JPH01153083A - アベルメクチンアグリコンの製造法およびそのための培養菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮呈上夏机且立！ 本発明はグリコシル化アベルメクチン生成能力を欠き、
および分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を持たな
い入玉２１上ａ−ｔｒｘ　　アベルミチュス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｓ＋１ｔｉｌｉｓ）の突然
変異体、前記−Ｓ、ヱ＜Ｊｋｌ　　’　Ｘ（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｗｉｔ−ｉｌｉｓ）を製造す
る方法および天然および非天然アベルメクチン　アグリ
コンの製造におけるそれらの利用に関する。

従来夏技走 米国特許４，３１０．５１９号および４，４２９．０４
２号は強力な抗寄生虫活性を持つ関連薬剤の複合体であ
るアベルメクチン類、および７．　　ｌｚ７’　　：１
．−ｔ−ノ、ヱーさＡ弓ＬＬユノ２株（即ちＡＴＣＣ番
号３１２６７．３１２７１および３１２７２号の旦、ヱ
さルｌ±１λ）の好気的醗酵によるそれらの生成につい
て記載している。引用した後の２つの株は各々ＡＴＣＣ
番号３１２６７号の−５−。

ヱさ及ま土ユＸの紫外線照射により得られた培養物の凍
結バイアルおよび凍結乾燥チューブを表わしている。

１９８６年７月１６日付で出願された米国特許申請第８
８６．８６７号に相当するヨーロッパ特許２１４，７３
１号（１９８７年３月１８日付特許公開）は、天然また
は既知のアベルメクチンに関連はしているが、２５位に
新規Ｗｌ換基を持つ多数の化合物（本明細書では非天然
アベルメクチンと称する）、およびある種の特定のカル
ボン酸またはそれらの前駆体の誘導体存在下におけるア
ベルメクチン生成微生物の醗酵によるそれらの製造のた
めの過程について記載している。また、前記アベルメク
チンのアグリコンおよび非天然アベルメクチンの緩和な
酸加水分解によるそれらの製造法についても記載してい
る。

前記新規Ｃ−２５置換アベルメクチンの生成に用いる旦
、ヱ丘土ｌ土工入微生物はＡＴＣＣ番号３１２６７．３
１２７１゜３１２７２およびＮＣＩＢ番号１２１２１号
のΣ、アベルミチＩＬである。　ＡＴＣＣ番号３１２７
１号の昼、アベルミチュ久から誘導された後者の微生物
はある程度規定した培地で培養した場合新規Ｃ−２５置
換アベルメクチンの収量が上がる。ＡＴＣＣ番号３１２
６７．３１２７１．３１２７２およびＮＣＩＢ番号１２
１２１の各々はまた新規Ｃ−２５置換アベルメクチンに
加え、種々の量の既知または天然のアベルメクチン（２
５−Ｗ換基はイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチ
ル（１−メチルプロピル）〕を産生ずる。

アベルメクチンの炭素骨核（式（１〕に示した）は酢酸
塩およびプロピオン酸塩から、および天然アベルメクチ
ンのＣ−２５ｆｆ換基はＬ−イソロイシン（Ｒ＝　（Ｓ
）−ｓｅｃ−ブチル）またはＬ−バリン（Ｒ＝イソプロ
ピル）から誘導される（フィッシャーおよびムロシック
“マクロライド抗生物質”アカデミツク　プレス（１９
８４）、　１４章］。

“既知の”または“天然の”アベルメクチンとはＡＴＣ
Ｃ番号３１２６７、３１２７１および３１２７２号の旦
、ヱごソｋｌｊ２丈２ヨにより生成され、２５位の置換
基がイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル（１−
メチルプロピル）であるアベルメクチンを意味する。２
５位の置換基がイソプロピルまたは５ｅｃ−ブチル（Ｓ
−型）以外のアベルメクチンは本明細書では新規または
非天然アベルメクチンと称する。

前述の特許において引用したーＳ−０−１４λ株は一般
にＣ−０７６と記述される部類の物質を生成する。これ
には、はっきり異ったしかし、＾１ａ＋Ａｌｂ、＾２ａ
、Ａ２ｂ＋　Ｂｌａ、　Ｂ１ｂ＋　Ｂ２ａおよびＢ２ｂ
と記述される非常に相関した８つの種類がある。“ａ”
系列の化合物は２５位の置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチ
ル、′ビ系列は２５位の置換基がイソプロピルである天
然アベルメクチンを意味する８名称“Ａ”および“Ｂ”
は各々５位置換基がメトキシまたはヒドロキシのアベル
メクチンを意味する。最後に番号“１”は２２−２３位
に二重結合が存在するアベルメクチンを意味し；および
番号“２″は２２−位に水素を、２３位に水酸基を持つ
アベルメクチンを意味する。

本明細書においては同定記号“ａ″および“ｂ”は脱落
している。同定記号＾１．＾２．Ｂ１およびＢ２は先に
記載したごとき天然アベルメクチンの構造様相に対応す
る構造様相を持つ非天然アベルメクチンを表わするため
に残しである。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く突然変異
体の発生は、枯草菌〔ヴイレッケおよびバーデイ、ジャ
ーナル　オプ　バイオロジカルケミストリー」旦、　５
２６４−７２（１９７１〕　　）および之□二ＬＦＬ±
７．　　ｌ（マーチンら、ジャーナルオブ　バクテリオ
ロジー、　１ｌＬ１９８−２０４（１９７３）　）に対
しては報告があるがス　Ｌ／　　　ｚ−ｂ１属では報告
されていない。

米国特許第４．２０６，２０５号はＣ−０７６の単糖お
よびアグリコン誘導体について記載している；即ち、マ
クロライド環のＣ−１３位に結合している４−（アルフ
ァーム−オレアンドロシル）−アルファ一り一オレアン
ドロースニ糖官能基の一つまたは二つの炭化水素部分が
酸存在下（良好なのは硫酸）水性非求核性有機溶媒中の
加水分解により除去されている。

はとんどアベルメクチン　アグリコンＡｌａおよびＡ２
ａのみを生成す多突然変異体、Σ、アベルミ天ユ久Ａｇ
１ｙ−１　、がシュルマンらにより報告されている（ジ
ャーナル　オブ　アンチビオティクス３８（１１〕、１
４９４−１４９８（１９８５））　、シネフンジン存在
下での盈、１ごジ生〕」ヒ隻２ヨＡｇ１ｙ−１の醗酵で
はアベルメクチン　アグリコンＢｌｌ成物の生成が増大
した事も報告されている。アベルメクチンの高産生株５
．１ヱ！ル〕」ヒ隻り、０８同様にＯ−メチルトランス
フェラーゼの阻害剤としてのシネフンジン存在下では、
Ｃ−５およびオレアンドロースニ糖部分の０−メチル基
を欠くアベルメクチンを生成する。

米国特許第４，３７８，３５３号はＣ−０７６関連化合
物および−５−０ｌご（少〕ニヒ隻ノヨ＾ＴＣＣ３１２
７２の紫外線照射により得られる突然変異株ＭＡ−５２
１８の培養によるそれらの製造について記載している。

突然変異体はＡＴＣＣ３１７８０号と同定された。前記
突然変異体により生成されるＣ−０７６関連化合物はＣ
−０７６化合物とは大きな構造相違がある。全ての生成
物でＣ−０７６フラン環が欠除している。さらに、報告
されているある種の化合物においては一つまたは両方の
オレアンドロース糖部分が切断されており、一方他の化
合物においては５位がケトン基に酸化されている。

ラビーら（“放線菌の生物学”についての第６回国際シ
ンポジウム、デプレセン、ハンガリー、１９８５年８月
２６−３０日）およびシュルマンら〔アンティマイクロ
バイアル　エージェンツ　アンドケモセラピ−３１，７
４４−７（１９８７）　）により、０−メチル基が欠除
したアベルメクチンを生成する３つの種類のΣ、７＜火
」」１隻ｌヨのＯ−メチルトランスフェラーゼ変異体が
報告されている。第一の種類は大環状ラクトン環のＣ−
５水酸基をメチル化する能力がないので根本的にＢアベ
ルメクチンを生成する。第二の種類はデメチルアベルメ
クチンと称される３′−０，３”−〇−ビスーデメチル
アベルメクチン（両方のオレアンドロース単糖残基の３
位に０−メチル置換基を欠くアベルメクチン）を生成す
る。第三の種類のものはどの位置もメチル化する事がで
きない。

