JPH0117410B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0117410B2 JPH0117410B2 JP55141130A JP14113080A JPH0117410B2 JP H0117410 B2 JPH0117410 B2 JP H0117410B2 JP 55141130 A JP55141130 A JP 55141130A JP 14113080 A JP14113080 A JP 14113080A JP H0117410 B2 JPH0117410 B2 JP H0117410B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- adsorbent
- chromatography
- present
- hydrophobic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は吸着剤およびそれを用いた酵素の精製
法に関するものであり、更に詳しくは疎水基を持
つ吸着剤およびそれを用いた疎水性クロマトグラ
フイによる酵素の精製法にある。 （従来の技術） 本発明にいう疎水性クロマトグラフイとは、ク
ロマトグラフイ吸着剤中に含まれる疎水基と、蛋
白質分子表面上の疎水基との間に生じる疎水結合
を吸着力として利用するクロマトグラフイの原理
に基づくものであつて、最近研究レベルで検討さ
れるようになつてきたが、未だ実用例は比較的少
ない。疎水基を有するクロマトグラフイ吸着剤お
よびそれを用いる酵素の精製法は、従来のイオン
交換クロマトグラフイなどの精製法と原理的に異
なるため、従来の精製法による精製が効果的でな
い場合の精製に特に有効である。また高い塩濃度
の存在下でも酸素が吸着されるので、予備処理と
しての脱塩処理が不要であるなどの長所をもつて
いる。 （発明が解決しようとする問題点） 従来報告されている方法、例えば直鎖脂肪族炭
化水素を含有するクロマトグラフイ担体を用いる
疎水性クロマトグラフイによる酵素の精製法には
次の問題点がある。 この疎水性クロマトグラフイは吸着が強すぎ
て、吸着された酵素を溶出するためには、高濃度
の有機溶媒溶液を必要とするため、酵素の失活を
引き起したり、それでもなお溶出が不充分でカラ
ム内に吸着したまゝ残留するなどの欠点がある。
他にもステロイドホルモンを固定化したクロマト
グラフイ担体を利用して、アフイニテイクロマト
グラフイを試みた２、３の例もあるが、クロマト
グラフイ担体の原料となるホルモンは極めて高価
であり、大規模な利用には不適当であると云う問
題点がある。 本発明者らは、上記従来の欠点に鑑み鋭意研究
の結果、新規なクロマトグラフイ吸着剤およびそ
れを用いた酵素の精製法を発明した。 即ち、本発明は
法に関するものであり、更に詳しくは疎水基を持
つ吸着剤およびそれを用いた疎水性クロマトグラ
フイによる酵素の精製法にある。 （従来の技術） 本発明にいう疎水性クロマトグラフイとは、ク
ロマトグラフイ吸着剤中に含まれる疎水基と、蛋
白質分子表面上の疎水基との間に生じる疎水結合
を吸着力として利用するクロマトグラフイの原理
に基づくものであつて、最近研究レベルで検討さ
れるようになつてきたが、未だ実用例は比較的少
ない。疎水基を有するクロマトグラフイ吸着剤お
よびそれを用いる酵素の精製法は、従来のイオン
交換クロマトグラフイなどの精製法と原理的に異
なるため、従来の精製法による精製が効果的でな
い場合の精製に特に有効である。また高い塩濃度
の存在下でも酸素が吸着されるので、予備処理と
しての脱塩処理が不要であるなどの長所をもつて
いる。 （発明が解決しようとする問題点） 従来報告されている方法、例えば直鎖脂肪族炭
化水素を含有するクロマトグラフイ担体を用いる
疎水性クロマトグラフイによる酵素の精製法には
次の問題点がある。 この疎水性クロマトグラフイは吸着が強すぎ
て、吸着された酵素を溶出するためには、高濃度
の有機溶媒溶液を必要とするため、酵素の失活を
引き起したり、それでもなお溶出が不充分でカラ
