JPH01165528A - 豚伝染性胃腸炎弱毒ウイルス、その作出法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新生仔豚の豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）を効果的
に防御する弱毒ウィルス及びその作出法ならびにこのウ
ィルスの用途すなわちワクチンに関するものである。

〔発明の背景〕

ＴＧＥは、哺乳豚から成豚に至るすべての月令の豚に感
染し、水様下痢、脱水、嘔吐を特徴とする胃腸炎をおこ
し、急激な体重減少、発育停止、母豚の泌乳停止を招来
し、また哺乳豚では日令の若い程死亡率が高く、生後７
日令以内では殆んどの豚が死亡し、養豚業に甚大な被害
を与えている。

しかしながら、ＴＧＥ予防ワクチン開発の試みは、ＴＧ
Ｅがその特殊な感染態様、すなわち腸管局所に於る病原
性ウィルスの増殖、によって惹起される疾患であるゆえ
に容易なものではない。換言すれば、ＴＧＥ予防には血
中中和抗体と、分泌性免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の両
者が関与することが示唆されており、培養細胞馴化弱毒
ウィルスによる乳汁免疫における哺乳豚の感染防御不成
立の理由のひとつとして、接種された馴化弱毒ウィルス
が母豚の腸管局所に到達しえないことが考えられている
（Ａｎｎａｌｅｓ　ｄｅ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ　Ｖｅ
ｔｅｒｉｎａｉｒｅｓ１５、３５９−３６４．１９８４
　）。馴化弱毒ウィルスが腸管局所に到達しえない最も
大きな可能性は、これら弱毒ウィルスが、本来の病原性
ウィルスが保有しているトリプシン等消化酵素に対する
耐性および酸耐性を、弱毒化のための累代継代中に失う
ことである。

〔発明の概要〕

本発明は、病原性を除去した安全なＴＧＥ弱毒ウィルス
が、有効なＴＧＥワクチンウィルスであるために必要と
考えられる腸管局所における増殖能を欠落しないように
鋭意工夫されたＴＧＥ弱毒ウィルスとその作出法に関す
るものである。

要旨 すなわち、本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスは、経鼻と
経口、あるいは経鼻、あるいは経口投与後、腸管に於て
増殖可能な、蛋白分解酵素および（または）酸に耐性な
もの、である。

また、本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスの作出法は、病
原性ＴＧＥウィルスを弱毒化後、変異原処理して、続い
て蛋白分解酵素および（または）酸耐性株を選別するこ
と、からなるものである。

さらにまた、本発明によるＴＧＥ予防用ワクチンは、経
鼻と経口、あるいは経鼻、あるいは経口投与後、腸管に
於て増殖可能な、蛋白分解酵素および（または）酸に耐
性なＴＧＥ弱毒ウィルスを含んでなる、ものである。

効果 本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスは弱毒化を病原性ウィ
ルスの累代継代によって行って得たものであることがふ
つうであるところ、従来はそのような培養細胞馴化弱毒
ウィルスには腸管増殖性が認められず、従って効果的な
感染防御が成立しなかったことからすれば、本発明によ
るＴＧＥ弱毒ウィルスがＴＧＥ予防効果をｔ現（血中中
和抗体の検出と腸管増殖性の獲得）したということは思
いがけなかったことといえよう。

そして、本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスはその弱毒化
過程を累代継代によって行なうことがふつうである。と
ころが、その場合に、蛋白分解酵素および（または）酸
耐性株を選別するに当って変異原処理（たとえばＵＶ照
射）をすると耐性株の選別効率が向上する。変異原処理
によるこの効果も思いがけなかったことといえよう。

〔発明の詳細な説明〕

１、　腸管増殖性ＴＧＥ弱毒ウィルス 本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスは、経鼻と経口、ある
いは経鼻、あるいは経口投与後、腸管に於て増殖可能な
、蛋白分解酵素および（または）酸の少なくとも一つに
耐性のものである。

この場合の蛋白分解酵素としては、トリプシン、α−キ
モトリプシン、ペプシン、その他がある。

これらは混合物であってもよい。また、これらの蛋白分
解酵素は、単独であれ混合物であれ、それぞれは実質的
に純粋なものであることが好ましいが、他の胃乃至腸由
来の蛋白分解酵素と混合した状態のものであってもよい
。

