JPH01149773A - 化学発光性環状ヒドラジドおよびその製法 - Google Patents
化学発光性環状ヒドラジドおよびその製法Info
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- JPH01149773A JPH01149773A JP63271907A JP27190788A JPH01149773A JP H01149773 A JPH01149773 A JP H01149773A JP 63271907 A JP63271907 A JP 63271907A JP 27190788 A JP27190788 A JP 27190788A JP H01149773 A JPH01149773 A JP H01149773A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は一般に、環状ヒドラジド化合物およびその製造
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化学発光性
フェナントレン環状ヒドラジド化合物およびその製造方
法に関する。
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化学発光性
フェナントレン環状ヒドラジド化合物およびその製造方
法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）化学
発光は、化学反応からの光の発生として定義することが
できる。化学発光反応のメカニズムについては、その詳
細は知られていないが、−船釣なメカニズムは以下のご
とく要約することができる［シュスター（Ｓｃｈｕｓｔ
ｅｒ）らのＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １８７〜２
３８（１９８４）参照］。
発光は、化学反応からの光の発生として定義することが
できる。化学発光反応のメカニズムについては、その詳
細は知られていないが、−船釣なメカニズムは以下のご
とく要約することができる［シュスター（Ｓｃｈｕｓｔ
ｅｒ）らのＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １８７〜２
３８（１９８４）参照］。
Ａ−＋Ｂ＊ → Ｂ＋ｈν
化合物Ａは化学反応を受けて（通常は酸化反応）電子的
に励起された状態の生成物（「Ｂ＊」）を生成する。こ
の生成物が基底状態（「Ｂ」）に戻るときに光（「ｈν
」）のかたちのエネルギーを放出する。
に励起された状態の生成物（「Ｂ＊」）を生成する。こ
の生成物が基底状態（「Ｂ」）に戻るときに光（「ｈν
」）のかたちのエネルギーを放出する。
化学発光は、池の方法か充分な感度を示さない分析化学
において種々の目的で用いられている。
において種々の目的で用いられている。
免疫診断において化学発光イムノアッセイ（ＣＬ＋Ａ）
は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素イムノ
アッセイ（Ｅ Ｉ Ａ）の感度に匹敵するかまたはそれ
らを上回るものである［キルツカ（Ｋｉｒｃｋａ）らの
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、上、４５〜
５２（１９８４）参照］。
は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素イムノ
アッセイ（Ｅ Ｉ Ａ）の感度に匹敵するかまたはそれ
らを上回るものである［キルツカ（Ｋｉｒｃｋａ）らの
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、上、４５〜
５２（１９８４）参照］。
多くの環状ヒドラジド化合物は化学発光性である。化学
発光性環状ヒドラジド化合物の例としては、ルミノール
、イソルミノールおよびそれらの誘導体が挙げられる。
発光性環状ヒドラジド化合物の例としては、ルミノール
、イソルミノールおよびそれらの誘導体が挙げられる。
他の例としては、ナフタレン１．２−ジカルボン酸ヒド
ラジドおよび７−アミツプチルエチルナフタレン１，２
−ジカルボン酸ヒドラジドがある。
ラジドおよび７−アミツプチルエチルナフタレン１，２
−ジカルボン酸ヒドラジドがある。
シ二レーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）らの英国特許出願
第２゜０２６、１５８号明細書およびバラクラ−（Ｂｕ
ｃｋｌｅｒ）らの米国特許第４．２２５．４８５号明細
書には、化学発光性のナフタレン１．２−ジカルボン酸
ヒドラジド、およびグンダーマン（Ｇｕｎｄｅｒｍａｎ
ｎ）らのＪｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｌ）ｉｇｓ Ａｎｎ、
Ｃｈｅｍ、、 １０．１８７３〜１８８８（１９７６）
に記載の手順に従って得られる７−アミノナフタレン−
１，２−ジカルボン酸ジメチルからの該化合物の合成が
記載されている。ここで開示されている化合物は、特異
的結合アッセイにおいてリガンドまたはその結合相手を
検出するための標識として用いられている。
第２゜０２６、１５８号明細書およびバラクラ−（Ｂｕ
ｃｋｌｅｒ）らの米国特許第４．２２５．４８５号明細
書には、化学発光性のナフタレン１．２−ジカルボン酸
ヒドラジド、およびグンダーマン（Ｇｕｎｄｅｒｍａｎ
ｎ）らのＪｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｌ）ｉｇｓ Ａｎｎ、
Ｃｈｅｍ、、 １０．１８７３〜１８８８（１９７６）
に記載の手順に従って得られる７−アミノナフタレン−
１，２−ジカルボン酸ジメチルからの該化合物の合成が
記載されている。ここで開示されている化合物は、特異
的結合アッセイにおいてリガンドまたはその結合相手を
検出するための標識として用いられている。
ワグナー−ヨーレッグ（Ｗａｇｎｅｒ−Ｊａｕｒｅｇｇ
）の５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８０，７６９〜７９８（
１９８０）およびジメント（Ｄｉｍｅｎｔ）らのＡｕ５
ｔ、 Ｊ、 Ｃｈｅｍ、、 ２２．１７２１〜３０（１
９６９）には天然クマリン誘導体であるキサンチレチン
およびキサントキシレチンをアセチレンジカルボン酸ジ
メチルと反応させてベンゾクマリンを得ることが開示さ
れている。
）の５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８０，７６９〜７９８（
１９８０）およびジメント（Ｄｉｍｅｎｔ）らのＡｕ５
ｔ、 Ｊ、 Ｃｈｅｍ、、 ２２．１７２１〜３０（１
９６９）には天然クマリン誘導体であるキサンチレチン
およびキサントキシレチンをアセチレンジカルボン酸ジ
メチルと反応させてベンゾクマリンを得ることが開示さ
れている。
上記式中、Ｘは牛すンチレチンについてはＨ１牛サント
キシレチンについてはＯＣＨ３である。この反応は、デ
ィールス−アルダ−反応の一種として記載されている。
キシレチンについてはＯＣＨ３である。この反応は、デ
ィールス−アルダ−反応の一種として記載されている。
