ビーズ当り2.0±0.11nｇのイ
ンスリン抗体を有するビーズ１粒を含有する
5.0ml容容器。 ●上記のインスリン−β−ガラクトシダーゼ
結合体／リン酸緩衝液50μ（インスリン
含量1nｇ／ml）。 ●ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％
アジ化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭメ
ルカプトエタノール、10％メタノール含有
（PH6.7）200μからなるβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体。 ●0.2Mグリシン緩衝液（PH10.4）2.5mlの反
応停止液。 ●脱インスリンの牛血清100μからなる反
応媒体。 ●0.1％アジ化ナトリウム、0.15M NaCl、
0.25％BSA、５ｍMEDTA含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2）からなる反応用洗浄液。 上記の各系を組合せて１テスト用のインス
リンの固相法測定用キツトとなす。 なお、上記の〔（ナイロンビーズ）−（抗
IgG抗体）−（インスリン抗体）〕は次の如く
して得たものである。 まずインスリン抗体について、 インスリン（ウシ）１mgを、0.15M NaCl
含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）0.5mlに溶
解し、これにFreund′s adjuvantを加えてホ
モゲナイズして、その１mlを得、これを２週
間に１回の割にてモルモツトに皮下注射し、
８回投与して感作した後採血し、これを
3000rpm、15分間遠心分離して、インスリン
の抗体を含有する血清を得た。この血清は、
次の如く精製法にて免疫グロブリン成分たる
抗インスリンのIgG成分を得た。 精製法１：上記の血清50mlに、等量の
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2）を加え、さらに飽和硫安水溶液を加え
て50％飽和にせしめてその沈澱物を得、次い
でこの沈澱物を0.15M NaCl含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2）に加えて100mlとなし、こ
れに20％飽和になるように硫安を加えて生じ
る沈澱物を去し、さらに35％飽和になるよ
うに硫安を追加し、これを遠心分離
（8000rpm、15分間）して、そのIgG画分を
得（収率70％）、さらにこのIgG画分を0.15M
NaCl含有リン酸緩衝液（PH7.2）10mlに溶解
し、これをセフアデツクスＧ−100を充填し
たカラム（径２×70cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて展開せし
めて、脱塩されたその素通り区分を得、さら
にその活性画分をDEAEセルロースを充填し
たカラム（径１×30cm）にチヤージして
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）にて展開せし
めて、その素通り区分を集めて、抗インスリ
ンのIgG画分を得た（収率59％、抗体含量1.7
％）。 精製法２：臭化シアンで活性化したセフア
ロース4B（商品名）２ｇに、ヘキサメチレン
ジアミンの10％水溶液（PH11）２mlを加えて
撹拌下60分間反応せしめ、次いで洗浄した後
これに５％グルタルアルデヒド水溶液（PH
８）２mlを加えて反応せしめ、さらに0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）で洗
浄し、次いでこれにインスリン10mgを加え
て、〔（セフアロース4B）−NH−（CH2）6−Ｎ
＝CH−（CH2）3−CH＝（インスリン）〕で略
示されるセフアロース4Bの水酸基とインス
リンのアミノ基とによるインスリン固定化セ
フアロース4Bを得た。次いでこのインスリ
ン固定化セフアロース4Bに、上記の抗イン
スリンのIgG画分を加えて一夜撹拌してイン
スリン固定化セフアロース4Bのインスリン
と、その抗体成分たるIgGとを結合せしめ、
これを0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）で十分洗浄後0.1Mグリシン・HCl緩
衝液（PH2.5）にて溶出してアフイニテイ−
クロマトグラフイーを行なつて、その活性画
分を得た（収率37％、抗体純度66％）。 これをインスリン抗体とした。 さらに、抗IgG抗体（モルモツトのIgGに
対する抗体）について、 モルモツトのIgG3mgを用いて、上記と同
様にして、上記のモルモツトの代りにウサギ
を用いて感作、採血して、その血清を得た。 さらにこの血清は、上記と同様にして得ら
れたモルモツトIgG固定化セフアロース4Bを
用いてアフイニテイ−クロマトグラフイーを
行ない、0.1Mグリシン・HCl緩衝液（PH2.5）
にて溶出して、ウザギのモルモツトの抗イン
スリンIgGに対する抗体として得た（収率37
％、純度72％）。 なお、このモルモツトのIgGに対する抗体
を得るに当つては、モルモツトとは別種の動
物を用いて感作等せしめればよいものであつ
