JPH01171500A - ウイルス感染に対するマーカー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、動物の細胞抽出物におけるヒト免疫不全ウィ
ルス又は実質的に類似した臨床症状を惹起するその他の
ウィルスの存在を測定する方法及びそれらに関連する発
明に関する。

ＡＩＤＳの一般的な背景 エイズ（ＡＩＤＳ　：後天性免疫不全症候群）は、２０
世紀の主な公衆衛生上の脅威を代表する。その生物学的
多様性、個体から個体へと蔓延する微妙な方法、そして
その現実の存在の早期の検出さえも不可能とする１潜伏
（ｌａｔ＠ｎｔ）”期間のために、ＡＩＤＳは先例のな
い程の疫学的窮地に急速に追い込まれていつ九。事実、
診断の可能−を高めるためにすでに開発された考えうる
方策をもりてしても、個体群のすべての区域内でこの問
題をしりかりと制御するために必要な要件はいまだ溝穴
されていない〔例えば、Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔ１
ｔｕｔｅｓ　ｏｆＨ＠ａｌ　ｔｈ　（Ｂ＠ｔｈｓ　ｓｄ
ａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）において１９８５年７月３１日
に開催された、Ｃｅｎｔ＠ｒ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇｓａｎ
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、ＦＴ）Ａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓｏｆ　　Ｈｅａｌｔｈ、　　及
びＣｅｎｔ＠ｒ　　ｆｏｒ　　Ｄｉｓｓａｔｅ　　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌにより後援されたタイトル″ＨＴＬＶ−１１
１抗体試験における経験、最新のスクリーニング、実験
室と疫学の相関”の会報、そしてま九Ｂｕｄｌ為Ｈｓｋ
ｙ＠５−ｅＮａｔｕｒｅ、　３１６ｓ９６頁（１９８５
）参照〕。

ヒト免疫不全ウィルス（）ＩＩＶ）についての数種の異
なる名称が存在する：　ＬＡＶはノ々スツール研究所立
操魂衛生研究所（Ｂ＠ｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ
、Ｕ、Ｓ、Ａ）において分離された該ウィルスに対する
名称である。本明細書においては、しばしば−船釣な名
称、又は）ＩＴＬＭ−９１もしくはＬＡＹもしくはＨＩ
Ｖと称するが、これらの間を区別することを意図するも
のではない。なお、本明細書における″）ＩＩＶ’の語
は、いまだ分離されていようと分離されてなかろうと、
ＡＩＤＳの発生に関与し得るいかなるその他のウィルス
をも包含する。単数形のＨＩＶは、それらのダノムの内
容物にかかわらずＨＩＶタイプのいかなるものも包含す
る。同様に、ＡＩＤＳ症状は、ＨＩＶ　（上記に定義し
たところの）　、　ＡＢＣ又はＡＩＤＳ関連コンプレッ
クス、リンパ腺症症候群（ＬＡＳ）、そして実質的に類
似する臨床症状を引き起こす他のウィルスにより惹起さ
れる症状を包含することを一般ＶＣ意味する。

ＡＩＤＢはヒト免疫不全ウィル・ス（ＨＩＶ）の感染に
より発病し免疫系の進行性劣化を伴う。この病気の初期
に、主にヘル１４−Ｔ及びイン７″エーサー細胞からな
るＴ細胞のサブセットであるいわゆるＴ４抗原を発現す
るＴ（胸腺由来）＃ｆｆｌ胞の喪失を通して、細胞性免
疫が低下してくる。Ｔ４細胞の欠落は、ＮＫ（ナチュラ
ルキラー細胞）、ＬＡＫ（リンホカインにより活性化さ
れたキラー細胞）及び細胞溶解性Ｔ細胞の欠損を含む細
胞性免疫のいくらかの欠損をもたらしうる。また、ＡＩ
ＤＳにおいてはＢ細胞（骨髄由来）の欠損も存在する。

ＡＩＤＳは、１相から他の相への遷移速度が可変的であ
シうるが、進行性の病気のようである。これらの相は分
類がされている。ＨＩＶによって感染した無症状の個体
が存在する（血清陽性）、これはすなわち上記ウィルス
一対する循環する抗体の存在によりて判定された（Ｍ、
Ｇ、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒｅｎ等、８ｅｌｅｎｃｅ、　
２２４ｅ　５０６頁、　１９８４）。もし彼らが他のい
かなるマーカーも持たないなら、フォルターリード（Ｗ
ａｌｔｅｒ　Ｒ・・ｄ）分類によれば、彼らはＷＲＩ期
患者である（Ｒ，Ｒ，Ｒ＠ｄｆｌｓｌｄ等、ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ＠ｄｌｃｉｎｓ
、　３１４．１３１頁、１９８６）。また、これらの個
体のいくらかはＡＲＣの症状を全く発現しないにもかか
わらず、彼らはブレ（ｐｒｅ　）　Ａ　ＲＣ（ＡＲＣ＝
ＡＩＤＳ　Ｉ’ｌｌ連コンプレックス）と呼ばれてき念
。これらの患者のいく人かは、リンパ腺症に発展するだ
ろうしくＷＲ２，）そしてＴ４細胞の欠損を示す（ＷＲ
３）。次に、抗原刺激増殖及び抗原刺激性ｒ−インター
フェロン産生を行う九めの９７７４球の能力が低下し、
そしてさらに、これらのＷＲ４患者は遅延性皮膚過筋作
を失い始める。ＷＲ５患者はアネルギー性（ａｎ＠ｒｇ
ｉｅ）である。

