JPH01157388A - 形質転換方法 - Google Patents
形質転換方法Info
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- JPH01157388A JPH01157388A JP31210287A JP31210287A JPH01157388A JP H01157388 A JPH01157388 A JP H01157388A JP 31210287 A JP31210287 A JP 31210287A JP 31210287 A JP31210287 A JP 31210287A JP H01157388 A JPH01157388 A JP H01157388A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は大腸菌の形質転換法に関する。
大腸菌の形質転換には塩化カルクラム処理による受容細
胞を用ｉる方法が一般的である。この時、従来に形質転
換に先立って作成した受容細胞をバイアル瓶中に凍結保
存しておき、形質転換操作を行う際にこれを解凍し、使
用量（１回約α１〜α２ｓ＋ｊ）ｉガラス製試験管に取
り、残りの受容細胞は再凍結保存することが行われてい
る。
胞を用ｉる方法が一般的である。この時、従来に形質転
換に先立って作成した受容細胞をバイアル瓶中に凍結保
存しておき、形質転換操作を行う際にこれを解凍し、使
用量（１回約α１〜α２ｓ＋ｊ）ｉガラス製試験管に取
り、残りの受容細胞は再凍結保存することが行われてい
る。
そして形質転換操作において、受容細胞へＤＮＡ懸濁液
を混合し０℃で保持した後、水浴を用いて５７ないし４
５℃への急速な加熱をすることが行われる。これを熱パ
ルスの印加と言い、形質転換において重要な操作である
。
を混合し０℃で保持した後、水浴を用いて５７ないし４
５℃への急速な加熱をすることが行われる。これを熱パ
ルスの印加と言い、形質転換において重要な操作である
。
従来の方法でに、形質転換操作を行うごとに保存され九
受容細胞の解凍、凍結を繰り返すことになり、受容細胞
の形質転換効率がしだいに低下する傾向が見られる。ま
九解封、分注操作を繰り返し行うことになるので、操作
が繁雑であり、またその間における雑菌による汚染も問
題になる。
受容細胞の解凍、凍結を繰り返すことになり、受容細胞
の形質転換効率がしだいに低下する傾向が見られる。ま
九解封、分注操作を繰り返し行うことになるので、操作
が繁雑であり、またその間における雑菌による汚染も問
題になる。
そこで本発明者に受容細胞を１回使用量ずつに受容細胞
を小容量のプラスチック製ふた付き使いすて試験管に分
注保存し更にこの試験管中で形質転換操作を行うことを
考えたが、従来の加熱法に従って熱パルス印加をすると
、グラスチック製試験管壁は、ガラス製試験管壁に比べ
伝熱抵抗が大きいため、内部の受容細胞の良好な急速加
熱ができず、形質転換の効率が非常に低下してしまうば
かりでなく、保存性の良好な小容量のグラスチック製試
験管は外形が小さいため水浴で加熱すると水浴の水によ
る内部受容細胞試料の汚染を受けやすく、かえって従来
法以上に雑菌汚染を起こしやすいという問題が生じた。
を小容量のプラスチック製ふた付き使いすて試験管に分
注保存し更にこの試験管中で形質転換操作を行うことを
考えたが、従来の加熱法に従って熱パルス印加をすると
、グラスチック製試験管壁は、ガラス製試験管壁に比べ
伝熱抵抗が大きいため、内部の受容細胞の良好な急速加
熱ができず、形質転換の効率が非常に低下してしまうば
かりでなく、保存性の良好な小容量のグラスチック製試
験管は外形が小さいため水浴で加熱すると水浴の水によ
る内部受容細胞試料の汚染を受けやすく、かえって従来
法以上に雑菌汚染を起こしやすいという問題が生じた。
本発明に上記プラスチック製試験管による軽質試験管に
よる形質転換反応を合目的に行える方法を提供しようと
するものである。
よる形質転換反応を合目的に行える方法を提供しようと
するものである。
すなわち本発明に形質転換操作に先立ち予め塩化カル７
ウム処理した大腸菌の受容細胞を、−可使用量ずつプラ
スチック製使いすて試験管に分注して凍結保存しておき
、形質転換操作を行うに当っては、該グラスチック裂使
いすて試験管の受容細胞を解凍した後形質転換操作を行
い、形質転換操作に必要な熱パルスを高温固体の熱源に
よって該プラスチック製試験管に印加することを特徴と
する形質転換方法でろる。
ウム処理した大腸菌の受容細胞を、−可使用量ずつプラ
スチック製使いすて試験管に分注して凍結保存しておき
、形質転換操作を行うに当っては、該グラスチック裂使
いすて試験管の受容細胞を解凍した後形質転換操作を行
い、形質転換操作に必要な熱パルスを高温固体の熱源に
よって該プラスチック製試験管に印加することを特徴と
する形質転換方法でろる。