て、その際ウザギに限定されるものでなく、
牛や馬などを用いてもよく、この場合には牛
または馬のモルモツトのIgGの抗体が得られ
るものである。 さらに、ナイロンビーズを用いて以下の通
り行なつた。 6.6ナイロンビーズ（径５mm）500粒を５塩
化リン４ｇとピリジン４ｇを含むベンゼン60
ml中で２日間撹拌した後４回ベンゼンにて洗
浄してイミクロライド化した6.6ナイロンビ
ーズを得、これに１ｇのヘキサメチレンジア
ミンを含む炭酸緩衝液（PH11）50mlを加えて
室温下24時間撹拌反応せしめ、１％重ソウ
100mlで４回洗浄し、さらにこれに２％グル
タルアルデヒド含有0.1Mリン酸緩衝液（PH
８）50mlを加えて１時間室温で反応せしめて
0.1Mリン酸緩衝液（PH８）で洗浄し、さら
に同様にして再度ヘキサメチレンジアミンお
よびグルタルアルデヒドの順にて処理して、
該ナイロンビーズにスペーサーを導入せしめ
た。次いで、このスペーサーを導入したナイ
ロンビーズ150粒に、上記に記載した通りの
ウザギのモルモツトの抗インスリンIgGに対
する抗体（抗IgG抗体）155γを0.15M NaCl
含有0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）中に加え
て５℃、一夜反応せしめて、〔（該ナイロン）
−（抗IgG抗体）〕にて略示される結合物を得
（450〜590nｇ抗IgG抗体／１ビーズ）、次い
で、これに上記に記載した通りのモルモツト
のインスリンの抗体を含有する血清の10000
倍希釈液（0.1％アジ化ナトリウム、0.15M
NaCl、0.25％BSA、５ｍＭ EDTA含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）よりなる希釈
液）15ml（350nｇの抗インスリンIgGを含
む）を加えて５℃、一夜撹拌して〔（該ナイ
ロン）−（抗IgG抗体）−（インスリンの抗体）〕
にて略示されるインスリン測定用のビーズを
得た。本品のインスリンの抗体活性を測定し
た結果、１ビーズ当り2.0±0.11nｇのインス
リン抗体活性を有していた。（本品の理論的
インスリン抗体活性値は2.25nｇである。） ○ロ 上記○イの測定用キツトにおいて、そのビー
ズの代りに、0.4nｇの抗体を含有するインス
リン抗体（モルモツト）、4γのIgGを含有す
るモルモツト正常血清および4γの抗体（第
二抗体）含有抗モルモツトIgGヤギ血清を用
い、さらにその他は○イの測定用キツトの各系
を用いて、二抗体法用測定キツトとなす。 (3) 分析法 ○イ 上記のインスリンの固相法測定用キツトを
用いて、次の如くしてインスリンの測定を行
なつた。 まず、インスリンの0.2nｇ／ml、0.4nｇ／
ml、0.8nｇ／ml、1.6nｇ／ml、3.2nｇ／ml、
6.4nｇ／ml、12.5nｇ／ml、25nｇ／mlの各濃
度のインスリンを含有する液体を調整して、
インスリン含有液体試料となり、また反応媒
体としては脱インスリンの牛血清100μを
用いた。このインスリン含有液体100μを、
上記のビーズ１粒を含有する5.0ml容容器に
上記インスリン−β−ガラクトシダーゼ結合
体／リン酸緩衝液溶液50μを含有する容器
の内容物とともに注入して、５℃、一夜イン
キユベイトせしめ、その後固相と液相とを分
別し、この固相を反応用洗浄液にて洗浄した
後さらにこの固相の固形物に上記のβ−ガラ
クトシダーゼ活性測定用媒体を加えて44℃で
２時間反応せしめた後、これに上記の該媒体
反応停止液を加えた後、その発色を420nｍ
の波長にてその吸光度を測定して、そのビー
ズに対するインスリンとインスリン−β−ガ
ラクトシダーゼ結合体の競合反応による、そ
のビーズに結合したインスリン−β−ガラク
トシダーゼ結合体のβ−ガラクトシダーゼの
活性とインスリン含有液体試料中のインスリ
ン量との関係を測定した。 その結果、第１図に示す通り、本発明のイ
ンスリン測定用キツトは、極めて良好な定量
曲線を示す有用なものであつた。 ○ロ 上記の二抗体法用測定キツトを用いてなる
インスリン測定方法は次の如くである。 インスリン含有液体試料、反応媒体たる脱
インスリンの牛血清100μ、インスリン−
β−ガラクトシダーゼ結合体／リン酸緩衝液
溶液50μを5.0ml容容器に注入し、これに
0.4nｇの抗体を含有するインスリン抗体を加
えて５℃、一夜インキユベイトし、さらにこ
れに、4γのIgGを含有するモルモツト正常血
清および4γの抗体（第二抗体）含有抗モル
モツトIgGヤギ血清を加えて５℃、一夜イン
キユベイトし、次いでこの反応液を
3000rpm、10分間遠心分離し、その沈澱物ま
たはその上清液を回収し、さらにこれらにβ
−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体を加えて
44℃、２時間反応せしめた後これに反応停止
液を加え、その発色を420nｍにて測定して
各々の酵素活性を測定することにより、イン
スリン含有液体試料中のインスリン量を測定
して、前記と同様に良好な定量結果を得た。 実施例 ２ (1) 不溶性担体−インスリン抗体結合体 ○イ Ａ Ｈ Sepharose 4B（臭化シアン活性化
アガロースへの1.6−ジアミノヘキサン誘導
