JPH01153700A - エイズ診断用ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 （１）発明の分野 本発明は後天性免疫不全徴候群（ＡＩＤＳ）関連抗体の
ヒ忙血清中での検出に有用な新規な合成ペプチドおよＹ
それらのペプチドとペプチド−担体共役物の調製方法に
関する。本発明はさらにこれらの抗体の検出のための診
断テストに関する。

もつと具体的には、本発明は式、 Ｈ２Ｎ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−＝　２− ＩＩ　ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｊ！ａ　−Ｖａ
、ｅ−−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ。

５ｅｒ−Ｃｏｏｌ−１ および １１　２　　Ｎ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｇｊ！ｙ−ＬＶｓ−
Ｌｅｕ−Ｉｊ！ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌ　ａ−８ｅ　ｒ
−ＣＯＯＨ の化合物およびヒト血清中のＬＡＶ／トＩＴＬＶ−■抗
体の検出に有用なペプチド−担体共役物に関している。

本発明はまた上記ペプチド−担体共役物の使用を伴なう
診断テストによりこれらの抗体の検出方法に関している
。

（２）　　先行技術の説明 ヒトＴリンパ趨向性趨向性ウィルスフパ趨向関連’）イ
／Ｌ／ス（ＨＴＬＶ−Ｉ［［／Ｉ−ＡＶ）　は後天性免
疫不全徴候群（ＡＩＤＳ）の主たる原因と考えられてい
る。

ＨＴＬＶ−１ウイルスに感染したほとんどの患者は主要
ウィルス蛋白であるコア蛋白ｐ２５および２つのエンベ
ロープ−糖蛋白Ｑｐ４１およびｇｌ）１１０に対する抗
ウイルス抗体を産生ずる。

現在存在するＡＩＤＳの診断のための血清学的テストは
血清抗体の存在はウィルスの存在を示すのでウィルスに
対する抗体の検出を基本としている。ＡＩＤＳに対して
現在使用できる血清学的テストには精製ウィルスまたは
生合成ウイ＝ルスペブチドを用いるＥＬＦＳＡ技術があ
る。ウィルス粒子を用いるウェスタンブロッティング或
いは放射免疫沈降アッセイおよびウィルス感染細胞を用
いる間接免疫蛍光も現在使用できるテストの例である。

ＥＬＩＳＡ法を使用する時の主な問題点としては患者血
清と診断４：ツ］へに使用される抗原性物質との非特異
反応のため起る高頻度の偽陽性の結果である。このにう
な非特異的反応は血清学的アッセイの抗原としてウィル
ス特異の合成ペプチドを用いることにより回避できる。

ＨＴＬＶ−Ｉｆｆのｅｎｖ−ｆｏｒ領域の遺伝子断片に
よりコードされる８２個のアミノ酸残基を含む大腸菌に
より生産されたペプチドがＩ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−１［
［に感染した患者の血清中の抗体を再現よく検出できる
ことがＣｈａｎｇら、Ｂｉ’ｃ）ｔｅｃｔ）ｎｏｌ’ｏ
ｇｙ　３巻、９０５−９０９頁（１９８５年）、により
明かにされている。それより前、５ｅｌａ、’／ｉｄＶ
川ｍｎｉ用ｕｎｏｌ’、　５巻、２９頁（’１９６６年
）、は蛋自質の抗原性部位は６から７個のアミノ酸残基
の“ことらあると示している。

〈発明の要約〉　　　　　　　　　　　□本発明の目的
は、適当な担体と結合した時にＡＩＤＳ患者から採取し
た血清中の□抗−Ｌ、’Ａ’Ｖ／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体
を検出することの出来る新規なペプチドを提供すること
にある。

また、容易に入手できる原料から始め゛て、有毒な試薬
を用いることなく、円滑な操作で簡単に除去できる保護
基を用い、本発明による新規ペプチドを調製する便利な
方法を提供も−ることも本発明の目的である。