シュルマンらは〔フエデレーシッン　プロシーディング
　４４．９３１（１９８５）　）酵素アベルメクチンＢ
−０−メチルトランスフェラーゼによるアグリコン部分
のＣ−５水酸基のメチル化を阻害するシネフンジン、Ｓ
−アデノシルエチオニンおよびＳ−アデノシルホモシス
ティンのごとき物質存在下でのΣ、ヱ丘止ま±見回醗酵
によるＢアベルメクチンの生成の増加について記載して
いる。０−メチルトランスフェラーゼ活性がないため、
アベルミクチン８Ｍ成物を多く生成するス上２１上ｓ−
ｂスヱ丘ｔＶＳ土ユ入変異体についてもシュルマンら〔
アンチマイクロバイアル　エージェンツ　アンド　ケモ
セラビイ　益、　６２０−６２４（１９８６）　）によ
り記載および参照されている。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く旦、ヱベ
ｔＢ土史囚変異株の突然変異形成により突然変異株が産
生され、それは適当な培地で培養するとアベルメクチン
　アグリコンを産生ずる事が明らかになってきた。この
変異体はＲＣＯＯＨＣ式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ
）−ｓｅｃ−ブチル〕または醗酵過程中にＲＣＯＯＨに
転換できる化合物の添加かない場合は天然アベルメクチ
ン　アグリコンを生成する能力を持っていない、しかし
ながら、期待されなかったことではあるが驚くべき事に
、ＲＣＯＯＨ化合物（式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ
）−ｓｅｃ−ブチルまたは本明細書に記載した他の基）
または前記１？ＧＯ（ＩＨの前駆体を添加して醗酵せし
めると天然および非天然のアベルメクチン　アグリコン
が生成される事が観察された。さらに驚くべきことには
、ここに記載した突然変異体は（Ｌ−イソロイシンまた
はＬ−バリンを分解する事ができない）広範囲の化合物
をアベルメクチン生合成経路へ同化せしめる事が可能で
、天然アベルメクチン　アグリコンを全く含まない非天
然アベルメクチン　アグリコンを生成する。

〔１４しよ゛と　る。　占 ある種の天然アベルメクチン　アグリコン（Ａｌａおよ
びＡ２ａ）は前記のごとく旦、１ご！生」」ヒ隻ノ。

Ａｇ１ｙ−１により生成される。しかしながら残りの天
然アベルメクチンのアグリコンと一緒で、それらは通常
対応するアベルメクチンの酸加水分解により製造される
。この過程は醗酵プロスからの天然アベルメクチンの単
離を必要とする。天然アベルメクチンは実質的に純粋な
形で単離されているが（米国特許第４，４２９，０４２
号参照）、その方法論はかなり困難である。それゆえ、
この方法によるアベルメクチン　アグリコンの全製造は
更に加水分解工程が加わる為より困難である。生成物の
数および複雑さを最小にするように天然または非天然ア
ベルメクチン　アグリコンのどちらかを生成するように
選択する能力が目的のゴールであり、そうする事により
、選択されたアベルメクチン　アグリコンの純度が増し
、それにより分離工程が簡素化される。

０　　″　　る６の 分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠き、適当な
栄養培地で醗酵せしめた場合アグリコンを生成できるΣ
、に二５５株は分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性
を欠く念、アベルミチｎ株の突然変異により得られる。

ここに記載した本発明の突然変異体はイソプロピルまた
はｓｅｃ−ブチル（Ｓ−型）基を持った脂肪酸またはそ
れへの前駆体を突然変異体を醗酵せしめる培地中へ添加
した場合を除いて天然アベルメクチン　アグリコンを合
成する事ができない。これらは適当なプライマー酸また
は醗酵過程においてそれらに転換できる化合物を含有す
る栄養培地中、水性好気性条件下醗酵せしめた場合、天
然および非天然アベルメクチン　アグリコンを生成する
事ができる。

必要な分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ欠損株〔例え
ばＳ、＜）ｋ、ｌ　　Ｉ　Ｘ　Ｉ　　３　（ＡＴＣＣ５
３５６７））は旦、ヱ丘及ま±ニスのアベルメクチン産
生株の突然変異、特に−５−、ヱ＜７１ｚ５％ユＸ　　
ＡＴＣＣ３１２６７゜ＡＴＣＣ３１２７１，ＡＴＣＣ３
１２７２またはＭＣｌＢ１２１２１の突然変異により製
造される。

分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の欠除を特徴と
する突然変異体は突然変異せしめたコロニーの中から１
４（０，検定に基づいて選択される。

この過程においては［”Ｃ−１〕　−２−オキソカプロ
ン酸、（１４Ｃ−１〕　−２−オキソ−３−メチル吉草
酸または〔１４Ｃ−１〕　−２−オキソ−３−メチル酪
酸などの基質から透過コロニーによる１４ｃｏ、発生が
ない事が分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠除
している事を示している。このようにして製造された突
然変異体を第二の突然変異操作にかける。適当なブライ
マー酸の存在下適当な培地で培養し、薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）および／または高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）により醗酵生成物中のアグリコンを
検査する。もしくは、逆の順序でも二重に阻害された突
然変異体を製造できる事をこの分野に精通する者は認識
するであろう；即ち、分枝２−オキソ酸デヒドロゲナー
ゼ阻害を第一工程ではなく第二工程で導入できる。

予期されなかった事であるが驚くべき事に、分枝２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠除した本明細書の変異
体はアベルメクチン　アグリコン、特に非天然アベルメ
クチン　アグリコンを生成する能力があった０通常の培
地で成育せしめた場合、天然脂肪酸アシル補酵素Ａ誘導
体を生成する事ができない本発明の変異体の無能力さは
もし膜の完全さが前記誘導体に依存したり、変異体にょ
るオキソ酸の蓄積が細胞毒性であったならば致命的突然
変異であったであろう、さらに、Ｌ−イソロイシンおよ
びＬ−バリン分解代謝によるアセチル−ＣｏＡおよびプ
ロピオニル−ＣｏＡの合成は本変異体が失った酵素活性
を必要とするので本変異体では合成できないと予期され
ていた。先に指摘したごとくアベルメクチン生合成のた
めのこれらのアシル−ＣｏＡ誘導体の必要性は本変異体
の非天然アベルメクチン　アグリコン生成が重度に害さ
れるであろうと予想させるが驚くことにそうではながう
た。

本明細書に記載した変異体は２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性が欠除しているのでＬ−イソロイシンおよびＬ
−バリンの分解による分枝脂肪酸アシルーＣｏＡ合成お
よびそれによる天然アベルメクチンの合成が阻害される
事になる。同様にして、−５−、アベルメクチンの分枝
アミノ酸トランスアミナーゼ陰性突然変異体はおそらく
天然アベルメクチンを生成する能力が妨げられているで
あろうと予期される。そのようなトランスアミナーゼ陰
性変異体は通常のアミノ基転移反応経路ではイソロイシ
ンおよびバリンから分枝２−オキソ酸を合成できないで
あろう、活性分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ酵素の
基質であるこれらの２−オキソ酸が減少すると、分枝脂
肪酸アシルＣｏＡ合成を有効に阻害できる０本発明はま
たそのようなトランスアミナーゼ陰性変異体単独の使用
および分枝トランスアミナーゼ陰性および２−オキソ酸
デヒドロゲナーゼ陰性の突然変異が組み合わさった変異
体の使用も包含する。

本明細書に記載した種からの核酸または相当物を使用し
、形質転換、形質導入、遺伝子組換えまたはいくつかの
他の遺伝子操作により発展させられ、それによりここに
記載した変異体の特徴を得た任意の微生物も、その外観
または生理学的挙動にかかわらず本発明に包含されるも
のである。

本明細書で使用される術語“アベルメクチン”または“
°アベルメクチン類”とは下に示す式（１〕を持つ化合
物を称するが、式中２５位の置換基（Ｒ）は本発明の昼
、ヱベ止ま±１久により前記の位置で任意の基に同化さ
れることもある。アベルメクチン　アグリコンは式（ｎ
）の化合物を称し、式中Ｃ−１３の三糖エーテル部分、
４〜（アルファーム−オレアンドロシル）−アルファー
Ｌ−オレアンドロシルオキシ基がＯＢで置換されている
。

本明細書に記載された突然変異体はここに記載および例
示された方法による非天然アベルメクチン　アグリコン
の生成に非常に有用である。これらは好ましいアベルメ
クチン　アグリコン、即ち、式（Ｉｆ）の化合物（式中
Ｃ−２５置換基は随意にＣ＋−０４アルキルで置換され
たＣ、−Ｃ，シクロアルキルまたはシクロアルケニル；
１−メチルチオエチルまたは５−または６員環の酸素ま
たは硫黄複素環基、特に３−チエニルまたは３−フリル
である）の生成に非常に有効である。

ス　し°　ミセス　１ごｉ火」」Ｌ４２５種のアベルメ
クチン産生株の突然変異は紫外線照射、Ｘ−線照射、Ｎ
−メチル−Ｎ”−二トローＮ−二トログアニジン、エチ
ルメタンスルホナート、亜硝酸およびナイトロジエンマ
スタード、例えばＮ−メチルビス（２−クロロエチル）
アミン、または類似の処理からなる種々の突然変異誘発
剤の任意のものを用いる既知の過程に従って実施する。

突然変異は、例えば旦、１ごε止ｎ隻ノヨ　ＡＴＣＣ３
１２７２のごとき天然アベルメクチンを生成できる旦、
ヱ＜）Ｌｔま±ｌ−の胞子または栄養生殖培養上に実施
する。