体：フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製）１ｇを、10mlの0.1M炭酸水素ナトリウ
ム水溶液で膨潤せしめた後これに５％グルタ
ルアルデヒド溶液10mlを加えて室温下30分間
撹拌し、取し、次いで0.5M NaCl水溶液
100mlで洗浄した。さらに、これに２−メル
カプトエチルアミン0.2ｇ含有0.1M炭酸水素
ナトリウム水溶液20mlを加えて室温下60分間
反応せしめ、その後取し、これを0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH８）で洗浄し、さらに0.1M
リン酸緩衝液（PH８）20mlを加え、水素化ホ
ウ素ナトリウム100mgを加えて60分間還元処
理し、これを取し、さらに0.01Mリン酸緩
衝液（PH8.5、0.15M NaCl含有）100mlで洗
浄して、チオール化したＡ Ｈ Sepharose
4Bを得た。 ○ロ The Jounal of Immunology、116(6)1554
（1976）の文献記載に従つて得られた、イン
スリン抗体活性1.2％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、２mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に溶解し、これに、100ｍＭ EDTA水
溶液25μとＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチ
オ）エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−
ジチオ）プロピオンアミド5.5μｇ含有0.5ml
メタノールを加えて室温下30分間撹拌せし
め、その後この反応液を0.1M水酸化ナトリ
ウム水溶液でPH8.5に調整した。 ○ハ 上記のチオール化したＡ Ｈ Sepharose
4Bに20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）を加
え、これを、上記のPH8.5に調整した反応液
0.22mlに加えて室温下60分間反応せしめ、こ
れを取し、さらに0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.2、0.15M NaCl含有）100mlにて洗浄して、
不溶性担体−インスリン抗体結合体（Ａ Ｈ
Sepharose 4B10mg当り、0.17μｇの
Fab′（インスリン抗体2nｇ）を結合）を得
た。 (2) 分析用キツト 実施例１の(2)分析用キツト○イに記載のキツト
におけるインスリン抗体を有するビーズの代り
に、１テスト当り、５mgの上記の不溶性担体−
インスリン抗体結合体を用いて、以下同様の組
成を用いてインスリンの固相法測定用キツトと
なす。 (3) 分析法 実施例１の(3)分析法○イに記載のインスリン測
定における反応において、固相と液相とを分別
する際に、3000rpm、10分間遠心分離せしめ、
この沈澱物を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2、
0.15M NaCl含有）で洗浄し、以下同様にして
酵素活性を測定する。 実施例 ３ (1) インスリン抗体−β−ガラクトシダーゼ結合
体 ○イ インスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.5mlの0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.0、0.15M NaCl含有）に溶解し、これ
に、100ｍＭ EDTA水溶液7μと5.0μｇの
Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕
−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プ
ロピオンアミド含有0.2mlのメタノールを加
えて室温下30分間撹拌反応せしめ、その後PH
8.5に調整し、これに、4.9mgのβ−ガラクト
シダーゼ含有0.5mlの0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5、0.15M NaCl含有）を加えて、さら
に30分間撹拌反応せしめた。次いで反応液
を、バイオゲルＰ−300（商品名）のカラム
（2.5×80cm）にチヤージし0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0、0.15M NaCl含有）を展開溶媒し
て、インスリン抗体−β−ガラクトシダーゼ
結合体の分画を得た（遊離のβ−ガラクトシ
ダーゼ含有率10.8％、活性炭率86％）。 ○ロ 実施例２(1)○イと同様にして得られたチオー
ル化したＡ Ｈ Sepharose 4B1ｇ、および
インスリン抗体Fab′5mgを用いて、実施例２
(1)と同様に行なつて抗体の固相体を得た（チ
オール化したＡ Ｈ Sepharose 4B10mg当
り、42μのFab′を結合）。 (2) 分析用キツト ○イ●上記の抗体の固相体（チオール化したＡ
Ｈ Sepharose 4B10mg当り、42μｇの
Fab′を結合）10mg。 ●上記のインスリン抗体−β−ガラクトシダ