ワグナ−〜ヨーレッグの５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 １９
８０．７６９〜７９８（１９８０）およびアクソン（Ａ
ｃｈｅｓｏｎ）のＪ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、 （Ｃ）
％ １隻昼旦、３８７（１９６８）には、２−ビニルピ
ロリドンをアセチレンジカルボン酸エステルと反応させ
て下記化合物を得ることが開示されている。
８０．７６９〜７９８（１９８０）およびアクソン（Ａ
ｃｈｅｓｏｎ）のＪ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、 （Ｃ）
％ １隻昼旦、３８７（１９６８）には、２−ビニルピ
ロリドンをアセチレンジカルボン酸エステルと反応させ
て下記化合物を得ることが開示されている。
グンダーマンらのＪｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇｓ 八ｎ
ｎ、 Ｃｈｅｍ、。
ｎ、 Ｃｈｅｍ、。
■、１８７３〜１８８８（１９６７）には、非プロトン
酸化系でルミノールの２倍〜３倍の化学発光性量子収率
を有する７−および８−アミノ置換ナフト［２，３−ｇ
］フタルアジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）−ジオンが開示
されている。とりわけ、２，３−ジヒドロナフト［２，
３−ｆ］フタルアジン−１゜４−ジオンが記載されてい
る。
酸化系でルミノールの２倍〜３倍の化学発光性量子収率
を有する７−および８−アミノ置換ナフト［２，３−ｇ
］フタルアジン−１，４（２Ｈ，３Ｈ）−ジオンが開示
されている。とりわけ、２，３−ジヒドロナフト［２，
３−ｆ］フタルアジン−１゜４−ジオンが記載されてい
る。
ザウアー（Ｓ ａｕｅｒ）のＡｎｇｅｗ、 Ｃｈｅｍ、
Ｉｎｔｅｒｎａｔ、 Ｅｄｉｔ、、５．２１ １〜
２２３（１９６６）、リード（Ｒｅｅｄ）らのＴｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、３土（７）、２１８８〜２１９１（１９６９）
およびザンダーマン（Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ）らのＴｅ
ｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ。
Ｉｎｔｅｒｎａｔ、 Ｅｄｉｔ、、５．２１ １〜
２２３（１９６６）、リード（Ｒｅｅｄ）らのＴｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、３土（７）、２１８８〜２１９１（１９６９）
およびザンダーマン（Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ）らのＴｅ
ｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ。
Ｎｏ、 １９．１２６７〜１２６８（１９６３）にもま
たアセチレンを用いるものを含むディールス−アルダ−
反応の一種が記載されている。
たアセチレンを用いるものを含むディールス−アルダ−
反応の一種が記載されている。
（課題を解決するための手段）
本発明による環状化合物の環状ヒドラジド化合物の製造
方法には、環状化合物のエチレン置換体にα、ω−アセ
チレンジカルボン酸エステルヲ加えて環状化合物の環状
ジカルボキシレートを生成させ、ついでこの環状ジカル
ボキシレートをヒドラジドと反応させて環状ヒドラジド
化合物を得ることが含まれる。
方法には、環状化合物のエチレン置換体にα、ω−アセ
チレンジカルボン酸エステルヲ加えて環状化合物の環状
ジカルボキシレートを生成させ、ついでこの環状ジカル
ボキシレートをヒドラジドと反応させて環状ヒドラジド
化合物を得ることが含まれる。
本発明による結合体は、本発明の化学発光性化合物に抗
体、ハプテン、抗原またはポリヌクレオチド（たとえば
ＤＮＡやＲＮＡ）を共有結合的に結合させることにより
得られる。化学発光アッセイを行う方法は、本発明の結
合体に特に反応性の物質、たとえば特異的抗原、特異的
抗体または相補的ポリヌクレオチド（すなわち本発明の
ポリヌクレオチド結合体と配列特異的水素結合を生成す
るポリヌクレオチド）の存在を検出するために、試験し
ようとする試料を本発明の結合体に接触させる工程から
なる。
体、ハプテン、抗原またはポリヌクレオチド（たとえば
ＤＮＡやＲＮＡ）を共有結合的に結合させることにより
得られる。化学発光アッセイを行う方法は、本発明の結
合体に特に反応性の物質、たとえば特異的抗原、特異的
抗体または相補的ポリヌクレオチド（すなわち本発明の
ポリヌクレオチド結合体と配列特異的水素結合を生成す
るポリヌクレオチド）の存在を検出するために、試験し
ようとする試料を本発明の結合体に接触させる工程から
なる。
本発明のフェナントレン環状ヒドラジド化合物は、下記
式で示される化合物であって、式中、Ｒ。
式で示される化合物であって、式中、Ｒ。
およびＲ１はそれぞれ独立に−Ｈ，−ＣＨ３または−Ｃ
Ｈ２ＣＨ３である化合物、Ｒ，が−ＨでＲ３が−（ＣＨ
２）ｎＳ Ｏ、Ｈ（式中、ｎは３または４である）であ
る化合物、Ｒ１およびＲ２が−（ＣＨ２）ｎＳ Ｏ３Ｈ
（式中、ｎは前記と同じ）である化合物、およびＲ３が
−ＣＨ，、−ＣＨ２ＣＨ３または−（ＣＨ、）ｎＳ Ｏ
。
Ｈ２ＣＨ３である化合物、Ｒ，が−ＨでＲ３が−（ＣＨ
２）ｎＳ Ｏ、Ｈ（式中、ｎは３または４である）であ
る化合物、Ｒ１およびＲ２が−（ＣＨ２）ｎＳ Ｏ３Ｈ
（式中、ｎは前記と同じ）である化合物、およびＲ３が
−ＣＨ，、−ＣＨ２ＣＨ３または−（ＣＨ、）ｎＳ Ｏ
。
Ｈ（ｎは前記と同じ）でＲ２が−（ＣＨ２）ｍ ＮＨ
Ｃ−Ｌ（式中、ｍは２〜８の整数、Ｌは抗原、タンパク
質、ポリペプチド、ハプテン、抗体、ホルモン、ビタミ
ン、医薬または核酸プローブのような特異的に結合し得
るリガンドである）である化合物よりなる群から選ばれ
た化合物である。
Ｃ−Ｌ（式中、ｍは２〜８の整数、Ｌは抗原、タンパク
質、ポリペプチド、ハプテン、抗体、ホルモン、ビタミ
ン、医薬または核酸プローブのような特異的に結合し得
るリガンドである）である化合物よりなる群から選ばれ
た化合物である。
加えて、このナフタレン環状ヒドラジド化合物は、米国
特許第４．５９８．０４４号明細書に記載されている種
類のアッセイに用いることもできる。
特許第４．５９８．０４４号明細書に記載されている種
類のアッセイに用いることもできる。
（発明の概要）
本発明のフェナントレン環状ヒトランドおよびその誘導
体は化学発光性化合物であり、たいていの知られた環状
ヒドラジドのものよりも長い放出波長を有している。本
発明のフェナントレン環状ヒドラジド化合物は、化学発
光イムノアッセイにおいて標識として用いることができ
る。本発明の新規なフェナントレン環状ヒドラジド化合
物および他の知られた環状ヒドラジド化合物を製造する
方法の手順は簡単であり、従来の他の手順によるよりも
大きな収量かつ短時間で環状ヒドラジド化合物を得るこ
とができる。たとえばグンターマンらは７−および８−
アミノ置換ナフト［２，３−ｇ］フタルアジン−１，４
−（２Ｈ，４Ｈ）−ジオンを８工ｉで合成することを開
示しているが［Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ
、 Ｃｈｅｍ、 、±０，１８７３〜１８８８（１９７
６）参照］、フェナントレン環状ヒドラジド化合物につ
いてではなく、該化合物は本件出願において記載される
。
体は化学発光性化合物であり、たいていの知られた環状
ヒドラジドのものよりも長い放出波長を有している。本
発明のフェナントレン環状ヒドラジド化合物は、化学発
光イムノアッセイにおいて標識として用いることができ
る。本発明の新規なフェナントレン環状ヒドラジド化合
物および他の知られた環状ヒドラジド化合物を製造する
方法の手順は簡単であり、従来の他の手順によるよりも
大きな収量かつ短時間で環状ヒドラジド化合物を得るこ
とができる。たとえばグンターマンらは７−および８−
アミノ置換ナフト［２，３−ｇ］フタルアジン−１，４
−（２Ｈ，４Ｈ）−ジオンを８工ｉで合成することを開
示しているが［Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ
、 Ｃｈｅｍ、 、±０，１８７３〜１８８８（１９７
６）参照］、フェナントレン環状ヒドラジド化合物につ
いてではなく、該化合物は本件出願において記載される
。
グンダーマンらのＪｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎ
ｎ、 Ｃｈｅｍ、、昼旦４，１２７（１９６５）および
米国特許第４，２２６、９２２号明細書には、アミノ官
能化ナフタレン１゜２−ジカルボン酸ヒドラジド（化合
物■、下記実施例６に記載された化合物）を１２工程で
合成する手順が記載されている。
ｎ、 Ｃｈｅｍ、、昼旦４，１２７（１９６５）および
米国特許第４，２２６、９２２号明細書には、アミノ官
能化ナフタレン１゜２−ジカルボン酸ヒドラジド（化合
物■、下記実施例６に記載された化合物）を１２工程で
合成する手順が記載されている。
反応式Ｉ
ＭｅＯ＠→ＭｅＯＧＣＯＣＩＩ、ＣＩ、Ｃ００ＩＩ Ｔ
■ ＭｅＯ００ＣＨｚＣ１ｌｚＣＨ２ＣＯＯＨ−’ｒ Ｍｅ
Ｏ＠）−Ｃ１１２Ｃ１１２ＣＨ２ＣＯＯＣＩＬ＋本発明
の合成反応により化合物■およびその異性体を一層大き
な収量で、しかもはるかに短時間で合成することができ
、また合成工程数を１２から５に減少させることもでき
る。
■ ＭｅＯ００ＣＨｚＣ１ｌｚＣＨ２ＣＯＯＨ−’ｒ Ｍｅ
Ｏ＠）−Ｃ１１２Ｃ１１２ＣＨ２ＣＯＯＣＩＬ＋本発明
の合成反応により化合物■およびその異性体を一層大き
な収量で、しかもはるかに短時間で合成することができ
、また合成工程数を１２から５に減少させることもでき
る。
（■） ０
（ＩＸ） ０
最後に実施例３および８に記載した化合物■または化合
物■のジアルキル誘導体をヒドラジドと反応させて、実
施例６および１１に記載した環状ヒドラジド化合物のア
ミン誘導体く化合物■および化合物ＩＸ）を得る。
物■のジアルキル誘導体をヒドラジドと反応させて、実
施例６および１１に記載した環状ヒドラジド化合物のア
ミン誘導体く化合物■および化合物ＩＸ）を得る。
抗体を標識するのに他の方法を用いることもできるが、
Ｎ Ｉ（Ｓ活性化法が現在のところ好ましい。
Ｎ Ｉ（Ｓ活性化法が現在のところ好ましい。
本発明に従ってよく機能し得る他の物質には、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片（以
下、これらは「抗体」なる−船釣な語に含まれるものと
する）、ハブテン、抗原、核酸プローブ、および結合タ
ンパク質（たとえば葉酸結合タンパク質、およびビタミ
ンＢ１２に結合する内因子）がある。
ーナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ抗体断片（以
下、これらは「抗体」なる−船釣な語に含まれるものと
する）、ハブテン、抗原、核酸プローブ、および結合タ
ンパク質（たとえば葉酸結合タンパク質、およびビタミ
ンＢ１２に結合する内因子）がある。
つぎに実施例に基ついて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。
が、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１〜６には、本発明によるアミ／官能化フェナン
トレン環状ヒトラント化合物の合成を記載している（下
記、反応弐■参照）。
トレン環状ヒトラント化合物の合成を記載している（下
記、反応弐■参照）。
反応式■
（ｒＶ）
（■）０
実施例７〜１１には、本発明によるアミノ官能化ナフタ
レン１．２−ジカルボン酸ヒドラジドの合成が記載され
ている（前記反応式■参照）。実施例１２は、本発明に
よる他のアミン官能化フェナントレン環状ヒドラジド化
合物の合成に関するものである。実施例１３には、本発
明による化合物の活性エステルの調製を記載しており、
実施例１４および１５は活性エステルの抗体への結合に
関するものである。実施例１６には、本発明による化学
発光イムノア１セイ（ＣＬ Ｉ Ａ）を記載してい実施
例１（化合物Ｉの調製） ニトロベンゼン（２００ｍＣ）中の２−ビニルナフタレ
ン［アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ、、 ＭｉｌｗａｕｋｅｅＳＷｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）社製］（１０，０９）およびアセチレンジ
カルボン酸ジメチル（アルドリッチ・ケミカル社製）（
９，７ＬｉＩ）の溶液を１６時間還流した。混合物を高
真空下で蒸留してニトロベンゼンおよび未反応出発物質
を除いた。茶色の残渣ヲ酸化アルミニウムカラム（中性
）のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼンで溶出した。
レン１．２−ジカルボン酸ヒドラジドの合成が記載され
ている（前記反応式■参照）。実施例１２は、本発明に
よる他のアミン官能化フェナントレン環状ヒドラジド化
合物の合成に関するものである。実施例１３には、本発
明による化合物の活性エステルの調製を記載しており、
実施例１４および１５は活性エステルの抗体への結合に
関するものである。実施例１６には、本発明による化学
発光イムノア１セイ（ＣＬ Ｉ Ａ）を記載してい実施
例１（化合物Ｉの調製） ニトロベンゼン（２００ｍＣ）中の２−ビニルナフタレ
ン［アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ、、 ＭｉｌｗａｕｋｅｅＳＷｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ）社製］（１０，０９）およびアセチレンジ
カルボン酸ジメチル（アルドリッチ・ケミカル社製）（
９，７ＬｉＩ）の溶液を１６時間還流した。混合物を高
真空下で蒸留してニトロベンゼンおよび未反応出発物質
を除いた。茶色の残渣ヲ酸化アルミニウムカラム（中性
）のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼンで溶出した。
溶出速度の速い黄色の溶液を集め、蒸発させてフェナン
トレン−１２−ジカルボキシレート（化合物Ｉ）（６ｇ
）を得た。この化合物のマススペクトルを測定したとこ
ろ以下のようであった。
トレン−１２−ジカルボキシレート（化合物Ｉ）（６ｇ