この分野に精通する者にはよく知られた方法に従い、〔
自’Ｃ−１〕−２−オキソ酸から”ｃｏｔを産生じてい
る多数の無作意に突然変異した細菌コロニーをスクリー
ニングする事が可能な生化学検定法に基づき突然変異し
たコロニーを選択する（タボールら、ジャーナル　オプ
　バクテリオロジー１２８４８５−４８６．１９７６）
。

方法論は、適当な栄養培地上ミクロタイタープレートの
くぼみの中で変異株のコロニーを増殖せしめ、トルエン
で細胞を透過性となし、続いて各々のくぼみに（１４Ｃ
−１〕　−２−オキソ酸（例えば２−オキソイソカプロ
ン酸）を添加し、醗酵液の上部の大気の１４（：、ｏ、
を検査する。もしくは、（１’ｃ−１〕　−２−オキソ
−イソカプロン酸の代わりに〔１４Ｃ−１〕　−２−オ
キソ−３−メチル吉草酸または〔１４Ｃ−１〕　−２−
オキソ−３−メチル酪酸も使用できる。放出されたすべ
ての１４ＣＯ，を捕捉するため個々のくぼみの上にＢａ
　（ＯＲ）　＊飽和液で湿らせた濾液を置き、もしあれ
ばＢａ”ＣＯｚをオートラジオグラフィーにて検出する
事により１４（１〕、の生成は便利に試験される０分枝
２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く変異体はブラ
ンク対照物のオートラジオダラムに近いそれを与える；
即ちＢａｌ４ＣＯｓは変異体により生成されない。

このようにして得た突然変異体は、前に記載した突然変
異誘発剤を用いて更なる突然変異生成を行う、突然変異
したコロニーは適当な培地で培養した時アベルメクチン
　アグリコンを生成する能力があるものを選択する。

本発明の突然変異体の形態的および培養特性は−Ｍ的に
米国特許第４．４２９，０４２号に記載されているごと
くであるが、ある種の例外もある０本発明の突然変異体
の顕著な特徴はそれらが分枝２−オキソ酸デヒドロゲナ
ーゼ活性がない事、およびここに記載したごと（通した
培地中で培養した場合のアベルメクチン　アグリコン生
成能力である。

これらの特徴によると脂肪酸ＲＣＯＯＨ（式中Ｒはイソ
プロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルである）または
醗酵中に前記ＲＣＯＯＨへ転換できる化合物が実質的に
存在しない規定された培地で増殖せしめた場合本変異体
は天然アベルメクチン　アグリコンを生成しないという
事である。アメリカン　タイプカルチャー　コレクシジ
ンにより実施された分類学的調査はそれ自身突然変異体
である（前記”Ｃｏ！検定により選択された）親株旦、
１ごｉル〕」Ｌ１２２Ｉ−３の特徴は米国特許第４，４
２９，０４２号に記載されている祖父母ＡＴＣＣ３１３
７２の特徴と密接な関係を持つ事が確認されている。し
かしながら、突然変異株１−３　（ＡＴＣＣ５３５６７
）は、ＡＴＣＣ３１２７２より形成する胞子鎖が著しく
少ない；一方、米国特許第４．４２９．０４２号におい
てメルクにより記載されているＡＴＣＣ３１２７２の記
述とは反対に、単一炭素源としてシｇ糖のみで本変異体
またはＡＴＣＣ３１２７２が増殖する事が検出できた。

突然変異体１−３は分枝２−オキソ酸デカルボキシラー
ゼ活性が欠損しているのみである。Ｉ−３の更なる突然
変異およびそのアベルメクチンアグリコン生成能により
選択された二重阻害突然変異体Ｓ−２８０５は突然変異
株１−３同様にＡＴＣＣ３１２７２に対し分類上の関連
を持っている。

ス上上１上ま立入　ヱさ灰ま±北回１−３およびＳ−２
８０５は永久に供託ができる認可された供託所アメリカ
ン　タイプ　カルチャーコレクション（ロックビル、メ
リーランド）にブタペスト条約のもと供託されており、
もし本申請書の特許が承認されるとだれでも容易に人手
可能である。各々スユ」タート辷１入　ヱさルｌ土悲久
ＡＴＣＣ５３５６７およびＡＴＣＣ５３６７７号の名称
が与えられている０本申請が未決の間は米国特許および
商標庁長官により３７　ＣＰＲ１，１４および３５１１
ｓｃ　１２２１７）名称で決定されれば、および本申請
の副本またはその写しが提出されている国においては外
国特許法に従って供託物は入手可能である。特許が承認
されればすぺての制限が最終的に取り除かれ、供託され
た微生物は一般にも入手可能となるであろう。

盈、　ノーｒｉスイｌ−ルＩ’）、　　　ＡＴＣＣ３１
２６７、ＡＴＣＣ３１２７１、ＡＴＣＣ３１２７２およ
びＮＣＩＢ　１２１２１の各々は天然アベルメクチン、
式（１〕の化合物、 （式中、２２−２３位の破線は随意の二重結合を表わし
； ｉｌｌは二重結合がない場合のみに存在する水酸基であ
り； ｈは式 の４”−（アルファーム−オレアンドロシル）−アルフ
ァーム−オレアンドロ シルオキシであり； Ｒ３は水素またはメチルであり；およびＲはイソプロピ
ルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルである。） を生成する。米国特許４，２８５，９６３は式中２５−
位がメチルおよびエチル基により置換され、Ｒ１が水酸
基であり、Ｒ３がメチルであるアベルメクチンについて
記載している。

ここで非天然アベルメクチンと称するものはＲがイソプ
ロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル以外の基であり、
以下に定義するごとくである。

本発明の突然変異体は式（ＩＩ）のアベルメクチン　ア
グリコンを生成する；即ち式（１〕の化合物であるが式
中Ｒ２は水酸基である０本発明の突然変異体により生成
されるアベルメクチン　アグリコン中のＲの価値は天然
アベルメクチンに存在する基（イソプロピルまたは（Ｓ
）−ｓｅｃ−ブチル）に相当し、イソプロピルまたは（
Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル以外であり、ここに記載されてい
る変異体により２５の位置で同化可能である。

天然アベルメクチンおよびそのアグリコン〔式（１〕お
よび（■）〕の生合成に必須な化合物Ｌ−バリンおよび
Ｌ−イソロイシンは旦、アベルミ±ニスの細胞に存在す
る。これらの化合物は２−オキソ酸への変換および分枝
２−オキソ酸デヒドロゲナーゼによる脱炭酸、付随する
生成物の補酵素Ａとの結合によりアベルメクチンの生合
成経路へ入ると信じられている。その存在は式（１〕お
よび（■）のイソプロピルおよび（５）−ｓｅｃ−ブチ
ル化合物両方の同時生成を説明する。もちろんこの事は
（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル誘導体からのイソプロピル型の
分離の問題を生じせしめる。

適当なプライマー化合物を含む栄養培地で醗酵せしめた
場合、本発明の突然変異体は式（ｎ）の化合物、より普
遍的な場合としては式（Ｉｆ）の化合物の２つまたはそ
れ以上の混合物を生成する（式中Ｒは使用したプライマ
ー化合物に対応する）。

便宜上、平凡にトアベルメクチンＡｔアグリコン、Ａ２
アグリコン、ＢｌアグリコンおよびＢ２アグリコン２称
する４つまでの生成物が生成される。もちろん“ｋ−“
基はＣ−２５置換基を意味する０例えばＲがシクロペン
チルの場合４つの可能なアベルメクチンアグリコンは以
下のごとくである： 非天然アベルメクチン　　アグリコンにおいてＣ−２５
置換基″Ｒ１はイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブ
チル以外の基である。

二重結合が存在しＯＨが存在しない式（ＩＩ）の化合物
はｉｌｌがＯＨであり二重結合が存在しない式（Ｉｆ）
の対応する化合物から脱水反応によっても合成されるで
あろう、第一に５および１３位の水酸基を選択的に例え
ばｔ−ブチルジメチルシリルオキシアセチル誘導体とし
て保護し、次に（４−メチルフェノキシ）チオカルボニ
ル　クロリドのごとき置換チオカルボニル　ハライドと
反応せしめ、続いて例えばトリクロロベンゼンのごとき
高沸点溶媒中で加熱する事により反応を実行し、米国特
許第４．３２８，３３５号に記載されている過程に従っ
た脱水反応を達成する。生成物は最後に保護基を脱離せ
しめて不飽和化合物を得る。

式中Ｒ２がＨである式（ＩＩ）の化合物はまたＲ３がＣ
Ｈｓである対応する化合物から脱メチル化反応により合
成されるであろう、この反応は５−メトキシ化合物また
はその適切に保護された誘導体を酢酸水銀で処理し、生
じる３−アセトキシ　エノールエーテルを希酸で加水分
解して５−ケト化合物を得る事により達成される。この
ものは次に例えば水素化ホウ素ナトリウムなどを用いて
還元し、５−ヒドロキシ誘導体を得る。これらの工程に
ついての適切な試薬および反応条件については米国特許
第４．４２３．２０９号に記載しである。

