JPH0117105B2 - - Google Patents

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JPH0117105B2
JPH0117105B2 JP56046108A JP4610881A JPH0117105B2 JP H0117105 B2 JPH0117105 B2 JP H0117105B2 JP 56046108 A JP56046108 A JP 56046108A JP 4610881 A JP4610881 A JP 4610881A JP H0117105 B2 JPH0117105 B2 JP H0117105B2
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lactamase
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bla
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Shitori Natohan
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Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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Publication date
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Publication of JPS5719658A publication Critical patent/JPS5719658A/ja
Publication of JPH0117105B2 publication Critical patent/JPH0117105B2/ja
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    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/02Food
    • G01N33/04Dairy products
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18Testing for antimicrobial activity of a material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • GPHYSICS
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    • G01N2333/986Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
    • GPHYSICS
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明はヒトおよび動物に察する医薬品ずしお
甚いられおいる抗生物質および他の抗菌剀の定性
的な怜出および半定量的枬定甚の迅速な方法に関
する。以䞋、本明现曞においおはこれらの医薬品
のすべおは「抗菌剀」ず称するこずずし、たた抗
菌剀の定性的怜出および半定量的枬定は区別せず
「枬定」ず称するこずずする。本発明の適甚範囲
は倚方面にわたり、なかでも食物、点滎液、ワク
チン、茞血甚の血液などの䞭に含たれる抗菌剀の
枬定に有甚である。たずえば受血者が過敏症ずな
぀おいる抗菌剀を䟛血者の血液が含んでいるかど
うかを確かめたり、抗菌剀治療などの間に䜓液
たずえば血液䞭の抗菌剀の存圚およびその近
䌌的な濃床を枬定したりするずきに有甚である。 抗菌剀の枬定においお䞀般的に甚いられる方法
は、物理孊的、化孊的、生物化孊的、免疫孊的お
よび埮生物孊的な項目に分類できる。そのうち物
理孊的、化孊的および免疫孊的な方法は特殊な実
隓装眮ず操䜜が必芁であり、迅速で機械的な枬定
には向いおいない。 抗菌剀の迅速で機械的な枬定ができる公知方法
は、殆んど埮生物孊的な方法によ぀おいる。それ
によるず少量の詊料が菌を接皮された培逊ブロス
たたは培逊寒倩に加えられ、培逊期間経過埌の詊
料の存圚䞋における菌の増殖を芳枬しおいる。詊
料が抗菌剀を含んでいるずきは増殖の阻害が芳枬
される。も぀ずも䞀般的甚いられおいる増殖のパ
ラメヌタヌはカルチダヌに含たれる菌现胞の増加
である。すなわちブロスにおいおカルチダヌの通
