JPH01165397A - 非タンパク原性アミノ酸を有するペプチドの酵素的合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は少くとも１個が非タンパク原性であるアミノ酸
を酵素により連結させて、それ自体ですでに重要な薬理
学的性質を有するかまたはｐｅｔａ−＜プチドの構成分
として使用されつるペプチドとなす方法に関するもので
あシ、場合によ・シある株のアミノ酸を意図的に用いる
ことによりかかるはプチドの薬理学的性質を変えること
ができる。

重要な薬理学的性質を有し、本発明方法により合成され
うるはプチドの例をあげれば、エンケファリン（米国特
許用４，３２２，３４０号またはＨｅ１ｖ、　Ｃｈｉｎ
、　Ａｃｔａ　、　６４．２０９０．１９８１）、プラ
ジキニン（ヨーロッパ特許出願Ｅｐ１２Ｂ、６０２）あ
るいはレニン−またはＡＣＥ−インヒビター（例えば米
国特許用４，５２２，５４０号）である。

かかる活性物質は慣用の化学的方法により製造される。

しかしその場合煩雑表保護基法な用いねばならずその上
化学反応に際して光学的に活性な化合物が部分的にラセ
ミ化される危険も存在し、それにより薬理活性が通常低
下する。

これらの欠点はペプチドの合成に酵素法を用いることに
より回避される（　Ｊ、　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅ
ｍ、　４　（１）、１．１９８５参照）。しかしながら
酵素により接触されたペプチドの合成は今日までほとん
どタンパク原性アミノ酸を用いてのみしか実施されてい
ない。一つの例外はＤ−アミノ酸の連結である（　Ｊ、
　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　１９８６、■、２７２８お
よびＰｅｐｔｉｄｓ　ｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ
　ｆｕｎｃｔｉｏｎ。

１９８５．３５９）。

今、驚くべきことに、非タンパク原性アミノｌ￥２残基
がサーモリシンまたはキモトリプシンを用いてタンパク
原性アミノ酸と酵素的に連結されうることが見出された
。

それゆえ本発明は少くとも１個が非タンパク原性である
アミノ酸および／ｉたはアミノ酸誘導体を酵素により連
結させるにあたり、ａ）式■ ＨＢ−Ｒ２Ｎ−ＥＣ−ＣＯＯＲ３（Ｉ）Ｒ１〔式中、 Ｘは〇−および／またはｍ−および／″またはｐ−位に
あるハロゲンであるか、あるいはｐ−位にあるニトロま
たはメトキシ基を表わす）であるかまたは式 を有する基であシ、 Ｒ２は水素または式Ａ−ＣＯ−（ここでＡはベンジルオ
キシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、フェニルまたはＣ１〜Ｃ
４−アルコキシを意味する）を有する基であシ、 Ｒ３はＣ１〜Ｃ４−アルキルまたはベンジルであ〕、Ｂ
は（ＨＮ−Ｃ■−ＣＯ）ｎ（ここでｎは０〜１０であり
そして Ｒ４ははプチド鎖である）を意味する〕を有するり、Ｌ
−’ｆｉたはＬ−化合物をキモトリプシンの存在下に式
■ Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃｏ−ＢＨ３（ｎ） 〔式中、 Ｒ５は水素、０１〜Ｃ４−アルキルまたは他のタンパク
原性アミノ酸残基を意味し、 Ｒ６はアミノ基、−ＮＨ−（ＣＩ−Ｃ４）−アルキ／Ｉ
／ｌたはフェニルアミノ基であシ、そして Ｂは前記した意味を有する〕 を有するり、Ｌ−またはＬ−化合物と反応させて弐■ ＲＩ　　　Ｒ５ （式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６およびＢは前記した意味
を有する） を有するり、Ｌ−化合物と反応させるか、またはｂ）式
■ ＨＢ−Ｈ８Ｎ−ＣＨ−ＣＯＯＨ（ＩＶ）〔式中、 Ｒ７は式ａｏｏｃ−（ｃａｚ）ｍ−（ここでｍは１また
は２である）を有する基であり、 Ｒ８は水素、０１〜Ｃ４−アルコキシカルボニルまたは
ベンジルオキシカルボニルであシ、モしてＢは前記した
意味を有する〕 を有するり、Ｌ−”ｉたはＬ−化合物をサーモリシンの
存在下に式Ｖ Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃｏ−Ｂ−Ｒ９（Ｖ） ■ （式中、 Ｒ１０は式 を有する基であシ、そして Ｒ？はＣ１〜Ｃ８−アルコキシ、ＮＨ２、ＮＨ−（ＣＩ
−０４）−アルキルまたはフェニルアミノ基を意味する
）を有するり、Ｌ−またはＬ−化合物と反応させて式■ Ｒ７ＲＩＧ （式中Ｒ７、Ｒ８、Ｒ？　、Ｒ１ＧおよびＢは前記した
意味を有する） を有するり、Ｌ−化合物となす、 ことからなる方法に関する。