Ｒ１がＨであり二重結合が存在しない式（ＩＩ）の化合
物は二重結合が存在するがＲ１が存在しない対応する化
合物から、適切な触媒を用いる選択的接触水素添加反応
により合成できる０例えばローロッパ特許出願Ｎｏ、０
ＯＯ１６８９に記載しであるごとくトリス（トリスフェ
ニルホスフィン）ロジウム（１〕クロリドを用いてこの
還元は達成される。

式（ＩＩ）のアグリコンはまた対応する式（Ｉ）の化合
物（「は４’−（アルファーム−オレアンドロシル）−
アルファーム−オレアンドロシルオキシである）から水
性有機溶媒中酸による温和な加水分解により４°−（ア
ルファーム−オレアンドロシル）−アルファーＬ−オレ
アンドロース基を除去する事により１３位に水酸基を持
つアグリコンが得られるので合成できる。

本発明の盈、ヱ％±ユ久が天然および非天然のアベルメ
クチンの生合成に利用できる化合物は式（ＩＩＩ−Ａ） Ｒ−Ｃｏｏｌ　　　　　　（ＤＩ−Ａ）の化合物であり
、醗酵過程の間に（ＤＩ−Ａ）へ転換できる化合物も含
まれる。前記化合物は本明細書においては“プライマー
化合物”と称される。

式（ＩＩＩ−Ａ）においてＲはアルファー分枝鎖状基で
あり、−Ｃｏｏｌ基が結合しているその炭素原子はまた
少くとも２つの水素以外の原子または基と結合している
。もちろんこの定義は飽和および不飽和非環式および環
状の基を包含し、任意に硫黄または酸素の異種分子を非
環式直鎖または環の一員として持つ基も含まれる。

特にＣ−２５置換基となるＲは、アルファ分枝Ｃ５−Ｃ
，アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアル
キルまたはアルキルチオアルキル基；アルキル基がアル
ファー分枝Ｃｌ−Ｃｓアルキル基であるＣｓ　　Ｃｍシ
クロアルキルアルキル基；メチレンまたは一つあるいは
それ以上のＣＩ　　Ｃｌアルキル基またはハロゲン原子
（フッ素、塩素、ヨードまたは臭素）で任意に置換され
ているＣｍ−Ｃｌシクロアルキルまたはｃｓ−ｃｓシク
ロアルケニル基；または酸素または硫黄を含む３から６
貴環の複素環でそれは飽和されていても、完全または部
分的に不飽和でもよく、任意に一つまたはそれ以上のＣ
ｌ−Ｃａアルキル基またはハロゲン原子で置換されてい
てもよ醗酵過程中にＲＣＯＯＨ（■−Ａ）に転換できる
化合物；即ち前駆体は式（ＩＩ−Ｂ）： Ｒ−（ＣＨり、−Ｚ　　　　　（ＩＩＩ−Ｂ）〔式中Ｒ
は前に定義したとおり、ｎは０．２．４または６；およ
び２は−ＣＨ＊ＯＨ、ＣＨＯ１ＣＨ！ＮＨｔ、−ＣＯＯ
Ｒ８または−ＣＯＮＩ（Ｒ’　（式中ＲＳはＨまたは（
ＣＩ−６）アルキルであり、１７６は水素（ＣＩ−４）
アルキルまたはアミノ酸、特にアスパラギン酸、グルタ
ミン酸およびメチオニンの残基、例えば各々−ＣＨ（Ｃ
ＯＯＨ）ＣＩＩＣＯＯＩ（。

ＣＨ（ＣＯＯＨ）　（ＣＨｔ）□ＧＯＯＢおよび−ＣＯ
（ＣＯＯＨ）　（Ｃｌり露ＳＣＨ３である）である） の化合物である。

式（ＩＩ［−Ａ）および（１１−Ｂ）の化合物の異性体
形および醗酵過程の間にそれらに転換可能な化合物も本
発明に包含されており、Ｃ−２５における異性体のアベ
ルメクチン　アグリコンは本明細書に記載した過程にお
いてそれらを使用する事により生じる。

本発明の方法は同化可能な窒素、炭素源、無機塩および
式ＲＣＯＯＨの化合物または醗酵過程の間に前記化合物
に転換可能な化合物（即ち前駆体）からなる水性栄養培
地中、グリコシル化アベルメクチン生成能および分枝２
−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いた３　、７　＜
　ｋ　ｌ　ｆ　ｌ　Ｘ株を好気的醗酵せしめる事により
実施する。酸またはそれに転換可能な化合物は接種時ま
たは醗酵中一定間隔で醗酵液に添加する。アベルメクチ
ン　アグリコン生成物の産生は醗酵液から試料を取り、
有機溶媒で抽出し、例えば高速液体クロマトグラフィー
を用いるクロマトグラフィーにより生成物の発現を追跡
する事によりモニターする。生成物の収量が最大になる
まで、−ｉ的に４から１５日の期間インキユベーション
を続ける。

プライマー化合物（カルボン酸またはそれに転換される
化合物）の各々の添加の良好な濃度はリットル当り０．
０５および３．０グラムの間である。プライマー化合物
は醗酵液へ連続的、断続的または全部−度に添加する事
ができる。酸（ＲＣＯＯＨ）はそのままでまたはナトリ
ウム塩、リチウム塩、またはアンモニウム塩のごとき塩
として、または前に定義したごとく酸へ転換可能な化合
物として添加される。もし酸が固体ならば水または（Ｃ
Ｉ−４）アルコールのごとき適切な溶媒に溶解せしめる
のが良好である。

醗酵のために使用する培地は（特にＣ−２５置換基がイ
ソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルであるべき場
合）同化可能な炭素、窒素および微量元素源を含む通常
培地である。　Ｃ−２５置換基が非天然の基であるべき
場合：即ちイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル
でない場合、醗酵培地は選択された成分が欠除している
かまたはＲ部分がイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−
ブチルであるプライマー化合物を最小量含むものである
。

良好には２４から３３℃の範囲の温度で数日間の期間醗
酵せしめた後、醗酵プロスを遠心分離するか濾過し、菌
糸のかたまりを良好にはアセトンまたはメタノールで抽
出する。抽出溶媒を濃縮し、所望の生成物は次にメチレ
ンクロリド、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノールま
たはメチルイソブチルケトンのごとき水と混和しない有
機溶媒中へ抽出する。抽出溶媒を濃縮し、粗生成物は必
要なら例えば分取用逆相高速液クロマトグラフイーのご
ときクロマトグラフィーにより更に精製する。

生成物は一般的にＲ１がＯＨで二重結合が存在しないも
のまたは１１が存在せず二重結合が存在するものかおよ
びＲ３がＨまたはＣＨｚである式（ＩＩ）の化合物の混
合物として得られる；しかしながらその比率は特定の突
然変異体および使用したプライマー化合物および使用し
た条件に依存して変化できる。

Ｒ基の源は；即ちそれがＲ−Ｃｏｏｎから直接来ても、
または前記の前駆体の一つから、または任意の前駆体か
ら生成されても、アベルメクチン　アグリコンの生成に
は重要でない、その生成のための本発明の方法の決定的
必要条件は、醗酵過程において所望のＲ基が本発明のＳ
、Ｚご（ル６株に役立つという事である。

適した化合物を以下に示す： ２．３−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルペンタ−４−エノン酸 ２−シクロプロピル　プロピオン酸 ４．４−ジフルオロシクロヘキサン　カルボン酸リチウ
ム塩 ４−メチレンシクロヘキサン　カルボン酸３−メチルシ
クロヘキサン　カルボン酸（シス／トランス） ｌ−シクロペンテン　カルボン酸 １−シクロヘキセン　カルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフェン−２−カルボン酸 ３−無性粘液酸 ２−クロロチオフェン−４−カルボン酸シクロブタン　
カルボン酸 シクロペンタン　カルボン酸 シクロヘキサン　カルボン酸 シクロヘプタン　カルボン酸 ２−メチルシクロプロパン　カルボン酸３−シクロヘキ
セン−１−カルボン酸 ２−メチルチオプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオフェン−３−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン ３−チオフェン　カルボキサアルデヒド３−シクロヘキ
シルプロピオン酸 ３−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−３−カルボン酸３−シクロペ
ンチル−１−プロパツール３−メチルシクロブタン　カ
ルボン酸リチウム塩３−フルオロシクロブタン　カルボ
ン酸３−メチルシクロブタン　カルボン酸すチ、ウム塩
２−メチル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオビラン−４−カルボン酸シクロブチル
メチルアミン シクロブタンカルボン酸エチル ４−ヒドロキシメチルシクロペンテン ２−（３−チオフェンカルボニル）プロピオン酸エチル
エステル ５−２−メチルペンタン酸 Ｒ−２−メチルペンタン酸、 ０−メチルトランスフェラーゼ変異体はここに記載した
分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰性、アグリコン産
生変異体から得る事ができる０分枝２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性の活性な方への突然変異と０−メチルト
ランスフェラーゼ突然変異の組合せにより得られる−３
，７ごＵヒ隻ノ。