さらに、血清試料中の抗−ＬＡＶ／ＨＴＬＶ−■抗体検
出に有用なペプチド−担体共役物を提供することも本発
明の目的である。

また、上記ペプチド−担体共役物を利用した診断テス１
〜を提供するのも本発明の目的である。

本発明によれば、式； ％式％ で示される合成ペプチドが提供される。

本発明によれば、上記ペプチドおよびスカシガイヘモシ
アニン（ＫＬＨ）のような適当な担体とに由来する共役
物が提供される。

本発明によればさらに、樹脂支持体を準備し、樹脂支持
体にアミノ基と水酸基を保護したセリンを結合し、結合
物からアミノ基の保護基を除去し、続いてα−アミノ拮
を保護したアミノ酸を結合して合成ペプチドを製造する
ことによる上記ペプチドを調製する方法が提供される。

本発明によればまた、上述のペプチド−担体共役物の一
定量を準備し、これを抗体を含むと思われる血清試料に
添加し、血清中の抗体の存在の有無を検出することより
成る血清試料中の抗−Ｌ　ＡＶ／ＨＴ　Ｉ　Ｖ’−１抗
体の検出方法が提供される。

〈好ましい実施態様の説明〉 一つ目の合成ペプチドはＨＴＬＶ−１［ｒのｅｎｖ−１
ｏｒ領域６０６−６２０の配列に重複するアミノ酸配列
を有し、これはＣｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ３巻、９０５−９０９頁（１９８５年）、の「ペプ
チド１２１」の４０−５４アミノ酸配列に対応する。二
番目のペプチドはＨＴＬＶ−Ｉ［１のｅｎｖ−１ｏｒ領
域の６０５−６２０のアナログで６０５の位置のシステ
ィンがヂロシンでＩｎされている。

これらの化合物は適当な担体（ＢＳＡ、ＫＬＨ、ポリ−
／’ｊ！ａ−ＬｙＳ）と共役さゼるとＡＩＤＳまたはＡ
ＴＤＳｆＳＱ達群の患者血清中の抗−ＬＡＶ／１−ＩＴ
ＬＶ−１［１抗体検出のために使用できる。

本発明の使用態様では、新規化合物は有効から正確で安
価な抗−Ｌ　Ａ　Ｖ　／　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１［［抗体
の定型的診断テストを提供する。

本発明のペプチドは一般的に知られる樹脂で支持された
アミノ酸から出発してアミノ酸配列を栴築する方法に従
って、固相法により調製される。

目的物はＨｅｒｒｉｆｉ（！ｌｄの方法、Ｊ、　Ａｍ、
、　ＣＩ＋ｅｍ、　Ｓｏｃ。

８５巻、２１４１頁（１９６３年）、によっても調製で
きる。しかし、Ｃｈａｎ（］およびＨｅ１ｎｈｏｆｅｒ
。

Ｉｎｔ、、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、
Ｒｅｓ、１１巻、２４６頁（１９７８年）の改良法を本
発明の好ましい方法として例示する。

使用する樹脂支持体は通常同相法で一般に使用されるど
んな適当な樹脂でもよいが、好ましくは、０．５から３
％のジビニルベンゼンで架橋し、最初に導入する保護ア
ミノ酸とエステル形成する部位を作成するためにクロロ
メチル化したポリスチレン、或いはＨｅｊｎｈｏｆｅｒ
ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ　
Ｒｅｓ、　１３巻、３５頁（１，９７，９年）、の方法
による、最初の保護アミノ酸をｐ−ベンジルＡキシアル
コール樹脂に導入して酸により不安定な結合を用いるな
どによる。この樹脂支持体はクロロメチル化した樹脂を
［Ｕら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ。

４６巻、３４３３頁（１９８１年）により４−ヒドロキ
シメチルフェノールと反応させて適当に調製される。樹
脂支持体にアミン基と水酸基を保護したセリンを結合後
、アミノ、保護基を同相ペプチド合成で通常使用される
公知の標準法により除去する：即ち、塩化メチレン中の
希薄トリフルオロ酢酸溶液またはジメチルホルムアミド
中のどベリジンを用いる。アミン保護基、を除去後、残
りのα−アミノ基を保護し、必要なら側鎖も保護したア
ミノ酸を順次、目的の配列で結合して目的物を得る。或
いは、液相法を用いて、アミノ酸を結合しておいてから
樹脂支持アミノ酸に結合することも出来る。結合試薬の
選択は確立した方法に従う。例えば、適した結合試薬と
してはＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド ー　９　＝ 口へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を単独または好ま
しくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下で使用
する。他の有効な結合方法は保護アミノ酸の対称無水体
を利用する。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列を同相反応槽に２−
６倍モル過剰で導入し、結合反応はジメヂルホルムアミ
ド：塩化メチレンまたは塩化メチレン単独中で行なう。

