JPH01168281A - カタラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は活性汚泥由来の微生物群を用いるカタラーゼの
製造方法に関する。

〔従来の技術〕

カタラーゼは食品加工、臨床分析等の分野での需要が増
加しつつあり、実用的価値の高い酵素として注目されて
いる。

カタラーゼは好気性生物に広く分布する酵素であるが、
酵素製造のための入手源として利用できるものは極めて
限られる。カタラーゼは現在上として豚、牛等の肝臓か
ら抽出採取されているが、これらの原料の入手には限り
があり、しかもカタラーゼの含量が比較的少ないため、
これらから製造されたカタラーゼ製品は非常に高価なも
のとなる。微生物を利用してカタラーゼを発酵生産する
方法として、ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
）　、ロドシュードモナス（訓覗吐緩媛９姐阻）、サツ
カロミセス（鉢仔恒二囮１組）等を使用する方法が知ら
れているが、これらの微生物のカタラーゼ生産性は必ず
しも十分でなく、また、これらの微生物の培養に当って
は無菌管理をしなければならない等のため、これらの微
生物を用いてカタラーゼを安価に製造することはやはり
困難であった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明はほとんど無菌管理をすることなく、し
かも極めて安価な培地を用いてカタラーゼを安価に且つ
工業的に製造することができる新規なカタラーゼ製造法
を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、上記のような特徴を有するカタラーゼの
製造方法を開発すべく種々検討した結果、活性汚泥中に
存在する微生物群を過酸化水素の存在下で培養して過酸
化水素耐性を獲得させた場合、これらの微生物群が高い
カタラーゼ生産能を有するという新しい知見を得、この
知見に基いてこの発明を完成した。

従って、この発明は、活性汚泥中の微生物群を過酸化水
素を含有する液中で培養することにより得られる、過酸
化水素に対する活性を獲得した微生物群を培養してカタ
ラーゼを生産せしめ、この培養物からカタラーゼを採取
することを特徴とするカタラーゼの製造方法を提供する
ものである。

〔具体的な説明〕

廃水処理設備等で水の浄化を司どる活性汚泥はシュード
モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、ズーグレア（ｋ
鵠玩竺）、フラボバクテリウム（）’　ｌａｖｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）等各種の微生物の菌体の集合体であり、
それに含まれる微生物の比率や性質はそれらが増殖する
液の成分、濃度、ｐＨ、温度等の環境条件により刻々と
変化する０本発明によれば廃水処理設備等から得られる
任意の活性汚泥中の微生物群を過酸ｆヒ水素を含有する
培地中で培養することにより過酸化水素に対して耐性を
有する微生物群（集団）が得られ、この微生物群はカタ
ラーゼ生産能を有する。

過酸化水素耐性を有する微生物群を得るには、出発材料
である例えば活性汚泥中の微生物群を過酸化水素を含有
する培地中で培養すればよい。この培養は好気的条件下
において行うのが好ましい。

この場合、微生物群をいきなり高濃度の過酸化水素を含
有する培地に入れれば死滅する場合があるから、最初低
濃度において馴養し、段階的に過酸化水素濃度を高めて
いくのが好ましい、この場合、最初に例えば５０〜１１
００ｐｐ程度の過酸化水素を含有する培地中で１〜２週
間培養を行い、次におよそ２００〜３００ｐｐｍの過酸
化水素を含有する培地中で培養を行う。このようにして
順次高濃度の過酸化水素を含有する培地中で馴養を行う
ことによって、例えば３０００ｐｐｍ程度の過酸化水素
に耐性を有する微生物群を得ることができる。しかしな
がら、過酸化水素に対する耐性の程度とカタラーゼの生
産性とはかならずしも比例関係にはなく、本発明によれ
ば２００〜３００ｐｐｍ　、例えば２５０ｐｐＬ１以上
の過酸化水素を含有する培地中で増殖できる微生物群を
使用すれば十分である。

この様にして得られた微生物群中には、例えばセラチア
（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒ
ｏ−ｂ−ａｃｔｅｒ）　、シュードモナス、ミクロコツ
カス、フラボバクテリウム等の微生物が含まれている。

なお、上記の様にして過酸化水素耐性を獲得した微生物
群は過酸化水素の非存在下でもカタラーゼを生産するが
その生産能は徐々に低下する傾向があるので、数日間の
間隔で定期的に培地に過酸化水素を添加することにより
カタラーゼ生産能の回復を図ることが好ましい。