は、ＲＣＯＱＨ化合物または醗酵過程の間にＲＣＯＯＨ
に転換できる化合物を与えた場合、基本的にＢアベルメ
クチンを生成する。前記突然変異体はここに記載した分
枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いた突然変異
体の紫外線および／またはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウ
レタン、ニトロソグアニジンまたは前に列挙したののご
とき突然変異誘発化学物質による突然変異生成により得
られる。もしくは、０−メチルトランスフェラーゼを欠
いた分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陽性の変異体を
ｔｌＶ光線または分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ陰
性、アグリコン産生変異体を生成する突然変異誘発剤処
理により突然変異を起こす事ができる。

突然変異生成による微生物の与えられた株の所望の対立
遺伝子の生成に加え、原形質体融合はある株で生成／同
定される所望の対立遺伝子の他の株の染色体への導入を
可能にする０例えば分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ
が欠除しているがグリコシル化アベルメクチンを生成す
る能力を持つ旦、ヱ丘土亙土ユ入株は５−０−メチルト
ランスフェラーゼ欠除旦、ヱ＜ｎｔｚｒｘ株との原形質
融合によりアベルメクチンＢアグリコンのみを合成でき
る旦、ヱ＜Ｊｌ、Ｂ　　、１株を生じる事ができる。

そのような突然変異体により産生された非天然アベルメ
クチン　アグリコンはアグリコン部分のＣ−５位の水酸
基の存在により特徴付けられる。

前記の突然変異体はシェルマンらにより記載された方法
論に従って同定される〔アンチミクロバイアル　エージ
ェント　アンド　ケモセラピイ、農、　６２０−６２４
（１９８６）　）　、それは既知のアベルメクチン　ア
グリコンと同じ方法であり、同一の目的には有用である
。

もしくは、０−メチルトランスフェラーゼ活性を阻害す
るシネフンジン、Ｓ−アデノシルエチオニンまたはＳ−
アデノシルホモシスティンのごとき物質の存在下では、
分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ不活性の本発明の突
然変異体の醗酵により生成されるＢアベルメクチンの量
が増加する。

作−■ 本発明の化合物は抗寄生虫剤として非常に活性であり、
駆虫剤、外部寄生虫剤、殺虫剤および抗だに剤としての
特別の有用性を持つ、特に、線虫類として記述される寄
生虫群により最も頻繁に起こされ、家畜および家禽を冒
すのみならず豚、羊、馬および畜生の重大な経済的損失
を生じせしめる事ができる嬬虫病を含む外部寄生虫によ
り起こされる種々の状態の調節（即ち予防および治療）
に有効である０本化合物は種々の補乳頻（ヒトおよび動
物）を冒す他の線虫類に対してもまた有効であり、例え
ば犬のジロフィラリアおよびアンサイロスドーマ属鉤虫
、ネカトール属鉤虫、回虫、糞線虫、施毛虫、毛頭虫、
侍史、撓虫のごとき胃腸寄生虫および血液または他の組
織および器官で発見される糞線虫および施毛虫の芋虫お
よび腸外段階のごとき寄生虫でヒトに感染できる種々の
寄生虫が挙げられる。

本化合物はまた、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、アオバ
エ、食いつく昆虫および畜生および馬につく移動性双翅
類の幼虫のごとき動物および鳥類の特定の節虫動物外部
寄生虫を含む外部寄生虫感染の処置にも有効である。

本化合物はまた、クモダニ、あぶらむし、いも虫のごと
き農業プラントの貯Ｒ穀物の害虫およびばったのごとき
移動性直翅目昆虫に有効であるのと同様に、ごきぶり、
いが、ひめまるかつおぶしむしおよび家ばえのごとき家
の中の害虫に対しても殺虫剤として活性がある。

式（Ｉｆ）の化合物は直面している特定の使用法、処置
する特定の種の宿主動物および含まれる寄生虫または昆
虫に適切な処方で投与される。虫下しとして使用するに
は本化合物はカプセル、丸薬、錠剤または液状水薬の形
で経口で投与でき、もしくは、注射または挿入で投与し
てもよい、そのような処方は標準の獣医業務に従い通常
の方法で調製される。このようなカプセル、丸薬および
錠剤は活性成分を、崩解剤および／またはデンプン、乳
糖、タルク、ステアリン酸マグネシウムその他のごとき
結合剤をさらに含む、適切にきれいに分割された希釈剤
または担体と混合する事により調製する。水薬処方は活
性成分を分散剤または浸潤剤その他と水溶液に分散せし
める事により調製し、および注射可能処方は溶液を血液
と等張とするのに十分量の塩またはグルコースなどの他
の物質を含む無菌溶液の形で調製される。これらの処方
は処置する宿主動物の種、感染の型および重度、および
宿主の体重に依存して活性化合物の重量に関して変化す
るであろう、経口投与においては一般的に、動物体重−
５り約０．０２から１０■の用量を一回量として、また
は１から５日の期間で分割した量を与えるのが良好であ
ろうが、しかしもちろん示した用量範囲より多いまたは
少い例もできるであろう、そのような事も本発明の範囲
に含まれる。

もしくは本化合物は動物の飼料と一緒に投与されてもよ
く、この目的には通常の動物飼料と混合するため濃縮飼
料添加物または前もって混合した物を調製する。

殺虫剤および農業害虫処置の為に使用するにはスプレー
、粉末、乳化剤または標準農業業務に従った類僚のもの
で本化合物を応用する。

工１０−　旦、ヱごＪ弓しヒＹ入ＡＴＣＣ３１２７２を
ニューパッチアガー培地上３０℃にて１２日間コンフル
エントローンとして増殖せしめる。培地は以下に示す組
成から成る： Ｖ−８ジｓ−ス”　　　　　　　　２００ｍＣａＣＯ３
３グラム 寒　天　　　　　　　　　　１５グラムＨｚ０　　　　
　　　　　　　１０００　ｊｄになるまで栄養プロス　
　　　　　　　１．θグラム／Ｌ酢酸ナトリウム・３ｕ
ｔｏ　　　　１．４グラム／Ｌイソ吉草酸　　　　　　
　　５０■／Ｌイソ酪＃５０■／Ｌ ２−メチル酪酸　　　　　　　５０■／Ｌイソロイシン
　　　　　　　２５０■／Ｌロイシン　　　　　　　　
　　２５０ｇ／Ｌバリン　　　　　　　　　２５０■／
Ｌ微量元素溶液＊＊　　　　　　　１■／Ｌ本８つの野
菜ジュース（トマト、ニンジン、セロリ、ビート、パセ
リ、レタス、オランダがらし、およびホウレン草）の混
合物に塩、アルコルビン酸、クエン酸および天然芳香剤
を加えたもの、キャムベル　スーブ　カンパニー（キャ
ムデン、　ＮＪ）から入手可能。

傘＊微量元素溶液の組成： ＦｅＣ１ｘ　　・６Ｈｚ０　　　　　２．７　ｇＭｎＳ
Ｏｓ　　・Ｈｚｏ　　　　　　４．２ＣＩＩＳＯ４・５
１ｈＯＯ，５ ＣａＣ１ｚ　　　　　　　　　１１．０１１３ＢＯ３０
，６２ ＣｏＣ１ｚ　　’　６Ｈ＊ＯＯ，２４ Ｚｎ（Ｊ＊　　　　　　　　　　　　　０．６ＢＮａ、
Ｍｏ０ａ　　　　　　　　　　　Ｏ，２４上記のものを
０．１Ｎ　ＨＣＺ　ｌリットルに溶解。

３つのそのようなプレートから胞子を採取し、０．０５
阿トリス−マレイン酸緩衝液（ｐ）１９．０）　２０−
に懸濁せしめる。

工［ｉ　　１０■のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＮＴＧ）を含むバイアルに１０Ｍ１
の胞子懸濁液を添加する。２８℃で６０分間バイアルを
インキュベートおよび振とうした後、１％Ｎａ１Ｊ溶液
にて胞子を存分に洗う。

ｍ　　洗った胞子を１％ＮａＣ１に懸濁し、等量の８０
％エチレングリコールと混合する。この懸濁液を一２０
℃で保存し、突然変異体をスクリーニングのための細胞
源として使用する０発芽させた場合約１０’コロニー／
、＋ｄであった。

この胞子貯蔵物をＹＰＤプレート上に拡げプレート当り
約１００ケのコロニーとする（ＹＰＤ培地は各々Ｌｏｇ
／ｊ！の酵母抽出物、バクトベプトン１およびデキスト
ロース；および１５　ｇ　／　ｌのバクト寒天９から成
り、オートクレーブにかける前にｐＨ６，９に調整する
）、アステリスクで印を付けた成分はデイフコ　ラボラ
トリ−、デトロイト、ミシガン４８２３８から入手可能
である。