本発明はさらに下記新規化合物、すなわちＬ−Ｚ−Ａｓ
ｐ−Ｌ−（２−テｚニル−Ａｌａ）−０ＣＨｘＬ−Ｎ−
ベンゾイル−（２−フリル−Ａｌａ）−Ｌ−Ｌａｕ−Ｎ
Ｈ２およびＬ−アセゲルベ２−チエニル−Ａｌａ）−Ｌ
−Ｌｅｕ−ＮＨ２にも関する。

本発明はまたエンケファリン、プラジキニンあるいはレ
ニン−またはＡＣＥ−インヒビターの製造への本発明に
より製造されたペプチドの使用にも関する。

「非タンパク原性」アミノ酸とは天然のタンノ５り質中
に存在しないアミノ酸を意味する。

「ハロゲン」とは弗素、塩素、臭素および沃素、特に弗
素、塩素および臭素を意味する。３個およびそれ以上の
炭素原子を有するアルキル基は直鎖であることも分校状
であることもできる。

「タンパク原性」アミノ酸残基（Ｒ５）とは、酸アミド
（−ＣＯＮＨ２）が遊離の酸（−Ｃ００Ｈ）の形態であ
ると仮定して式■の化合物の残分と一緒になってタンパ
ク原性アミノ酸を構成する残基な意味する。例えば次の
とおシである。

Ｒ５−−ＣＨ！Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　（
Ａアラニン）ｆｉ　−ＣＩＨ−ＣＨ３（■バリン） 昆 皺　−ｃＨ２−ＣＨ−ＣＨｓ　　　　　　　　　　（鵬
ロイシン）昆 ■　−ＣＨ−ＣＨ２−ｃＨｓ　　　　　　　　　　（−
インロイシン）占ジ Ｒ’　　＝　　−ＣＨ２＠　　　　　　　　　　　　（
−７ｚ二＃７ｊｒ−ン）冒　−〇Ｈ２−ぐＤｏａ　　　
　　　　　　　（−ｆ１’シン）■　−ＣＩ’１２−Ｏ
Ｈ（讃セリシ） −−ＣＨ−ＣＨ３（−）レオニン） ＯＨ −−ＣＨ２−８Ｈ（−システィン） イプチド鎖Ｒ４はタンパク原性および非タンパク原性ア
建ノ酸から、ならびにこれら２種の群の混合物から構成
されることができ、その際前記定義が適用される。

ラセミ化合物が用いられるかあるいは純粋表り２化合物
が用いられるかには関係なく本発明による方法において
は出発化合物のＬ−鏡像異性体のみが連結されて相当す
るり、Ｌ−化合物が生成される。

本発明による方法荀においては、２種の成分すなわち式
Ｉの化合物および式■の化合物を！：Ｉ［■１ｔα７５
−１．５０モル比でできるだけ少量の脱を車ツル水にと
シ、そして場合により５〜６０容量％（Ｉ＋ＩＩ＋Ｈ２
０の容量に基づき）の有機溶媒、例えばメタノール、エ
タノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭ８０　）あるい
はジメチルホルムアさド（ＤＭＦ）を加えそして次に得
られる溶液の声を７〜９、好ましくは８にｉ１！整する
のが最勢である。式Ｉおよび■はう七ミ化合物でもＬ−
化合物でも使用されうる。式■の化合物は純粋なＬ−化
合物として使用されるのが好ましい。一般的には、ここ
ではタンパク原性アミノ酸のすべてのアミドが使用され
うる。反応は２５°Ｃ〜４５℃好ましくは２８℃〜３２
℃で約５〜５００Ｕ／ミリモル好ましくは１０〜６０Ｕ
／ミリモルの希α−または２御キモトリプシン溶液を添
加することにより開始される。反応時間中は反応溶液を
撹拌するのが好ましい。酵素はそのままあるいは例えば
シリカゲルに固定して使用されうる。溶液の２値は好ま
しくは自動滴定器を使用して０．ＩＮあるいは１Ｎ水酸
化す）　ＩＪクム溶液を添加することにより一定に保た
れうる。反応は例えばＲＰ−ＨＰＬＣにより追跡できる
。