ム内に吸着したまゝ残留するなどの欠点がある。
他にもステロイドホルモンを固定化したクロマト
グラフイ担体を利用して、アフイニテイクロマト
グラフイを試みた２、３の例もあるが、クロマト
グラフイ担体の原料となるホルモンは極めて高価
であり、大規模な利用には不適当であると云う問
題点がある。 本発明者らは、上記従来の欠点に鑑み鋭意研究
の結果、新規なクロマトグラフイ吸着剤およびそ
れを用いた酵素の精製法を発明した。 即ち、本発明は
【式】
基を支持体に固定したデヒドロコール酸セフアロ
ースからなる蛋白質精製用吸着剤、
ースからなる蛋白質精製用吸着剤、
【式】基を支持体に固
定たデヒドロコール酸セフアロースからなる吸着
剤を用いる疎水性クロマトグラフイによる酵素の
精製法を提供するにある。 本発明でいう
剤を用いる疎水性クロマトグラフイによる酵素の
精製法を提供するにある。 本発明でいう
【式】基
を固定せしめる支持体としては、次のようなもの
が挙げられる。例えばアガロースゲル、デキスリ
ンゲル、セルロース、多孔性ガラスビーズ、多孔
性シリカゲル、多孔性合成樹脂などがあり、本発
明においては特にアガロースゲルなどの水不溶性
多糖類が好ましい。 本発明でいう
が挙げられる。例えばアガロースゲル、デキスリ
ンゲル、セルロース、多孔性ガラスビーズ、多孔
性シリカゲル、多孔性合成樹脂などがあり、本発
明においては特にアガロースゲルなどの水不溶性
多糖類が好ましい。 本発明でいう
【式】基
を上記支持体に固定せしめる方法としては、通常
行われているカルボキシイミド法を用いることが
出来る。 支持体に対する
行われているカルボキシイミド法を用いることが
出来る。 支持体に対する
【式】
基の割合は１mlあたり１〜500μｇ当量が好まし
い。 （作用） かくして得られた疎水性クロマトグラフイ吸着
剤を用いて酵素の精製を行うわけであるが、本発
明で精製し得る酵素は特に限定はなく、すべての
酵素に適用される。なかでも特に3α−ヒドロキ
システロイド−デヒドロゲナーゼ、β−ヒドロキ
システロイド−デヒドロゲナーゼなどのステロイ
ド代謝系酵素などの酵素精製に有用である。 本発明による疎水性クロマトグラフイ吸着剤を
酵素の精製に使用する方法を例示すれば、次のよ
うな方法がある。 (a) 酵素の水溶液を吸着剤カラムに通塔し、吸着
させた酵素をジメチルホルムアミド、エチルア
ルコール、グリセリンなどの有機溶媒溶液によ
つて溶出させる。この時の有機溶媒濃度は、有
機溶媒および酸素の種類によつて異なるが１〜
６％（Ｖ／Ｖ）の範囲が望ましい。 (b) カラムに吸着された酵素を、コール酸トライ
トンＸ−100（商品名）などの界面活性剤の水溶
液によつて溶出させる。この時の界面活性剤の
濃度は界面活性剤および酵素の種類によつて異
なるが0.01〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲が好まし
い。 (c) NAD+、NADP+などの助酵素の存在下で酵
素を吸着させ、助酵素の濃度を低下させること
によつて溶離する。この時の助酵素の濃度は、
助酵素および酵素の種類によつて異なるが１〜
500μMの範囲が望ましい。 (d) 助酵素および有機溶媒の存在下で酵素を吸着
させ、有機溶媒の存在下で助酵素の濃度を低下
させることによつて、酵素を溶出させる。この
時の助酵素および有機溶媒の好ましい濃度範囲
は上記と同様である。 （実施例） 以下に本発明の実施例を示し詳述する。 実施例 １ AH−セフアロース4B（フアルマシア社：商品
名）15ｇを0.5MのNaCl溶液で洗浄し、水分を
過で除く。これに水60mlおよび１ｇのデヒドロコ
ール酸を含むジオキサン120mlを加えた後、PHを
4.5〜6.0に調整する。ゆつくり撹拌しながら、こ
れに1.5ｇのカルボジイミド（EDC）（株式会社ペ
プチド研究所）を加えて、PHを4.5〜6.0に保ちな
がら24時間撹拌を続ける。反応後、50％（Ｖ／
Ｖ）のジオキサンで洗浄し、更に水で洗浄した。
以上の操作で約40mlの吸着剤（デヒドロコール酸
セフアロース）を得た。その基本的構造式を図１