本発明においてに、例えば、受容細胞を一回使用分、ｔ
ｏ ｏ ｐｔずつ使いすてグラスチック製試験管に無
菌的に分注、凍結保存し、使用時にはこれを解凍し、更
にこの使いすて試験管内において以降の形質転換操作を
行うこととし、形質転換において重要な熱パルス印加を
加熱の目標温度よりも高温の固体の熱源によって行うこ
とにより従来の問題点を解消すると共に操作の簡略化を
図るものである。
ｏ ｏ ｐｔずつ使いすてグラスチック製試験管に無
菌的に分注、凍結保存し、使用時にはこれを解凍し、更
にこの使いすて試験管内において以降の形質転換操作を
行うこととし、形質転換において重要な熱パルス印加を
加熱の目標温度よりも高温の固体の熱源によって行うこ
とにより従来の問題点を解消すると共に操作の簡略化を
図るものである。
保存された受容細胞の内の使用される分だけが取り出さ
れ、解凍されるため、残シの受容細胞が劣化するおそれ
が極めて少ない。まな、形質転換操作において試料が接
触する機器の数、操作手数を少なくできるため雑菌汚染
も抑えられ、また操作の繁雑化が避けられる。
れ、解凍されるため、残シの受容細胞が劣化するおそれ
が極めて少ない。まな、形質転換操作において試料が接
触する機器の数、操作手数を少なくできるため雑菌汚染
も抑えられ、また操作の繁雑化が避けられる。
さらに３７〜４５℃の加熱目標温度よりも高温の熱源を
プラスチック製試験管に接触させることにより伝熱速度
を上げ、ガラス試験管よりも伝熱抵抗が大きいことを補
って内部受容細胞の良好な急速加熱を行い、またこの熱
源として従来より用いられた水浴に替えて固体の熱源を
用いることにより、受容細胞材料の水による汚染をなく
すことができる。
プラスチック製試験管に接触させることにより伝熱速度
を上げ、ガラス試験管よりも伝熱抵抗が大きいことを補
って内部受容細胞の良好な急速加熱を行い、またこの熱
源として従来より用いられた水浴に替えて固体の熱源を
用いることにより、受容細胞材料の水による汚染をなく
すことができる。
〔実施例］
常法の塩化カルシウム法に従い作成した大腸菌ＨＢ１０
１株の受容細胞の１６％グリセロール、１Ｍ塩化カルシ
ウム懸濁液を外径１１日φの滅菌したプラスチック製フ
タ付試験Ｗ（Ｌ５−容）に１００μｔずつ分注し一８０
℃で凍結保存した。この状態を第１図に示す。第１図に
おいて、１はポリプロピレン製使いすて試験管、２は受
容細胞を示す。
１株の受容細胞の１６％グリセロール、１Ｍ塩化カルシ
ウム懸濁液を外径１１日φの滅菌したプラスチック製フ
タ付試験Ｗ（Ｌ５−容）に１００μｔずつ分注し一８０
℃で凍結保存した。この状態を第１図に示す。第１図に
おいて、１はポリプロピレン製使いすて試験管、２は受
容細胞を示す。
凍結した試験管の内の一本を取り水中で解凍し、この受
容細胞液にプラスミドＤＮＡ ＰＢＲ３２２の５μｒ／
ｗｔ懸濁液を２μを加え、０℃で１時間静置し之。
容細胞液にプラスミドＤＮＡ ＰＢＲ３２２の５μｒ／
ｗｔ懸濁液を２μを加え、０℃で１時間静置し之。
次に、第２図に示すように、この試料の入ったポリプロ
ピレン製使いすて試験管１を、６８℃に保ったアルミニ
ウム製ブロック６の内径１ ｔ５ｍφの穿孔４内に挿入
し、２分間保持した。この間に試験管１内部に４２℃ま
で温度上昇した。
ピレン製使いすて試験管１を、６８℃に保ったアルミニ
ウム製ブロック６の内径１ ｔ５ｍφの穿孔４内に挿入
し、２分間保持した。この間に試験管１内部に４２℃ま
で温度上昇した。
この後、第１表に示す２ＸＹＴ液体培地８００μｔを加
え、３７℃で５０分間前後培養した後、抗生物質アンピ
シリンを選択マーカーとして常法に従い形質転換体を得
、その形質転換効率を調べ念ところ、プラスミドＰＢＲ
３２２ＤＮＡ １μ？あたりｌＸ１０’個の形質転換体
であった。これに従来法による作成直後の受容細胞とは
ソ同じである。
え、３７℃で５０分間前後培養した後、抗生物質アンピ
シリンを選択マーカーとして常法に従い形質転換体を得
、その形質転換効率を調べ念ところ、プラスミドＰＢＲ
３２２ＤＮＡ １μ？あたりｌＸ１０’個の形質転換体
であった。これに従来法による作成直後の受容細胞とは
ソ同じである。
第１表
ＥＡＣＴＯｌ’ リ プ ト ン （ＤＩＦＣＯ製
） １６１ＤＡＣ！Ｔｏ 酵母エキス （
ＤＩｐｃｏ製） １０１塩化ナトリウム
５？ 水 １を更に、上
記方法で作成し３ケ月間凍結保存し念受容細胞での形質
転換効率を調べたところ、その値に作成直後と差がなく
、受容ａＦ＠が長期間安定に保存されることが確かめら
れた。
） １６１ＤＡＣ！Ｔｏ 酵母エキス （
ＤＩｐｃｏ製） １０１塩化ナトリウム
５？ 水 １を更に、上
記方法で作成し３ケ月間凍結保存し念受容細胞での形質
転換効率を調べたところ、その値に作成直後と差がなく
、受容ａＦ＠が長期間安定に保存されることが確かめら
れた。
また、この間において雑菌による汚染に認められながっ
た。