）を得た。この化合物のマススペクトルを測定したとこ
ろ以下のようであった。
Ｍ ／ ｅ ： ビークは２９４ ［Ｍ］＋および２
６３ ［Ｍ＋フイナス０−ＣＨ３］である（特定の位置
での（すなわちＭ／ｅでの）マススペクトルにおけるベ
ースピーク（Ｍ÷）として）。
６３ ［Ｍ＋フイナス０−ＣＨ３］である（特定の位置
での（すなわちＭ／ｅでの）マススペクトルにおけるベ
ースピーク（Ｍ÷）として）。
実施例２（化合物Ｈの調製）
実施例１で得た化合物１（４，２ｇ、１４．３ミリモル
）を大過剰量の無水トリフルオロ酢酸に溶解し、溶液を
水浴でＯ′Ｃに冷却した。濃硝酸の溶液（１７，１ミリ
モル）をスポイトにて滴下した。反応混合物をＯ′Ｃで
６時間保ち、ついで室温で一夜撹拌した。溶媒を除くと
茶色の油が残った。この粗製の油をシリカゲル［イー・
メルク（Ｅ、 Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタット、西ド
イツ］カラム上のクロマトグラフィーにかけ、ＣＨＣｌ
３で溶出した。黄色のフラクションを集め、蒸発させて
９−ニトロフェナントレン−１，２−ジカルボキシレー
ト（化合物■）を得た。化合物のマススペクトルは、Ｍ
／ｅ−３３９［Ｍ＋］であった。
）を大過剰量の無水トリフルオロ酢酸に溶解し、溶液を
水浴でＯ′Ｃに冷却した。濃硝酸の溶液（１７，１ミリ
モル）をスポイトにて滴下した。反応混合物をＯ′Ｃで
６時間保ち、ついで室温で一夜撹拌した。溶媒を除くと
茶色の油が残った。この粗製の油をシリカゲル［イー・
メルク（Ｅ、 Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタット、西ド
イツ］カラム上のクロマトグラフィーにかけ、ＣＨＣｌ
３で溶出した。黄色のフラクションを集め、蒸発させて
９−ニトロフェナントレン−１，２−ジカルボキシレー
ト（化合物■）を得た。化合物のマススペクトルは、Ｍ
／ｅ−３３９［Ｍ＋］であった。
実施例３（化合物■の調製）
実施例２で得た化合物■を無水エタノール中に溶解し、
炭素上の１０％Ｐｄ触媒（１００Ｉｌ＋９）を加えた。
炭素上の１０％Ｐｄ触媒（１００Ｉｌ＋９）を加えた。
混合物を室温、初期圧力２気圧で約６時間水素添加した
。ついて得られた溶液を誘過して触媒を除いた。溶媒を
蒸発させると９−アミノフェナントレン−１，２−ジカ
ルボキシレート（化合物■）が得られた。化合物のマス
スペクトルは、Ｍ／ｅ＝ ３０９ ［Ｍ＋］であった。
。ついて得られた溶液を誘過して触媒を除いた。溶媒を
蒸発させると９−アミノフェナントレン−１，２−ジカ
ルボキシレート（化合物■）が得られた。化合物のマス
スペクトルは、Ｍ／ｅ＝ ３０９ ［Ｍ＋］であった。
実施例４（化合物■の調製）
グンダーマンらのＪｅｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ’ ｓ
Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ、 ６８４．
ｌ ２７（１９６５）記載の手順に従い、２，２．２
−トリフルオロエタノール（５００ｍの中の化合物■（
５９，１６ミリモル）およびＮ−（４−ブロモブチル）
フタルイミド（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオー
キー、ライスコンシン）（４，６ｙ）の溶液を窒素ガス
雰囲気下で２４時間還流した。溶媒を蒸発させると暗赤
色の残渣が得られた。この暗赤色の残渣をシリカゲル（
イー・メルク、ダルムシュタット、西ドイツ）カラム上
のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼンとメタノールの
混合物（１９：Ｌ ｖ／ｖ）で溶出した。急速に移動す
る赤色のバンドを集め、蒸発させて９−［４−（フタル
イミド）ブチルコアミノフェナントレン−１，２−ジカ
ルボキシレート（化合物■）を得た。化合物のマススペ
クトルは、Ｍ／ｅ＝５１０［Ｍ＋］てあった。
Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ、 ６８４．
ｌ ２７（１９６５）記載の手順に従い、２，２．２
−トリフルオロエタノール（５００ｍの中の化合物■（
５９，１６ミリモル）およびＮ−（４−ブロモブチル）
フタルイミド（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオー
キー、ライスコンシン）（４，６ｙ）の溶液を窒素ガス
雰囲気下で２４時間還流した。溶媒を蒸発させると暗赤
色の残渣が得られた。この暗赤色の残渣をシリカゲル（
イー・メルク、ダルムシュタット、西ドイツ）カラム上
のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼンとメタノールの
混合物（１９：Ｌ ｖ／ｖ）で溶出した。急速に移動す
る赤色のバンドを集め、蒸発させて９−［４−（フタル
イミド）ブチルコアミノフェナントレン−１，２−ジカ
ルボキシレート（化合物■）を得た。化合物のマススペ
クトルは、Ｍ／ｅ＝５１０［Ｍ＋］てあった。
実施例５（化合物■の調製）
実施例４で得た化合物■およびジエチルサルフェ−１−
（１０ｘ１２）の溶液を窒素雰囲気下、１３０°Ｃで２
４時間加熱した。得られた暗赤色の溶液を炭酸水素ナト
リウムの冷飽和水溶液中に注いだ。この混合物をＣＨＣ
ｌ３（２００ｍ□で３回抽出した。ＣＨＣ１３抽出物を
集め、乾燥し、蒸発させて赤色の油を得た。この油をシ
リカゲルカラム上のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼ
ンとメタノールの混合物（２０： １、ｖ／ｖ）で溶出
した。急速に移動するバンドを集め、蒸発させて９−（
Ｎ−エチル−Ｎ−（４−フタルイミド）ブチル）アミノ
フェナントレン−１，２−ジカルボキシレート（化合物
■）を得た。化合物のマススペクトルは、Ｍ／ｅ＝５３
８［Ｍ＋］であった。
（１０ｘ１２）の溶液を窒素雰囲気下、１３０°Ｃで２
４時間加熱した。得られた暗赤色の溶液を炭酸水素ナト
リウムの冷飽和水溶液中に注いだ。この混合物をＣＨＣ
ｌ３（２００ｍ□で３回抽出した。ＣＨＣ１３抽出物を
集め、乾燥し、蒸発させて赤色の油を得た。この油をシ
リカゲルカラム上のクロマトグラフィーにかけ、ベンゼ
ンとメタノールの混合物（２０： １、ｖ／ｖ）で溶出
した。急速に移動するバンドを集め、蒸発させて９−（
Ｎ−エチル−Ｎ−（４−フタルイミド）ブチル）アミノ
フェナントレン−１，２−ジカルボキシレート（化合物
■）を得た。化合物のマススペクトルは、Ｍ／ｅ＝５３
８［Ｍ＋］であった。
実施例６（化合物■の調製）
実施例５て得た化合物Ｖ（１ｇ）、ヒドランン（５ｍの
およびエタノール（２０ｍのを一夜還流した。
およびエタノール（２０ｍのを一夜還流した。
冷却し、反応混合物を蒸発乾固し、固体残渣を高真空下
で一夜乾燥させた。残渣をシリカゲル（イ−・メルク、
ダルムシュタット、西ドイツ）カラム上のクロマトグラ
フィーにかけ、エタノールと１Ｍ炭酸水素トリエチルア
ミン（ｐＨ７、３）との混合物（７・３、ｖ／ｖ）で溶
出した。主要なフラクションを果め、蒸発させてオレン
ジ−黄色の固体（化合物■）を得た。
で一夜乾燥させた。残渣をシリカゲル（イ−・メルク、