反応は弐ＩのＬ−化合物が使用される場合はエステルが
それ以上検出されなくなると停止される。式！のり、Ｌ
−化合物が用いられる場合は、ペプチド（ｇの容量が最
大を過ぎたところで反応は終了する。酵素反応は例えば
蟻酸の添加によるか（溶性酵素が使用された場合）、あ
るいは固定化酵素なｐ失することＫよシ停止されうる。

かくして得られた粗製反応混合物を水浴中で冷却しそし
て析出した粗生成物（ｍ）をｐ過する。とのペプチドは
例えば粗生成物を水および／ｌたＧ：ｔアルコール例え
ばメタノールで洗い、次に塩酸のような希酸を添加しそ
して終りに水酸化ナトリウム溶液のような希アルカリを
加えることにより後処理および精製を行うことができる
。有機溶媒を含有する反応混合物は例えばメタノールま
たはエタノールを使用した場合は酵素反応を停止させた
のち真空下に？ｌ！Ｉ給するかあるいは例えばＤＭＳ　
ＯまたはＤＭＰを使用した場合は凍結乾燥するのが好ま
しい。以後の処理は前記したとお〕である。

粗生成物の洗浄によってはＨＰＬＣ的に純粋なはプチド
が得られない混合物は例えば酢酸エチルまたはメチルイ
ンブチルケトンを用いて抽出することにより精製されう
る。

方法ｂ）では、２ａｉの出発成分である式■およびＶの
ラセミｔたはＬ−化合物の水溶液を別々に調製するのが
最善である。この２種の溶液の…は５〜７好ましくは６
に調整される。この２種の溶液のモル濃度は式Ｖの化合
物の溶液の濃度が弐■の化合物のそれの１．８〜２．２
倍、好ましくは１．９〜２．１倍であるべきである。次
にこの２種の溶液を、酢酸カルシウムのような易溶性力
ルシクム塩の１０〜３０オリモル／ｌ好ましくは１５〜
２５オリモル／ｌおよび酵素を含有する水性混合物中に
同時に継続して滴下する。酵素は例えは市販のサーモア
ーゼ（ｔｈａｒｍｏａｓｅ）が用いられる。酵素濃度は
式Ｖの化合物の濃度を基準として乙４Ｕ／ηで約５．〜
１０ダ／ミリモル、好ましくは７〜１４ダ／ミリモルで
ある◇反応温度は３０℃〜５０°Ｃ１好ましくは３５℃
〜４０℃である。式■およびＶの化合物の溶液を混合物
に滴下するとはプチド■が継続して沈澱する。度応完結
後希酸好ましくは２．５Ｎ　ＨＣＩで洗浄すると遊離の
ペプチド■が純粋な物質（固形物）として得られる。

本発明により用いられる酵素であるα−またはδ−キモ
）リプシンおよびサーモアーゼは商業的に入手できる。

式Ｉ、ｎ、ＩＶおよびＶを有する出発化合物はもし購入
できなければ相当するアミノ酸から簡単な方法で調製で
きる。従ってり、Ｌ−アミノ酸エステルは例えばり、Ｌ
−アミノ酸をチオニルクロライドおよび相当するアルコ
ールと反応させることにより得られる。適当な方法は例
えばＭ、　Ｂｒｅｎｎｅｒ氏他のＨｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ
。

Ａａｔａ、　　５６．１１０９（１９５７）に記載され
ている。

式■のり、Ｌ−アミノ酸アミドは例えはエステルを過剰
のアンモニアと反応させることにより得られうる（　Ｈ
ｏｕｂｅｎ　Ｗｅｙｌ、”Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　　ｄｅｒ
Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　　Ｃｈｅｍｉａ　Ｂｄ、１１
／２．８．３５？、Ｇｅｏｒｇ　　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅ
ｒｌａｇ出版、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　。

１９５８参照）。

Ｄ、Ｌ　−Ｎ−アシルアミノ酸エステルは例えばり、Ｌ
−アミノ酸エステルを無水酸またはアシルクロライドと
反応させることにより得られる（Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ
氏他、”　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍ１
ｎ。

