JPH0117111B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は人間血液の白血球分離法で、詳細には
(i)赤血球集合剤即ち凝集剤と(ii)水に非常に良く溶
け比較的高密度且つ比較的低粘度低滲透性の溶液
を作る化合物の単一水溶液から成る分離媒体を使
用する、単核球、多形核白血球および赤血球の迅
速一段階密度分離法に関するものである。 発明者は、血液細胞群（および群内の種類）の
分離・精製に使用される多くの異なる技術および
方法を認識している。白血球を赤血球から分離す
るために使用される技術の中で最も一般的なも
のゝ一つに、血液サンプルを赤血球を凝集させる
溶液を単に混合し、それによつて赤血球の沈降速
度を高めるものがある。この分離液の濃度は、白
血球の沈降にはあまり影響がなく、そして赤血球
が沈降した時に分離液の上部から白血球を収集で
きるようなものにする。 より新しく開発された技術では、赤血球凝集剤
を実際には血液と混合せず、その代りに血液サン
プルを分離液媒体の上部の上に注意深く積層する
方法を利用し、その界面上で赤血球を凝集または
集合させ媒体の入つている試験管の底に沈降させ
る。赤血球を凝集させるものとしては数種の高分
子化合物が良く知られており、例えば
FICOLL400で（フアルマシアフアイン ケミカ
ルス社（スエーデン）の登録商標）このものは中
性で分枝の多い白糖の高分子量ポリマーで、そし
てこれらが一般に比較的高密度且つ比較的低粘度
のナトリウムメトリゾエイトまたはナトリウム
ジアトリゾエイトの様な溶液形にした化合物と混
合される。分離は、単位重力でまたは遠心分離に
よつて行なうことができる。白血球は大部分が界
面に残るが、従来のこの方法では白血球の種類即
ち単核球および多形核白血球を、少なくとも単一
密度の分離媒体を使用する一段階法では、分ける
ことができなかつた。この分離を行なうための１
つの既存の方法は、単核球をIsopaque−Ficoll
（登録商標）混合液（ナトリウム メトリゾエイ
トを主成分とするノルウエーのNyegaard社から
入手されるIsopaque溶液）を使用して第一段階
で遠心分離し、次に赤血球を沈降させるためにデ
キストランまたはゲラチンを使用して多形核白血
球を分離するものである。他の既存の方法では混
合白血球を得るため第一段階でデキストラン沈降
を行ない、次にIsopaque−Ficoll密度勾配媒体を
使用する第２段階の遠心分離で白血球の小グルー
プ即ち種類を分離している。この方法では、比較
的純粋な多形核白血球を得るために、汚染赤血球
を塩化アンモニウムで溶解させるもう１つの操作
段階が必要となる。また、２種類またはそれ以上
の密度の異なる分離溶液を互いの上に積層する、
不連続密度勾配の利用が知られている。これらの
密度は、望ましい範囲の（不連続）勾配が作り出
される様に選択される。 報告されているもう１つの開発された方法では
一段階法を利用しているが、これは全血サンプル
から単核法を分離する場合にだけ有効なものであ
つた。例えば、その上に血液サンプルを積層す
る、密度1.077ｇ／mlのHypaque−Ficoll混合物
から成る分離媒体の使用が知られている（ここに
Hypaque〔ハイパキユ〕とは登録商標である）。
この場合、血液を遠心分離すると、赤血球と多形
核白血球が底に沈降する一方、単核球が界面に層
を形成した。この分離した単核球のフラクシヨン
を、界面層をピペツトで吸取り別に回収した。遠
心分離法による血液細胞群の密度分離法の原理に
ついてはこの分野の技術者に既に良く知られてい
るところであり、それ故こゝで詳論する必要はな
い。 発明者等は、分離液媒体の比量および赤血球凝
集剤の濃度（重量（ｗ）／総容積（ｖ））の両者
を注意深く調節することにより、一段階でM.N.