ダルムシュタット、西ドイツ）カラム上のクロマトグラ
フィーにかけ、エタノールと１Ｍ炭酸水素トリエチルア
ミン（ｐＨ７、３）との混合物（７・３、ｖ／ｖ）で溶
出した。主要なフラクションを果め、蒸発させてオレン
ジ−黄色の固体（化合物■）を得た。
化学発光を光子計数ルミノメータ−（ｌ ｕｍ ｉｎｏ
ｍｅｔｅｒ）で測定した。光の産出ｈ１を全光子カウン
トとして記録し、これから各化合物の有効性をカウント
１モルとして計算した。光子計数の有効性は器具に依存
したものなので、これらの数値は相対的なしのである。
ｍｅｔｅｒ）で測定した。光の産出ｈ１を全光子カウン
トとして記録し、これから各化合物の有効性をカウント
１モルとして計算した。光子計数の有効性は器具に依存
したものなので、これらの数値は相対的なしのである。
このフェナントレン環状ヒドラジド誘導体の放射波長は
、６００ｎｍ以上の領域に及んだ。
、６００ｎｍ以上の領域に及んだ。
試験しようとする化学発光性化合物（１ｍ９）をキュベ
ツト中でＤＭＦ（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオ
ーキー、ライスコンシン）（１ｍＱ）に溶解した。この
ストック溶液をさらに０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７，０
）で濃度約１０−６〜１０−’Ｍに希釈し、化学発光性
化合物のアリコート（ｌＯμの、触媒（１０μＩ２）［
すなわち約１０−１３Ｍの濃度のミクロペルオキシダー
ゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（シグマ・ケミ
カル社、セント・ルイス、ミズーリ製）］またはバナジ
ウム■触媒（ＶＩＶ）（０，３ｘｙ／ｘのまたは他の金
属イオン（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー
、ミズーリ）を混合した。キュベツトを光子計数ルミノ
メータ−中に挿入し、０．２５Ｎ ＮａＯＨ中の３％
Ｈ，Ｏ３溶液（１００μのを反応キュベツト中に注入し
た。注入後直ちに放出された光を２秒間測定した。
ツト中でＤＭＦ（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオ
ーキー、ライスコンシン）（１ｍＱ）に溶解した。この
ストック溶液をさらに０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７，０
）で濃度約１０−６〜１０−’Ｍに希釈し、化学発光性
化合物のアリコート（ｌＯμの、触媒（１０μＩ２）［
すなわち約１０−１３Ｍの濃度のミクロペルオキシダー
ゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（シグマ・ケミ
カル社、セント・ルイス、ミズーリ製）］またはバナジ
ウム■触媒（ＶＩＶ）（０，３ｘｙ／ｘのまたは他の金
属イオン（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー
、ミズーリ）を混合した。キュベツトを光子計数ルミノ
メータ−中に挿入し、０．２５Ｎ ＮａＯＨ中の３％
Ｈ，Ｏ３溶液（１００μのを反応キュベツト中に注入し
た。注入後直ちに放出された光を２秒間測定した。
化学発光性化合物の有効性は、ｐＨ１溶媒および触媒濃
度に依存する。そのような化合物の有効性は、通常１０
′７〜１０′９力ウント１モルの範囲である。
度に依存する。そのような化合物の有効性は、通常１０
′７〜１０′９力ウント１モルの範囲である。
実施例７（化合物■の調製）
ニトロベンゼン（２００ｍＱ＞中の４−ニトロスチレン
［フェアフィールド・ケミカル（Ｆ ａｉｒｆ １ｅｌ
ｄＣｈｅｍ、 Ｇ ｏ、 、 ）社、プリスウノド、
南カロライナ］（１５ｙ）およびジメチルアセチレンジ
カルボキシレート（１４，２９９）の溶液を２４時間還
流した。
［フェアフィールド・ケミカル（Ｆ ａｉｒｆ １ｅｌ
ｄＣｈｅｍ、 Ｇ ｏ、 、 ）社、プリスウノド、
南カロライナ］（１５ｙ）およびジメチルアセチレンジ
カルボキシレート（１４，２９９）の溶液を２４時間還
流した。
過剰の溶媒を高真空蒸留により除いた。得られた暗色の
残渣を酸化アルミナ（中性）カラム上のクロマトグラフ
ィーにかけ、ベンゼンで溶出した。溶出した黄色の溶液
を集め、蒸発させて９５％の純粋な７−ニドロナフタレ
ンー１，２−ジカルボキシレート（化合物■）（６ｇ）
を得た。化合物のマススペクトルはＭ／ ｅ＝ ２８９
［Ｍ＋］であった。
残渣を酸化アルミナ（中性）カラム上のクロマトグラフ
ィーにかけ、ベンゼンで溶出した。溶出した黄色の溶液
を集め、蒸発させて９５％の純粋な７−ニドロナフタレ
ンー１，２−ジカルボキシレート（化合物■）（６ｇ）
を得た。化合物のマススペクトルはＭ／ ｅ＝ ２８９
［Ｍ＋］であった。
祖鮒旦（化合物■の調製）
実施例７で得た化合物■（６９）を無水エタノール（２
５０ｘの中に溶解し、炭素上の１０％Ｐｄ（１００ｆｆ
ｇ）を加えた。得られた溶液を、Ｈ２の取り込みが終わ
るまで初期圧力２気圧にて６時間水素添加した。得られ
た非常に蛍光性の高い溶液を詞過して炭素を除いた。溶
液を蒸発させて７−アミノナフタレン−１，２−ジカル
ボキシレート（化合物■）を得た。化合物のマススペク
トルはＭ／ｅ＝２５９ ［Ｍ＋］であった。
５０ｘの中に溶解し、炭素上の１０％Ｐｄ（１００ｆｆ
ｇ）を加えた。得られた溶液を、Ｈ２の取り込みが終わ
るまで初期圧力２気圧にて６時間水素添加した。得られ
た非常に蛍光性の高い溶液を詞過して炭素を除いた。溶
液を蒸発させて７−アミノナフタレン−１，２−ジカル
ボキシレート（化合物■）を得た。化合物のマススペク
トルはＭ／ｅ＝２５９ ［Ｍ＋］であった。
実施例９（化合物■Ｘの調製）
実施例８て得た化合物■（１，７ｙ）、Ｎ−（４−ブロ
モブチル）フタルイミド（アルドリッチ・ケミカル社、
ミルウオーキー、ライスコンシン）および２，２．２−
）リフルオロエタノール（２Ｃ）＋のからなる溶液をＮ
、雰囲気下で２４時間還流した。
モブチル）フタルイミド（アルドリッチ・ケミカル社、
ミルウオーキー、ライスコンシン）および２，２．２−
）リフルオロエタノール（２Ｃ）＋のからなる溶液をＮ
、雰囲気下で２４時間還流した。
溶液を蒸発させて暗色の残渣を得た。水／エーテル（２
５０ｘＱ／ ５００＋Ｎ）ノ溶液を加え、エーテル層を
分離し、乾燥し、蒸発乾固して赤色の油を得た。この赤
色の油をシリカゲル（イー・メルク社、ダルムシュタッ
ト、西ドイツ）カラム上のクロマトグラフィーにかけ、
ベンゼンとメタノールとの混合物（１８：１、ｖ／ｖ）
で溶出した。得られた黄色のフラクションを集め、蒸発
させて赤色の油を得た。この油は７−［４−Ｎ−（フタ
ルイミド）ブチルコアミノナフタレン−１，２−ジカル
ボキシレート（化合物ＩＸ）であり、そのマススペクト
ルはＭ／ｅ＝ ４６０ ［Ｍ＋］であった。
５０ｘＱ／ ５００＋Ｎ）ノ溶液を加え、エーテル層を
分離し、乾燥し、蒸発乾固して赤色の油を得た。この赤
色の油をシリカゲル（イー・メルク社、ダルムシュタッ
ト、西ドイツ）カラム上のクロマトグラフィーにかけ、
ベンゼンとメタノールとの混合物（１８：１、ｖ／ｖ）
で溶出した。得られた黄色のフラクションを集め、蒸発
させて赤色の油を得た。この油は７−［４−Ｎ−（フタ