！土　２８℃にて２〜３週間後プレートから単一のコロ
ニーを取り、標準の９６穴ミクロタイタープレートの個
々の穴へ置（、またコロニーの少量を新鮮な寒天培地へ
接種し、突然変異体が同定された場合の生存可能な細胞
源となす。

、工程」−各々の穴へ１％グルコース、０．１χカサミ
ノ酸、および各々０．０１％のイソ吉草酸、イソ酪酸お
よび２−メチル酪酸を含有する液状Ｍ９塩培地を約７５
マイクロリツトル添加する。２８℃にて数日インキュベ
ートした後細胞に分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼが
存在するかどうかを検定する（Ｍ９塩培地１リットルは
、６ｇのＮａＪＰＯａ　、３　ｇのＫＨｆＰＯ，，０，
５ｇのＮａＣ１および１ｇのＮ１１４（Ｊを含む。

培地をオートクレーブにかけ、ｌｄづつの無菌１Ｍ　ｎ
ｇｓｏ４および０．ＩＭ　ＣａＣ１ｚを無菌的に加える
）。

工■旦　短時間超音波処理する事により、■塩培地の５
％トルエン微小懸濁液を調製する。２５−のこの懸濁液
に（１４Ｃ−１〕　−２−オキソ−イソカプロン酸（２
，５マイクロキユーリー／ｄおよび１０．０マイクロキ
ユ一リー／マイクロモル）含有溶液を１．２　ｄ添加す
る。この全部の混合物の５０マイクロリツトルを検定さ
れるべきコロニーを含むマイクロタイタープレートの各
々の穴に添加する。

工■工　各々の穴から産生される１４ＣＯ！は、タボー
ルらにより記載されている方法により捕捉および視覚化
される〔ジャーナル　オプ　バクテリオロジ−」皿４８
５−４８６（１９７６）、′多数の試料中の′４ＣＯ□
を検出する筒便な方法：突然変異体の迅速スクリーニン
グへの応用”と題されている〕分枝２−オキソ酸デヒド
ロゲナーゼ活性を欠く突然変異体では対照で観測される
Ｂａ”ＣＯｓの量を超える事はない。

Ｂａ”ＣＯｓの結果としてのオートラジオグラム上の濃
いスポットで示される”ｃｏｗの陽性検定とスポットが
ないかまたは非常に薄いスポットにより示される陰性検
定の間の対照を改良したより洗練された方法は以下の改
良スクリーンを特徴とする。

７〜１４日の増殖後（２〜３週間よりもむしろ早く取り
、前記工程６および７で直接検定する）寒天培地から単
一コロニーを取る（前記工程４）。

前記過程の工程５は省略する。

＋４ｃｏｔ放出に関して事実上定量的であるより洗練さ
れた検定法は１％グルコースおよび０．１％”５ｙｎｃ
ａｓａ−ｂｃａａ″（市販のカサミノ酸とほとんど同じ
組成を持つし一アミノ酸の合成混合物であるが、Ｌ−バ
リン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシンを含まない
、下記参照）を含むＭ９塩培地からなる適切な培地上で
前記スクリーンにより突然変異体が検出できるまで増殖
せしめる事を特徴とする。

”Ｓ　ｎｃａｓａ−ｂｃａａ”の　　　　００１１ダラ
ム／リツトル Ｌ−アラニン　　　　　　　　　３ Ｌ−アルギニン　　　　　　　　４ Ｌ−アスパラギン酸　　　　　　６ Ｌ−シスチン　　　　　　　　　　ｌ Ｌ−グルタミン酸　　　　　　２０ グリシン　　　　　　　　　　　Ｉ Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　２ Ｌ−リジン　　　　　　　　　　７ Ｌ−メチオニン　　　　　　　　３ Ｌ−フェニルアラニン　　　　　６ Ｌ−プロリン　　　　　　　　　１Ｏ Ｌ−セリン　　　　　　　　　　６ Ｌ−スレオニン　　　　　　　　４ Ｌ−チロシン　　　　　　　　　４ Ｌ−）リブトファン　　　　　　　１ 混合物をｐＨ７に調整しろ過殺菌する。１容量の濃縮液
を９９容量の培地に加え標準使用濃度を達成する。

高細胞密度に増殖せしめた後細胞をｎ９塩培地で洗浄し
、前もって超音波処理してトルエンを乳状白色分散液と
した１％トルエン含有冷Ｍ９塩培地に再懸濁せしめる。

ｓｉ胞／緩衝液／トルエン懸濁液を３０℃にて４０分イ
ンキエベートして細胞を透過性となす、透過性細胞をＭ
９塩培地中で洗浄し、元の５分の１の容量のＭ９培地緩
衝液に最終的に再懸濁せしめる。検定に１８０マイクロ
リツトルの本懸濁液を使用する。

トルエン化細胞、チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）
　、０．４１１Ｍ；　　補酵素Ａ（ＣｏＡ）、０．１１
ｍＭ；　　二：ｊチンアミド　アデニン　ジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）、０．６８１１Ｍ；ジチオスレイトール（
ＤＴＴ）、２．６ｍＭ；　ＭｇＣＺｘ、４．ＩＩＩＩＨ
；トリス−ＨＩＪ、６０ｍＭ、ｐＨ７，５；　　および
（１４Ｃ−１〕−アルファーケトイソカプロン酸塩（６
，０００ｃｐｍ。

マイクロモル当り１マイクロキユーリー）が３００マイ
クロリツトルの反応液に含有されている。計数の効率は
７３％であった。２Ｘ２Ｃ１１ワットマン誹４濾紙がバ
イアルのスクリューキャップ内へがっちりと押し込まれ
ている１５ｍのシンチレーションバイアル中で反応を実
施する。濾紙は３０マイクロリツトルの１Ｍ水酸化ハイ
アミン（水酸化メチルベンゼトニウムの１Ｍメタノール
溶液；シグマ　ケミカルＣｏ、セントルイス、ＭＯ６３
１７８から入手可能）を含み、それが反応で発生する１
　４ＣＯ！を捕捉する。

２時間インキエベートした後、濾紙を１０ｄのベックマ
ンアクアゾール■（普遍的なＬＳＣ（液体シンチレーシ
ョンカウンター）でニューイングランドヌクレア　リサ
ーチ　プロダクト、ボストンガへ〇２１１８から入手可
能〕に浸し、４時間またはそれ以上たって平衡にした後
液体シンチレーションカウンターの放射活性を測定する
。空対照反応（即ち細胞なし）では５０−３００ｃｐ−
であった。

突然変異体１−３およびそれと類似のものは空対照反応
と等しいかまたはそれ以下の計数値を与えたが、一方親
株は、空対照値より数倍多い計数値であった。

Ｓ　アベルミ　！スＳ−５ＡＴＣＣ５３６７７の　−工
■土　新鮮ＳＡＭＭ寒天プレート上で４日間増殖せしめ
た約１００■の旦、ヱ至ニアＬｚＱ％九久１−３（ＡＴ
ＣＣ５３５６７）を５０ｍ１のＳＣＭ培地（ｐＨ７，２
）を含む３００　ｍのフラスコ内へ接種する。フラスコ
は３０℃にて２０ＯＲＰＭで２４時間振とうする（最終
ｐＨ＝８．２）。

工ｌ　　振とう器よりフラスコを除き、全プロスの１０
１ｄを無菌チューブにとり２００ＯＲＰＭで遠心分離す
る。細胞は３００ｉの無菌三角フラスコ中の５゜ｄのＳ
ＣＭ培地に再懸濁し、フラスコは回転大振とう器上３０
℃にて２時間振とうする。

工程ユ　ｌＯｄの懸濁液を無菌チューブに移す。

工■土　換気の良いフード内でエチルメタンスルホナー
トをチューブに添加し、中味を十分に混合せしめた後３
００ｍの無菌フラスコに注ぎ、フラスコは回転大振とう
器にて３ｏ″Ｃで３時間振とぅする。

工ｎ　　新鮮な無菌ＳＣＭ培地（４（ｌｄ）をフラスコ
に添加し、総計７０時間になるまで３０℃にて振とうを
続ける。

工Ｕ　　フラスコを取り、内容物は２０’Ｃにて１゜分
間８０００ＲＰ？ｌにて遠心分離する。細胞は５ｃＦＩ
培地に再懸濁する事により洗浄し、再び遠心分離し、１
０Ｗ１のＳＣＭ培地に再懸濁する。

匹り隻−府 酵母自己溶菌物　　　　　　　　１０　ｇ　／　１牛肉
抽出物　　　　　　　　　　５ｇ／１２カゼイン酵素的
加水分解物　　　１０ｇ／ｆＩＮ　Ｍｇ５Ｏｓ　　　　
　　　　　　　　３　ｇ　／　４２１Ｍ　ＫＪＰＯａ；
　　９Ｈ１，Ｏ（Ｈ（Ｊ）　　　　１００ｇ＃！工■１
　突然変異生成集団を希釈し、単一コロニーを取るため
８４７１Ｍ寒天上に拡げる。