ーゼ結合体（遊離のβ−ガラクトシダーゼ
含有率10.8％）をFab′として50μｇ。 ●β−ガラクトシダーゼ活性測定用媒体：ｏ
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド
５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％ア
ジ化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭメル
カプトエタノール、10％メタノール含有）
（PH6.7）200μからなるβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体、および0.2Mグリシ
ン緩衝液（PH10.4）からなる該媒体反応停
止液。 ●反応媒体：0.05％アジ化ナトリウム、0.2
％BSA、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）。 ●反応用洗浄液：0.1％アジ化ナトリウム、
0.15M NaCl、0.25％BSA、５ｍＭ
EDAT含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）。 上記の各系を組合せて１テスト用のサンド
イツチ法によるインスリン測定用キツトとす
る。 (3) 分析法 5.0ml容容器に、上記の抗体の固相体10mgを
加え、これにインスリン含有液体試料（インス
リン0.2〜12.5nｇ／ml含有）100μを加え、こ
れに反応媒体200μを加えて５℃で一夜反応
せしめ、次いでこれにインスリン抗体−β−ガ
ラクトシダーゼ結合体を加えて20時間反応せし
めた後遠心分離し、その沈澱物を回収し、反応
用洗浄液にて洗浄後、これにβ−ガラクトシダ
ーゼ活性測定用媒体を加えて44℃、２時間反応
せしめ、次いで反応停止液を加えた後、420n
ｍの波長にてその吸光度を測定して、インスリ
ン含有液体試料中のインスリン含量を求めた。 その結果、本発明のキツトは、その定量曲線
において良好な直線性を示す有用なる測定用キ
ツトであつた。 実施例 ４ (1) T3−β−ガラクトシダーゼ結合体 ○イ 実施例１(1)○ロに準じて、T3（トリヨードサ
イロニン）1.1mgを、0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.2）１mlに溶解し、これに2.5mgのｓ−アセ
チルメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イドを加えて反応せしめた後セフアデツクス
Ｇ−10のカラム（1.5×70cm）にチヤージし
て、その60〜66mlの分画を回収し、この溶出
液をヒドロキシアミンにて処理して脱アセチ
ル化せしめて、その0.7mlを分取し、これを
再度上記と同一カラムにチヤージしてチオー
ル化したT3の分画6.5mlを得た（T31分子当
り、0.72分子のチオール基を含有、チオール
化T3含量0.11nｇ） ○ロ 上記のチオール化したT3の溶液５mlに、
63μのＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）
エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミドを含むジメチルホルム
アミド１mlを加えて室温下、30分間撹拌反応
せしめ、その0.5mlを分取し、次いでこの反
応液を0.1M水酸化ナトリウム水溶液でPH8.5
に調整した後β−ガラクトシダーゼ4.5mg含
有0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.5）１mlを加えて室温下30分間撹拌し、
この反応液を、0.15M NaCl、0.2％BSA、
0.05％アジ化ナトリウム含有0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2）を展開溶媒とするセフアデツ
クスＧ−100のカラム（1.5×80cm）にチヤー
ジして、β−ガラクトシダーゼ活性分画を得
た。本分画は遊離のβ−ガラクトシダーゼを
14.9％含有し、またチオール化したT3とβ−
ガラクトシダーゼが１対１にて結合した下記
の略示構造式で示されるT3−β−ガラクト
シダーゼ結合体を含有するものであつた。 略示構造式： (2) 測定用キツト及び測定法 ●後述の実施例８に記載の如くして得られた
T3−アルブミン結合体を用い、常法により
モルモツトよりのT3の抗体を得、かつモル
モツトのIgGに対する抗体たる抗IgG抗体を
用いて、前記実施例１(2)○イ記載の方法に従つ
て、T3測定用のビーズ（略示すれば；〔（ナ
イロンビーズ）−（抗IgG抗体）−（T3の抗
体）〕、１ビーズ当り3nｇのT3の抗体含有）
を得た、１ビーズ含有5.0ml容容器。 ●T3として0.1nｇを含有する上記のT3−β−
ガラクトシダーゼ結合体0.2％BSA、0.15M
NaClを含む0.01MPH7.2リン酸緩衝液100μ
。 ●ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド
５mg／ml含有0.1Mリン酸緩衝液（0.1％アジ
化ナトリウム、0.1％BSA、20ｍＭ メルカ