た。
本発明により凍結保存された受容細胞の劣化および雑菌
汚染を抑えることができると共に操作の簡略化が図れる
。
汚染を抑えることができると共に操作の簡略化が図れる
。
第１図は、本発明の一実、！ｌｌ１ｉ列としてのゲラス
テック製試験管に凍結保存した受容細胞の状帽を示す説
明図、第２図は、本発明の一実施例としてのアルミニウ
ム製ブロックを用いたプラスチック製試験管の加熱の状
態を示す説明図である。
テック製試験管に凍結保存した受容細胞の状帽を示す説
明図、第２図は、本発明の一実施例としてのアルミニウ
ム製ブロックを用いたプラスチック製試験管の加熱の状
態を示す説明図である。
Claims (1)
- 形質転換操作に先立ち予め塩化カルシウム処理した大腸
菌の受容細胞を、一回使用量ずつプラスチック製使いす
て試験管に分注して凍結保存しておき、形質転換操作を
行うに当つては、該プラスチック製使いすて試験管の受
容細胞を解凍した後形質転換操作を行い、形質転換操作
に必要な熱パルスを高温固体の熱源によつて該プラスチ
ック製試験管に印加することを特徴とする形質転換方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31210287A JPH01157388A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31210287A JPH01157388A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 形質転換方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01157388A true JPH01157388A (ja) | 1989-06-20 |
Family
ID=18025263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31210287A Pending JPH01157388A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 形質転換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01157388A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5895745A (en) * | 1996-09-25 | 1999-04-20 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Method of thawing cryopreserved cells |
| WO2005061717A1 (ja) * | 2003-12-19 | 2005-07-07 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 新規な核酸導入法 |
| US8742091B2 (en) | 2001-06-20 | 2014-06-03 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Method of promoting nucleic acid transfer |
-
1987
- 1987-12-11 JP JP31210287A patent/JPH01157388A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5895745A (en) * | 1996-09-25 | 1999-04-20 | W.R. Grace & Co.-Conn. | Method of thawing cryopreserved cells |
| US8742091B2 (en) | 2001-06-20 | 2014-06-03 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Method of promoting nucleic acid transfer |
| WO2005061717A1 (ja) * | 2003-12-19 | 2005-07-07 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 新規な核酸導入法 |
| JPWO2005061717A1 (ja) * | 2003-12-19 | 2007-07-12 | 大日本住友製薬株式会社 | 新規な核酸導入法 |
| JP4954550B2 (ja) * | 2003-12-19 | 2012-06-20 | 大日本住友製薬株式会社 | 新規な核酸導入法 |
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