本発明によるＴＣ，Ｅ弱毒ウィルスは、酸に耐性のもの
でもあることが好ましい。その場合の酸としては、各種
のものがありうるが、塩酸が最も代表的である。

本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスが蛋白分解酵素および
（または）酸の少なくとも一つに耐性であるということ
は、豚の胃または腸管内で遭遇する温度（たとえば３９
．６℃まで）および蛋白分解酵素〔たとえばトリプシン
（１：　２５０）の０．５重量％まで〕および（または
）酸性度（たとえばｐＨ３〜ｐＨ７）の条件下で、実質
的に破壊され難い（たとえばトリプシン感受性株に比べ
て耐性株の破壊によるウィルスが１０２以上以上−）と
いうことである。

２、　腸管増殖性ＴＧＥ弱毒ウィルスの作出（１）　一
般的説明 本発明によるＴＧＥ弱毒ウィルスの作出法は、基本的に
は、病原性ＴＧＥウィルスの豚培養細胞上での累代継代
による弱毒化、得られた弱毒株の変異原処理、および変
異原処理した弱毒株の蛋白分解酵素および（または）酸
耐性株の選別、からなる。

すなわち、さらに具体的には、病原性ないし強毒性のＴ
ＧＥウィルス、たとえばＴＧＥウィルスＫＡ株、同Ｔｏ
株、その他、を豚培養細胞、たとえば腎臓、翠丸、その
他の臓器の細胞、上での累代継代たとえば１００〜１８
０代程度の累代継代を行なうと弱毒化される。この時点
に於ては、生成弱毒株の圧倒的多数が各種消化酵素感受
性であり、また酸感受性である。これに変異原処理、た
とえば紫外線（ＵＶ）処理、Ｘ線処理、ニトロソグアニ
ジン処理、その他、特にＵＶ処理、を施す。

ＵＶ処理は、公知の方法、たとえばＶｊｒｏｌｏｇｙ　
１７゜５１１−５１９．１９８２およびＶｉｒｏｌｏｇ
ｙ　５２，５７−７１．１９７３に記載の方法で行なう
ことができる。このような変異原処理後、ふつうは直ち
にプラーククローニングによりウィルスクローンを分離
する。このクローンを各々、−旦豚培養細胞上例えば豚
腎株化細胞（ＣＰＫ細胞）、で増殖させて消化酵素およ
び（又は）酸耐性株選別工程に入る。この選別工程は、
ウィルス液の消化酵素および（又は）酸処理とこの処理
の後、生存するウィルスの豚培養細胞による回収増殖の
二操作からなる。消化酵素および（又は）酸処理には、
種々の蛋白分解酵素、例えばトリプシン、α−キモトリ
プシン、ペプシン又はバンクレアチンのような各種酵素
の混合物がもちいられる。酸処理には稀塩酸が好ましい
。これらの酵素又は酸処理は、たとえば、２５℃〜３８
℃、好ましくは３７℃で、１０分〜６０分間行なう。処
理後、直ちに水冷し、さらに好ましくは仔牛血清をウィ
ルス液と等瓜加えて反応を抑制する。この処理ウィルス
液を、直ちに上記の豚培養細胞の単層培養に接種し、残
存ウィルスを回収増殖させる。残存ウィルスの増殖が確
認できたものについて、すなわち細胞変性効果（ＣＰ　
Ｅ）が出現したものについて、ＣＰＥが十分に広がって
から、ウィルス液を採取し、好ましくは再び上記の蛋白
分解酵素および（又は）酸処理と、残存ウィルスの豚培
養細胞を用いた回収増殖操作をくり返す。この選別操作
を少くとも１２代くり返して、蛋白分解酵素および（又
は）酸耐性の、従って腸管粘膜上で増殖可能と考えられ
る、弱毒ＴＧＥウィルスを得る。

（２）　好ましい具体例の説明 親株としては、例えば、野外より分離した強電体、ＴＧ
ＥウィルスＫＡ株（ｌｌａｒａｄａ　ｅｔ、　ａｌ、。

ＮａＬｌ、　１ｎｓＬ、　Ａｎｉｍ、　＋１１ｔｈ、　
ＱｕａｒＬ、、　７　、１２７−Ｈ７゜１９６７）を用
いることができる。この株は農林水産省生物資源研究所
から分譲をうけることができる。