彼らは、帯状庖疹（Ｈ＠ｒｐ＠ｓ　Ｚｏｓｔｅｒ）感染
、口腔粘膜カンシダ症（Ｓ０涜）、又は長期にわたる発
熱、寝汗、疲労、下痢及び／もしくは体重減少を伴うＡ
ＢＣ症状を呈する。またさらに、この段階のＡＢＣは一
般に進行性免疫崩壊により特徴づけられる。最後に、Ｗ
Ｒ６個体は、“本格的”なＡＩＤＳを構成する日和見感
染に冒され、１２ケ刀以内に患者の５０％は死に至る（
Ｈ，Ｗ、、Ｍｕｒｒａｙ等、Ｎ＠ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ＊ｄｌｅｌｎｅ、　３１０ｍ　
８８３頁、１９８４）。

〔発明の背景〕

天然の２’−５’Ａ抗ウイルス性防御経路のＨＩＶに向
けられたインヒビターが記載される。これらの知見は、
さまざまなウィルス疾病（例えば、ヘルイス、レトロウ
ィルス感染等）及び／又はその上に潜在的σ癌の症状に
ついての新診断法及び／又は治療様式に対して適切であ
る。

インターフェロン罠より誘導される２−５Ａ（２’−５
’−オリカアテニレートフシンテターゼ／ＲＮａｔＩＬ
系は、ウィルス感染に対する宿主防御機構の一部である
。上記系のいくつかの要素は、中ｄ　ｓ　ＲＮＡ依存性
２−５人シンテターゼ、（１１）内因性（＊ｎｄｏｇ＊
ｎｏｕｓ）　２−５　Ａ、及び（ｌｉＤ２−５Ａ依存性
エンドリゲヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＬ）ｌ包含する。

２−５人シンテターゼ／謄１ａｓ＠Ｌ経路のこれらの要
素のいずれかの脱落は、抗ウイルス効果の完全又は部分
的な消失をも友らすであろう。

いくらかのウィルス感染を有するヒト又はインターフェ
ロン治療を受けているヒトの血清及び末梢血単核細胞（
ＰＢＭＣ）中に高いレベルの２−５Ａシンテターゼが見
い出されている。それゆえに、ＰＢＭＣにおける２−５
Ａシンテターゼの誘導は、限定的ではあるが潜在的な診
断的価値を有しているようだ。その上、ｐＢＭＣ中の高
い２−５Ａシンテターゼレイルは、いくらかのウィルス
疾患の進行した病気の状態を示したが、対照的に、他の
ウィルス感染の効果的なインターフェロン治療の徴候で
もある。インターフェロンはＡＩＤ’Ｓ患者の血清中に
見い出されているが、それにもかかわらずＡＢＣからＡ
ＩＤＳに進行した個体について、２−５Ａシンテターゼ
の持続的な増加が観察された。これらの極端な実験室／
臨床の矛循は、もし上記２−５Ａシンテターゼ／　ＲＮ
ａｓｅ　Ｌ系の他の要素、例えば細胞間２−５人又はＲ
ＮａｓｅＬが機能しないことが見い出されれば説明でき
るであろう。この可能性を探究する次めには、本発明者
が本明細書で詳細に説明するように、生体内（ｌｎｖｌ
ｖｏ）で合成され九２−５Ａ及びＲＮａｓａＬ活性を特
徴づけることが要求されるであろう。

本発明の説明 ヒト免疫不全ウィルスで感染した細胞により放出される
か又は放出されるように原因付けられたインヒビター物
質が発見された。このインヒビターは、ＲＮａｓｅＬ酵
素に物理的に付着し、２’　−５’オリゴアゾニレ−）
　／　ＲＮａｓｅＬ経路の最終生産物は、全免疫系を機
能不全に至らしめ、そしてＨＩＶが非抑制的に増殖する
ことを許容していると思われる。

ＲＮａ−・Ｌの不存在又はＲＮａｓｅＬの不活性により
、あるいは２’　−５’Ａ　／　ＲＮａｓｅ　Ｌ経路中
の生化学的媒介物のインヒビター、すなわちＨＩＶ又は
実質的に類似する臨床状態を生じさせる関連ウィルスの
存在を検出するためのマーカーとして役立つインヒビタ
ー、の存在により、直接的又は瀾接的に、これらのイン
ヒビターを同定する技術が開示される。

患者における、特に、それらの末梢血中に又は血液、血
液画分、移植器官の細胞及び細胞抽出物を包含する組織
中にＨＩＶに対する抗体を有する患者における、十分に
発達し７ｔＡＩＤｇの進行に関するこのマーカーの前兆
的な重要性が検討される。