プトエタノール、10％メタノール含有）（PH
6.7）200μからなるβ−ガラクトシダーゼ
活性測定用媒体。 ●0.2Mグリシン緩衝液（PH10.4）2.5mlの反応
停止液。 ●0.05％アジ化ナトリウム、0.2％BSA、0.15M
NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）か
らなる反応媒体。 ●0.1％アジ化ナトリウム、0.15M NaCl、0.25
％BSA、５ｍＭ EDAT含有0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.2）からなる反応洗浄液。 上記の各系を組合せて１テスト用の固相法に
よるT3測定用キツトとなす。 次いで、上記のT3測定用キツトを用いてな
る測定法について述べる。 まず、T3の0.1nｇ／ml、0.2nｇ／ml、0.4n
ｇ／ml、0.8nｇ／ml、1.6nｇ／ml、3.2nｇ／ml、
6.4nｇ／mlの各濃度のT3含有液体（0.2％BSA、
0.05％アジ化ナトリウム0.15M NaCl含有PH7.2
0.01Mリン酸緩衝液）を調整してT3含有液体試
料となし、この各100μを用い、上記のビー
ズ１粒を含有する5.0ml容容器に、上記のT3−
β−ガラクトシダーゼ結合体含有リン酸緩衝液
100μおよび反応媒体100μとともに加えて
５℃、一夜インキユベイトせしめ、その後その
固相を分別し、洗浄液にて洗浄した後にこの固
相に上記のβ−ガラクトシダーゼ活性測定用媒
体を加えて44℃、２時間反応せしめ、その後反
応停止液を加え、その発色を420nｍの波長に
て測定した。その結果、第２図に示す通り、良
好な測定結果を示した。 実施例 ５ (1) テストステロン−ペルオキシダーゼ結合体 ○イ テストステロン20mg、ヘキサメチレンジア
ミン40mgを水酸化カリウム−メタノール溶液
１mlに溶解し、室温下150分間撹拌した後溶
媒を留去し、これに水を加えて撹拌し、さら
にこれを遠心分離してその沈澱物を回収し、
乾燥して６−アミノヘキサメチレンイミノテ
ストステロン（ベンゼン：メタノール＝９：
１によるシリカゲル薄層クロマトグラフイー
によるRf＝0.31）24mgを得た。この0.66mgを
分取し、これをジメチルホルムアミド0.5ml
に溶解し、0.1Mリン酸緩衝液（PH6.2）１ml
を加え、さらに塩酸でPH6.2に調整し、これ
に2.4mgのｓ−アセチルメルカプトサクシニ
ツクアンハイドライドを加えて30分間反応せ
しめた後、さらにヒドロキシアミンを加えて
脱アセチル化せしめ、反応後酢酸エチル20ml
を加え、20mlの水で８回洗浄した後酢酸エチ
ルを留去し、その残渣を１mlのメタノールに
溶解した（１分子当りチオール基の導入率は
0.65分子であつた）。 ○ロ ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）6.7mgを、
PH6.2の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶解し、こ
れに0.1mgのｓ−アセチルメルカプトサクシ
ニツクアンハライドを加えて上記と同様に反
応せしめ、さらにヒドロキシルアミンにて脱
アセチル化して、5.63mgのチオール化したペ
ルオキシダーゼの分画を得た（１分子当りチ
オール基の導入率は1.07分子であつた）。 ○ハ 上記のチオール化したテストステロン74μ
ｇを含むメタノール20％含有0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）２mlに、100ｍＭ EDTA水溶
液20μとＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）
エチル〕−３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）プロピオンアミド45μｇ含有メタノール
溶液200μを加えて室温下30分間反応せし
めた。次いでその１mlを分取し、これに上記
のチオール化したペルオキシダーゼ1.6mg含
有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）0.5mlを加え
て、さらに水酸化ナトリウム水溶液にてPHを
8.5に調整して室温下、反応せしめ、次いで
その反応液を、セフアデツクスＧ−50のカラ
ム（1.5×75cm）にチヤージしてその活性画
分を得、テストステロン−ペルオキシダーゼ
の結合体を得た（活性収率74％、遊離のペル
オキシダーゼ17％、略示構造式： 実施例 ６ (1) インスリン−β−ガラクトシダーゼ結合体 ○イ ２，2′−ジチオビス（ピリジン−Ｎ−オキ
サド）5.05ｇを、クロロホルム200mlに溶解
し、これに３−メルカプトプロピオン酸2.55
ｇを滴下し、40℃、１時間撹拌し、その後反
応液を室温まで冷却して折出物を取し、さ
らにこの析出物をクロロホルムにて再結晶化
して、３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド
−ジチオ）プロピオン酸3.72ｇを得た（Rf
値：0.63（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：