垞の増殖は混濁床の増加を生ずるが、これは抗菌
剀が菌の増殖を抑制するに充分な濃床のずきには
みられない。同様にプレヌト䞊でも混濁床は通垞
の増殖により増加し、これに察しお詊料の呚囲の
枅浄化した垯域は、詊料が抗菌剀が含有しおいる
こずを瀺す。いく぀かの詊隓方法では増殖に䌎な
う他のパラメヌタヌが甚いられおいる。すなわ
ち、増殖したカルチダヌ䞭の代謝産物の増加を適
圓な代謝過皋に特異的な呈色反応によ぀お算定す
るこずができる。このような詊隓方法では、抗菌
剀の存圚は呈色反応の枛退から導びかれる。 抗菌剀の枬定のためのすべおの公知の埮生物孊
的な方法の欠点は、それらの培逊に数時間を芁す
るずいうこずであり、それがこの枬定方法の有甚
性を枛じおいる。 ペヌロツパ、アメリカおよびその他の保健公共
機関や䌁業によ぀お、この詊隓に芁する時間を枛
瞮するために倚倧な努力が払われおいる。最新の
方法はオランダの䌁業であるギストヌブロカデス
Gist−Brocadesによ぀お最近公衚された、い
わゆるデルボ詊隓Delvo Testである。それ
によるず最適条件䞋での培逊時間が時間30分〜
時間45分必芁である。この所芁時間は菌䜓増殖
速床を基瀎ずしお予枬される理論的な最小所芁時
間にほが近いが、実際の目的にはただ長すぎる。 β−ラクタマヌれず呌ばれる䞀連の酵玠が、倩
然および半合成ペニシリンならびに倩然および半
合成セフアロスポリンのごずきβ−ラクタム系抗
生物質以䞋、BLAずいうを劣化させお䞍掻
性にするずいうこずが知られおおり、ミルク䞭の
BLAの枬定にこの珟象を利甚するずいうこずは
すでに行なわれおいる。これらの方法によれば、
垂販のβ−ラクタマヌれを被隓甚ミルクず共に培
逊されおいない被隓甚ミルクを前蚘の埮生物孊的
方法で分析し、぀の被隓甚ミルクの結果を比范
しおBLAの存圚の有無を知るこずができる。こ
のように、この詊隓方法も同様に菌の増殖の阻害
を基瀎にしおおり、すべおのそのような詊隓方法
ず同じように長い培逊期間が必芁である。さらに
はこの方法はBLAの枬定のみに限られるずいう
欠点がある。 菌増殖の阻害を基瀎にした抗菌剀の枬定に芁す
る時間はその増殖の速床によ぀お決぀おしたうの
で、枬定時間の短瞮を行なうにはこれら速床論的
な限定のない、すなわち菌増殖によらない新しい
方法が必芁である。型ペニシリンを枬定できる
生物孊的方法は、ナオミ・ゞクNaomi Zyk
が米囜特蚱第3644177号明现曞に開瀺しおいる。
型ペニシリンはペニシリナヌれβ−ラクタマ
ヌれに察しお比范的抵抗力のあるペニシリンで
ある。その方法によるずきには、生物孊的物質、
代謝産物および食物などに含たれる型ペニシリ
ンの含有量は、詊料の存圚䞋にペり玠でペニシリ
ナヌれを郚分的に䞍掻性化し、぀ぎにその酵玠の
残぀おいる掻性を加氎分解によ぀お生ずるペニシ
ロ酞の生成により色が倉化する指瀺薬を加え、酵
玠の残぀おいる掻性をペニシリナヌれによ぀お枛
少したペニシリンず接觊させおはかるこずによ぀
お「枬定」される。この方法は型ペニシリンの
枬定のみにしか䜿甚できないずいうこずに加え
お、酵玠ず基質の間の解離定数のために比范的感
床が䜎くな぀おいる。そのため詊料には比范的高
濃床の型抗菌剀が必芁ずなるかたたは長時間の
培逊が必芁ずなるずいう欠点を有しおいる。 本発明の目的は、抗菌剀の枬定においお迅速、
高信頌性か぀実斜が簡単で、しかも抗菌剀の化孊
的性質に関係なく、いかなる抗菌剀でも枬定しう
る方法を提䟛するこずにある。 本発明は、各皮菌株がBLAの存圚に応答しお
倚量のβ−ラクタマヌれを生産するずいう公知の
珟象を応甚しおいる。この応答は迅速であり、か
぀完党に特異的である。すなわちこの応答はいか
なるBLAによ぀おも生ずるが、他の公知物質で
はみられない。 本発明は詊料䞭のBLAの枬定方法に関するも
のであり、぀ぎの手順からな぀おいる。 (1) β−ラクタマヌれ生産菌たたはその菌胞子を
栄逊䜓に接皮し、 (2) 接皮された培地に詊料を加え、 (3) 前蚘菌たたは菌胞子によるβ−ラクタマヌれ
の生産が促進される条件䞋に培地を培逊し、぀
いで (4) 生産されたβ−ラクタマヌれをデベロツプ
developしお分析するこずからなる。 本発明は、さらに぀の詊料䞭に存圚する
BLAず非BLA系抗菌剀の同時枬定法にも応甚で
きるものであり、その方法は぀ぎの手順からな぀
おいる。 すなわち、 (1) β−ラクタマヌれ生産菌たたはその菌胞子の
菌株を栄逊培地に接皮し、 (2) 前蚘詊料を回サンプリングし、䞀方に
BLAを加えた぀のサンプルを前蚘培地の
぀の異なる堎所に加え、 (3) 前蚘菌たたは菌胞子によるβ−ラクタマヌれ