ＲＮａ−・Ｌの活性化法及び／又はＲＮａｔ＠Ｌインヒ
ビターを除去し又は不活化する方法が記載される。

ＡＩＤＳ及び関連のウィルスを処置するための治療法、
並びにＲＮａｓｅＬを活性化しそして／又はＲＮａｓｅ
Ｌインヒビターもしくはインヒビターに向けられ九ウィ
ルスを除去しもしくは不活性化することにより前記のよ
うなウィルスの発達をモニターする医療的方法は本発明
の一部である。ＲＮａｓｅＬの特異的インヒビター又は
２’　−５’Ａ／　ＲＮａｓｅ　Ｌ　４１路中の生化学
的媒介物のウィルスに向けられたインヒビターを抗原と
して用いて、生体内（ｉｎ　ｖｌマＯ）及び試験管内（
ｌｎｖｌｔｒｏ）双方でこれらのウィルスに対する抗体
を調製する方法は本発明に包含される。上１９２−５Ａ
シンテターゼ／　ＲＮａ　ｍ・Ｌ抗ウィルス経路の構成
要素は、リンノ譬腺症（ＬＡＳ）、ＡＩＤＳＩＤＳ関連
コンブレックスＣ）及び後天性免疫不全症症候群（ＡＩ
ＤＳ）を有するヒト由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
の抽出物中マ測定された。２−５Ａシンテターゼのレベ
ルは、ＡＩＤＳを有するヒトにおいて非常に上昇してお
り、そしてＡＢＣ又はＬＡＳを有する個体において基底
のレベルにあることが示された。しかし、２−５Ａシン
テターゼの多様性と無関係に、高い濃度の内因性２−５
Ａ（３５、Ｍ以下）がＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳ
を有するヒトで検出された。抽出され九２−５Ａは、結
合アッセイ、コアーセルロース（ｃｏｒｅ−ｅｓｌｌｕ
ｌｏｓｅ）アッセイ及びリボゾームのＲＮＡ分解アッセ
イにより測定したところ確かに機能的でありた。機能的
な内因性２−５Ａの濃度が増強したにもかかわらず、ｉ
、Ａｓ。

ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒトのいずれにおいてもい
かなる活性化ＲＮａ＊ｓＬを示すことができなかつ九〇
しかしながら、たとえ内因性２−５Ａの濃度が５ｎＭ以
下でありたとしても、ＲＮａｓｅＬは全ての健康な個体
のＰＢＭＣ中で活性化された。実験を組みあわせること
により、ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳ　’ｉ有する
ヒト５人中５人においてＲＮａｍ・インヒビターが存在
する証拠が提供され九。このインヒビターは転移され、
そしてＬ９２９細胞抽出物中のｒＲＮＡの２−５Ａで誘
導されたＲＮａｓ・Ｌ特異的分解を妨げることができる
。ＲＮａｓ・のこのようなインヒビターの１つはＴＣＡ
及びエタノールにより沈澱する。

ＲＮａｓｅＬ活性の抑制はＲＮａｍｅＡ又はプロテアー
ゼ処理によ勺消失された。本発明者の研究は、ＬＡＳ。

ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒトのＰＢＭＣ中で、内因
性ｄ　ａ　ＲＮＡは２−５Ａシンテターゼの活性を促進
し、そしてそれは内因性２−５人の濃度を増強する結果
をもたらすことを示唆する。ＲＮａｔｅを活性化する機
能的２−５Ａの能力は、ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤ
Ｓを有するヒトのＰＢＭＣ中のＲＮａｓｓ　Ｌ１２）Ｈ
ＩＶにより誘導されるインヒビターにより抑制される。

ここに本発明者は、特異的且つ高感度のアッセイを用い
ることによるＰＢＭＣ抽出物中の２−５人の１度及びＲ
ＮａｓｅＬの機能の測定に注目し、そしてＬＡＳ　、　
ＡＲＣ及びＡＩＤＳを有するヒトからのＰＢＭＣ中の２
−５Ａシンテターゼ／　ＲＮａ　＠＠抗ウィルス系の欠
損が、ＲＮａｓｅＬインヒビターの存在に基づくもので
あって非機能的２−５Ａの合成に基づくものではないこ
とを証明する。ここに提示したデータは、ウィルス感染
細砲中で生じている外見上では逆説的な相互作用が今や
合理的に、理路整然と生化学的な術語で説明し得ること
を強調する。

図面の簡単な説明 アクリル系のビーズに結合したＲＮａｓｅ　Ａ　（１■
）又はカルボキシメチルセルロースに結合したプロテア
ーゼ（１ｒｆ１９）、　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社）を、ＮＰ４０細胞溶解緩衝液（１６）（１０μｌ
）に３０℃で２時間浸した。次に最終容量が１５μｌに
なるようにＰＢＭＣ抽出物（１００μ９／アツセイ）を
混合し、さらに３０℃で２時間インキエペートした。

二度目のインキエペーシ１ンの間中、試験管をゆりく夛
と指で数回攪拌した。対照サンダルは、いずれの酵素も
加えないでインキユベートした。固定化サレタ酵素を遠
心（１０，０ＯＯＸ、９．５分、室温）により沈澱させ
た。５μｌの上澄分画をＬ９２９細胞抽出物（１５０μ
Ｉ、タンパク／アッセイ）に加え、そしてｒ　ＲＮＡ分
解アッセイを使用してＲＮａｓ・し特異活性を測定した
。

さらにＰＢＭＣ抽出物から単離された内因性２−５人は
、ｒＲＮＡ分解アッセイによル特徴づけた。　ＰＢＭＣ
から単離した２−５人についてのＲＮａｍｅＬにより生
成される開裂ツヤターンは、真正の２−５人を用いて得
られたノ９ターンよｆｉ　Ｌ９２９４ｆｆｌ胞抽出物中
では著しく相違した（第１図、レーン３，５．７及び９
をレーン１０と比較）。例えば、ＰＲＭＯから単離され
次内因性２−５ＡはＬ９２９細胞からのＲＮａｓｅＬを
活性化して２８８及び１８８ｒＲＮムを開裂せしめ、３
個の特徴的な開裂生成物を形成せしめる（第１図、レー
ン１０）。観察された開裂ノ！ターンの相違に対する説
明は、ＰＢＭＣで産生じた内因性２−５人は真正２−５
Ａから異るということであろう。