Ａｃ１ｄ１１°、Ｗｉｌｅｙ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　
、　１９６１　、あるいはＨｏｕｂｅｎ　　Ｗｅｙｌ　
、’　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　　ｄｅｒ　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅ
ｍｉａ”、Ｂｄ、　１１／２．３０頁、Ｇｅｏｒｇ　Ｔ
ｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ　、８ｔｕｔｔ−ｇａｒｔ、
１９５８および同Ｂｄ、１５／１．４６頁以下、１９７
４参照）。例えばエチルＤ、Ｌ　−２−エトキシカルボ
ニルアミノ−４−フェニルブチレート（実施例６参照）
はエチルＤ、Ｌ　−２−プロモー４−フェニルブチレー
トおよびＫＯＣＮからＤＭＦ／エタノール中でＣｈｅｍ
、　Ｂｅｒ、　１１４．１７３’（１９８１）に記載さ
れる方法と同様にして調製される。

Ｄ、Ｌ　−Ｎ−ベンゾイル−（２−フリル）−アラニン
メチルエステ７１１／（実施例３参照）は、例えば初め
に無水酢酸／酢酸ナトリウム中でフルフラールおよび馬
尿酸からエレンマイヤーアズラクトン合成によジデヒド
ロアズラクトンを調製し、これをナトリウムメタノラー
ド／メタノールを用いて開環させ、次にＨ２／　）　リ
ス（トリフェニルホスフィン）ロジウム（Ｉ）クロライ
ドを用いメチレンクロライド／ベンゼン中で水素添加し
て最終生成物となすことにより合成される。

用いられる他の出発物質はすべて商業的に入手できるか
、または関連するアミノ酸を購入して簡単ナペプチド連
結、エステル化および／またはアシル化反応により相当
する出発化合物に変換することができる。

本発明による方法ａ）およびｂ）の特別な長所は式Ｉ、
ＩＩおよびＩＶ、Ｖの化合物がラセミ体としておよび純
粋なＬ−化合物としてのいずれでも使用されうることで
ある。

以下の実施例により本発明をよル詳細Ｋａ明する。

実施例　１ α−キモ）ＩＪプシンを用いるペプチド合成ｅｕＮＨ２ 分子量：　（１８５，２２）　　　　　　　　　分子ｆ
ｉ：　（２６９，３５）２８６η（１，５ミリモル）の
エステル（１）および５９０１９（３ミリモル）のＬｅ
ｕ−ＭＨｚを３．５−の水、１．５　ｍのエタノールお
よび１．１−のｌＮＮａＯＨ中に溶解させ、ｐＨ８，０
０に調整しそしてこの混合物を３０℃に加温する。これ
に約１．５　ＷＩ９のα−キモトリプシンを加えそして
Ｒプチド合成期間中ＩＮ　ＮａＯＨ溶液を滴下する。約
５時間後に生成が最高に達する。沈澱を水にとシそして
同量の酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相中にペプチ
ドが強く富化される。酢酸エチル相中にはプチドしか含
有されなくなるまで抽出を反復する。

粗製溶液の組成： 堅プチド＝Ｄ−エステ／Ｉ／：酸−６６：２７：ライプ
チドの収量：１０２■（５１％） 特性化： ４００　ＭＨｚ　１）１ｑＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）　
；１．４８ｍ、２鳳　ＣＨ２−ＣＨ＜ １．５５ｍ、　ＩＨ，Ｃ−ＣＨく １．８４ｇ、５ＨＳＣＯＣ旦３ ２．２２ｍ、ＩＨ，１４８ｍ、ＩＩ（、Ｃ−Ｃ−ＣＨ２
−４，２０ｍおよび４．２８ｍ、　２Ｎ，２ｘＮＨ−Ｃ
Ｈ−５，０８ｍｓ　２　Ｈ％　２Ｎｃ＝！ｃＨ−５，７
５ｍ、　Ｉ　Ｈ，２ＮＣ−ＣＨ−６，９４ｓ、ＩＨｓ７
．１８ｓ、１龜−Ｎ旦２実施例　２ シリカゲルに固定されたα−キモトリプシンを用いるペ
プチド合成 ■ ｏｃＨ３ ＤＬ−Ａｃ−（４−ＮＯ２−Ｐｈｅ）　−０ＨＣ分子１
１：　（２６９） 分子量：（３６４，４０） １．１３１１（４，２ミリモル）のエステル（１）およ
びα５２Ｉｉ（４ミリモル）　のＬｅｕ−ＭＨｚを２−
の水、４−のＣ！（３０Ｈ１２，５ｍｌのＩＮ　ＮａＯ
Ｈおよび五５−のＤＭＳＯ中に溶解させる。均質な溶液
なα−キモトリプシンまたはδ−キモトリプシンとイン
キュベーションすると、ペプチド合成は数分しか進行せ
ず反応は完結しないまま中断する。この現象は約１−の
α−キモトリプシン／シリカゲルを使用した場合には現
われない。４時間後ペプチド濃度が最高となる（ＨＰＬ
Ｃによｈａｇ＞。