本発明において使用する培地は特に臨界的ではなく、活
性汚泥中の微生物群が増殖できるものであればよい。例
えば、培地を人工的に配合調製する場合には、細菌の培
養に一般に用いられる材料、例えばペプトン、肉エキス
、酵母エキス、コーンステイープリカー等を単独で又は
組合わせて使用することができる。これらは例えば０．
０１〜０．５％の濃度で添加するのが好ましい。また、
無機窒素を補給するため、例えば硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム等を培地に加えることもできる。さらに
、カリウム、鉄、マグネシウム、カルシウム等の陽イオ
ン、及びリン酸イオン等の陰イオンを少量加えることが
好ましい９しかしながら、この発明によれば、上記のよ
うな人工培地でなくても、例えば食品加工工場排液、家
庭排液等のように比較的有機物に富む排液をそのまま、
又は−ｇ・要により水で稀釈して、あるいはこのような
液に硫酸アンモニウム等を補給して使用することもでき
る。

培養は１０℃〜４０℃と、比較的広範囲の温度において
行うことができるが、好ましくは２０℃〜３０℃である
。培地中のａｌｌは好ましくは６．０〜８．０の範囲と
する。培養は通気等の手段により好気的条件下で行う。

培養は種々の方式により行うことができる０例えば、通
常使用される発酵槽に過酸化水素を含む培地を仕込み、
これに種菌として例えば排液処理場からの活性汚泥を添
加して適当量の通気を行って培養を行うことができる。

しかしながら、この方法によれば培地中の過酸化水素濃
度が高くなるに従って微生物の菌体外で過酸化水素の分
解が起こり、これにより気泡が生じて微生物が浮上し培
養を継続することが困難となる場合がある。

この問題点を解決する１つの手段として第１図に示すよ
うな循環培養装置を用いるのが好ましい。

この方法によれば、原料供給管３から１定速度で培地を
曝気槽１に供給し、他方空気吹込管２により空気を吹き
込み、曝気槽１中で微生物の増殖とカタラーゼの生産が
行われる。そしてこの間に浮上した菌体は溢流管４によ
り沈降槽５に移送される。沈降槽５では菌体が沈降し、
これは汚泥返送管６により曝気槽に返還され再利用され
る。他方、培地供給量に相当する上清培養液を放流管７
から放流する。なお、汚泥返送管６より、菌体を含有す
る培養液を一部定期的又は連続的に取り出し、これから
カタラーゼを採取する。

他の方式として第５図に示すような固定床装置を用いる
ことができる。この装置においては、過酸化水素添加管
１３及び栄養液添加管１４からそれぞれ過酸化水素及び
栄養液が添加され貯槽１２において培地が配合され、こ
れがポンプ１５により充填塔１１を通して循環され、過
剰の液は排出管１６から排出される。充填塔１１中に小
石等の塊状の支持体が充填されており、この表面上に固
定された状態で微生物が増殖する。こうして、支持体表
面上にカタラーゼ生産能の高い微生物を得ることができ
る。この微生物を定期的に回収し、これからカタラーゼ
を採取することができる。この方式によれば、微生物が
浮上流出する虞れがなくなるので、比較的高濃度の過酸
化水素を含む培養液で培養できるので、非常にスムース
に耐性を得るようになるため、馴応に要する時間を短縮
することが出来、時間の無駄を防ぐことが出来るととも
に、馴応に際しての作業が極めて容易になるなどの効果
が得られる。

カタラーゼの採取は、常法に従って行うことができる。

カタラーゼは大部分が培養物中に含まれるため、まず培
養物を採取する。このものは凝集沈降しやすいため、培
養液を静置してこの培養物を沈降せしめ上清を除去する
ことにより一簡単に濃縮することができる。必要により
、この濃縮物を濾過、遠心分離等によりさらに濃縮する
こともできる。この菌体からカタラーゼを遊離せしめる
には、種々の一般的な分離手段を用いることができるが
、この菌体をアセトン中で脱水した後乾燥せしめ、アセ
トン乾燥菌体を水で抽出し、抽出液を遠心分離、限外ｒ
過等により精製した後、液を蒸発乾燥せしめることによ
り、収率よく高純度のカタラーゼを得ることができる。