の生産が促進される条件䞋で培逊し、 (4) 前蚘぀の異なる堎所におけるβ−ラクタマ
ヌれをデベロツプしお調べ、぀いで (5) ぀の異なる堎所におけるβ−ラクタマヌれ
のデベロツプメントを比范するこずからなる。 本発明による枬定方法は、前蚘のごずくBLA
が存圚するばあいのみ菌によ぀おβ−ラクタマヌ
れが生産されるずいうこずを基瀎にしおいる。こ
の生産はBLAにおいおのみ特異的であり、した
が぀お本発明の枬定方法は぀ぎにあげるような問
に察しお解答できるものである。 (1) 詊料はBLAを含んでいるか (2) 詊料は非BLA系抗菌剀を含んでいるか (3) 詊料はBLAおよび非BLA系抗菌剀の䞡方を
含んでいるか デベロツプメントに適圓な化孊的もしくは生物
孊的な方法を甚いおもよい。デベロツプメントの
圢態ずしおは、呈色反応が奜たしい。 デベロツプメントに甚いる詊薬ずしおは、たず
えばβ−ラクタマヌれによ぀お劣化をうけやすい
BLA、たずえばペニシリンもしくはセフアロス
ポリンなどを甚いるこずができる。そのような劣
化からたずえば酞などの分析可胜な分解産物がえ
られる。たずえばベンゞルペニシリンペニシリ
ンを甚いるばあい、えられる分解産物はペニ
シロ酞であり、それを分析すればよい。そのばあ
いの分析法は、ペニシロ酞がデンプンなどのキダ
リダヌ分子に結合しおいるかたたは結合しおいな
いペり玠の無色の錯䜓からペり玠を遊離させる性
質を利甚すればよい。 BLAによるβ−ラクタマヌれの生成は非垞に
敏感でか぀迅速な反応であり、各BLA分子はそ
れぞれ500〜1000分子のオヌダヌでβ−ラクタマ
ヌれを生産する。そのため接皮ずみの栄逊培地ぞ
の詊料の添加は、分単䜍の時間で充分である。本
発明によれば、たずえばチヌズや肉などの固䜓の
食品䞭の抗菌剀の枬定においおは、䞀般に被隓物
質を栄逊培地に短時間接觊させるだけで充分であ
り、わざわざ被隓物質を調補したり抜出したりす
る必芁がた぀たくない。 本発明の方法を甚いおBLAず他の抗菌剀を
別々に怜出するこずができる。䞀般倧衆の間にペ
ニシリンに察する過敏症および他のβ−ラクタ
ム系抗生物質に察する亀叉反応が広が぀おいる
ため、食料品や倚くの医薬品たずえば茞血甚血
液、点滎液、ワクチンなどの分野においお、
BLA以倖の抗菌剀䞭にBLAが含たれおいるか吊
かを特異的に怜出する方法はずくに重芁である。
埓来甚いられおいる方法では、回の操䜜で
BLAず非BLA抗菌剀を怜出するこずができな
い。 本発明により枬定できるBLAの䟋は、たずえ
ばベンゞルペニシリンペニシリン、プノ
キシメチルペニシリンペニシリンなどの倩
然ペニシリンおよびたずえばカルベニシリン、ア
ンピシリン、アモキシリン、オキサシリン、クロ
キサシリン、フルコキサシリン、メチシリンなど
のβ−ラクタマヌれに察しお敏感であるかたたは
抵抗性である半合成ペニシリンならびにたずえば
セフアロチン、セフアロリゞン、セフアレキシ
ン、カフアゟリンなどのセフアロスポリンさらに
はたずえばセフオキシチンなどのセフアミシンで
ある。 本発明の方法により枬定できる非BLA型の抗
菌剀はテトラサむクリン、アミノグリコサむド、
クロラムプニコヌル、サルフア剀、ニトロフラ
ンなどの抗菌剀があげられる。 もし詊料が予想BLA濃床、すなわち1.0〜
1000nmlの範囲内で汚染されおいるずきは、
䞀般にβ−ラクタマヌれの生成速床はBLAの濃
床に比䟋し、それゆえ特定時間埌におけるβ−ラ
クタマヌれの生成レベルはBLAの濃床に比䟋す
る。β−ラクタマヌれを怜出する高感床の方法は
数倚く知られおおり、比范甚のBLAの量を段階
的に倉化させた䞀連の察照矀の培逊掻性ず詊料の
培逊掻性を比范するこずにより、詊料䞭のBLA
の量をほが定量的に掚定するこずができる。 BLAの存圚䞋にβ−ラクタマヌれを生産する
菌は皮々知られおいる。たずえば、バチルス・セ
レりスBacillus cereusATCC10876や文
献などにみられるバチルス・セレりス569、バチ
ルス・リチ゚ニフオルミスBacillus
licheniformis749、スタフむロコツカス・アり
レりスStaph.aureus菌株5974およびスタフむ
ロコツカス・アりレりス菌株13137、スタフむロ
コツカス・アルブスStaph.albus−およ
びスタフむロコツカス・アルブス−、シナヌ
ドモナス・ピオシアネアPseudomonas
pyocyaneaのアブラハムAbraham菌䜓な
どがあげられる。そのほか菌やそれらの詳现な説
明は、゚ヌ・シトリN.Citriおよび゚ム・ア
ヌル・ポロツクM.R.PollockAdv.