析出した生成物から沈降により触媒を除去する。

反応生成物を数回水にとって凍結乾燥する。固形残留物
（組成：ペプチド：Ｄ−エステル：＃！−５８：２９：
１３）を残留するペプチドがＨＰＬＣ的に純粋となる壕
で水／メタノールで注意深く洗浄する。

純粋なペプチド：３１０■（理論量の４１％）Ｌ−Ａｃ
−（４−ＮＯ２−Ｐｈｅ）−Ｌｅｕ−ＮＨ２の特性化：
４００　ＭＨｚＩＨ−ＮＭＲ １，４９ｍ、　２Ｎ，＞ＣＨ−Ｃ！（２−ＣＨ＜１．７
５ｓ、５Ｈ，ＣＯＣ旦５ ４．２０ｍ、　Ｉ　Ｈ，−ＣＨ−ＮＨ−４，５８ｍ、　
Ｉ　Ｈ，−Ｃ！１−ＮＨ−６，９４ｓ、　１Ｈ，７，２
３ｓ、ＩＨ−ＮＨ２７，４８ｍ、２Ｎ，２Ｎ−７リール ８．０２−８．１８ｍ、　４ＨＳ２Ｎ−アリール＋２　
Ｘ　ＮＦｉ−Ｃ０実施例　３ δ−キモトリプシンを用いるペプチド合成：Ｌ−Ｎ−＜
ンゾイ、ルー（２−フリル−Ａｌａ）−ＬｅｕＮＨ２曝 ｚ ＶＸ、、−Ｎ−：ンゾイルー（２−フリル−Ａｌａ）−
０Ｃ’ＨｓＬ−Ｎ−ベンゾイル−（２−７リルーＡｌａ
）−Ｌ−ＬｅｕＮＨ２ 分子量：　（３７１，４４） １０９■（０，４ミリモル）のエステル（１）および１
００■のＬ−Ｌｅｕ　−ＮＨ２（０，７６ミリモル）を
１−のメタノール、１ｗｔの水および１．５−のＤＭＳ
Ｏ中にＰＨ−＆０Ｏ（３０°Ｃ）で溶解させる。均質な
溶液に８３９のδ−キモトリプシンを加え、そしてｊＮ
　ＮａＯＨを用いて声を８．００に保持する。約１０分
間反応させると生成物が沈澱し始める。

３０分後、ＨＰＬＣによれば、生成物の濃度が最大とな
）、そこで数滴の蟻酸を用いて反応を停止させる。反応
混合物を冷却したのちフリットで一過しそして２回水洗
する。

収量：９２■ 組　成： ペプチド　　　　　　　　８３１ Ｎ−ベンゾイル−（２−７リルー　１２　　　　３４Ａ
ｌａ）−０Ｍｅ Ｎ−ベンゾイル−（２−フリル−５４ Ａ１５Ｌ　）　−０Ｈ Ｌｅｕ−ＮＨ２６１ 固形物をメタノール：　Ｈ２Ｏ（１：　１　）から注意
深く再結晶することによＦ）４９．２ＷＣ６６％）の純
粋なペプチドが得られる。

溶液をゆつくシと蒸発させることＫよ、９　Ｄ−Ｎ−ベ
ンゾイル−（２−フリル−Ａｌａ　）　−０ＣＨｇが固
形物として継続して沈澱する５７ダ（理論量の６８％）
が回収される。

ｒ＝−Ｎ−＜ンゾイルー（２−７リルーＡｌａ）−Ｌ−
ＬｅｕＮＨ２の特性化：４００　ＭＨｚ’Ｈ−Ｎ）ａ（
ｄ６−ＤＭＳＯ）　：１．４７ｍ、２Ｎ，＞ＣＨ−ＣＨ
２−ＣＨ＜４．２５ｍ、　Ｉ　Ｈ，ＮＥ！−Ｃｐ−Ｃｏ
　。