結合が不完全な場合には、α−アミノ保護基を除去して
次のアミノ酸を固相反応槽に人．れる前に．結合反応を
もう一度くり返す。

合成各段階の結合反応の度合はＥ．Ｋａｉｓｅｒら、Ａ
ｎａｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．３　４巻、５９５頁（１９
７０年）、により記載されるニンヒドリン反応によりモ
ニターする。

合成中２ポリペプチド鎖に導入する各アミノ酸に使用す
る必要なα−アミノ保護基は好ましくは９−フルオレニ
ルメチロキシカルボニル（Ｆｍ　ｏ　ｃ　）であるが、
結合反応条件下で分解せず、分子中に存在する他の保護
基の存在下で選択的に容易に除去される限り他のどのよ
うな保ｆＪｇ＜＝　１０　− でも使用できる。そのようなα−アミノ保護基の例とし
てはポリペプチド分子の残りの構造的特徴を考慮して、
さらにｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）、２
−　（４−ビフェニル）プロピル−２−オキシカルボニ
ル（Ｂｌ）ＱＣ）、または２（３，５−ジメトキシフェ
ニル）プロピル−２−オキシカルボニル（Ｄｄｚ＞およ
び関連試薬がある。

側鎖アミノ酸の保護基選択の基準は、（ａ）各合成ステ
ップのα−アミノ保護基除去に選択的な条件下に於ける
種々試薬への保護基の安定性＝（ｂ）保Ｍ基はその本来
の重要な性状（例えば結合反応条件下で分解しない）を
保持していな（）ればならない：そして（Ｃ）保護基は
ポリペプチド合成の終結時にその弛のポリペプチド構造
には影響を及ぼさない条件下で容易に除去されねばなら
ない。本発明で使用する好ましいアミノ酸側鎖保護基は
セリン、スレオニンおよびチロシンにはｔｅｒｔ−ブチ
ル基、リジンにはｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（Ｂ
ＯＣ）、そしてシスティンにはトリチル基である。

完全保護の樹脂結合ペプチドはｐ−ベンジルオキシアル
コール樹脂より塩化メチレン中５０−６０％のトリフル
オロ酢酸溶液中、アニソール、チオアニソール、エチル
メチルスルフィド、１．２−エタンジチオールおよび関
連試薬のような適当なスカベンジャーの存在下で室温に
て１−６時間処理で切断する。同時に全ての酸不安定な
側鎖保′ａ基が除去される。

抗体を形成させ、イムノアッセイを実施するために、精
製ペプチドは甲状腺グロブリン、ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）、卵アルブミン、スカシガイヘモシアニン（に
ｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）
（ＫＬＨ）またはポリ−Ｄ　Ｌ−アラニン−ポリーＬ−
リジンおよび関連分子のような適当な担体と共役さゼる
。ペプチド−担体共役体の生成のための共役結合法の選
択は確立されている方法に従う。

試薬結合のための好ましい結合方法は水可溶性三官能基
スルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルである。第一段階としてスカシガイヘ
モシアニン（ＫＬＨ）のアミン基を試薬の活性化Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル基でアシル化して外に
突ぎ出したマレイミド基を有するＫＬＨを得る。第二段
階として後者を合成ペプチドのＳＨ基と反応させてペプ
チド−担体共役物を得る。

〈実施例〉 実施例１ 塩化メチレン（４０ｍり一ジメチルホルムアミド（１０
ａｉ’）混合物に溶解した９−フルオレニルメチルオキ
シカルボニル−Ｑ　−ｔｅｒｔ−ブチル−セリン（４，
０２ｇ、１０．５ｍ　ｍｏｌｅ）を２０ｇのｐ−ベンジ
ルオキシアルコール樹脂（置換０．３５ｍｅｑ、／ｇ、
７．０１　ｍｏｌｅ）の塩化メチレン（１６０＃Ｉｅ）
−ジメチルホルムアミノド（４０ｄ）混合液中【ノん濁
液に０℃で添加した。混合物を手で数秒間撹拌し、次に
Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド １　１　、　５　５＋＋＋　ｍｏｌｅ＞で処理し、続い
て４−ジメチルアミノピリジンの触媒ｆｉｔ　（１　２
８■、１．０５ｍ　ｍｏｌｅ）で処理した。混合液を０
℃でさらに３０分間撹拌し、次に室温で一晩行なった。