１：１によるシリカゲル薄層クロマトグラフ
イー） また、前記実施例１(1)○イと同様にして得ら
れた２−ピリジル2′−アミノエチルジスルフ
イド・２塩酸塩2.0ｇを水20mlに溶解し、氷
冷下1N水酸化ナトリウム水溶液にてPHを10
に調整した後クロロホルムにて抽出し、その
クロロホルム層を回収し、水洗した後芒硝を
加えて乾燥し、さらにこれを減圧濃縮した。 さらに、上記の３−（2′−ピリジル−Ｎ−
オキサイド−ジチオ）プロピオン酸1.19ｇ
を、テトラヒドロフラン50mlに溶解し、この
溶液に、氷冷下撹拌しながら、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド1.06ｇ含有テトラヒドロ
フラン溶液２mlを滴下した。20分後、この溶
液と、上記の濃縮液とを氷冷下撹拌しながら
合し、１時間撹拌した後室温下、３時間撹拌
し続けた。 反応後生成したジシクロヘキシル尿素を
去し、その液に水を加え、さらにクロロホ
ルムを加えて、そのクロロホルム抽出液を回
収した。さらにこのクロロホルム層を、５％
塩酸、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、水の
順にて洗浄した後、芒硝を加えて乾燥し、ク
ロロホルムを留去して、下記構造を有する目
的物1.46ｇ（純度91％）を得た。 構造式： Ｎ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド−
ジチオ）プロピオンアミド Rf値：0.55（ｎ−ブタノール：ピリジン：
酢酸：水＝10：３：0.1：11の上層液による
シリカゲル薄層クロマトグラフイー） ○ロ 前記実施例１(1)○ロと同様にして得られたチ
オール化したインスリン590μｇを含む0.01M
リン酸緩衝液（PH7.0、0.15M NaCl含有）５
mlに、100ｍＭ EDTA水溶液60μと38μｇ
のＮ−〔２−（2′−ピリジル−ジチオ）エチ
ル〕−３−（2′−ピリジル−Ｎ−オキサイド−
ジチオ）プロピオンアミドを含むジメチルホ
ルムアミド１mlを加えて室温下30分間撹拌反
応せしめた（その結果、チオール化したイン
スリンのチオール基に対して94％が反応、導
入され、そのうちの97％がそのピリジル−Ｎ
−オキサイド基に結合しているｓ−ｓ基と反
応したものであつた）。次いでこれに、0.1N
水酸化ナトリウム水溶液を加えてPH8.5に調
整した。 ○ハ 上記の反応液0.3mlを分取し、これに、2.4
mgのβ−ガラクトシダーゼを含む0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.5、0.15M NaCl含有）0.5ml
を加え60分間室温で反応せしめ、次いで反応
液をセフアデツクスＧ−100のカラムにチヤ
ージして0.15M NaCl、0.2％BSA、0.05％ア
ジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）にて展開溶出せしめて、インスリン
−β−ガラクトシダーゼ結合体の活性分画を
得た（活性収率83％、遊離のβ−ガラクトシ
ダーゼ含有率14％）。 また、本化合物のインスリン−β−ガラク
トシダーゼ結合体の略示構造式は、実施例１
に示されるそれと同一であり、従つてまた実
施例１と同様に、分析用を使用し得るもので
ある。 実施例 ７ (1) １−34h−PTH−β−ガラクトシダーゼ結合
体 ○イ ２mgの１−34h−PTH（Proceeding of the
National Academy of Sciences of the
USA、71(2)384−388（1974）の記載に従つて
合成した、１−34のアミノ酸配列からなるヒ
トの副甲状腺ホルモン、以下単にPTHとい
う）を0.01Mベロナール緩衝液（PH8.0）0.2
mlに溶解し、これに、100ｍＭ EDTA水溶
液15μとｓ−アセチルメルカプトサクシニ
ツクアンハイドライド260μｇ含有ジメチル
ホルムアミド0.1mlを加えて室温下60分間反
応せしめ、反応後セフアデツクスＧ−25のカ
ラム（1.0×50cm）にチヤージして、その
PTH含有分画を得、次いでこの分画に、0.2
mlの0.5Mヒドロキシルアミンを加えて脱ア
セチル化し、上記と同様のカラムにチヤージ
して、チオール化したPTHを含む分画を得
た（PTH1分子当りのチオール基は0.33分子
であつた）。 ○ロ 上記で得られたチオール化したPTHを含
む分画0.5ml（0.15mg含有）に、Ｎ−〔２−
（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕−３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ンアミド5.2μｇ含有ジメチルホルムアミド
0.1mlを加えて室温下30分間反応せしめた。 ○ハ 次いで、上記の反応後の溶液0.3mlを分取
し、これに、2.5mgのβ−ガラクトシダーゼ
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH8.5）２mlを加え
て室温下60分間撹拌反応せしめ、次いでこの
反応液を、セフアデツクスＧ−200のカラム