４．７５ｍ、　Ｉ　Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ０一 ６．９７ｓ、　Ｉ　Ｈ，７，２３ｓ、　Ｉ　ＨＳＭ’ｋ
ｊ２７．７９−７．８２、ｍ、２Ｎ，ｏ　、ｏ’−Ｈ−
：ンゼン７．９５ｄＳＪ−８Ｈｚ、１）！、Ｎ旦−Ｃ０
８，５７ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、ＩＨ，に＠−〇〇実施例　４ 短い形態 分子量！　（２６７）　　分子量：　（１９７）→Ｌ−
Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−（４Ｆ−Ｐｈｅ）−０ＣＨｇ＋Ｄ−４
Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ又応混合物： ６．８１　（２５ミリモル）のＬ−Ｚ−Ａｓｐ１αＯＪ
’（５０ｊリモル）のＤＬ−４−Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ４
０ｍの水 ２００ダのサーモアーゼおよび１００Ｍｇの酢酸カルシ
ウム操　作： ２種の成分を水に溶解させ、ｍ　ＮａＯＨを用いて≠６
００に調整しそしてこれに酵累およびＣａ（ＣＨｓＣＯ
Ｏ）２を添加する。この混合物を２２°Ｃで１６時間撹
拌する。析出した沈澱を吸引ｐ過し、２．５Ｎ　ＭＣＩ
に懸濁させ（塩変換工程）、再び吸引−過し、水洗しそ
して乾燥する。

生成物の重量：８．２＋５．９のＬ−Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−
４−Ｆ−Ｐｈｅ　−ＯＣＨｇ（理論量の７４％） 特性化： ４００　ＭＨｚ’Ｈ−ＮＭＲｄ４−ＤＭＳＯ：２４７−
２．６２ｍ、　２Ｎ，−Ｃ旦２−ＣＯＯＨ３，５８ｓ、
　３ＨＳＣＯＯＣ巨３ ４．３３−４．４７　ｍ、　２　Ｘ　−ＣＴＪ−７，０
！ｉ−７，５２ｍ、　１１　Ｈ，１０旦−アリール＋Ｎ
旦８．２５ｄＳＪ−８Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ，Ｎ旦１２．３１
　ｓ、　Ｉ　Ｈ，Ｃ０ＯＨ 実施例　５ Ｌ−Ｚ−Ａｓｐ　　　＋　　２ＤＬ−（２−チエニル−
Ａｌａ）−０ＭｅＸ　ＨＣｌ−＋分子３１　：　（２６
７）　　　　　分子ｔ：（２２１，７）→（Ｌ−Ｚ−Ａ
ｓｐ−Ｌ−（２−ｆエニルーＡｌａ）−０Ｍｅ　　Ｘ分
子量：　（６９２）　　　　　　Ｄ−（２−チエニル−
Ａｌａ）−ＱＪｂ）＋）（２０塩交換 （Ｌ−Ｚ−Ａ１１１）　−Ｌ−（２−ｆ：ｒ−ニル）−
０ＭｅｘＤ−（２−チエニル−Ａｌａ）−０Ｍｅ）＋Ｈ
２０」ＥｌゆＬ−Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−（２−チエニル−Ａ
ｌａ）−０Ｍｅ　＋Ｄ−（２−ｆエニルーＡｌａ）−０
Ｍｅ分子量：（４７ＣＬ７） 反応混合物： ｓ、３４ｙ（２０ミリモル）のＬ−Ｚ−Ａｓｐ８．９０
ＩＩ（４０ｆリモル）のＤＬ−（２−チエニル−Ａｌａ
）−αＭＸ　ＨＪ１８０１ｖのサーモアーゼ １１０ｊｌｊＦのＣａ（ＣＨｇＣＯＯ）　２操　　作： Ｌ−Ｚ−Ａｓｐを水１０ｇｇ中にとシそして１ＯＮＮａ
ＯＨを用いて−６，００に調整する（−溶液Ｉ）ｏ同様
にしてエステルの溶液も調製する（−溶液■）。

次にサーモアーゼおよＣＦ　Ｃａ（ＣＨｓＣＯＯ）２を
水２−中に溶解させて４０℃に加温する。次にこの溶液
中に溶液Ｉ十溶液■を２時間内で同時に滴下する。自動
滴定器を用いｌＮＮａＯＨを滴下するととによりｐＨ６
，ＯＯに保持する。