（単核球）およびP.M.N.（多形核白血球）白血球
フラクシヨンならびにまた赤血球フラクシヨンが
分離できることを発見した。 それ故、不連続密度勾配のない単一分離水溶液
を利用して全血から単核球、多形核白血球および
赤血球を同時分離するための迅速一段階法を提出
することが、本発明の主な目的である。 従がつて、本発明により、全血の(i)単核球、(ii)
多形核白血球および(iii)赤血球の各フラクシヨンへ
の一段階密度分離法が提出され、この方法では全
血サンプルを遠沈管の水性分離媒体上に積層し、
その血液サンプルと分離媒体を遠心分離して全血
サンプルが前記の各フラクシヨンに分けられ、そ
の分離媒体は(a)高分子白糖またはブドウ糖ポリマ
ーである赤血球集合即ち凝集剤の水溶液および(b)
比較的高密度で比較的低粘度・低滲透性の水溶性
メトリゾエイトまたはジアトリゾエイト化合物の
水溶液の混合物で、(i)この(a)と(b)の混合溶液の密
度は室温で1.095ｇ／mlより大きくそして(ii)(a)の
濃度は５〜11％の範囲にある（混合液に対する
ｗ／ｖ％）。 本発明に従がうこの方法は、従来のものと比較
してかなりの長所を有している。第１に、この方
法は非常に簡単且つ迅速で、全操作を完了するの
に僅かに約30分程度の時間を要するだけであり、
且つ経験のない人が実施することができる。第２
に、比較的純粋なMNおよびPMN白血球が得ら
れる。第３に、両白血球が非常に高収量で得られ
ならびに、PMNフラクシヨンが赤血球で汚染さ
れることがなく、その結果塩化アンモニウム溶解
とそれに予測される好中球への有害効果が避けら
れる。最後に、細胞の免疫学的完全性が保存さ
れ、それ故処理がより簡単で分離がより迅速な結
果としてずつと健全な血液細胞群（および群内の
種類）を得ることができる。 本発明により、非常に予期せぬ結果が得られて
いる。即ち、血液細胞が一段階の操作で３種の別
のフラクシヨンに分離され、血液サンプル−分離
媒体界面に１つの帯が形成され、この最上帯のす
ぐ下に更に１つの帯ができ、加わえてより密度の
高い赤血球が沈澱を形成する。この最上帯には単
核球が含まれ、一方その下の帯に比較的重い
PMN白血球が含まれる。 本発明を更に解説・例示するために、我々は以
下に、それによつて本発明を実施することのでき
る方法を記述した実施例を幾つか挙げる。 これらの実施例では、分離液媒体を、
Hypaque85％溶液（28.33％ナトリウム３，５−
ジアセタミド−２，４，６−トリヨードベンゾエ
イトと56.67％ｎ−メチルグルカミン３，５−ジ
アセタミド−２，４，６−トリヨードベンゾエイ
ト（オーストラリアニユーサウス ウエールズ州
ウインスロツプ ラボラトリースより購入）の滅
菌水溶液）および10w／ｖ％濃度で蒸留水に溶解
したFicoll400（スエーデン パルマシア社）から
調製した。この分離媒体は20mlのHypaque85％
と90mlの10％Ficoll水溶液より成り、この混合液
の密度は室温で1.114ｇ／mlであつた。 遠心分離用には、15×105mm（直径×長さ）の
滅菌使い捨てプラスチツク試験管を使用した。各
試験管に、３mlの分離液を加えた。次に、この分
離液の上にピペツトを使用して静脈穿刺で得てヘ
パリン処理された５〜６mlの人間の全血を注意深
く積層した。この時血液カラムの高さは、3.5cm
になつた。次に、この試験管を（その中にこの管
を支持する）スイング・アウト式バキツトを持つ
在来型遠心分離器で、室温で200ｇで20〜30分間
遠沈した。遠心分離時間と速度は当然、この分野
の技術者の常識に従がつて変えてもよい。遠沈後
に、３種の明確な血液細胞層が観察された。境界
層は単核球、中層は多形核白血球および下層は試
験管の底に沈降した赤血球より成ることが、証明
された。この２つの白血球層を次に別にピペツト
で分離し、３回洗浄し、既知溶媒中に再懸濁させ
た。表１に、上の２つの層の各種白血球の相対的
数値を示す。これらの結果は、５人の異なる正常
被験者から得た（末稍）全血を使用した５回の実
験結果を、平均±標準偏差で表わしたものであ
る。

【表】 総白血球回収率は全ての実験で80％以上で、細
胞の生存率も98％を超えていた。この方法で精製
したリンパ球と好中球では、免疫学的機能が無傷
のまゝ残されていることがわかつた。 発明者が行なつたまた別の実験で、MNと
PMN白血球を満足に分離するには、分離溶液の
密度を1.095ｇ／ml以上にしなければならないこ
とがわかつた。Ficollをある一定濃度にして密度
を1080から1.120ｇ／mlに変えた分離溶液でテス
トを重ねた結果、分離溶液の密度が1.095ｇ／ml
を超えた場合にだけ細胞フラクシヨンの充分な分
離が生ずることが明らかに確かめられた。 MNフラクシヨン帯とPMNフラクシヨン帯間
の距離は、その試験管内の（分離混合液上の）血
液サンプルの高さにほぼ比例することがわかつ
た。即ち、全血の血液柱の高さが高くなければな
る程、各帯間の距離が大きくなつた。 試験はまた、試験管内の血液サンプルをある一
定の高さにすると、MNとPMN白血球帯間の距