−Ａに示す。 実施例 ２ 上記実施例１の吸着剤のカラム（10ml）を20ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（PH7.5）（以下これを単に緩衝
液とよぶ）で平衡化した後、１ｍＭのNADHを
含む上記緩衝液40mlを流す。シユドモナステマト
ステローンのヒドロキシステロイド−デヒドロゲ
ナーゼ粗酵素（シグマ社、グレード）の溶液
（3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
20.9U／ml、β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ26.7U／ml、蛋白質21.1mg／mlおよび１
ｍＭのNADHを含む上記緩衝液）７mlをカラム
に流し、続いて１ｍＭのNADHを含む上記緩衝
液100mlで洗浄する。次に上記緩衝液200mlを流す
ことによつて、3α−ヒドロキシステロイド−デ
ヒドロゲナーゼ（3α−酵素）を溶出させた（図
２の１）。 次に５％ジメチルホルムアミドおよび１ｍＭの
NAD+を含む上記緩衝液100mlでカラムを洗浄し、
続いて５％ジメチルホルムアミドを含む上記緩衝
液200mlによつてβ−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ（β−酵素）を溶出させた（図２の
２）。 この結果、3α−酵素の回収率は約67％、ピー
クの比活性は310U／mg蛋白質（310倍精製）であ
つた。また、β−酵素の回収率は約61％、ピーク
の比活性は61U／mg（47倍精製）であつた。 尚、図１−Ｂに示すような酢酸セフアロースの
カラムを用いて同様のクロマトグラフイを試みた
場合には、いずれの酸素もカラムに全く吸着され
なかつた。 Battaisらが行つたエステロンアミノカプロン
酸アガロースを吸着剤として用いるアフイニテイ
クロマトグラフイによると、上記と同様の酵素試
料の精製結果では、3α−酵素は比活性13.3U／mg
蛋白質から86.5U／mg蛋白質へ6.5倍の精製であ
り、回収率は68％であつた。また、β−酵素は
0.26U／mg蛋白質から3.33U／mg蛋白質へ12.8倍の
精製であり、回収率は69％であつた。 （効果） 本発明のものは、前記実施例による結果の示す
ように、上記従来法と比較して回収率では大差な
いが、精製効果および最終純度が極めて優れてい
る。
い。 （作用） かくして得られた疎水性クロマトグラフイ吸着
剤を用いて酵素の精製を行うわけであるが、本発
明で精製し得る酵素は特に限定はなく、すべての
酵素に適用される。なかでも特に3α−ヒドロキ
システロイド−デヒドロゲナーゼ、β−ヒドロキ
システロイド−デヒドロゲナーゼなどのステロイ
ド代謝系酵素などの酵素精製に有用である。 本発明による疎水性クロマトグラフイ吸着剤を
酵素の精製に使用する方法を例示すれば、次のよ
うな方法がある。 (a) 酵素の水溶液を吸着剤カラムに通塔し、吸着
させた酵素をジメチルホルムアミド、エチルア
ルコール、グリセリンなどの有機溶媒溶液によ
つて溶出させる。この時の有機溶媒濃度は、有
機溶媒および酸素の種類によつて異なるが１〜
６％（Ｖ／Ｖ）の範囲が望ましい。 (b) カラムに吸着された酵素を、コール酸トライ
トンＸ−100（商品名）などの界面活性剤の水溶
液によつて溶出させる。この時の界面活性剤の
濃度は界面活性剤および酵素の種類によつて異
なるが0.01〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲が好まし
い。 (c) NAD+、NADP+などの助酵素の存在下で酵
素を吸着させ、助酵素の濃度を低下させること
によつて溶離する。この時の助酵素の濃度は、
助酵素および酵素の種類によつて異なるが１〜
500μMの範囲が望ましい。 (d) 助酵素および有機溶媒の存在下で酵素を吸着
させ、有機溶媒の存在下で助酵素の濃度を低下
させることによつて、酵素を溶出させる。この
時の助酵素および有機溶媒の好ましい濃度範囲