ウィルスの継代に好ましく使用される豚腎培徨（ＳＫ）
細胞は、健康な豚の腎臓をトリプシンで消化したのち、
仔牛血清を１０％に添加したイーグルＭ　Ｅ　Ｍ培地で
培養して調製することができる。

このＳ　Ｋ細胞にウィルス液を希釈せすそのまＮ用いて
接種し、３７℃で累代継代を行なう。１７２代までＳＫ
細胞に累代継代して得たウィルス、すなわちＫＡ１７２
株ウィルスを、感受性ある４頭の豚に経鼻と経口接種し
た結果、表１に示したように接種豚は臨床的に下痢など
の症状は認められず、正常であり、ＫＡ１７２株は補乳
豚に対して病原性を有しないまでに弱毒化したことが証
明された。弱毒化したＫＡ１７２株を紫外線（ＵＶ）処
理したのち各継代ごとにウィルスをトリプシン処理して
ＣＰＫ培養細胞に接種して、累代継代を行う。継代１２
代のウィルスについてトリプシン感受性を調べれば、目
的とするトリプシン耐性弱毒の　ＴＧ、Ｅウィルスが作
出されるに至ったことが判明する。

実施例１　　　　　− Ｓ　Ｋ細胞に累代継代して得られた弱毒Ｋ　Ａ１７２ウ
イルス（親株弱毒ＫＡ１７２株）をＵＶ処理したのち、
トリプシン処理してＣＰＫ培養細胞に継代した。

ＵＶ処理はウィルス液をシャーレに薄く入れ、約４００
μｗ　／　ｃｉの紫外線放射強度のもとて３０秒間照射
することによって行ない、直ちにＣＰＫ培養細胞（豚腎
株化細胞）を用いてブラッククローニングを行なう。Ｃ
ＰＫ培養細胞に０．２５％トリプシン溶液と０　、　２
９６　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（エチレンジアミン四酢酸二ナ
トリウム三水塩）溶液の等全混合液を入れて細胞を分散
させて、細胞懸濁液を作る。次に、この細胞懸濁液中の
細胞を遠心分離によって沈殿させ、この沈殿した細胞を
とり出して、細胞増殖用培養液でＣＰＫ細胞浮遊液を作
る。ここで使用した細胞増殖用培養液は、イーグルＭＥ
Ｍ培地に容量百分率で仔牛血清１０％およびトリプトー
スフォスフエイトブロス１０％を加え、さらにカナマイ
シン１００μｚ　／　ｍｌおよびファンギソン１μｇ／
ｍｌ（抗黴剤）を混合したものである。前記ＣＰＫ細胞
浮遊液をシャーレに分注し、３７℃で２〜３日培養する
。培養細胞のｔＩｔ層が完全に形成されたシャーレより
培養液を取り除き、ＵＶ照射した前記のウィルス液を接
種する。３７℃の００２ふ卵器内に６０分間おいてウィ
ルスの吸着を行ったのちウィルス液を吸引除去し、前記
細胞増殖液（たゾし牛血清のみを５％に減量したもの）
にバクトアガーを１％の割合に加えた寒天液を重層し、
さらに３７℃で２〜３日間置装て明瞭にブラックが形成
されたものを採取してブラッククローニングを行なう。

ＣＰＫ培養細胞に増殖したクローニングウィルス液に５
０００μｇ　／　ｍｌの割合にトリプシン（１：　２５
０）を加え、３７℃に６０分間おいて処理したのち直ち
に氷冷し、仔牛血清をウィルス液と等量論えてトリプシ
ンの作用を抑制して、ＣＰ　Ｋ培養細胞に接種する。こ
のＣＰＫ培養細胞は前記ＣＰＫ細胞浮遊液を細胞培養び
んに分注し、３７℃で２〜３日培養し、単層細胞が完全
に形成されたもので、培養液を取り除いてウィルス液を
接種する。３７℃に６０分間おいてウィルスの吸着を行
ったのちウィルス液を吸引除去し、イーグルＭＥＭ培地
を加えて３７℃に培養する。ＣＰＥが確認されたのち（
通常接種後２〜３ＬＩ）、ウィルスを採取する。ウィル
スの累代継代にはウィルス液にトリプシンを５００〜５
０００μｇ　／　ｍｌの割合に加え、前記トリプシン処
理と同様にしてＣＰ　Ｋ培養細胞に接種して、継代を繰
り返す。１２代継代したウィルスを調べたところ、トリ
プシン耐性弱毒の性状を有するＴＧＥウィルス株が作出
された。