２−５人に対する現在知られている標的酵素であるフリ
ーのＲＮａａｅＬ（２−５Ａで活性化されていない）の
レベルを概算するために放射線結合アッセイが用いられ
た。本発明番の発見と同等な追加の標的酵素を用いるこ
ともできる。ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有する
ヒトのＰＢＭＣ抽出物は、正常者のそれよシも５−７倍
低いレベルのフリーのＲＮａｓｅＬを有する（第１表、
第４カラム）。しかしながら、ＲＮａａｅＬへの結合に
ついてＰμ４（”ｐ）、ＣＰと内因性２−５Ａとが競合
するようなサンプルにおいては、上記放射線結合アッセ
イの適用には限界がある。従りて、放射線結合アッセイ
で得られた結果はＲＮａ　ｓ・Ｌのレベルを正確に反映
するものでない。それゆえに、２−５人で活性化された
ＲＮａａｅＬのレベルの決定は必須であった。この目的
を達成するために、本発明者は、末梢血の１ゴはどの少
量から単離されたＰ　ＢＭＣの抽出物中の活性化ＲＮａ
ｓｅＬの測定を許容する下記に記載する新規かつ高感度
な技術を用い九。なお、この技術はｒＲＮムに対する２
−５Ａ活性化ＲＮａａ＠Ｌの開裂の特異性に基礎を置い
九。

Ｐ　８ＭＣ中のｒ　ＲＮＡは検出限界より低いから、１
囚人原としてＨＬ９２９細胞（Ｌ９２９細胞系のＲＮａ
ａ＠Ｌ欠損サックローン）を代用した。）ＩＬ９２９細
胞は、ツタペスト条約の規定の下に、ア′メリカンタイ
デカルチャーコレクシ璽ン（Ｔｈ＠Ａｍ＠ｒｌｃａｎＴ
ｙｐ＠Ｃｕ１ｔｕｒ＠Ｃｏ１１＠ｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｒ
ｏｅｋｖｉｌｌ＠。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　、　ＵＳＡ）に受託番号第　　　　
号で寄託された。このアッセイを使用して、本発明者は
、機能的２−５Ａの高い細胞内蓄積を示すところの、Ｌ
ＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒト由来のＰＢ
ＭＣ抽出物中ではＲＮａｓｅＬが活性をもたないことを
証明することができる（第２図、２−６レーン）。実験
され九すべての健康な個体由来のｐＢＭｃ抽出物は、九
とえ２−５Ａが（５ｎＭで存在したとしても、特徴的開
裂生成物を生じるＲＮａｓｅＬ活性の存在を示した（第
２図、７レーン）。

ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳが感染した患者由来の
ｐＢＭＣ抽出物中に生物学的に活性な２−５人が存在し
たとの本発明者の観察は、何故ＲＮａｓｅＬが不活性で
あったかについて疑問を生じさせ念。上記ＲＮａａ＠Ｌ
活性の不存在が（第２図、２−６レーンで明らかにされ
たごとく〕、非機能的なＲＮａａｅＬのせいであるか、
又はＲＮａ＠＠Ｌ活性のインヒビターのせいであるかを
決定するために、混合実験を以下のように行りた。機能
的なＲＮａａｅＬを含有するＬ９２９細胞抽出物を、Ｌ
ＡＳ　、ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒト由来のＰＢＭ
Ｃ抽出物・と混ぜ、そして同時インキエペー）　（ｃｏ
−１ｎｃｕｂａｔｅ）　ｌ、た、ＲＮａｓｅＬ−特徴的
開裂生成物のいかなる形成物も検出されなかった（第１
図、３，５及び７レーン）。

ＲＮａｓｓＬの活性化の原因である内因性２−５人（第
１図、３，５及び７レーン）が、これらのサンプルが調
製された細胞抽出物（第１図、２，４及び６レーン）に
比較し少なくとも°４倍希釈を代表することを強調する
ことが重要である。これらのデータは、ＬＡＳ　、ＡＢ
Ｃ及びＡＩＤＳを有するヒトのＰＢＭＣ中にＴＣＡ−不
溶ＲＮａｓ＊Ｌインヒビターの存在を示す。かかるイン
ヒビターは健康人には見い出されなかりた。なぜなら、
健康人のＰＢＭＣ抽出物は、Ｌ９２９細胞抽出物との同
時インキエベーシ１ンに続きＲＮａａｅＬ−特徴的開裂
生成物が生じたからである（第１図、８レーン）。同様
に、また健唐人に由来するＰＢＭＣのＴＣＡ−可溶分画
も特徴的開裂生成物を生じる（第１図、９レーン）。機
能的２−５Ａの存在、及び推測されるＲＮａ−・Ｌイン
ヒビターがＴＣＡ及びエタノール沈澱性であるという事
実は、上記ＲＮａａ＠ＬのインヒビターはＨ８Ｖ−１及
びレトロウィルス感染細胞の培養物中で最近同定され九
ように２−５Ａ類似体ではない仁とを示唆する。