濾過した樹脂を塩化メチレン、ジメチルホルムアミドお
よびイソプロパツールで次々に洗滌しく夫々３回ずつ）
、最後に塩化メチレンで洗う。樹脂を水槽で冷却した塩
化メチレン（２０’Ｏｄ）にけん濁し、そのけん濁液に
再蒸留したピリジン（５．２ｄ、４　５　ｍ　ｍｏｌｅ
）　、続いてベンゾイルクロリド（５．　２ｒｔｄｌ，
　４５ｍ　ｍｏｌｅ）を撹拌しながら添加した。撹拌は
０℃で３０分間、続いて室温で６０分間続けた。濾過後
、樹脂を順次゛塩化メチレン、ジメチルホルムアミドお
よびイソプロパツール（各３回ずつ）で、最後に石油エ
ーテル（２回）で洗滌し、高真空下で重量が２３．８ｇ
の一定値となるまで乾燥した。

Ｈｅｉｎｈｏｆｅｒら、Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ。

１３巻、３５頁（１９７９年）、の方法による置換度の
分光光疫測定の結果、樹脂の置換は０、３２５ｍｅＱ、
／’ＪＴア”）り。　　１実施例２ ステル Ｖａｊ！−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ　−Ｂｕｔ 芽 ５ｅｒ−Ｑ−樹脂 前述の実施例１からの９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル− 脂（４．　０ｇ）をＬａｂｏｒｔｃｃ　　ＳＰ　　６４
０へ７チド合成機の１２５ＩＩＩ！反応槽に入れ、以下
のように処理する： １、５０ｄ！のジメチルホルムアミド（１分間ずつ２回
）で洗う。

２、ジメチルホルムアミド中のピペリジン２０％溶液６
０ｄで前洗滌する（３分間）。

３、ジメチルホルムアミド中のピペリジン２０％溶液６
０−で脱保護基を行なう（１０分間）。

４、５０７のジメチルホルムアミドで洗滌する（３０秒
間ずつ４回）。

５、６０ｄのイソプロパツールで洗滌する（３０秒間ず
つ２回）。

６、５０ａｅのジメチルホルムアミドで洗滌する（４５
秒″間ずつ２回）。

７、遊離アミノ基の検査−ＫａｉＳｅｒテスト（ＩＩ性
でなければならない）。

８、次に６０ａｌ！の乾燥した再無情ジメチルボルムア
ミドに溶解した３モル量の目的 Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸および３．６モル量の１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールとペプチド樹脂とを静かに２
分間振とうさせる。

９、次に反応槽に固体Ｎ，Ｎ’ージシクジンキシルカル
ボジイミド ル等量）。

１０、反応液を２時間振とうする。

１１、　６０ａｄ！のジメチルホルムアミドで洗滌する
（４５秒間ずつ２回）。

１２、６０ｍｌ！イソプロパツールで洗滌（４５秒間ず
つ２回）。

ステップ１２の後、一部をとってニンヒドリンテストを
行なう：テストで陰性であったら次のアミノ酸の結合反
応のためステップ１に戻る。テス］〜が陽性またはやや
陽性であればステップ６に戻って１２まで再びやり直す
。

上記スケジュールを本発明で記載されるペプチドの各ア
ミノ酸の結合に用いる。合成を通して、９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）によるＮ−α−
保護を残りのアミノ酸のそれぞれに使用する。