比較試験１ 上記により得たトリプシン耐性弱毒株と親株弱毒ＫＡ１
７２株についてトリプシン感受性を比較した。その成績
を下記第１図に示した。トリプシン（１：２５０）５０
００μｇ／ｍ１（３７℃。

６０分）の処理で、ＫＡ１７２株は１０３の感染価の低
下があって、トリプシン感受性であったが、トリプシン
耐性弱毒株は１０°″５程度の低下であって、トリプシ
ン耐性であった。また、両者の生残率の差は１０２“７
５であった。

比較試験２ 上記のトリプシン耐性株と親株弱毒ＫＡ１７２株につい
て、α−キモトリプシン、ペプシン（１：　１００００
）およびバンクレアチンに対する感受性を比較した。そ
の結果は、下記第２．３．４図で示すように、ＫＡ１７
２株に比べてトリプシン耐性弱毒株は、例えば、α−キ
モトリプシンの１１０００ｃｚ／ｍｌ　（３７℃、６０
分））で１．２５ １０　　、ペプシンではｐＨ４，２において、ぺ２．２
５　　、、 プシンの５００μｇ　／　ｍｌで１０　　、ハノクレア
チン（１：　１００００）の５０００μｇ／ｍｌで１０
１．０といずれの場合も高い生残率を示しており、トリ
プシン耐性弱毒株はＫＡ１７２株より耐性であった。

比較試験３ 上記のトリプシン耐性弱毒株と親株弱毒ＫＡ１７２株に
ついて３７℃で４０分処理した時の酸感受性を比較した
。その結果は、第５図に示すように、ＫＡ１７２株はｐ
Ｈ３，０とｐＨ２，０で、１ｏ３．５の感染価の低下が
あったが、トリプシン０．５ 耐性弱毒株はｐＨ３，０で１０　〜１０°゛７５程度の
感染価の低下であり、ｐＨ２，０で１０３°５の感染価
の低下がみられた。この結果、ＫＡ１７２株はｐＨ３，
０以下の酸に感受性であり、これに比べてトリプシン耐
性弱毒株は、ｐＨ３，０に耐性、ｐＨ２，０には感受性
であり、トリプシン耐性弱毒株は酸に対してＫＡ１７２
株に比べより耐性であった。

比較試験４ 上記のトリプシン耐性弱毒株と親株弱毒ＫＡ１７２株に
ついて、豚胃腸内容液に対する感受性を比較した。用い
た胃腸内容液は８０００ｒｐｍで２０分間遠心沈澱させ
た。その結果は、表３に示すように、ＫＡ１７２株に比
べてトリプシン耐性弱毒株は、胃、十二指腸、空腸の上
部、中部、下部と回腸の６つの内容液で３７℃、６０分
間処理した時、これらの内容液に対してより耐性の性状
であった。

以上比較試験例１．２．３．４の成績から、Ｉ・リプシ
ン耐性弱毒株は親株弱毒ＫＡ１７２株に比べて明らかに
トリプシン耐性であり、またα−キモトリプシン、ペプ
シン、パンクレアチンの消化酵素や酸あるいは胃腸内容
液に対してもより耐性の性状であり、親株弱毒ＴＧＥウ
ィルスのＫＡ１７２株と区別できる性状を有することが
証明された。

実施例２ 次に、上記トリプシン耐性弱毒株の安全性と有効性を調
べるため、トリプシン耐性弱毒株からなるワクチンを感
受性ある７頭の豚に経鼻と経口接種して観察した。その
結果は、下記表１に示したように、トリプシン耐性弱毒
株ワクチンを接種したいずれの豚もｆ痢、嘔吐、食欲不
振など臨床上の異常は全く認められず正常であり、すな
わちトリプシン耐性株は哺乳豚に対して病原性を示さな
いまでに弱毒であって、トリプシン耐性弱毒株の安全性
が確認された。