ルイミド）ブチルコアミノナフタレン−１，２−ジカル
ボキシレート（化合物ＩＸ）であり、そのマススペクト
ルはＭ／ｅ＝ ４６０ ［Ｍ＋］であった。
実施例１０（化合物Ｘの調製）
実施例９で得た化合物ＩＸを大過剰のヨードエタンに加
えた。過剰のヨードエタンを蒸発させて赤色の油を得た
。粗製の赤色の油をシリカゲル（イー・メルク社、ダル
ムシュタット、西ドイツ）カラム上のクロマトグラフィ
ーにかけ、ベンゼンとメタノールとの混合物（１９／１
、ｖ／ｖ）で溶出した。得られた黄色のフラクションを
集め、蒸発させて７−（Ｎ−エチル−Ｎ−［４−（Ｎ−
フタルイミド）ブチルコアミノ）ナフタレン−１，２−
ジカルボキシレート（化合物Ｘ）を得た。化合物のマス
スペクトルは、Ｍ／ ｅ＝ ４８８ ［Ｍ ＋］であっ
た。
えた。過剰のヨードエタンを蒸発させて赤色の油を得た
。粗製の赤色の油をシリカゲル（イー・メルク社、ダル
ムシュタット、西ドイツ）カラム上のクロマトグラフィ
ーにかけ、ベンゼンとメタノールとの混合物（１９／１
、ｖ／ｖ）で溶出した。得られた黄色のフラクションを
集め、蒸発させて７−（Ｎ−エチル−Ｎ−［４−（Ｎ−
フタルイミド）ブチルコアミノ）ナフタレン−１，２−
ジカルボキシレート（化合物Ｘ）を得た。化合物のマス
スペクトルは、Ｍ／ ｅ＝ ４８８ ［Ｍ ＋］であっ
た。
実施例１１（化合物■の調製）
実施例１０で得た化合物Ｘ（４９）を２５０′／ＩＱ容
丸底フラスコに入れ、これにＮＨ，ＮＨ７（１０ｒｔｒ
（１’）およびエタノール（１００ｆｆｌ（２）を加え
た。得られた溶液を一夜還流した。冷却すると同時に溶
液を蒸発乾固して黄色の溶液を得た。粗製の固体を乾燥
ピリジンから再結晶させ、黄色の固体を集めて７−［Ｎ
−アミノブチル−Ｎ−エチルコアミノナフタレン−１，
２−ジカルボン酸ヒドラジド（化合物Ｍ）を得た。
丸底フラスコに入れ、これにＮＨ，ＮＨ７（１０ｒｔｒ
（１’）およびエタノール（１００ｆｆｌ（２）を加え
た。得られた溶液を一夜還流した。冷却すると同時に溶
液を蒸発乾固して黄色の溶液を得た。粗製の固体を乾燥
ピリジンから再結晶させ、黄色の固体を集めて７−［Ｎ
−アミノブチル−Ｎ−エチルコアミノナフタレン−１，
２−ジカルボン酸ヒドラジド（化合物Ｍ）を得た。
実施例１２
化合物ＩＩＩ（５００ｍｇ、１．６ミリモル）および１
゜３−プロパンスルトン（アルドリッチ・ケミカル社、
ミルウオーキー、ライスコンシン）（０，７９９）を１
３０°Ｃに４時間加熱した後、反応混合物を放置して室
温に冷却した。残渣をベンセンで洗浄しテ過剰の１，３
−プロパンスルトンを除き、ついで得られたアミド固体
を蒸発乾固させて過剰の溶媒をすべて除いた。得られた
物質にＮ）ｌ、ＮＨ，（２ｘ（２）およびエタノール（
Ｉ Ｑｍのを加えた。混合物を一夜還流した。冷却後、
溶液を蒸発乾固して９−（ジプロパンスルホン酸）アミ
ノフェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドを
得た。化合物ノマススヘクトルは、Ｍ／ ｅ＝ ５２２
［Ｍ ＋Ｈ］であった。
゜３−プロパンスルトン（アルドリッチ・ケミカル社、
ミルウオーキー、ライスコンシン）（０，７９９）を１
３０°Ｃに４時間加熱した後、反応混合物を放置して室
温に冷却した。残渣をベンセンで洗浄しテ過剰の１，３
−プロパンスルトンを除き、ついで得られたアミド固体
を蒸発乾固させて過剰の溶媒をすべて除いた。得られた
物質にＮ）ｌ、ＮＨ，（２ｘ（２）およびエタノール（
Ｉ Ｑｍのを加えた。混合物を一夜還流した。冷却後、
溶液を蒸発乾固して９−（ジプロパンスルホン酸）アミ
ノフェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドを
得た。化合物ノマススヘクトルは、Ｍ／ ｅ＝ ５２２
［Ｍ ＋Ｈ］であった。
実施例１３
化合物■またはＸ［（１００ｍｙ）および無水コノ・り
酸（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライ
スコンシン）（１等モル）を乾燥ピリジン（アルドリッ
チ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコンシン）中
、室温にて撹拌した。反応は薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）（ＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ−２：１）でモニター
した。Ｒｆ値か０．５５の黄色のバンドをプレパラティ
ブＴＬＣにより単離して化合物■またはＭのヘミスクシ
ネートとして黄色の固体（４５ｘｇ）を得た。このヘミ
スクシネート（ｔｍｙ）ヲ乾燥ＤＭＦ（アルドリッチ・
ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコンシン）中に再
溶解し、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，ア
ルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコン
シン）（１等モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（Ｎ ＨＳ 、アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオ
ーキー、ライスコンシン）（ｌｉモル）を加えた。混合
物を室温にて一夜撹拌して活性エステルを生成した。
酸（アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライ
スコンシン）（１等モル）を乾燥ピリジン（アルドリッ
チ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコンシン）中
、室温にて撹拌した。反応は薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）（ＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ−２：１）でモニター
した。Ｒｆ値か０．５５の黄色のバンドをプレパラティ
ブＴＬＣにより単離して化合物■またはＭのヘミスクシ
ネートとして黄色の固体（４５ｘｇ）を得た。このヘミ
スクシネート（ｔｍｙ）ヲ乾燥ＤＭＦ（アルドリッチ・
ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコンシン）中に再
溶解し、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，ア
ルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー、ライスコン
シン）（１等モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（Ｎ ＨＳ 、アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオ
ーキー、ライスコンシン）（ｌｉモル）を加えた。混合
物を室温にて一夜撹拌して活性エステルを生成した。
実施例１４
ウサギＩｇＧ（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミ
ズーリ）（１１１ｇ）を、１％ツイーンを含有するＯ、
１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中に溶解した。実施例
１３で得た活性エステルの溶液（３５μのを常に撹拌し
ながら加えた。反応を６時間進行させた。混合物をファ
ルマシア社、ビスカドウェー、ニューシャーシーから入
手可能なセファデックスＧ−２５（１０ｃｍＸ０．７５
ｃｒり上でのクロマトグラフィーにかけ、Ｏ，］Ｍ
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で溶出した。標識結合体は、か
すかに黄色がかった蛍光バンドとして溶出した。１票識
タンパク質は、Ｂｌｏ−３ｉｌ ＴＳＫ−２５０カラ
ム（バイオラド社、リッチセント、カリフォルニア）を
用いたＨＰＬＣによりさらに精製することができる。得
られた結合体は、３２０ｎｍでの吸光度に対する２８０
ｎｍでの吸光度の比から決定されるように、約４〜６標
識／タンパク質を含んでいた。
ズーリ）（１１１ｇ）を、１％ツイーンを含有するＯ、
１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中に溶解した。実施例
１３で得た活性エステルの溶液（３５μのを常に撹拌し
ながら加えた。反応を６時間進行させた。混合物をファ
ルマシア社、ビスカドウェー、ニューシャーシーから入
手可能なセファデックスＧ−２５（１０ｃｍＸ０．７５
ｃｒり上でのクロマトグラフィーにかけ、Ｏ，］Ｍ
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で溶出した。標識結合体は、か
すかに黄色がかった蛍光バンドとして溶出した。１票識
タンパク質は、Ｂｌｏ−３ｉｌ ＴＳＫ−２５０カラ
ム（バイオラド社、リッチセント、カリフォルニア）を
用いたＨＰＬＣによりさらに精製することができる。得
られた結合体は、３２０ｎｍでの吸光度に対する２８０
ｎｍでの吸光度の比から決定されるように、約４〜６標
識／タンパク質を含んでいた。
実施例１５
実施例１３で得た活性エステルの溶液を、０゜１Ｍリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７、０）中のマウスモノ
クローナルＣＥＡ抗体と３０；１の比で２〜８°Ｃにて
約６時間混合した。
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７、０）中のマウスモノ
クローナルＣＥＡ抗体と３０；１の比で２〜８°Ｃにて
約６時間混合した。
ついで結合体を、透析物の吸光度かもはや遊離の標識か
存在しないことを示すまて、ＰＢＳノ＼。
存在しないことを示すまて、ＰＢＳノ＼。
ファー（ｐ）１７．０）に対して透析した。ＵＶ分光分
析により、実施例１４で示したような吸光度の比から決
定されるように、４〜６標識／抗体か示された。
析により、実施例１４で示したような吸光度の比から決
定されるように、４〜６標識／抗体か示された。
実施例１６
環状ヒドラジド−標識ＣＥＡ結合体を、ＰＢＳ。
０．０１％ツイーン（ｐＩ（７，０）中に２５０ ｎｙ
／ ｍＱ。
／ ｍＱ。
に希釈した。アボット・ラボラトリーズ、アボットパー
ク、イリノイから購入したＣＥＡキットを用い、アッセ
イを以下のようにして行った。
ク、イリノイから購入したＣＥＡキットを用い、アッセ
イを以下のようにして行った。
試料希釈物（５０μの、結合体（１００μのおよびアボ
ットＩ／４インチビーズをウェル中に混合した。混合物
を３７°Ｃで１時間インキュベートし、蒸留水で４回洗
浄した。洗浄したビーズをＴＤＸキュベツト中に移し、
バナジウムＩＶ触媒（０，３ｚｙ／Ｉｇ、１００μ＆）
を加えた。０．２５Ｎ ＮａＯＨ中の３％＋−（２０
２溶液（２００μのを加えた後、直ちに光子ルミノメー
タ−で結果を２秒間読み取った。
ットＩ／４インチビーズをウェル中に混合した。混合物
を３７°Ｃで１時間インキュベートし、蒸留水で４回洗
浄した。洗浄したビーズをＴＤＸキュベツト中に移し、
バナジウムＩＶ触媒（０，３ｚｙ／Ｉｇ、１００μ＆）
を加えた。０．２５Ｎ ＮａＯＨ中の３％＋−（２０
２溶液（２００μのを加えた後、直ちに光子ルミノメー
タ−で結果を２秒間読み取った。
その結果は、上記アッセイかＯｎｙ〜８０ ｎ９／ ｍ
Ｑの臨床的に有為の範囲においてＣＥＡを定量的に測定
し得ることを示していた。
Ｑの臨床的に有為の範囲においてＣＥＡを定量的に測定
し得ることを示していた。
以上の記載から、分析対象物に標識を付着させるための
反応性官能基を本発明の化合物中に組み込むことが当業
者によってなされ得ることは理解される。また本発明の
化合物をＤＮＡプローブを標識するのに用いることがで
きること、酵素反応の生成物が化学発光性の化合物であ
るような酵素基質中に組み込むことができること、さら
にエネルギー移動や蛍光の消光を伴う系に組み込むこと
ができることもまた考えられる。
反応性官能基を本発明の化合物中に組み込むことが当業
者によってなされ得ることは理解される。また本発明の
化合物をＤＮＡプローブを標識するのに用いることがで
きること、酵素反応の生成物が化学発光性の化合物であ
るような酵素基質中に組み込むことができること、さら
にエネルギー移動や蛍光の消光を伴う系に組み込むこと
ができることもまた考えられる。
本発明を考察することによって、他の変更や改良を加え
ることが当業者によりなされることが期待される。たと
えば、２−ビニルナフタレンは下記の異性体（ｉ）およ
び（ｉｉ） （ｉ） １１） を表すので、アントラセン環状ヒドラジドおよびフェナ
ントレン環状ヒドラジドを本発明によって製造すること
ができ、それらの化合物はそれぞれ下記式（ｉｉｉ）お
よび（ｉｖ）を有する。
ることが当業者によりなされることが期待される。たと
えば、２−ビニルナフタレンは下記の異性体（ｉ）およ
び（ｉｉ） （ｉ） １１） を表すので、アントラセン環状ヒドラジドおよびフェナ
ントレン環状ヒドラジドを本発明によって製造すること
ができ、それらの化合物はそれぞれ下記式（ｉｉｉ）お
よび（ｉｖ）を有する。
＋＋
＋１
（ｉｉｉ） （ｉｖ）上記式中
、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のすへ
てについてＢまたはＣの一方が−Ｎ０２、− Ｎ Ｈ２
、−ＯＨ，−０ＣＨ３およびハロゲン原子よりなる肝か
ら選ばれた基であり、（ｉｉ）および（ｉｖ）について
はＦまたはＧの一方が該鮮から選ばれた基、（ｉ）およ
び（ｉ ｉ ｉ）についてはＡが該鮮から選ばれた基で
ある。
、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のすへ
てについてＢまたはＣの一方が−Ｎ０２、− Ｎ Ｈ２
、−ＯＨ，−０ＣＨ３およびハロゲン原子よりなる肝か
ら選ばれた基であり、（ｉｉ）および（ｉｖ）について
はＦまたはＧの一方が該鮮から選ばれた基、（ｉ）およ
び（ｉ ｉ ｉ）についてはＡが該鮮から選ばれた基で
ある。
Claims (16)
- （１）（ａ）α，ω−アセチレンジカルボン酸エステル
を環状化合物のエチレン置換体に加えて環状化合物の環
状ジカルボキシレートを生成させ、ついで（ｂ）該環状