ＮａＪＰＯ４６，０ ＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　　　　３．０ＮａＣ１Ｏ
，５ ＮＨ４ＣＩ　　　　　　　　　　　　１．０ＩＭ　Ｍｇ
５Ｏａ　　　　　　　　　　１．００、ＩＭ　ＣａＣ１
ｔ　　　　　　　　　１．０デキストロース　　　　　
　８．０ カサミノ酸　　　　　　　２０．０ 寒天　　　　２０．０ 工ＬｆＬ−人」」こズＭ文ノー　１づＪづしＬ九入株１
−３　（ＡＴＣＣ５３５６７）の突然変異生成集団（３
％エチルメタン　スルホナートンのコロニーを取り、以
下のごとくして調製した寒天培地上にパッチ状に拡げる
（リットル当りのグラム数）：細かくしたでんぷん、８
０；ＫｗＨＰＯａ＊Ｉ：　ＭｇＳＯ４’７ＨｚＯ１１；
　アルダミンｐＨ，５；　ＣａＣＯ５，５；　Ｐ−２０
００，１ｄ：Ｆｅ１ｏ４・７Ｈｚ０，０．０１；　Ｍｎ
１Ｊｉ　’　４１１ｔＯ，０，００１ｉ　　Ｚｎ５Ｏａ
・７Ｈｔ０，０．００１；バクト寒天１７；蒸留水で９
８０ｊｄとする。１２１℃で２０分間オートクレーブす
る直前にＮａＯＨにてｐＨを７．０に調整する。オート
クレーブ後、２０ｍの無菌５％（±）−２−メチル酪酸
貯蔵溶液（ｐＨ７，０）を加える。

寒天培養物を２８°Ｃにて８から１２日間インキュベー
トする。細胞（菌糸体）を寒天表面から取り、２５０マ
イクロリツトルのアセトン中に入れる。２５マイクロリ
ツトルのアセトン抽出物を、アナルテク　シリカゲルＧ
Ｆでコートしである薄層クロマトグラフィープレート上
にスポットする。酢酸エチルを展開溶媒として３０から
４０分クりマトダラムを行い、乾燥し、３％バニリンの
エタノール溶液を噴霧する。プレートを１００°Ｃのオ
ーブン内へ１から３分入れ、３％硫酸のエタノール溶液
を噴霧し、再び１００℃のオープンに１０から１５５分
入る。

アグリコン生成培養物は新規スポット（）ｌｆ約０．’
６３）の発現で同定される。この動きはＡ２ａの酸加水
分解（１％Ｈオｓｏ、メタノール溶液、２５℃、１８時
間）で合成されるＡ２アグリコンと一致する。

１１Ｊｕづ− 盈、ヱ＜）ｋまｑＳ−２８０５（ＡＴＣＣ５３６７７）
培養物の凍結バイアルを、５００ｍの三重にじゃま板を
付けたフラスコ中、１００ｄの＾Ｓ−７培地内へ接種す
る。フラスコは回転大振とう器上２８−３０”Ｃにて２
００ｒｐ−でかきまぜながらインキエベートする。２４
時間のインキュベーシッン後、全プロスのｌａｄを４０
ｍ１のＡＰ−５培地を含む３００ａｆのフラスコ内へ接
種する。

各々４４０ｐｐ−の下に掲げたプライマー化合物の存在
下、２Ｂ　−３０℃ニテ二重（７）４０ｄｆｉ酵を行つ
、Ｗａ酵培地へのプライマー化合物（ＲＣＯＯＩＩ）添
加の時間は右側の欄に示しである。

ブ立不ヱニ化立隻　　　　　　　　蚕１例！■シクロヘ
キサン　カルボン酸　　　　　２４時間シクロペンタン
　カルボン＃　　　　　　９６時間３−チオフェン　カ
ルボン酸　　　　　９６時間２〜メチルチオプロピオン
酸　　　　　２４時間２−メチル酪酸　　　　　　　　
　　　９６時間２６４時間後、全プロス試料を水（Ｉｏ
Ｉｄ）で希釈し、メチレン　クロリドＣ２×２０ｄ）で
抽出する。有機抽出液は乾燥後（ＭｇＳＯ，）蒸発乾固
せしめる。得られる残留物はメタノール（ｌ１１１〕に
溶解し、溶液の３０ｐ！をベックマン　ウルトラスフェ
アＯＤＳカラム（３，９２５０ｍｍ）に注入する。メタ
ノールおよび０．１Ｍ酢酸アンモニウム（８５：　１５
）の混合液を用い一分間１Ｍ１の流速でカラムを溶出す
る。カラム溶出液は直接ＶＧ１２−２５０サーモスプレ
ーマス分光計へ流入している。

都ｍ−池 細かくしたでんぷん１２０ アルゾミン　ｐｎゝ　　　　　　　５ フアルマメジア’　　　　　　　　１５ＣａＣＯ３２ ａバチルス　！　エニホルミスからのアルファーアミラ
ーゼ（ノボエンザイム、ウィルトン、　ＣＴから入手可
能で“テルマミル”の登録商標で販売されている）によ
りデキストロース当量４０％＋５％まででんぷんを加水
分解する事により調製される。

ｂイースト　プロダクト　Ｉｎｃ、＋クリフトン、ＮＪ
０７０１２より ｃ　トレーダーズ　プロティン、メンフィス、　Ｔ８３
８１０８より ２５％ＮａＯＨでｐＨを７．２に調整。

１」Ｌ」Ｅ−池 アルゾミン　ｐＨ’　　　　　　　　５に！）ＩＰＯ４
１ ■ｇｓｏ４　　・７Ｈｚ０　　　　　　　　１ＮａＣ１
ｌ ＣａＣＯ３７ ＦｅＳＯａ　　・７Ｈｚ０　　　　　　　　０．０１Ｍ
ｎＣＺｘ　　’　７Ｈｘ０　　　　　　　　０．００１
ＺｎＳＯ４’７ＨｘＯＯ，００１ Ｐ−２０００（アンチ型）　　　　　　　ｌｄ／　ｆｆ
１２５％ＮａＯＨにてｐＨを６．９に調整。

微生物ＡＴＣＣ５３６７７の培養液の凍結接種物（２ｄ
）を３００　ｍのフラスコ中、でんぷん（Ｉｇ）、ファ
ーマメディア（登録商標）（０，７５ｇ）、アルゾミン
ｐＨ（０，２５ｇ）および炭酸カルシウム（０，１ｇ）
を含む培地内へ接種し、２８°Ｃにて２日間インキエベ
ートする。この接種物（５０ｍ）をでんぷん（１２ｇ）
　、ファーマメディア（８ｇ）、アルゾミンｐＨ（３ｇ
）および炭酸カルシウム（１，２ｇ）を含む第２の接種
フラスコに移し、２８℃にて更に２日間インキエベート
する。この接種物は１５リツトルの広口の醗酵びん内の
でんぷん（１，５ｋｇ）　、硫酸マグネシウム（１５ｇ
）　、ファーマメディア（７５ｇ）　、リン酸水素二カ
リウム（１５ｇ）、硫酸第一鉄（０，１２ｇ）　、炭酸
カルシウム（１０５ｇ）、グルタミン酸（９ｇ）、硫酸
亜鉛（０，０１５ｇ）および硫酸マンガン（０，０１５
ｇ）含有の１５リツトルの培地に接種する。醗酵物は２
８℃にて、３５０ｒ、ｐ、−でかきまぜながらインキエ
ベートし、その間１分間当り１５リツトルの通気を行う
、シクロペンタンカルボン酸を９６時間後（６ｇ）およ
び２１６時間後（６ｇ）に再び添加する。

２４０時間後に菌糸体を濾過して採取し、アセトンで抽
出する（ＳＬ＋０．７ＳＬ洗液）、アセトン抽出液を約
１．５Ｌまで濃縮し、酢酸エチル（３Ｌ）で２度抽出す
る。得られた酢酸エチル層を合併し、蒸発せしめると褐
色油状物を得る（１．２ｇ）。

前記油状物をジエチルエーテルに溶解せしめ、シリカゲ
ルのカラム（４０ｇ）にかける、カラムはジエチルエー
テルで溶出し、１５Ｉｄづつの分画を集める０分Ｈ４−
６を合併し、蒸発せしめると部分的に精製された物質（
１３５■）を得る。生成物をメタノール（０，５ａｅ）
に溶解し、Ｃ１８ゾルパックス０ＤＳ（デュポンの登録
商標）カラム（２１ｍｍ　Ｘ　２５Ｃ１〕上、メタノー
ルおよび水（７５：　２５）の混合物を用い、１分当り
９−の流速で溶出するクロマトグラフィーを行う、適切
な分画を合併し、溶媒を留去すると式（■）（式中、Ｖ
はＯＨであり、二重結合は存在せず、Ｒ２がシクロペン
チルであり、Ｒ３がＣ）ＩＳであり、およびＲ４がＯＨ
である）の化合物を白色粉末（９■）として、ｉｐ、１
３１−１３３℃）得る。