（1.5×75cm）にチヤージして0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.2、0.15M NaCl含有）にて溶出せ
しめ、β−ガラクトシダーゼ活性分画を回収
して、PTH−β−ガラクトシダーゼ結合体
を得た（活性収率87％、遊離のβ−ガラクト
シダーゼ含有率35％）。 実施例 ８ (1) 不溶性担体−インスリン抗体結合の実施例２
への応用 ○イ Ａ Ｈ Sepharose 4B1ｇを0.1M炭酸水
素ナトリウム水溶液10mlで膨潤せしめ、次い
で５％グルタルアルデヒド10mlを加えて室温
下30分間撹拌反応せしめ、これを取し、
0.5M NaCl水溶液100mlで洗浄した。次いで
これに、メルカプトエチルアミン0.2ｇ含有
0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液20mlを加え
て室温下60分間反応せしめた。反応後取
し、0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）で洗浄し、
さらにこれに20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH
8.0）を加え、またこれに水素化ホウ素ナト
リウム100mgを加えて60分間還元処理し、反
応後これを取し、0.15M NaCl含有0.01M
リン酸緩衝液（PH8.5）100mlで洗浄して、チ
オール化したＡ Ｈ Sepharose 4Bを得た。 ○ロ インスリン抗体活性11％を含むモルモツト
Fab′0.5mgを、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0）２mlに溶解し、これに、
5.3μｇの１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチ
オ）−６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサン
を含有するジメチルホルムアミド溶液0.2ml
を加えて30分間撹拌反応せしめ、その反応後
反応液を0.1N水酸化ナトリウム水溶液にて
PH8.5に調整した。 ○ハ 次いで、上記のチオール化したＡ Ｈ
Sepharose 4Bに、20mlの0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH8.5）を加えて懸濁
せしめ、これを、上記のPH8.5に調整した反
応液0.2mlに加えて室温下60分間撹拌反応せ
しめ、反応後取し、0.15M NaCl含有
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）100mlで洗浄
し、Ａ Ｈ Sepharose 4B10mg当り0.38μｇ
のFab′が結合した不活性担体−インスリン
抗体結合体を得た。（また本品は、前記実施
例２と同様にして使用されるものである） なお、上記の１−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）−６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘ
キサンは次の如くして得られる。 ２，2′−ジチオビス（ベンゾチアゾール）
20mgを40％エタノール含有0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.4、１ｍＭ EDTA含有）３に溶
解し、これに２，2′−ジチオビス（ピリジ
ン）397mgを溶解した上記と同一緩衝液１、
および1.6−ジメルカプトヘキサン9.0mgを溶
解した上記と同一緩衝液１を室温下撹拌し
ながら加えて60分間反応せしめた。反応後減
圧下エタノールを留去し、次いでクロロホル
ムにて３回抽出し、そのクロロホルム層を回
収し、併合し、これに芒硝を加えて乾燥した
後濃縮した。さらにこの濃縮液を、シリカゲ
ル充填カラム（径1.0×40cm）にチヤージし、
ベンゼン：酢酸エチル＝20：１の溶出溶媒に
て溶出せしめ、その目的物を含むフラクシヨ
ンを回収し、これを減圧乾固して、１−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）６−（2′−
ピリジル−ジチオ）ヘキサン16.5mgを得た。 本品のλmax＝279nｍ（ジメチルホルムア
ミド：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）＝１：
９）、Rf＝0.51（ベンゼン：酢酸エチル＝10：
１によるシリカゲル薄層クロマトグラフイ
ー）であり、構造式としては次の通りであ
る。 また上記の１、６−ジメルカプトヘキサン
の代りに、１、２−ジメルカプトエタン、
１、４−ジメルカプトブタン、１、８−ジメ
ルカプトオクタン、１、９−ジメルカプトノ
ナン、１、10−ジメルカプトデカン、ジ（２
−メルカプトエチル）エーテル、ジチオエリ
スリトール、ジチオスレイトールを等モル量
使用することにより、各々、下記の化合物が
得られた。 また、これらの化合物はいずれも、上記の
１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−６−
（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサンと同様に