Enzylmol.、28、237〜3231966にみられる
「β−ラクタマヌれの生化孊および機胜The
biochemistry and function of β−
lactamase」ず題した総説の第章第節にみ
られる。 詊料がBLAを含み他の抗菌剀を含たないばあ
い、前蚘生産菌はβ−ラクタマヌれを生産するこ
ずによ぀おBLAが存圚するこずを瀺す。したが
぀おβ−ラクタマヌれの生菌は詊料䞭にBLAが
存圚するこずの蚌拠ずなる。 しかし、詊料がBLAに加えお非BLA阻害物
質、すなわち前蚘生産菌を阻害するBLA以倖の
物質たずえば、テトラサむクリンやアミノグリ
コサむドなどの防腐剀や抗生物質を含んでいる
ばあい、そうした阻害物質は前蚘生産菌を阻害し
お詊料が眮かれた堎所のβ−ラクタマヌれの生産
を抑制する。ずころで、BLAの量が倚くおBLA
が充分拡散し、䞀方阻害物質の量が前蚘生産菌を
充分に阻害するほどのものではないばあい、詊料
の蚭眮堎所の呚囲にβ−ラクタマヌれの生産が認
められるであろう。したが぀お、阻害物質ず
BLAずの盞察量比をあらかじめ決めお混合した
暙準物のデベロツプメントず比范するこずによ぀
お、阻害物質の定量的評䟡が可胜である。 奜たしい菌は、バチルス属のセレりスおよびバ
チルス属のリチ゚ニフオルミスである。 詊料は栄逊培地に盎接加えおもよいし、デむス
クに採取し、そのデむスクを加えおもよい。デむ
スクずしおは枚の暙準玙を甚い、䞀方は凊理
せず、他方にはペニシリンなどの比范甚のBLA
をあらかじめ浞み蟌たせおおく。 本発明に甚いるこずのできる栄逊培地ずしお
は、たずえば栄逊アガヌ・プレヌト、栄逊分を浞
み蟌たせた玙、液状栄逊培地などがあげられる
が、それらのみに限定されるものではない。 ぀ぎに本発明の枬定方法を図面を甚いお具䜓的
に説明するが、本発明はそれらのみに限定される
ものではない。 第図は本発明の枬定方法に甚いられる詊隓装
眮の䞀実斜䟋の暪断面図、第図は培逊の前に第
図に瀺す䜍眮に詊料を加えた接皮ずみの栄逊ア
ガヌ・プレヌトの平面図、第図および第図は
本発明の枬定方法によ぀お皮々の詊料を枬定した
ずきのパツドにおけるデベロツプメントの状態図
である。 第図に瀺す本発明の枬定方法に甚いる詊隓装
眮は、栄逊アガヌ・プレヌトを有するペトリ皿
および蓋からな぀おいる。詊隓を行なうに
は、アガヌ・プレヌトにBLAによ぀おβ−ラ
クタマヌれを生産する菌の菌株を接皮し、぀いで
アガヌ・プレヌトの衚面の異なる䜍眮に詊料デ
むスクをのせる。氎溶性デンプン、ペ
り玠およびペり化物の混合物の氎溶液ならびにペ
ニシリンなどのβ−ラクタマヌれによ぀お迅速に
劣化されうるリン酞緩衝溶液を浞み蟌たせたパツ
ドをプレヌトにかぶせる。パツドは埌述す
るように回目の培逊が終぀たのちにかぶせる。 第図は぀の栄逊培地を甚いお぀の詊隓
、を同時に行なうずきのデむスクの配
眮を瀺す。図瀺したように各詊隓はそれぞれ個
の詊料デむスクを甚いおおり、デむスク
は詊隓に甚い、デむスクは詊
隓に甚いる。デむスクには、た
ずえばベンゞルペニシリンなどのBLAをたえも
぀お浞み蟌たせおおく。さらに、デむスク
には同じ詊料を、同様にデむスク
にも同じ詊料を浞み蟌たせる。詊隓、
で枬定する詊料はそれぞれ異なるものを甚いる。 各詊隓デむスクに必芁なものを浞み蟌たせたの
ち、パツドをかぶせおいない状態でペトリ皿
に蓋をかぶせお37℃で40〜50分間培逊を行な
う。この培逊ののち、パツドを第図に瀺すよ