カタラーゼの力価は次のようにして測定する。

口径３０ｆｆｌＩ１１の試験管に約０．ＯＩＭ　ｌｌ２
（ｈ　５　ｍｌをとり、３０℃の恒温水槽に浸漬し、恒
温とする。これに３０℃に保温した酵素液１社を加え、
反応を開始し、正確に５分後にｌＮ１１□Ｓ０．２　ｍ
ｌを加えて反応（酵素作用）を停止させる。次に１０％
ＫＩ１ｍｌと１％モリブデン酸アンモニウム１滴を加え
、遊離したヨウ素をデンプン指示薬を用いて、Ｎ／２０
０　Ｎａ２Ｓ２０ｉで滴定する（Ａｍ１）。別に酵素液
の代わりに水を用いて同様に操作したものをブランクと
して滴定する（Ｂｍｉ’）。

上記条件下で１分間に１μＭの１１□０２を分解する酵
素量をカタラーゼ力価１単位（ユニット）とし、次式お
よび第４図に示す作用曲線より力価を求める。

Ｎ　／２００　Ｎａ２Ｓ２０ｉ　１　ｄ＝２．５μＭ　
−Ｈ２ｄ□故に ５分間に分解したｌ１２０２ノｕＭ＝（Ｂ　　Ａ）Ｎ２
．５ｘｆ（但し、ｒはＮ　／　２００　Ｎａ２Ｓ２０ｉ
のファクター）。

〔発明の効果〕

一般に、活性汚泥を構成する微生物群は繁殖力が非常に
強く、この中で他の侵入菌が繁殖することができないた
め、常に安定な生態系を維持する。

従って、本発明の培養においては、培地を殺菌したり、
培養中に無菌管理を行う必要はない。従って、殺菌、無
菌管理等のための高価な設備を必要とせず、また複雑な
管理も必要としない。また、この発明の方法によれば高
価な培地を必要とせず、食品工場等から出る排液を使用
することもできる。

さらに、この発明の培養を通常の排液処理の一環として
行うこともできる。従って本発明の方法によればカタラ
ーゼを安価に工業生産することができる。

次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する
。

火バ鮭Ｌ１劃し幻帽吐慟１１１１Ｏ肝設廃水処理設備よ
り採取した汚泥１０１を、図１に示す活性汚泥試験機を
用い、表１の組成を有する培地（流量１５１／日）で培
養した。この例においては容量１０１の曝気槽１を使用
した。空気吹込管２より空気を吹込み酸素の供給を行う
と共にゆるやかな撹拌を起すようにした。原料供給管３
より培地を供給した。溢流管４よりオーバーフローした
液は沈降槽５（５１）に入り、汚泥分は底に沈降し濃縮
された後、汚泥返送管６により曝気槽１に戻した。返送
汚泥の一部を系外に抜き出し、汚泥濃度をコントロール
した。放流管７より培養液を排出した。汚泥濃度はＭＬ
ＳＳ（Ｍｉｘｅｄ　ＬｉｑｕｏｒＳｕｓｐｅｎｄｅｄ　
５ｏｌｉｄｓ）　２〜３ｇ／ｌを目標とした。過酸化水
素（Ｈ２０□）濃度は最初１１００ｐｐとし、２週間培
養しな。次に過酸化水素濃度を３００ｐｐｍに上げ１週
間培養し、更に２６００ｐｐｍまで上げて培養した。こ
の濃度において微生物群は十分な耐性を示した。

このように耐性を獲得した培養物を沈降濃縮した後遠心
分離し、乾燥したものについてカタラーゼ活性を調べた
ところ、カタラーゼ活性が飛躍的に向上している事が見
出された。馴養の各段階におけるカタラーゼ活性を比較
すると第２表の通りである。

なお、カタラーゼの活性比較の条件は次の通りである。

室温２５℃において過酸化水素（１１２０□）２２７０
ｍｇ／ｌの液５０ｍ１を三角フラスコにとり、これにサ
ンプルを加える。発生して来る酸素ガスの容積を一定時
間毎に測定し、作図により反応中の過酸化水素の半減期
を求める。試薬カタラーゼ（シグマ社製、生肝カタラー
ゼ　表示力価２８００ユニツト／ＩＩＩｇ）についても
同様に半減期を求めこの活性を１００％として相対値（
％）を算出する。