固相上に不溶化した分解酵素を用いる本発明者の実験は
、ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒト由来の
ＰＢＭＣ抽出物中に見い出されるＲＮａｓｅＬのイン・
ヒビターの性質について重要な新しい洞察を提供した。

固定化グロテアーゼ又はＲＮａｓ・と共にＡＩＤＳを有
するヒト由来のＰＢＭＣ抽出物をブレインキ為ベー）　
（ｙｒｅｌｎｃｕｂａｔｓ）　Ｌ、そして引き続きＬ９
２９細胞抽出物とコ・インキユベートした場合は、特徴
的な生成物の出現物により明らかＫしたようＫ（第３図
、１及２レーンと３レーンとの比較）、ＲＮａｓｅＬ活
性は回復した。

ＬＡＳ　、　ＡＲＣ及ヒＡＸＤＳを有するヒト由来ＯＰ
ＢＭＣにおける２−５Ａシンテターゼ／ＲＮａｓ・Ｌ抗
ウィルス系の欠損は、　ＲＮａｓｅＬのインヒビターに
帰することができるが、しかし機能的２−５Ａの欠失に
帰することにできないことを、本発明者の研究は証明し
ている。ＲＮａｓｅＬ（ンヒビターは、ＬＡＳ　。

ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒトから単離されたＰＢＭ
Ｃ抽出物中に存在し、そしてこのことは該インヒビター
が典聾的なレトロウィルス性疾病の進行の全ての段階に
おいて存在でき、そしてまた種々の他の亜急性／慢性、
ウィルス性／病原体感染にも関連することを示している
、ここで実験されたＬＡＳ　。

ＡＲＣ及びＡＩＤＳを有するヒト由来の全てのＰ　ＢＭ
ＣがＨＩＶ　ＲＮＡ　（分子ハイデリダイゼーシッンに
より検出されるような）及びＨＩｖ感染センター（ｌｎ
ｆ＠ｅｔｉｏｎｍ　ｃｅｎｔｅｒｓ）を有するという本
発明者の今までの報告を考慮すればＲＮａ−・Ｌインヒ
ビターがウィルスにより誘導される可能性が高い。

ここに説明し九発見が示唆するところＫよれば、ウィル
スの複製が２−５人シンテターゼ／　ＲＮａｓｅＬ系を
変化せしめ、自然の抗ウイルス状態が十分に発揮されず
そして／又は維持されなくなる。ＨＩＶ及び／又は他の
共存するレトロウィルスによりコードされ九タンノタク
又はＲＮＡはＲＮａｓｅＬの活性を抑制できるようであ
る。

〔実施例〕

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はファイコールーヒノ臂キ
ｚ　（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）上で単離された
；Ｌ９２９及びＨＬ９２９（Ｌ９２９のＲＮａｍ・Ｌ失
損サブクローン）細胞は単層培地中に保存された；そし
てＬ９２９及びＬＨ９２９由来の細抱質抽出物はグリセ
ロール緩衝液中で調製されそしてＰＭＢＣ抽出物はＮＰ
４０ＩＩＡ砲溶解緩衝液中で調製された（全て公知の手
法に従う）。上記抽出物のタンａ４り濃度は１−１５μ
Ｉ／μノの範囲とした。

２−５人シンテターゼの活性はポリ（ｒＩ）−ポリ（ｒ
Ｃ）−アガロースを用いて単離されたＰＢＭＣ抽出物（
５０μｍタンパク／アッセイ）中で検出した。

２−５Ａは、フレオン／トリー！−オクチルアミン中和
後ＰＢＭＣ抽出物のＴＣＡ−可溶性分画から単離した。

ＴＣＡにより抽出された２−５人は、その後凍結乾燥さ
れそして水に再溶解して５μＩタンノＪ？り／μＩと同
等となるよう全てのサンダルは水のある量で標準化した
。ＰＢＭＣ抽出物中に存在する２−５人の濃度は、ＲＮ
ａｓｅＬの龜料としてＬ９２９細胞抽出物を用いる放射
線結合アッセイで測定された。

１８．９００ｄｐｍ　Ｏｐ５Ａ４（”Ｆ’）ｐＣｐ　（
死活ｆｉ　３０００Ｃ１／ｍｍｏｌ、Ａｍ＊ｒｓｈａｍ
）がアッセイ当シ添加され、２−５Ａの添加をしないと
きはＲＮａｓｅＬに９，４００ｄｐｍが結合された。５
μ！の単離した２−５Ａサンプルが添加されたアッセイ
において約９−１４％のｐ５Ａ４（５２ｐｌｐｃｐが置
換された。Ｐ、８ＭＣ中の２−５Ａ濃度は、真正な２−
５人を用いる測定曲線との比較により決定され、そして
２５μｇ／μｌの細胞質タンノ譬り濃度が計算の基礎と
された。また、ＰＢＭＣから単離された２−５Ａの濃度
は、謄ムｓｅＬの原料としてＬ９２９細胞抽出物を用い
るコアー−セルロース（ｃｏｒｅ−ｃ＠１ｌｕｌｏｓ・
）アッセイで測定された。

このアッセイにおける２−５ＡによるＲＮＩＬＩＩ＠の
活性化は、ポ９　（Ｕ）（”ｐ〕ｐｃｐの酸性可溶化断
片への転換が基礎とされた。全ポ１７　（ＵＸ５２Ｐ）
ｐＣｐ（１５，ＯＯＯｄｐｍ）の約５−２０％が上記単
離２−５人サンプル２．５μ！の存在中で開裂された。