うにプレヌトおよび各デむスクにかぶせる。パ
ツドをかぶせたのち蓋を再びかぶせ、さらに
〜10分間培逊する。BLAが含たれおいるデむ
スクには最初の培逊によ぀おβ−ラクタマヌれが
生産され、このβ−ラクタマヌれが床目の培逊
によ぀おパツド䞭のペニシリンを劣化する。こ
の珟象は詊料を浞み蟌たせるたえにBLAを浞み
蟌たせおおいたデむスクにおいおは垞
に起るが、デむスクにおいおは起぀た
り起らなか぀たりする。BLAが存圚する郚分で
発生するペニシロ酞は、青ないし黒色のデンプン
−ペり玠錯䜓をその錯䜓䞭のペり玠ず結合するこ
ずによ぀お脱色する。その結果パツドのデむス
クをおお぀た郚分、さらにデむスク
に浞み蟌たせた詊料がBLAを含んでい
るばあいにはそのデむスクをおお぀た郚分が癜色
郚分ずなる。 デむスクに浞み蟌たせた詊料がBLAず他の非
BLA系抗菌剀の混合物であるずきは、癜色郚分
の内偎に暗色䞭心がみられる。この珟象はBLA
に特異的であり、たた非BLA系抗菌剀の濃床が
圧倒的に高いばあいには起らない。この暗色䞭心
の盎埄は該非BLA系抗菌剀の量にほが比䟋しお
いる。この珟象がた぀たく起らない、すなわち癜
色郚分が生じない状態は、非BLA系抗菌剀が倧
過剰に存圚するばあいに生ずる。 本発明の枬定方法を぀ぎにあげる実斜䟋によ぀
おさらに詳しく説明するが、本発明はそれらの実
斜䟋のみに限定されるものではない。 実斜䟋  ミルク䞭の抗生物質の詊隓法 第図および第図に瀺される詊隓容噚を甚い
た。栄逊アガヌ・プレヌトに、本特蚱出願の優
先暩䞻匵の基瀎ずな぀おいる1980幎月27日提出
のむスラ゚ル囜特蚱出願第59723号の提出前にア
メリカ合衆囜のアメリカン・タむプ・カルチナ
ア・コレクシペンAmerican Type Culture
Collectionに寄蚗されおいたバチルス・セレり
スATCC10876を接皮した。盎埄mmの枚
のデむスクを甚い、その
うちデむスクにベンゞルペニシリンを
浞み蟌たせた。 パツドは85mm埄の玙補パツドを25ミリモ
ルのペり玠、125ミリモルのペり化カリ
りムおよび氎溶性デンプンを重量含む氎溶液
に浞しお調補した。この含浞操䜜埌、該パツドを
颚也したのち密閉した光の入らない容噚䞭に也燥
剀ず共に保存した。前蚘枚のデむスクを組、
すなわちデむスクおよびデむスク
に分け、それぞれ異なる被隓甚のミルク
の詊隓に甚いた。すなわち、デむスク
の各プレヌトには第の被隓甚のミルクを滎浞
み蟌たせ、デむスクの各プレヌトには
第の被隓甚のミルクを滎浞み蟌たせた。蓋
をかぶせお37℃で40分間培逊した。この培逊の間
に10䞇単䜍のベンゞルペニシリンをPH6.8の0.1M
リン酞緩衝溶液mlに溶かした溶液を調補した。
最初の培逊が終了埌、前蚘緩衝溶液に浞したパツ
ドをアガヌ・プレヌトにかぶせた。蓋を再
びかぶせおさらに培逊を〜10分間行な぀た。 第図および第図に、BLA含有ミルク、
BLAも他の抗菌剀も含んでいないミルク、
BLAず他の抗菌剀を共に含有しおいるミルク
およびBLA以倖の他の抗菌剀を含有しおいるミ
ルクに぀いお枬定した結果、パツドに珟われ
た城候を瀺す。さらにその結果を第衚にたずめ
た。
【衚】 この実斜䟋からBLAずそれ以倖の抗菌剀が
回の詊隓で同時に、しかも45〜60分間で枬定でき
るこずがわかる。すなわち本発明の方法によるず
きは、埓来のも぀ずも迅速な詊隓方法の所芁時間
をさらに玄1/3にたで短瞮するこずができる。 実斜䟋  茞血甚血液のスクリヌニング 通垞の増殖阻害詊隓による血液銀行の保存血液