また１、トリプシン耐性弱毒株を感受性ある豚に接種し
て、ウィルスの体内分布を調べた。その結果は、下記表
２に示した。１０目殺の豚の鼻粘膜、気管、扁とう、空
腸上部からウィルスが回収され、消化管での増殖も空腸
上部のみではあったが確認された。３１１目と５１］目
には肺のみからウィルスが分離された。試験した他の臓
器、消化管、リンパ節からウィルスは回収されなかった
。これらの試験成績から、トリプシン耐性弱毒株のウィ
ルスの体内分布域は狭く、弱毒が裏付けられると共にワ
クチンウィルスとして重要な腸管局所での増殖が確認さ
れた。

また、上記トリプシン耐性弱毒株を接種した豚について
、ＴＧＥウィルスＴｏ−１６３株（Ｔ。

＝１６３株は、農林水産省家畜衛生試験場から分譲され
た。ＴＧＥウィルスの中和試験その他の試験の標準ウィ
ルスとして一般に広く用いられているＴＧＥウィルス弱
毒株である。）に対する中和抗体価を調べ、中和抗体の
産生が確認された。その結果は表１の中に示したように
、ＫＡ１７２接種豚は１２８倍〜２５６倍、トリプシン
耐性弱毒株接種豚は２５６倍〜１０２４倍の中和抗体価
であり、トリプシン耐性弱毒株はＫＡ１７２株と同等以
上に接種豚の抗体応答がよいことが証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、弱毒株のトリプシン耐性を示す説明図である
。 第２図（婆、弱毒株のα−キモトリプシン耐性を示す説
明図である。 第３図は、弱毒株のペプシン耐性を示す説明図である。 第４図は、弱毒株のパンクレアチン耐性を示す説明図で
ある。 第５図（ａ、　　ｂ）は、弱毒株の酸耐性を示す説明図
である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 第１図 第２図 第４図 ｐＨ （Ｇ） ＯＳ＜ｊｒｅｎｓｅｎ　　ｂｕｆｆｅｒ・Ｍｉｃｈａｅ
ｌｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ ΔＭｃＩＩｖａｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ ％ ｐＨ 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、経鼻と経口、あるいは経鼻、あるいは経口投与後、
   腸管に於て増殖可能な、蛋白分解酵素および（または）
   酸の少くとも一つに耐性な豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）弱
   毒ウィルス。 ２、該蛋白分解酵素がトリプシンである、特許請求の範
   囲第１項記載のＴＧＥ弱毒ウィルス。 ３、該蛋白分解酵素がα−キモトリプシンである、特許
   請求の範囲第１項記載のＴＧＥ弱毒ウィルス。 ４、該蛋白分解酵素がペプシンである、特許請求の範囲
   第１項記載のＴＧＥ弱毒ウィルス。 ５、病原性豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）ウィルスを弱毒化
   後、変異原処理して、続いて蛋白分解酵素および（また
   は）酸の少なくとも一つに耐性の株を選別することから
   なる、 経鼻と経口、あるいは経鼻、あるいは経口投与後、腸管
   に於て増殖可能な、蛋白質分解酵素および（または）酸
   の少なくとも一つに耐性な豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）弱
   毒ウィルス作出法。 ６、該病原性ＴＧＥウィルスがＴＧＥ・ＫＡ株である、
   特許請求の範囲第５項記載の作出法。 ７、弱毒化が豚の培養細胞に累代継代することによって
   行われる、特許請求の範囲第５項記載の作出法。 ８、該変異原処理が紫外線照射である、特許請求の範囲
   第５項記載の作出法。 ９、蛋白分解酵素耐性株の選別を、ウィルスの累代継代
   毎のトリプシン処理によって行う、特許請求の範囲第５
   項記載の作出法。 １０、経鼻と経口、あるいは経鼻、あるいは経口投与後
   、腸管に於て増殖可能な蛋白分解酵素および（又は）酸
   の少くとも一つに耐性な豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）弱毒
   ウィルスを含んでなる豚伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）予防用
   ワクチン。