生成物の構造は以下のごとくしてマス分光光度法にて確
認した： ＶＧモデル７０７０Ｅマス分光計にて固体塩化ナトリウ
ムとトリエチレングリコールの試料マトリックスを用い
、高速原子面ｍｌ　（ＦＡＢ）マス分光光度法を実施し
た。　（Ｍ＋Ｎａ）＋が−／ｅ６５１　（計算値６５１
〕に観察された。

ＶＧモデル７０７０Ｆマス分光計を用い電子線衝撃マス
分光光度法を実施した。主なフラグメントの一／ｅ値は
以下のごとくである：　６２Ｂ（Ｍ”）、　６１０゜４
６８、３３５．３１７．２７５．２５１．２３３．２２
３．１７９゜（外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリコシル化アベルメクチン産生能力が欠除しおよ
   び分枝２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を欠いた￥ス
   トレプトミセス￥￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏ
   ｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）であって：好気
   的条件下に同化可能な炭素、窒素および無機塩源および
   式 ＲＣＯＯＨ （式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル
   である）の酸または前記￥Ｓ￥．￥アベルミチリス￥（
   Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｔｉｌｉｓ）に
   より前記の酸へ転換可能な化合物からなる水性栄養培地
   で醗酵せしめた場合Ｃ−０７６化合物のアグリコンを産
   生するもの。 ２、透過性細胞が、添加した〔＾１＾４Ｃ−１〕−２−
   オキソ−イソカプロン酸から＾１＾４ＣＯ＿２を生成す
   る能力がないことを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の￥ストレプトミセス￥￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒ
   ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）。 ３、ＡＴＣＣ５３６７７の同定特性を持つ￥ストレプト
   ミセス￥￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
   ｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）。 ４、￥ストレプトミセス￥￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒ
   ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＡＴＣ
   Ｃ５３６７７。 ５、好気的条件下、同化可能な炭素、窒素および無機塩
   源からなる水性栄養培地で醗酵せしめた場合、実質的に
   物質Ｃ−０７６アグリコンを産生できない、￥アベルメ
   クチン￥￥アグリコン￥産生￥ストレプトミセス￥￥ア
   ベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍ
   ｉｔｉｌｉｓ）であって： 前記培地は式 ＲＣＯＯＨ （式中、Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチ
   ルである）の酸または￥Ｓ￥．￥アベルミチリス￥（Ｓ
   ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）に
   より前記酸へ転換可能な化合物を実質的に含有しないが
   、前記培地が式ＲＣＯＯＨ（式中Ｒはイソプロピルまた
   は（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルである）の酸または前記￥Ｓ
   ￥．￥アベルミチリス￥により前記酸へ転換可能な化合
   物を含む場合前記培地で醗酵せしめるとＣ−０７６アグ
   リコンが産生可能となるもの。 ６、同化可能な窒素、炭素および無機塩源およびアベル
   メクチンアグリコン生合成で利用できる化合物からなる
   水性栄養培地中、特許請求の範囲第１項記載の￥ストレ
   プトミセス￥￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株を好気的に醗酵
   させることからなるアベルメクチンアグリコンの製造方
   法。 ７．￥Ｓ￥．￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）がＡＴＣＣ５３６７
   ７の同定特性を持つ、特許請求の範囲第６項記載の方法
   。 ８．￥Ｓ￥．￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）が￥Ｓ￥．￥アベル
   ミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉ
   ｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ５３６７７である特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 ９、化合物が式 ＲＣＯＯＨ （式中Ｒはアルファー分枝鎖基であり、−ＣＯＯＨ基が
   結合している炭素原子はまた少くとも２つの水素以外の
   原子または基と結合している）の化合物であるか、また
   は醗酵過程の間に前記化合物へ転換可能な化合物である
   特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０、化合物が、Ｒとしてアルファー分枝Ｃ＿５−Ｃ＿
   ８、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシア
   ルキルまたはアルキルチオアルキル基；アルキル基がア
   ルファー分枝Ｃ＿２−Ｃ＿５アルキル基である＿５−Ｃ
   ＿８シクロアルキルアルキル基；各々、メチレンまたは
   １つまたはそれ以上のＣ＿１−Ｃ＿４アルキル基または
   ハロゲン原子で任意に置換されているＣ＿３−Ｃ＿８、
   シクロアルキルまたはＣ＿５−Ｃ＿８シクロアルケニル
   基；または飽和または完全または部分的に不飽和で、１
   つまたはそれ以上のＣ＿１−Ｃ＿４アルキル基またはハ
   ロゲン原子で任意に置換されている３から６員の酸素ま
   たは硫黄含有複素環を有する、かまたは醗酵過程の間に
   前記化合物へ転換可能な化合物である特許請求の範囲第
   ９項記載の方法。 １１、基質ＲＣＯＯＨへ転換可能な化合物が式Ｒ−（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｎ−Ｚ 〔式中Ｒは前に定義したとおりであり；ｎは０、２、４
   または６であり；およびＺは−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨＯ
   、−ＣＯＯＲ＾５、−ＣＨ＿２ＮＨ＿２または−ＣＯＮ
   ＨＲ＾６（式中Ｒ＿５はＨまたは（Ｃ＿１＿〜＿６）ア
   ルキルであり；Ｒ＾６は水素、（Ｃ＿１＿〜＿４）アル
   キル、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ＿２ＣＯＯＨ−ＣＨ（Ｃ
   ＯＯＨ）（ＣＨ＿２）＿２ＣＯＯＨまたは−ＣＨ（ＣＯ
   ＯＨ）（ＣＨ＿２）＿２ＳＣＨ＿２である）である〕 の化合物である特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、Ｒが シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロヘキシル、 シクロヘプチル、 ２−メチルシクロプロピル、 ３−シクロヘキセニル、 １−シクロペンテニル、 １−シクロヘキセニル、 ３−メチルシクロヘキシル（シス／トランス）、４−メ
   チレンシクロヘキシル、 ３−メチルシクロブチル、 ３−メチレンシクロブチル、 ３−シクロペンテニル、 １−シクロプロピルエチル、 ３−フルオロシクロブチル、 ４，４−ジフルオロシクロヘキシル、 イソプロピル、 ｓｅｃ−ブチル、 ２−ペンチル、 ２，３−ジメチルプロピル、 ２−ヘキシル、 ２−ペント−４−エニル、 ２−メチルチオエチル、 Ｓ−２−ペンチル、 Ｒ−２−ペンチル、 ２−チエニル、 ３−チエニル、 ４−テトラヒドロピラニル、 ３−フリル、 ２−クロロチエニル、 ３−テトラヒドロチエニル、 ４−メチルチオ−２−ブチル、 ４−テトラヒドロチオピラニル、 ４−メトキシ−２−ブチルまたは ４−メチルチオ−２−ブチル である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、Ｒが式Ｒ−ＣＯＯＨのカルボン酸から誘導される
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、Ｒがシクロペンチル、シクロヘキシルまたはチエ
   ニルである特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、醗酵中Ｒ−ＣＯＯＨへ転換可能な化合物からＲが
   誘導され、前記化合物は式 Ｒ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｚ 〔式中Ｒは前に定義したとおりであり；ｎは０、２、４
   または６であり；Ｚは−ＣＨ＿２ＯＨ、−ＣＨＯ、−Ｃ
   ＯＯＲ＾５、−ＣＨ＿２ＮＨ＿２または−ＣＯＮＨＲ＾
   ６（式中Ｒ＿５は（Ｃ＿１＿〜＿６）アルキルであり；
   Ｒ＾６は水素、（Ｃ＿１＿〜＿４）アルキル、−ＣＨ（
   ＣＯＯＨ）ＣＨ＿２ＣＯＯＨ、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（Ｃ
   Ｈ＿２）＿２ＣＯＯＨまたは−ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ
   ＿２）＿２ＳＣＨ＿３である）である〕 の化合物である特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １６、Ｒがアルファー分枝Ｃ＿３−Ｃ＿８アルキル基で
   ある場合、それはイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−
   ブチルではない特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １７、￥Ｓ￥．￥アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
   ｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株が￥Ｓ￥．￥
   アベルミチリス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅ
   ｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ５３６７７である特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １８、アベルメクチンアグリコンを産生する￥ストレプ
   トミセス￥（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する新
   規菌株であって： 前記菌株は￥ストレプトミセス￥￥アベルミチリス￥（
   Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）
   ＡＴＣＣ５３５６７を突然変異する事により得られ、好
   気的条件下、同化可能な炭素、窒素および無機塩源から
   なり、式 Ｒ−ＣＯＯＨ （式中Ｒはイソプロピルまたは（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル
   である）の酸または￥ストレプトミセス￥（Ｓｔｒｅｐ
   ｔｏｍｙｃｅｓ）属菌により前記酸へ転換可能な化合物
   を実質的に含んでいない水性栄養培地中で醗酵せしめた
   場合、実質的に物質Ｃ−０７６アグリコンを産生できな
   いもの。