濃度は上述のような真正な２−５Ａの有する測定曲線か
ら決定された。無変化ＲＮａａ＠Ｌレベルは、ＰＢＭＣ
：抽出物（５０μＩタンノ臂り／アッセイ）Ｋ２Ｏ，０
００’ｄｐｍのｐ、Ａ４（”Ｐ］ｐＣｐを添加した後に
放射線パインディングアッセイで測定された。得られた
結果は次のとおりであつ７’ｊ： 以下余白 ＬＡＳ　、　ＡＢＣ及びＡＩＤＳを有するヒトから得ら
れたＰＢＭＣの抽出物中のインターフェロンにより誘導
される酵素、すなわち２−５人シンテターゼを試験管内
（ｉｎ　ｕｌｕ）で測定しそして表１に示したような健
康人由来の抽出物中のものと比較したＡＩＤＳ　（＋　
３及び＋５）を有するヒトＫｊ？ける２−５Ａシンテタ
ーゼレベルは正常者で観察されたもの（表１．カラム１
）よりも１６及び２０倍高かりた。とれに対して、　Ｉ
、Ａｓ　（＋１）、ＡＢＣ（＋２）及び力ｆジ（Ｋａｐ
ｏｓｉ　’ｓ　）自腹を併うＡＩＤＳを有する患者にお
ける２−５Ａシンテターゼレベルは。

１．３−５倍高められているＫすぎず、他のものＫより
行われた基線観察の結果を支持した。

２−５人シンテターゼのこの試験管内測定が生体内の機
能的酵素を示すものであるかを決定するために、２−５
Ａを上記ＰＢＭＣから抽出された。

ＰＢＭＣ抽出物のＴＣＡ−可溶性分画由来の２　＝５’
Ａの生物学的活性は、放射線結合アッセイ及びコアー・
セルロースアッセイにより広範囲にわたって特徴づけら
れた。２−５人の濃度は上記２つのアッセイ手法により
決定された場合（表１．カラム２及び３）同程度であり
た。方法Ａ及び方法Ｂ（表１゜カラム２及び３）Ｋより
て得られた結果の間の一致は、と）　ＰＢＭＣ抽出物か
ら単離された２−５人が真正の２−５Ａと同じ程度でＬ
９２９細胞由来のＲＮａｓｓ　Ｌに対して結合できそし
て該ＲＮａｓｅＬを活性化できることを明らかＫしてい
る。

ＬＡＳ　、ＡＢＣ及びＡＩＤＳにおける２−５Ａシンテ
ターゼレベルと内因性２−５Ａのレベルとの間の量的な
相関性の見かけ上の不在（表１．カラム２及び３とカラ
ム１を比較）は、今や初めて次のように説明し得る。試
験管内アッセイにおける２−５Ａシンテターゼの決定は
、Ｉす（ｒＩ　）−ポリ（ｒＣ）−アｄａ−スによる部
分的な精製に基礎づけられている；従りて、このアッセ
イではフリー２−５Ａシンテターゼのみが測定されそし
てｄｓＲＮＡＫより生体内で活性化された２−５Ａシン
テターゼは測定されない。しかし、内因性２−５Ａシン
テターゼの直接測定に上記２−５人変性酵素を加えた（
即チ、２’−ホスホジェステラーゼ及びホスファターゼ
）。それゆえに、ＬＡＳ、ＡＲＣ及びＡＩＤ８を有する
ヒトのＰＢＭＣ中の２−５Ａの蓄積は２−５Ａ変性酵素
の低い活性を示す。またさらに、ＰＢＭＣ中の２−５人
の存在は、正常な被検者においてもＡＩＤＳ患者に訃い
ても従来観察されなかりた内因性ｄｓＲＮＡが存在する
ことを示している。

ミスマツチ二重鎖（ｍｉｓｍａｔｅｈ＠ｄ　　ｄｏｕｂ
ｌｅ　−５ｔｒａｎｄ＠ｄ　）　ＲＮＡは高分子ＲＮＡ
の公知の欽晶であり（米国特許第４，０２４，２２２号
及び同第４．１３０，６４．１号）、そしてその中で二
重鎖らせんの不安定性が塩基の対合を妨げる。ミスマツ
チｄ　ｓ　ＲＮＡは、本来インターフェロンの誘導に関
連性のない機構を示すところの、そのインターフエ四ン
誘導特性について周知である上列えは、ヨーロッパ特許
出願（Ｅ、Ｐ、Ａ、）第８３３０５４２’６．５号（１
９８３年８１１５日出願１発明の名称：腫瘍細胞上のｄ
　ｓ　ＲＮＡ　ｓの抗増殖作用″）。

ミスマツチ二重鎖ＲＮＡの典型的な治療の態様は。

−プリがイノシン酸及び−プリーシチジル酸／ウリジル
酸の複合により調製された合成ｄＩＲＮ人１例えばｒＩ
ｎ−ｒ　（Ｃｘ勺又はＧ）ｎ（但し、Ｘは４−２９の値
を有する）、より具体的にはｒＩｎ−ｒ　（Ｃｌ２Ｕ）
ｎ〔本明細書ではＡＭＰＬＩＧＬＷ＠　（ＨＥＭ　Ｒ＠
　５ｅａｒｃｈ　。