離が、試験管の直径をどの様に変えてもほゞ一定
に留まることを示した。 また、Ficoll水溶液の濃度は７％またはそれ以
上（使用分離溶液に対するｗ／ｖ％）にしなけれ
ばならず、９％にすることが望ましいが、11％以
上にしてはならないことがわかつた。この分野の
技術者なら当然、溶液粘度が高くなると血液細胞
機能に影響が生じ、また分離過程に悪い効果を持
つ血液細胞の凝集を引き起こすことから、Ficoll
の濃度をあまり高くできないことを認識していよ
う。 Ficoll−Hypaque分離溶液の密度を1.114ｇ／
ml（室温）とFicollを９％（ｗ／ｖ）にした時
に、最も良い結果が得られた。 発明者が行なつたまた別の実験で、Ficoll溶液
の密度を適当に調節するのに使用される
Hypaque85％溶液が、ナトリウム メトリゾエ
イト、ナトリウム ジアトリゾエイト、メグルミ
ン（Ｎ−メチルグルカミン）メトリゾエイトまた
はメグルミン、ジアトリゾエイトおよびそれらの
混合物の様な他の支持媒体水溶液で交換し得るこ
とが、確認された。メグルミン ジアトリゾエイ
トたはメグルミン メトリゾエイトとナトリウム
メトソゾエイトまたはジアトリゾエイトの混合
溶液が（＋Ficoll溶液）、Ficoll水溶液＋混合され
ていないナトリウム メトリゾエイトまたはナト
リウム ジトリゾエイト溶液と比較して、境界が
より明確な白血球フラクシヨン帯を与えることが
わかつた。これらの支持媒体は全て水に良く溶
け、比較的高密度且つ比較的低粘度低滲透性の溶
液を作る。それ故、混合分離水溶液の最終的粘度
に不当な影響（即ち、粘度の上昇）を与えずに高
密度溶液を調製するために、Ficollと混合するの
に適している。 発明者が行なつた類似の実験で、分離液媒体の
赤血球凝集剤はデキストラン水溶液で良く（デキ
ストランは、分子量約370000までのグルコースの
高分子量ポリマーである）、これがなお血液細胞
をMNとPMNおよび赤血球フラクシヨンに分離
させる（しかしその効果は比較的弱い）ことがわ
かつた。しかし、その中で満足な結果が得られる
デキストラン（分子量264000、シグマ・ケミカル
社、アメリカ合衆国）の濃度範囲がFicoll400の
範囲と僅かに異なることがわかり、Hypaque混
合液でのFicollの７〜11％と比較して実際５〜10
％の間にあつた。デキストラン含有分離溶液の密
度は、Ficoll混合液の場合と同様、望ましい血液
細胞フラクシヨンを作るにはまた1.095ｇ／ml以
上でなければならない。 前記の各例を要約すると、発明者は、ある規定
限界内の密度と濃度を持つ単一分離混合水溶液を
使用して、迅速一段階法を作成するのに成功した
ことが理解される。この方法によつて、免疫学的
目的で白血球の種類の診断が、非常に迅速、簡便
且つ効果的に実施できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 全血サンプルを遠沈管中の水性分離媒体上に
   積層し、この血液サンプルと分離媒体を遠心分離
   し、全血サンプルを単核球、多形核白血球および
   赤血球フラクシヨンに分割し、 分離媒体は(a)高分子量白糖またはブドウ糖ポリ
   マーの赤血球集合または凝集剤の水溶液と(b)メグ
   ルミン ジアトリゾエイトまたはメグルミン メ
   トリゾエイトの水溶液とナトリウム メトリゾエ
   イトまたはナトリウム ジアトリゾエイトの水溶
   液の混合物とし、 (i)(a)と(b)の混合液の密度が室温で1.095ｇ／ml
   以上で、(ii)(a)の濃度が５〜11％の範囲にある（混
   合液に対するｗ／ｖ％）ことを特徴とする全血を
   (i)単核球、(ii)多形核白血球および(iii)赤血球フラク
   シヨンに迅速一段階法で行う血液密度分離方法。 ２ 特許請求の範囲第１項において、(a)が白糖ポ
   リマーで、この白糖ポリマーの濃度が７〜11％の
   範囲にある（溶液に対するｗ／ｖ％）ことを特徴
   とする血液密度分離方法。 ３ 特許請求の範囲第２項において、迅速一段階
   法で、この白糖ポリマーが分子量約400000の
   Ficoll（登録商標）であることを特徴とする血液
   密度分離方法。 ４ 特許請求の範囲第１項において、(a)がブドウ
   糖ポリマーで、その濃度が５〜９％（溶液に対す
   るｗ／ｖ％）の範囲にあることを特徴とする血液
   密度分離方法。 ５ 特許請求の範囲第４項において、そのブドウ
   糖ポリマーが分子量約264000のデキストラン（登
   録商標）であることを特徴とする血液密度分離方
   法。 ６ 特許請求の範囲第１項において、分離媒体が
   濃度が７〜11％（溶液に対するｗ／ｖ％）の
   Ficollとハイパキユ（Hypaque）85％の水溶液
   で、この水溶液の濃度が室温で1.095〜1.20ｇ／
   mlの範囲にあることを特徴とする血液密度分離方
   法。 ７ 特許請求の範囲第１項において、溶液密度が
   室温で1.114ｇ／mlであることを特徴とする血液
   密度分離方法。