４０℃で７時間後沈澱を一過し、ｐ液をさらに１６時間
反応せしめる。ここで析出した化合物を最初の沈澱と合
し、２．５Ｎ　ＨＣＪ　２０−中に懸濁させ、−過し、
水洗しそして乾燥する。

生成物のｌ１ｉｆｆｉニア、７．Ｆ（理ＫｋＭの８２％
）のペプチドＬ−Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−（２−？−１−ニル
ーＡｌａ）−０Ｍｅの特性化４００　ＭＨｚＩＨ−ＮＭ
Ｒ（ｃ１６−ＤＭＳＯ）：２．４２−２．６８ｍ、　２
Ｎ１−ＣＨ２−Ｃ０ＯＨ！１．６２Ｂ１　５ＨＳＣＯＯ
Ｃ旦３ ４、！＋７−４．５０ｍ、２Ｎ，２ｘ−Ｃ■−■ ５．０３ｓ、２Ｎ，−ＣＯＯＣ巨２−Ｐｈ６．９０−６
．９５ｍ、２Ｎ，２ｉ？オフエン７．３１−７．４０ｍ
１６Ｈ，１旦チオフエン＋５Ｈフエニル７．６０ｄ、Ｊ
−８，２Ｎｚ、ＩＨ，−ＮＨ−ａ３１（１，Ｊ−７，５
Ｈ２，Ｉ　Ｈ，−ＮＨ−１２，２９５＋、ＩＨ，−ＣＯ
ＯＨ 実施例５と同様の方法で、Ｄ、Ｌ−（２−７！Ｊル）　
−Ａｌａ−ＯＣＨ３を用いるとはプチド：Ｌ−Ｚ−Ａｓ
ｐ−Ｌ−（２−７リル）−Ａｌａ−ＯＣＨ３が調製され
る。

収率：理論量の４０％ Ｌ−Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−（２−７９＃）　−Ａｌａ−ＯＣ
Ｈ３の特性化：４００　ＭＨｚＩＨ−ＮＭＲ（１６−Ｄ
ＭＳＯ）：２．５８−２．７０　：ｍ、　２Ｎ，−ＣＨ
２−ＣＯＯＨｘｏｓ−ｘｏｓ：ｍ％　２Ｎ％　９ｃ旦２
−５．６０：ｓ、３亀ｃ’ｏｏｃ’旦５ ４．５２−４．５５：ｍ、　２Ｎ，２Ｘ−ＣＨ−一 ５．０５；♂、２　Ｈ，Ｃ００ＣＨ２−Ｐｈ６．１５　
：ｍ、　　Ｉ　Ｈ，６，５５：ｍ、　　Ｉ　Ｈ，２Ｎ−
７ラン７．５５：ｍ、６Ｈ，ＩＨ−フランおよび５　Ｈ
−７！ニル７．５０　：ｓ、Ｃ００Ｈ（一部オーバーラ
ップ）７．５５　：　ｄ、　ｌ−８Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ，−
ＮＨ−ＣＯ−８，３０：　ｄ、　Ｊ　−８Ｈｚ　、　１
１（、−ＮＨ−Ｃｏ　一実施例　６−１３ アシル成分Ｒ１−ＣＨ−ＣＯＯＲ５およびアミン受容Ｎ
Ｈ−Ｒ２ 体Ｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ２を使用し、ｐＨａ、ｏｏでキモト
リプシンを用いるはプチド合成 下記第１表には、置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３を有する
出発アシル成分（Ｉ）、（Ｉ）の濃度、ＬＬ−Ｉｊ３′
ｕ−ＮＨ２の濃度、使用される溶媒混合物、酵ｋＡ量、
反応温度、反応時間、収率％ならびに同様の実施例が示
される。第２表には実施例６−１３の化合物のＩ　Ｈ−
ＮＭＲ分光データが示される。