次に以下のアミノ酸残基を順次導入した：Ｆｍｏｃー１
ーーアラニン（４ｍ　ｍｏｌｅ）　、Ｆｍｏ　ｃ−Ｌ−
アスパラギン（４ｍ　ｍｏｌｅ）　、Ｆｍｏｃ−１−ト
リプトファン（４ｍ　ｌｌｌｏＩｅ）　、Ｆｍｏｃ−Ｌ
　−プロリン（４ｍ　ｍｏｌｅ）　、Ｆｍｏｃ−１−バ
リン（４ｎ＋　ｇ＋ｏｌｅ）　、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニ
ン（４ｍ　ｎ＋ｏｌｅ）　、Ｆｍ　ｏ　ｃ”　−　０　
−　ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン（４ｍ　ｍｏｌ
ｅ）　、Ｆｍｏ　ｃ−０−ｔｅｒｔ−ブチル−し−スレ
オニン（４ｍ　ｍｏｌｅ）　、Ｆｍｏｃ　−ｓ−トリチ
ル−Ｌ−システィン（　４　ｍ　ｍｏｌｅ）、Ｆｍｏｃ
−Ｌ−イソロイシン（　４　ｒｏ　ｍｏｌｅ）、ＦＩＴ
ＩＯＣ−ｌ−０イシン（４ｍ　ｍｏｌｅ）　、Ｆｍｏ　
ｃ−　Ｎ６−　ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル−１−
リジン（４ｍｍ０１ｅ）、ＦｍＯＣ−グリシン（　４　
Ｉｌｌ　ｍｏｌｅ）　、およびＦ　ｍ　ｏ　ｃ　−　０
　−　ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン（　４　ｍ　ｍｏ
ｌｅ）。最後のアミノ酸を添加後、Ｎ末端のセリン残基
のＮ−α−Ｆｍｏ　ｃ基を上記スケジュールのステップ
１から７までを−　１８　＝ くり返して除去する。ペプチド樹脂を塩化メチレンで洗
滌し、真空乾燥して６．８ｇの固体物質を得た。

実施例３ ン ）−ｌ　　２　　Ｎ　　−Ｓ　ｅ　　ｒ−Ｇ　　１　ｙ
−Ｌｙｓ−Ｌ’ｅｕ　　−ＩＪ！ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｔｈｒ−Ａｊ！ａ−Ｖａｊ！−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ
−△ｊｉａ−３ｅｒ−ＣＯＯＨ 上述（実施例２）の保護ペプチド−樹脂（３，４ｇ）を
２．５％の１．２−エタンジヂオールおよび２．５％の
アニソール含有の塩化メチレン中５５％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）溶液３０ｄにけん濁した。混合液に窒素を
噴入し、室温で１．５時間撹拌した。、混合液を濾過し
て樹脂を塩化メチレンで洗滌する。樹脂を再び１．２−
エタンジヂオール（０，２５％）含有の塩化メチレン中
２０％のトリフルオロ酢１１（ＴＦＡ）溶液３０ｍＩ！
で室温にて５分間処理した。混合液を濾過して樹脂を塩
化メチレン中２０％のＴＦＡ溶液で、続いて塩化メチレ
ンで洗滌した。、濾液を合わせて３５℃以下にて真空上
濃縮し、残留物を乾燥ジエチルエーテルで数回振る。固
型物を１０％酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥して粗表記
化合物（６６７Ｉｆｔｇ）を得た。

実施例４ 上記粗ペプチド（実施例３）（４１０ＩＲｇ）をｖｙｄ
ａＣＣ１８シリカ（粒径１０μ、孔径３００人）のカラ
ム（２，５Ｘ２５ｃｍ＞を用いた調製用　２ｏ　− ＨＰＬＣで精製し、目的物を１５％の溶媒へから５５％
の溶媒Ｂまで４５分間、８ｄ／ｍｉｎの流速で直線勾配
により溶出した（溶媒Ａは０．１Ｍトリエチルアンモニ
ウムりん酸、ｐＨ２，２５で溶媒Ｂはアセトニトリル（
６０％）とＡ（４０％）の混合液である。）。溶出液は
２２Ｏｎｌｌｌでモニターし、各分画につぎ下記条件下
の分析用ＨＰＬＧで分析して適当な純粋画分をまとめた
。まとめた画分のアセトニトリルを室温真空下で蒸発さ
せ、残りの溶液を０．０６％トリフルオ［ｌ酢酸水溶液
から０．０６％トリフルオ０［アセトニトリル溶液の直
線勾配（２０分間で０％から６０％）を用いた同じカラ
ムで脱塩した。まとめた両分を凍結乾燥して１７７＃＋
９の精製目的物を得た。