Ｉｎｃ、、Ｒｏｅｋｖ１１１ｅ＋ＭａｒｙｌａｎｄｅＵ
８Ａの米国登録商標）〕テある。アンプリｙ　ｙ　（Ａ
ＭＰＬＩＧ）ｉＷ　）と同様に作用する多くのミスマツ
チｄｓＲＮＡポリマーが研究されてきた。他の形態の天
然及び／又は合成ｄｓＲＮＡに対するミスマツチｄ　ｓ
　ＲＮＡの医療的な主たる利点は、動物及びヒトにおけ
るそれらの低い毒性である。例えば、　Ｌａｍｐｓｏｎ
等は種々のインターフェロン関連効果を誘因し得るｄ　
ｓ　ＲＮＡの初期の複合体を開示した（米国特許第３，
６６６，６４６号）。

しかし、かかる化合物の毒性は、癌又は関連の疾病の治
療におけるすべての臨床的な使用を排除した。

ミスマツチｄ　ｓ　ＲＮＡ　１例えばアンブリダンは、
−定のヒト腫瘍、特に腎臓癌に対し治療効果を有するこ
とが今や知られている。最近は完全に１インタ一フエロ
ン誘発剤”のように考見られているが本件の発明者がそ
の発明者であるところのＥ、Ｐ、Ａ８３３０５４２６．
５に十分に記載されたように。

ｄ　ｓ　ＲＮＡ５はインターフェロンそのものに完全に
耐性があるある種のヒト腫瘍について活性を有する。

他の特許出＄（Ｅ、Ｐ、Ａ、８６３０６５８２．７゜出
願日：１９８６年８月２６日１名称「二重鎖ＲＮＡ　ｓ
　Ｋよるウィルス関連事象の調整Ｊ）において。

本発明者は原型ｄｓＲＮＡとしてアンブリダンを使用し
てｄ　ｓ　ＲＮＡ　ｍによるヒト細胞培養中のＡＩＤＳ
ウィルスの抑制を記載している。“マツチ（ｍａｔｃｈ
・ｄ）ｄ　ｓ　ＲＮＡ　”は相対鎖間の水素結合（塩基
の積重ね）がほぼ完全である。即ち、中断が２９個の連
続す、る塩基残基毎に１個未満の塩基対であることを意
味する。従うて、゛オスマツチｄｓＲＮＡ’の語は理解
されるだろう。

上記ｄ　ｓ　ＲＮＡは、ウラシル塩基又はグアノシン塩
基を例えば塩基として、１：５−１：３００割合で含有
するポリイノシネート及びポリシチジレートの複合体で
あり得る（　ｐｏｌｙ　１．　ｐｏｌｙ（Ｃ４−２９Ｘ
）Ｕ又はＧ））。

核ｄ　ｍ　ＲＮＡの一般式は。

ｒＩｎ・（Ｃｌ２Ｕ　）ｎ でありてもよい。ｄ　ｓ　ＲＮＡの他に適当な例は以下
に説明する。

本発明の用途に好ましいミスマツチｄ　ｓ　ＲＮＡは。

一般式：　ｐ　ｏ　１　ｙ　（Ｃｎ　＊　Ｕ　）及びｐ
ｏｌｙ　（Ｃｎ５Ｇ　）　（式中、ｎは４−２９の整数
値を表わす。）で示されるものから選ばれた共重合ヌク
レオチドに基づくものであり、そして？プリざシチジレ
ート（ｒＣｎ）鎖に沿って不対塩基（ｕｎｐ鳳１ｒ＠ｄ
　ｂａｓ・）（ウラシル又はグアニン）を導入するため
のｒｌ−ｒｃｎを改変することにより調製されたポリリ
？イノシン酸及びポリリ♂シチジル酸の複合体のミスマ
ツチ類以体（ｍｌｓｍａｔ＠ｄ　ａｎａｌｏｇｓ　）で
ある。他方、核ｄｓ＋ＲＮＡはポリリゲイノシン酸（ｒ
Ｉｎ）のりデシル骨格を改変する１例えば２／−Ｏ−メ
チルリメシル残基を含ませる。ことによりｔ＋ｏｌｙ（
Ｉ）ｐｏｌｙ（Ｃ）ｄ　ｓ　ＲＮＡから誘導されてもよ
い、これらｒＩｎ−ｒＣｎのミス了ツチ類以体は、Ｃａ
ｒｔ＠ｒ及びＴｓ’ｏの米国特許第４，１３０．６４１
号及び４，０２４，２２２号に記載されている一般式ｒ
ｌｎ−ｒ（Ｃ１２ｅＵ）ｎで示されるものが好ましく、
そしてこの記載を引用することによって本明細書の内容
に含める。本明細書に一般的に記載されたｄｓＲＮＡ’
ｓＦｉ本発明の用途に適している。

本発明中で使用するためのミスマツチｄ　ｓ　ＲＮＡの
具体例は： ｐｏｌｙ　（Ｉ）、ｐｏｌｙ　（Ｃ４／Ｕ）ｐｏｌｙ　
（ｒ）・ｐｏｌｙ　（ｃ　７ｔ　Ｕ）ｐｏｌｙ　（Ｉ　
）　、　ｐｏｌｙ　（Ｃ１ｓ／υ）ｐｏｌｙ　（Ｉ）　
−ｐｏｌｙ　（Ｃ２２／Ｕ）ｐｏｌｙ　（Ｉ）−ｐｏｌ
ｙ　（０２０７Ｇ）ｐｏｌｙ　（Ｉ）　−ｐｏｌｙ　（
Ｃ２９’　Ｇ）及びｐｏｌｙ　（ｚ　）　−ｐｏｔｙ　
（ｃ、　）　２３　ｃ＞ｐを包含する。また１本発明に
より期待される医薬組成物は、適当な医薬賦形剤中で非
経口的投与のために適合させた組成物を包含する。すな
わち。