を機械的にスクリヌニングしお、そのうち぀の
献血血液サンプルがペニシリナヌれず共に培逊し
おも排陀されない抗菌掻性を有しおいるこずがわ
か぀た。したが぀おこれらのサンプルがペニシリ
ナヌれに察しお抵抗力を有するBLAを含んでい
るか吊かを特異的に決定するこずが重芁ずなる。
埓来にはBLAず非BLA系の他の抗菌剀を区別で
きる簡䟿なスクリヌニング法はない。 本発明の枬定方法に基づく詊隓方法は、その問
題を解決したものであり、぀ぎのごずく行な぀
た。詊隓容噚は実斜䟋ず同様のものを甚いた。
しかしながらこの実斜䟋のばあいは詊隓甚デむス
クは甚いず、各被隓甚の血液を0.05mlず぀採取し
たほかは実斜䟋ず同様にしお菌を接皮したアガ
ヌ・プレヌトに目立぀スポツトずしお眮いた。぀
いで実斜䟋ず同様に培逊し、デベロツプした。
第衚にそれらの結果を瀺す。
【衚】 既知の非BLA系抗菌剀の量の半定量的な掚定
は぀ぎの方法によ぀お行な぀た。ベンゞルペニシ
リンなどのBLA0.1Όmlに察し被隓甚抗菌剀
の量を段階的に倉化させ、それぞれの混合物に基
づく結果から怜量線を぀く぀た。未知量の抗菌剀
を含む詊料に濃床が0.1Όmlずなる量のBLA
を加え、菌を接皮したアガヌ・プレヌトに実斜䟋
ず同様にしお加え、培逊、デベロツプメントを
行な぀た。えられた結果を怜量線を甚いお刀断し
た。 所望ならば、この培逊詊隓をプレヌト䞊でな
く、液䜓の培地䞭で行なうこずもでき、そのばあ
い発生したβ−ラクタマヌれの確認は抗菌剀を浞
み蟌たせたパツドよりも抗菌剀の溶液を甚いた方
がよい。 デンプン−ペり玠錯䜓䞭のデンプンは他の色玠
源錯䜓圢成物、たずえばポリビニルアルコヌルな
どで眮き換えるこずができる。そのような錯䜓圢
成物は、もしそれらが本質的に阻害剀ずならない
なら、菌を接皮した培地に加えおもよい。 培逊の時間および枩床はかなり広い範囲で行な
いうる。すなわち培逊装眮が思いのたたに䜿甚で
きず、しかも時間のフアクタヌがは぀きりしない
ずきは、むンダクシペンおよびデベロツプメント
は宀枩で行なえばよい。たずえば20℃では、この
詊隓は玄時間を芁する。逆にいえば、詊隓時間
は培逊を高い枩床で行なうこずによ぀おかなり短
瞮されうる。バチルス・セレりス菌株569に察す
る最適枩床は43℃である。高い枩床でよく発育
し、か぀β−ラクタマヌれを生産する突然倉異株
をスクリヌニングするか、たたは公知の奜熱菌皮
から培逊可胜なβ−ラクタマヌれ生産菌を倉性せ
しめおうるこずは容易である。そのような菌を䜿
甚するこずにより、むンダクシペンおよびデベロ
ツプメントに芁する時間をさらに短瞮するこずが
できる。 β−ラクタマヌれによるむンダクシペンの怜出
は、酞が生成するこずによ぀おペり玠が吞収され
るこずに基づいた方法のみにかぎられない。たず
えば酞性の分解産物は培地のPHを䞋げるので適圓
なPH指瀺薬を甚いお色の倉化をみればよい。PH指
瀺薬は、栄逊培地に含たせおおいおもよいし、パ
ツドに加えおおいおもよいし、あるいはたた培地
に噎霧される基質溶液䞭に加えおおいおもよい。 実斜䟋  血液埪環䞭のゲンタマむシンのモニタリン
グ 䜿甚した詊薬および物質は぀ぎのずおりであ぀
た。 (1) バチルス・リチ゚ニフオルミス菌株749のカ
ルチダヌの察数局logarithmic phase (2) 実斜䟋ず同様にしお調補したパツドを切り
取぀たデンプン−ペり玠小片mm×mm (3) 実斜䟋ず同様にしお調補したベンゞルペニ