この精製物質について０１８　μｍＢｏｎｄａｐａｋカ
ラム（３、９ａｍＸ　３０ＣＩＲ）を用いたＶａｒｉａ
ｎ５０００システムの分析用１−Ｉ　Ｐ、　Ｌ　Ｃで、
０，０６％ＴＦＡ水溶液から０２０６％ＴＦＡアセトニ
トリル溶液への直線勾配（５０分間でＯから５０％）を
用いて流速１ｍ１／分、圧力６２　ａｔｍ、で純度を調
べた。

２２０ｎｍのピークはＶａｒｉａｎの可変波長検出器で
検出した。目的物質は３５．９分の保持時間で溶出し、
Ｉｌｌ！疫は９６％であった。

ペプチドの薄層アッセイ系（シリカ、ｍｅｒｃｋＦ　２
５．４　＞でのＲｆ値は、ｎ−ブタノール：酢酸：酢酸
エチル：水（１：１：１：１）で０．３９、ギ酸：酢酸
：水：メタノール（１ニア：２：１０）を溶媒として０
．７２であった。

ペプチドを６Ｎ−塩酸中（０，２１＋Ｉｌ！／２０ｎｍ
ｏｌｅペプチド）１１０℃２０時間密封系で加水分解し
た結果、全ての、予想アミノ酸が以下の割合で存在する
ことがわかった： Ｌｙｓｌ、０３　（１）　、Ｔｒｐｌ、１５　（１）、
Ａｓｐｏ、９９　（１，）　１．Ｔｈ　ｒ、１、．８４
　（２）、５ｅｒ１．．８１．（２＞、Ｐｒｏ１．０２
　（Ｌ）、ＧＩＶ、０．９９．　（Ｌ）　、Ａ、Ａ、ａ
　１、．９９、（２）、１／２　Ｃｙｓｔ、　５　（１
）１．Ｖａ、１．０．９９（１）、Ｉｊ！ｅｏ、７３．
（１）、Ｌｅｕｌ、０（１）。

目的ペプチドは精製固体の９４％を構成してい−２２＝ ることがわかった。

実施例５ Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｇｊ！ｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
１ｊ！ｅ−ＣｙＳ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ　！　ａ　−Ｖ
　ａ　１−　Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｔ　ｒ　Ｏ−八５ｎ−Ａｊ
！ａ−８ｅｒ−ＯＨ 実施例２のペプチド樹脂６８０Ｒｇを実施例２に記載さ
れる方法に従ってＦｍｏｃ−０−ｔｅｒｔ−ブチル−し
−ヂロシンと反応させた。Ｆｍｏｃ基を除去し、ペプチ
ド樹脂を塩化メチレンで洗滌して真空下で乾燥して７６
０ｍｇの固体を得た。このペプチド樹脂を実施例３に記
載すると全く同じ方法で切断および脱保護基を行なって
表記化合物を得た（１５０＃！Ｆ）。これを実施例４と
同じように精製して３７．５■の精製表記化合物を得た
。

精製物質を実施例４に記載される分析用ＨＰ　Ｌ、　Ｃ
によりその純度を検定した。目的物は保持時間３７．２
分で溶出し、純度は９７％であった。

薄層アッセイ系（シリカ、ＨｅｒｃｋＦ２５４）におけ
る本ペプヂドのＲｆ値は、ｎ−ブタノール：酢酸：酢酸
■チル：水（１：１：１：１）は０．６１、クロロボル
ム：メタノール＝３２％酢酸（５：３：１）の溶媒での
Ｒｆ値は０．５６であった。

ペプチドを６Ｎ−塩酸中（０，２ａｅ／２０ｎｍｏｌｅ
ペプチド）１１０℃２０時間密封系で加水分解した結果
、全ての予想アミノ酸が以下の割合で存在することがわ
かった： Ｉ　ｙｓｌ、Ｏ（１）、Ｔｒｐｌ、１３　（１）、ＡＳ
Ｉ）０．９７　（１）、Ｔｈｒｌ、８２　（２）、５ｅ
ｒ１．８０　（２）、Ｐｒｏｌ、０　（１）、Ｇｊ！ｙ
１．Ｏ（１）、Ａｊ！ａ１．９４　（２）、１／２　Ｃ
ｙｓｔ、７２　（１）、Ｖａｌｏ、９６（１）、　１１
ｅ０．７２　　（１）、Ｌｅｕｌ、０（１）、ＴＶｒｏ
、９７　　（１）　　。