第１表において、 α−ＣＴ−■−シリカゲルに固定されたα−キモトリプ
シンδ−ＣＴ■δ−キモトリプシン を表わす。

帯　　−声ａ７０での反応

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）少くとも１個が非タンパク原性であるアミノ酸およ
   び／またはアミノ酸誘導体を酵素により連結させるにあ
   たり、 ａ）式 I ＨＢ−Ｒ＾２Ｎ−ＨＣ−ＣＯＯＲ＾３（ I ）Ｒ＾１ 〔式中、 Ｒ、は式　 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＸはｏ−お よび／またはｍ−および／またはｐ−位にあるハロゲン
   であるか、またはｐ−位にあるニトロまたはメトキシ基
   を表わす）を有する基であるか、 または式 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する 基であり） Ｒ＾２は水素または式Ａ−ＣＯ−（ここでＡはベンジル
   オキシ、Ｃ＿１−Ｃ＿４−アルキル、フエニルまたはＣ
   ＿１−Ｃ＿４−アルコキシを意味する）を有する基であ
   り、 Ｒ＾３はＣ＿１−Ｃ＿４−アルキルまたはベンジルであ
   り、 Ｂは（ＨＮ−ＣＨ−ＣＯ）ｎ（ここでｎは０〜１０であ
   りそして Ｒ＾４はペプチド鎖である）を意味する〕 を有するＤ，Ｌ−またはＬ−化合物をキモトリプシンの
   存在下に式II ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中、 Ｒ＾５は水素、Ｃ＿１−Ｃ＿４−アルキルまたは他のタ
   ンパク原性アミノ酸残基を意味し、 Ｒ＾６はアミノ基、−ＮＨ−（Ｃ＿１−Ｃ＿４）−アル
   キルまたはフェニルアミノ基であり、そして Ｂは前記した意味を有する〕 を有するＤ，Ｌ−またはＬ−化合物と反応させて式III ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾５、Ｒ＾６およびＢは前記
   した意味を有する） を有するＬ，Ｌ−化合物となすか、または ｂ）式IV ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中、 Ｒ＾７は式ＨＯＯＣ−（ＣＨ＿２）ｍ−（ここでｍは１
   または２である）を有する基であり、 Ｒ＾８は水素、Ｃ＿１−Ｃ＿４−アルコキシカルボニル
   またはベンジルオキシカルボニルであり、そして Ｂは前記した意味を有する〕 を有するＤ，Ｌ−またはＬ−化合物をサーモリシンの存
   在下に式Ｖ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中、 Ｒ＾１＾０は式 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する基であり、そして Ｒ＾９はＣ＿１−Ｃ＿８−アルコキシ、ＮＨ＿２、ＮＨ
   −（Ｃ＿１−Ｃ＿４）−アルキル、またはフェニルアミ
   ノ基を意味する）を有するＤ，Ｌ−またはＬ−化合物と
   反応させて式VI▲数式、化学式、表等があります▼（V
   I） （式中Ｒ＾７、Ｒ＾８、Ｒ＾９、Ｒ＾１＾０およびＢは
   前記した意味を有する） を有するＬ，Ｌ−化合物となす、 ことからなる方法。 ２）Ｒ＾２が水素、ベンゾイル、ベンジルオキシカルボ
   ニル、アセチルまたはエトキシカルボエルであり、 Ｒ＾３がエチル、メチルまたはｎ−プロピルであり、 式IIの化合物がＬ−Ｌｅｕ−ＮＨ＿２であり、Ｒ＾７が
   ＢＯＯＣ−ＣＨ＿２−であり、 Ｒ＾８が水素またはベンジルオキシカルボニルでありそ
   して Ｒ＾９がメトキシである、 ことからなる請求項１記載の方法。 ３）方法ａ）ではｐＨを７〜９に調整しそして方法ｂ）
   ではｐＨを５〜７に調整するととからなる請求項１また
   は２記載の方法。 ４）方法ａ）が２５℃〜４５℃で、そして方法ｂ）が３
   ０℃〜５０℃で実施されることからなる請求項１〜３の
   いずれかに記載の方法。 ５）方法ａ）では式IIのＬ−化合物が用いられそして方
   法ｂ）では式IVのＬ−化合物が用いられることからなる
   請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６）請求項１〜５のいずれかに記載の方法によル得られ
   るペプチドをエンケフアリン、ブラジキニン、レニンイ
   ンヒビターまたはＡＣＥ−インヒビターの製造に使用す
   ること。 ７）式 Ｌ−Ｚ−Ａｓｐ−Ｌ−（２−チエニル−Ａａ）−ＯＣＨ
   ＿３、Ｌ−Ｎ−ベンゾイル−（２−フリル−Ａ１ａ）−
   Ｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ＿２、または Ｌ−アセチル−（２−チエニル−Ａ１ａ）−Ｌ−Ｌｅｕ
   −ＮＨ＿２を有する化合物。