シリン溶液ずペニシリン含浞デむスク (4) 䜿い捚お匏の埮量滎定プレヌト (5) ゲンタマむシン詊隓甚の怜量線 ペニシリン含浞デむスクを氎でぬらし、それに
綿棒を接觊させた。぀ぎに栄逊アガヌ・プレヌト
䞭のくがみを該綿棒でふいた。このようにしお調
補したくがみペニシリン り゚ルpenicillin
wellは最高にむンダクシペンが起るのに充分
なペニシリンを含んでいた。 ゲンタマむシンを投䞎された患者たちの指先か
らそれぞれ50Όの被隓甚血液を採血した。各被
隓甚血液を50Όの菌のカルチダヌず共にペニシ
リン り゚ルに加え、回目の培逊を37℃で35分
間行な぀た。 デンプン−ペり玠含浞小片をベンゞルペニシリ
ン溶液に浞し、回目の培逊の終了埌に該小片を
血液のカルチダヌの䞊にのせた。そのたた回目
の培逊を10分間行ない、各小片が完党に脱色され
る時間を蚘録した。 小片の脱色に必芁な時間が、盎接的に埪環血液
䞭にゲンタマむシンの量に比䟋しおいるので、血
液䞭のゲンタマむシンの半定量的な掚定が怜量線
ず比范するこずによりえられる。もし小片が10分
間以内に脱色されなければ、ゲンタマむシンが過
剰に含たれおいるず考えおよい。そのこずは、そ
れぞれゲンタマむシンをた぀たく含んでいない暙
準被隓甚血液および既知量のゲンタマむシンを含
んでいる暙準被隓甚血液によ぀お確認した。
【図面の簡単な説明】
第図は本発明の枬定方法に甚いられる詊隓装
眮の䞀実斜䟋の暪断面図、第図は培逊のたえに
第図に瀺す䜍眮に詊料デむスクを加えた接皮ず
みの栄逊アガヌ・プレヌトの平面図、第図およ
び第図は本発明の枬定方法によ぀お皮々の詊料
を枬定したずきのパツドにおけるデベロツプメン
トの状態図である。 図面の䞻芁笊号、アガヌ・プレヌト、
詊料デむスク、パ
ツド。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  (1) β−ラクタマヌれ生産菌たたはその菌胞
    子を栄逊培地に接皮し、 (2) 接皮された培地に詊料を加え、 (3) 前蚘菌たたは菌胞子によるβ−ラクタマヌれ
    の生産が促進される条件䞋に培逊し、぀いで (4) 生産されたβ−ラクタマヌれをデベロツプし
    お調べる こずを特城ずする前蚘詊料䞭のβ−ラクタム系抗
    生物質の枬定方法。  前蚘菌がバチルス・セレりスである特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘菌がバチルス・リチ゚ニフオルミスであ
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘デベロツプはβ−ラクタマヌれによ぀お
    劣化を受けやすいペニシリンたたはセフアロスポ
    リンを甚い、えられた分解産物を分析する特蚱請
    求の範囲第項、第項たたは第項蚘茉の枬定
    方法。  前蚘分解産物がペニシロ酞であり、その分析
    にペり化ポリサツカラむドを甚いる特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘分解産物が酞であり、その分析にPH指瀺
    薬を甚いる特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定方
    法。  詊料䞭のβ−ラクタム系抗生物質の濃床を、
    比范甚のβ−ラクタム系抗生物質の量を段階的に