ペプチドのＩ１１！痕は９４％と検定された。

実施例６ 艮 スルボスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニ
ルブチル−１・）（スルホ−８ＭＰＢ。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）　　（１３、９ｊ
ｌｆｆ）を水に溶解（１，４１１１１り　したものを０
．９ｄの０．０２Ｍりん酸シトリ１クム緩衝液（ｐＨ７
，０）中のスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）（１７，
，９■）に添加した。得ら・れる溶液を室温で４５分間
振とうし、活性化担体を直ちに４℃で０．１Ｍりん酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，０＞で平衡化したゼファデツ
＝　２５− クスＧ−２５にのせる。この緩衝液で溶出すると未反応
のスルホ−′ＳＭＰＢが除去される。２８０ｎｍの吸収
の最初のピークを集めると活性化に’　Ｌ　Ｈを含有し
ていた。このピークを丸底フラスコに移し、２．０Ｉｌ
ｄ！の０．．０５Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１６
，２）に溶解した表記ペプチド（２ｏＩＩｔｇ＞を添加
した。混合液に窒素を十分噴入し、室温で一晩インキユ
ベートした。次にこれをりん酸緩衝溶液（ｐＨ１７，４
）に対して透析した。結合効率は放射活性標識ペプチド
を用いてモニターし、４６％とわかった。

実施例７ 本実施例は血清中の抗ＬＡＶ／ＨＴＬＶ−１１抗体を検
出する試験への上述ペプチドの一つの使用に関する。こ
れはＥｎｇｖａｌｌ　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｌｌ　
０９巻、１２９−１３５頁（１９７２年）およびＶａｎ
　Ｗｅｅｍａｎら、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　　２４巻、７７−８１頁（１９７２年）の方法に従っ
て実施するプレート結合アッセイである。ＥＬＩＳＡプ
レートの各列をＫＬＩ−（ＳＫＬＨ−結合ペプチドまた
はＭ両液のみ（トリス−塩酸０．０１Ｍ：ＮａＣｊ！０
．５Ｍ：Ｔｗｅｅｎ　２０　０．０５％＝ｐＨ７，５）
のいずれかで感作する。この実施例では８、０　’　５
ｈａｕｏｈｎｅｓｓＶ　　（１−ＣＤ　Ｃ、オタワ）博
士から入手した１２０血清試料の対照パネルを使用した
。

抗−ＬＡＶ／ＨＴＬＶ／ＩＩ抗体の存在を示す陽性反応
がその抗体を含有することがわかっている５７の血清試
料のうち５１試料で観察された。陰性反応（抗−ＬＡＶ
／＋１−ＬＶ−Ｉ抗体の非存在）は抗−ＬＡＶ／ＨＴＬ
Ｖ−１抗体が存在しないことのわかっている［ｌ［Ｉ清
試料６３のうち６３試料で観察された。間違った陽性反
応は観察されなかつ観察数／試験数　　　　　％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）【遺伝子配列があります。】 および 【遺伝子配列があります。】 の式で示される化合物より成るグループから選択される
   合成ペプチド。 ２）特許請求の範囲第１）項に記載のペプチドを共役物
   を生成できる担体と共役させて得られるペプチド−担体
   共役物。 ３）該ペプチドが該担体とＳＨ基を介して結合している
   特許請求の範囲第２）項記載のペプチド−担体共役物。 ４）該担体がスカシガイホモシアニンより成る特許請求
   の範囲第３）項記載のペプチド−担体共役物。 ５）特許請求の範囲第４）項記載のペプチド−担体共役
   物の一定量をとり、該共役物を抗−ＬＡＶ／ＨＴＬＶ−
   III抗体を含有する血清 試料に添加し、該血清試料中の該抗体の存在の有無を検
   出することより成る血清試料中の抗−ＬＡＶ／ＨＴＬＶ
   −III抗体の検出方法。