ｓ−ｓ交換反応性を示すもので、上記と同様
に使用されるものである。 実施例 ９ (1) インスリン抗体−酵素結合体 インスリン抗体活性11％を含むモルモツトの
Fab′0.5mgを、0.5mlの0.15M NaCl含有0.01M
リン酸緩衝液（PH0.7）に溶解し、これに、
5.3μｇの１−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
６−（2′−ピリジル−ジチオ）ヘキサンを含む
ジメチルホルムアミド溶液0.2mlを加えて室温
下30分間撹拌反応せしめ、反応後その溶液のPH
を8.5に調整し、これに4.8mgのβ−ガラクトシ
ダーゼ含有0.5mlの0.15M NaCl含有0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.5）を加えて室温下30分間撹拌
反応せしめた。反応後反応液を、セフアデツク
スＧ−200充填カラム（1.5×80cm）にチヤージ
し、0.15M NaCl、0.2％BSA、0.05％アジ化ナ
トリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて
展開溶出せしめ、その45〜52mlのフラクシヨン
を回収して、インスリン抗体−β−ガラクトシ
ダーゼ結合体の活性分画を得た（遊離β−ガラ
クトシダーゼ含量7.5％、活性収率82％）。
第１図は実施例１におけるインスリン−β−ガ
ラクトシダーゼ結合体を用いてなるインスリン含
有液体試料のインスリン定量曲線を示し、第２図
は実施例４におけるT3−β−ガラクトシダーゼ
結合体を用いてなるT3含有液体試料のT3定量曲
線を示した。
ラクトシダーゼ結合体を用いてなるインスリン含
有液体試料のインスリン定量曲線を示し、第２図
は実施例４におけるT3−β−ガラクトシダーゼ
結合体を用いてなるT3含有液体試料のT3定量曲
線を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記、一般式〔〕 A1−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−A2 〔〕 （ただし、式中、A1およびA2のいずれか一方は
酵素またはそのチオール化修飾誘導体のチオール
残基、他方は免疫関連物質またはそのチオール化
修飾誘導体のチオール残基、Ｘは炭素数２〜15分
子のスペーサー基を示す）で表わされる酵素−免
疫関連物質結合体を含有する免疫測定用組成物。 ２ 免疫関連物質が、ハプテン、抗原または受容
体である特許請求の範囲第１項記載の免疫測定用
組成物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4458979A JPS55136261A (en) | 1979-04-12 | 1979-04-12 | Novel compound and kit comprising it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4458979A JPS55136261A (en) | 1979-04-12 | 1979-04-12 | Novel compound and kit comprising it |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP28673687A Division JPS63152979A (ja) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | ジチオール基を有する試薬組成物 |
Publications (2)
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|---|---|
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ID=12695655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4458979A Granted JPS55136261A (en) | 1979-04-12 | 1979-04-12 | Novel compound and kit comprising it |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| ES2859923T3 (es) * | 2013-02-28 | 2021-10-04 | Univ Tufts | Compuestos de disulfuro para el suministro de agentes farmacéuticos |
Family Cites Families (2)
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-
1979
- 1979-04-12 JP JP4458979A patent/JPS55136261A/ja active Granted
Also Published As
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