例えば、非経口溶液、非経口懸濁液及び非経口分散液が
、溶媒／希釈剤として無菌の又は発熱物質を除去した水
、ｔたさらに任意に生理学的に許容できる塩を用いて、
公知の医薬製剤技術に従い調製され得る。

遠位の箇所において投与直後の循環血液系の体液当たり
の該ｄ　ｓ　ＲＮＡが０，０１μｍ１７Ｉｌｌの血中濃
度ピークを達成するために十分で弗るのが好ましい。

他方、有効量は患者に注入する直前に血液生成物に添加
されてもよい。かかる場合において、施術者は、ｄｓＲ
ＮＡの必要量との平衡のために用いられる体液容量と患
者の体液容量との合計である彼又は彼女の体液容量と、
受容者の体重とを関連ずける体液容量標準表を単に引用
すればよい、６０−７０に９の患者は約５−６リツトル
の体液を持りているだろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、リゲンームＲＮＡ分解アッセイにより測定Ｌ
　７’ｊ　Ｉ、Ａｓ　、　ＡＲＣ又はＡＩＤＳを有すル
ヒトノＰＢＭｃ抽出物から抽出された２−５ＡによるＲ
ＮａｓｅＬの活性化を示す／　＋１アクリルアミドｒル
鷹気泳動プレートの写真である。 第２図は、リデソームＲＮＡ分解アッセイにより測定さ
れたところのＰＢＭＣ抽出物におけ銘Ｎａｓ＊　Ｌレベ
ルの活性化を示すダル電気泳動プレートの写真である。 第３図は、ＰＢＭＣにおけるリゲソームＲＮＡ分解活性
の回復を示したダル電気泳動プレートの写真である。 そして、第４図は、２’　−５’オリゴアデニレート／
ＲＮａｓｅＬ経路を図示したフローチャートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、動物中の細胞抽出物中のＲＮａｓｅ　Ｌインヒビタ
   ー、ＨＩＶの存在を示すマーカー又はＨＩＶにより指令
   される遺伝情報の存在を決定することを含んでなる、ヒ
   ト免疫不全ウィルス又は実質的に同様な臨床症状を惹起
   するウィルスの存在を測定するための方法。 ２、ヒトの生物学的な流体又は細胞中のＲＮａｓｅ　Ｌ
   インヒビターの存在を検出することを含んでなる請求項
   １記載のヒトの生物学的な流体又は細胞中の潜在性ヒト
   免疫不全ウィルスの存在を測定するための方法。 ３、生物学的な流体が血液又は血液分画である請求項２
   記載の方法。 ４、動物の組織の抽出物を試験し、そしてＨＩＶウィル
   スの投影された存在をポジティブに示す存在である請求
   項１のＲＮａｓｅ　Ｌインヒビターの少なくとも１つの
   存在又は不存在を決定することを含んでなる、動物中の
   ＨＩＶの投影された頻度を決定するための診断試験法。 ５、ＨＩＶ又は同様な生化学的及び／又は臨床症状を惹
   起するウィルスからの回復の進行をモニターする方法で
   あって、 （１）患者の細胞の抽出物中のＲＮａｓｅ　Ｌインヒビ
   ターの少なくとも１つが存在するか又は存在しないかを
   決定し、もしＲＮａｓｅ　Ｌインヒビターが検出されな
   いなら、 （２）ＨＩＶにより誘導された状態又は同様な生化学的
   及び／又は臨床症状を惹起する他のかかるウィルスのＲ
   Ｎａｓｅ　Ｌインヒビターの量を減少するために十分な
   ｄｓＲＮＡの量を投与し、そして （３）患者の臨床的症状が安定化又は改善されるまでｄ
   ｓＲＮＡの投与を継続する、段階を含んでなる方法。 ６、上記ｄｓＲＮＡがミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅ
   ｄ）ｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項１又は５
   記載の方法。 ７、上記ｄｓＲＮＡがウラシル塩対グアニジシン塩を１
   ：５−１：３０含有するポリイノシネート及びポリシチ
   ジレートの複合体である請求項６記載の方法。 ８、上記ｄｓＲＮＡが一般式： ｒＩ■・（Ｃ＿１＿２Ｕ）ｎ で示されることを特徴とする請求項７記載の方法。 ９、抗原のようなＲＮａｓｅ　ＬのＨＩＶ特異的インヒ
   ビター又は２′−５′Ａ／ＲＮａｓｅ　Ｌ経路における
   生化学的媒介物のウィルスに向けられたインヒビターを
   動物に投与することを含んでなるＨＩＶに対する免疫を
   付与する方法。 １０、ＲＮａｓｅ　ＬのＨＩＶ特異的インヒビターを除
   去する物質の有効量又は２′−５′Ａ／ＲＮａｓｅ　Ｌ
   経路における生化学的媒介物のウィルスに向けられたイ
   ンヒビターの有効量をＨＩＶ感染動物に対して投与し、
   そして該インヒビターが実質的に変化するまで上記投与
   を続けることを含むＨＩＶを処理する方法。