    倉化せしめた䞀連の察照矀に基づくチダヌトにお
    けるデベロツプメントず比范するこずにより掚定
    する特蚱請求の範囲第項、第項、第項、第
    項、第項たたは第項蚘茉の枬定方法。  前蚘詊料を盎接栄逊培地に加える特蚱請求の
    範囲第項、第項、第項、第項、第項、
    第項たたは第項蚘茉の枬定方法。  前蚘詊料をサンプリングデむスクに採取し、
    該デむスクを栄逊培地に加える特蚱請求の範囲第
    項、第項、第項、第項、第項たたは第
    項蚘茉の枬定方法。  (1) β−ラクタマヌれ生産菌たたはその菌
    胞子の菌株を栄逊培地に接皮し、 (2) ぀の詊料から回サンプリングし、䞀方に
    β−ラクタム系抗生物質を加えた぀のサンプ
    ルを前蚘培地の぀の異なる堎所に加え、 (3) 前蚘菌たたは菌胞子によるβ−ラクタマヌれ
    の生産が促進される条件䞋に培逊し、 (4) ぀の異なる堎所におけるβ−ラクタマヌれ
    をデベロツプしお調べ、぀いで (5) ぀の異なる堎所におけるβ−ラクタマヌれ
    のデベロツプを比范する こずを特城ずする前蚘詊料䞭のβ−ラクタム系抗
    生物質ず非β−ラクタム系抗生物質抗菌剀の同時
    枬定方法。  前蚘菌がバチルス・セレりスである特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘菌がバチルス・リチ゚ニフオルミスで
    ある特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘デベロツプはβ−ラクタマヌれによ぀
    お劣化を受けやすいペニシリンたたはセフアロス
    ポリンを甚い、えられた分解産物を分析する特蚱
    請求の範囲第項、第項たたは第項蚘
    茉の枬定方法。  前蚘分解産物がペニシロ酞であり、その分
    析にペり化ポリサツカラむドを甚いる特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の枬定方法。  前蚘分解産物が酞であり、その分析にPH指
    瀺薬を甚いる特蚱請求の範囲第項蚘茉の枬定
    方法。  詊料䞭のβ−ラクタム系抗生物質の濃床
    を、比范甚のβ−ラクタム系抗生物質の量を段階
    的に倉化せしめた䞀連の察照矀に基づくチダヌト
    におけるデベロツプメントず比范するこずにより
    掚定する特蚱請求の範囲第項、第項、第
    項、第項、第項たたは第項蚘茉
    の枬定方法。  詊料䞭の公知の非β−ラクタム系抗生物質
    の抗菌剀の濃床を、既知量のβ−ラクタム系抗生
    物質で詊隓を行なうたえに前蚘詊料を远加し、前
    蚘既知量ず同量のβ−ラクタム系抗生物質ず量を
    段階的に倉化せしめた非β−ラクタム系抗生物質
    の抗菌剀ずの混合物からえられる結果に基づくチ
    ダヌトにおけるデベロツプメントず比范するこず
    により掚定する特蚱請求の範囲第項、第
    項、第項、第項、第項、第項、
    第項たたは第項蚘茉の枬定方法。  前蚘詊料をサンプリングデむスクに採取
    し、該デむスクを栄逊培地に加える特蚱請求の範
    囲第項、第項、第項、第項、第
    項たたは第項蚘茉の枬定方法。
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