大部１■工 実施例１と同様の方法を実施し、７５０ｍｇ／ｌの過酸
化水素を含有する培地において得られた培養液（汚泥液
）　１０１　（ＭＬＳＳｆ４度１９２８＋ｎｇ／　１）
を沈降濃縮して１１の培養物を得、２〜３℃に冷却した
後、これに１０ｍｊ！のトルエンを加え、バイオミキサ
ーによってホモジナイズした。この処理液を遠心分離に
かけて固形物を除去し、黄褐色の上清液を得た。この上
清液を凍結・融解処理し、０．８μのメンブランフィル
タ−で濾過して來雑物を分離したｆ＆２〜３℃に冷却し
た。この液に一１０℃に冷却したアセトンを徐々に添加
してカタラーゼの結晶を析出させ、これを凍結乾燥する
ことにより１０６０ユニツト／ｍｇの活性を有するカタ
ラーゼ結晶０．５ｇを得た。

犬Ｗ事す− 実施例２と同様の方法を実施した。但し、０．８μのメ
ンブランフィルタ−の代りに１．０μのメンブランフィ
ルタ−を使用した。これにより６９０ユニット／ｍｇの
活性を有するカタラーゼ１ｇを得た。

この標品を用いて、各ｐＨにおけるカタラーゼ活性を測
定し、ｐＨ７，０における活性を１００として各ｐＨに
おける相対活性を求めた。この様子を第２図に示す。

また、前記カタラーゼを水に溶解して２７３ユニツト／
ｒａ１のカタラーゼ溶液を調製し、これを３０℃〜７０
℃の各種温度において１５分間インキュベートしたｔｉ
残存酵素活性を測定した。３０℃における残存酵素活性
を１００とした場合の各温度における相対活性を第３図
に示す。

大月［工 実施例１に記載したのと同様の方法を行った。

市下水終末処理場から採取した活性汚泥を種として使用
し、第３表に示す培地を３０１／日のフィード量で添加
した。

１日に１回、曝気槽より１１の液を抜き出し、遠心ｒ過
により培養物を得、これをアセトンで処理してアセトン
粉末を調製した。このアセトン粉末を２０ｇ／ｌの濃度
で水中に懸濁し、ゆるやかに撹拌しながら１時間放置す
ることによりカタラーゼを抽出した。この液を５００Ｏ
ｒｐｍにて３０分間遠心分離し上清を得、この上清のカ
タラーゼ活性を測定した。アセトン粉末の収量及びカタ
ラーゼ活性（ユニット／ｍ１）を第３表に示す。

以下余白 第３表 にｆ、ｆｐｊ斡２小口によるカタラーゼゝ性の増力■第
３表かられかるように、培養経過日数と共にカタラーゼ
の生産量が増加し、培養開始からおよそ２週間経過した
後、安定してカタラーゼが生産された。

実業け９５゜ アクリル製の充填塔（１０Ｘ　１０　Ｘ　５０ｃｍ）に
１０−１５ｍｍ径の小石を詰めペプトン液を循環させ、
ここに活性汚泥を接種した。４８時間循環させた後、こ
こに過酸化水素の添加を始め過酸化水素濃度を３００ｐ
ｐｍに保って運転した。

培養物の剥がれや流出は、はとんど見られなかった。こ
れを１週間続けた後、過酸化水素の濃度を１１０００ｐ
ｐに上げ、更に１週間運転を続けた後、小石を洗浄して
集めた培養物をホモジナイザーにかけ、遠心分離した上
澄み液を冷却し、アセトンを添加してカタラーゼを析出
させた。このカタラーゼ活性を調べたところ６９０ユニ
ツ）−／ｍｇであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施において使用した実験装置の略図
である。 第２図は本発明のカタラーゼのｌＪＩ＋と活性との関係
を示すグラフである。 第３図は本発明のカタラーゼの熱安定性を示すグラフで
ある。 第４図はカタラーゼ作用曲線の際に用いるカタラーゼ作
用曲線である。 第５図は本発明の方法に使用する固定床装置の略図であ
る。 第１図中１は曝気槽、２は空気吹込管、３は原料供給管
、４は溢流管、５は沈降槽、そして７は放流管をそれぞ
れ示す。 また、第５図中、１１は充填塔、１２は貯槽、１３は過
酸化水素添加管、１４は栄養液添加管、そして１５は循
環ポンプを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性汚泥中の微生物群を過酸化水素を含有する液中
   で培養することにより得られる、過酸化水素に対する耐
   性を獲得した微生物群を培養してカタラーゼを生産せし
   め、培養物からカタラーゼを採取することを特徴とする
   カタラーゼの製造方法。 ２、培養により得られた培養物をアセトン処理した後乾
   燥させ、次にこれに水を加えてカタラーゼを抽出するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。