ジカルボキシレートをヒドラジドと反応させる ことを特徴とする環状化合物の化学発光性環状ヒドラジ
ドの製造方法。 - （２）下記式で示される化合物であって、式中、Ｒ＿１
およびＲ＿２はそれぞれ独立に−Ｈ、−ＣＨ＿３または
−ＣＨ＿２ＣＨ＿３である化合物、Ｒ＿１が−ＨでＲ＿
２が−（ＣＨ＿２）ｎＳＯ＿３Ｈ（式中、ｎは３または
４である）である化合物、Ｒ＿１およびＲ＿２が−（Ｃ
Ｈ＿２）ｎＳＯ＿３Ｈ（式中、ｎは前記と同じ）である
化合物、およびＲ＿１が−ＣＨ＿３、−ＣＨ＿２ＣＨ＿
３または−（ＣＨ＿２）ｎＳＯ＿３Ｈ（ｎは前記と同じ
）でＲ＿２が▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｍは２〜８の整数、Ｌは抗原、タンパク質、ポ
リペプチド、ハプテン、抗体、ホルモン、ビタミン、医
薬または核酸プローブのような特異的に結合し得るリガ
ンドである）である化合物よりなる群から選ばれた化学
発光性フェナントレン環状ヒドラジド化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （３）９−［Ｎ−エチル−Ｎ−ブチル］アミノフェナン
トレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドである特許請
求の範囲第（２）項記載の化合物。 - （４）９−（ジプロパンスルホン酸）アミノフェナント
レン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドである特許請求
の範囲第（２）項記載の化合物。 - （５）特許請求の範囲第（２）項記載の化合物に抗体を
結合させることにより得られる結合体。 - （６）試料を特許請求の範囲第（５）項記載の結合体に
加えることを特徴とする、物質の存在を試験するための
化学発光イムノアッセイを行うための方法。 - （７）特許請求の範囲第（２）項記載の化合物に抗原を
結合させることにより得られる結合体。 - （８）試料を特許請求の範囲第（７）項記載の結合体に
加えることを特徴とする、特許請求の範囲第（７）項記
載の抗原に対する抗体の存在を試験するための化学発光
イムノアッセイを行うための方法。 - （９）特許請求の範囲第（３）項記載の化合物に抗体を
結合させることにより得られる結合体。 - （１０）試料を特許請求の範囲第（９）項記載の結合体
に加えることを特徴とする、物質の存在を試験するため
の化学発光イムノアッセイを行うための方法。 - （１１）特許請求の範囲第（３）項記載の化合物に抗原
を結合させることにより得られる結合体。 - （１２）試料を特許請求の範囲第（１１）項記載の結合
体に加えることを特徴とする、特許請求の範囲第（１１
）項記載の抗原に対する抗体の存在を試験するための化
学発光イムノアッセイを行うための方法。 - （１３）特許請求の範囲第（２）項記載の化合物にポリ
ヌクレオチドを結合させることにより得られる結合体。 - （１４）試験すべき試料を特許請求の範囲第（１３）項
記載のポリヌクレオチド結合体に加えることを特徴とす
る、該結合体に相補的なポリヌクレオチドの存在を検出
するための化学発光イムノアッセイを行うための方法。 - （１５）特許請求の範囲第（３）項記載の化合物にポリ
ヌクレオチドを結合させることにより得られる結合体。 - （１６）試験すべき試料を特許請求の範囲第（１５）項
記載のポリヌクレオチド結合体に加えることを特徴とす
る、該結合体中の核酸に相補的なポリヌクレオチドの存
在を検出するための化学発光イムノアッセイを行うため
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11431687A | 1987-10-28 | 1987-10-28 | |
| US114316 | 1987-10-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01149773A true JPH01149773A (ja) | 1989-06-12 |
Family
ID=22354502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63271907A Pending JPH01149773A (ja) | 1987-10-28 | 1988-10-27 | 化学発光性環状ヒドラジドおよびその製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0313919A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01149773A (ja) |
| KR (1) | KR890006594A (ja) |
| AU (1) | AU617130B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2056142A1 (en) * | 1990-11-27 | 1992-05-28 | Hirotomo Masuya | Pyridopyridazine compounds and their use |
| BRPI0307864B1 (pt) * | 2003-11-25 | 2016-01-12 | Univ Rio De Janeiro | processo para formação de hidrazidas a partir de hidrazinas e ácido dicarboxílicos |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4225485A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins |
| US4743541A (en) * | 1985-07-17 | 1988-05-10 | Mast Immunosystems, Inc. | Luminescent substrate preparation and its use in specific binding assays |
-
1988
- 1988-10-12 EP EP88116906A patent/EP0313919A3/en not_active Withdrawn
- 1988-10-27 AU AU24402/88A patent/AU617130B2/en not_active Ceased
- 1988-10-27 KR KR1019880014014A patent/KR890006594A/ko not_active Ceased
- 1988-10-27 JP JP63271907A patent/JPH01149773A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU617130B2 (en) | 1991-11-21 |
| KR890006594A (ko) | 1989-06-14 |
| AU2440288A (en) | 1989-05-25 |
| EP0313919A3 (en) | 1990-08-16 |
| EP0313919A2 (en) | 1989-05-03 |
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