は上記と同様である。 （実施例） 以下に本発明の実施例を示し詳述する。 実施例 １ AH−セフアロース4B（フアルマシア社：商品
名）15ｇを0.5MのNaCl溶液で洗浄し、水分を
過で除く。これに水60mlおよび１ｇのデヒドロコ
ール酸を含むジオキサン120mlを加えた後、PHを
4.5〜6.0に調整する。ゆつくり撹拌しながら、こ
れに1.5ｇのカルボジイミド（EDC）（株式会社ペ
プチド研究所）を加えて、PHを4.5〜6.0に保ちな
がら24時間撹拌を続ける。反応後、50％（Ｖ／
Ｖ）のジオキサンで洗浄し、更に水で洗浄した。
以上の操作で約40mlの吸着剤（デヒドロコール酸
セフアロース）を得た。その基本的構造式を図１
−Ａに示す。 実施例 ２ 上記実施例１の吸着剤のカラム（10ml）を20ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（PH7.5）（以下これを単に緩衝
液とよぶ）で平衡化した後、１ｍＭのNADHを
含む上記緩衝液40mlを流す。シユドモナステマト
ステローンのヒドロキシステロイド−デヒドロゲ
ナーゼ粗酵素（シグマ社、グレード）の溶液
（3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
20.9U／ml、β−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ26.7U／ml、蛋白質21.1mg／mlおよび１
ｍＭのNADHを含む上記緩衝液）７mlをカラム
に流し、続いて１ｍＭのNADHを含む上記緩衝
液100mlで洗浄する。次に上記緩衝液200mlを流す
ことによつて、3α−ヒドロキシステロイド−デ
ヒドロゲナーゼ（3α−酵素）を溶出させた（図
２の１）。 次に５％ジメチルホルムアミドおよび１ｍＭの
NAD+を含む上記緩衝液100mlでカラムを洗浄し、
続いて５％ジメチルホルムアミドを含む上記緩衝
液200mlによつてβ−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ（β−酵素）を溶出させた（図２の
２）。 この結果、3α−酵素の回収率は約67％、ピー
クの比活性は310U／mg蛋白質（310倍精製）であ
つた。また、β−酵素の回収率は約61％、ピーク
の比活性は61U／mg（47倍精製）であつた。 尚、図１−Ｂに示すような酢酸セフアロースの
カラムを用いて同様のクロマトグラフイを試みた
場合には、いずれの酸素もカラムに全く吸着され
なかつた。 Battaisらが行つたエステロンアミノカプロン
酸アガロースを吸着剤として用いるアフイニテイ
クロマトグラフイによると、上記と同様の酵素試
料の精製結果では、3α−酵素は比活性13.3U／mg
蛋白質から86.5U／mg蛋白質へ6.5倍の精製であ
り、回収率は68％であつた。また、β−酵素は
0.26U／mg蛋白質から3.33U／mg蛋白質へ12.8倍の
精製であり、回収率は69％であつた。 （効果） 本発明のものは、前記実施例による結果の示す
ように、上記従来法と比較して回収率では大差な
いが、精製効果および最終純度が極めて優れてい
る。
図中、第１図は構造式を示すものであり、Ａは
本発明の吸着剤（デヒドロコール酸セフアロー
ス）、Ｂは従来の吸着剤（酢酸セフアロース）で
ある。 第２図は、本発明の疎水性クロマトグラフイ分
画を示すもので、１は3α−酵素、２はβ−酵素
である。
本発明の吸着剤（デヒドロコール酸セフアロー
ス）、Ｂは従来の吸着剤（酢酸セフアロース）で
ある。 第２図は、本発明の疎水性クロマトグラフイ分
画を示すもので、１は3α−酵素、２はβ−酵素
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 【式】基を支持体に 固定したデヒドロコール酸セフアロースからなる
蛋白質の精製用吸着剤。 ２ 【式】基を支持体に 固定したデヒドロコール酸セフアロースからなる
吸着剤を用いる疎水性クロマトグラフイによる酵
素の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55141130A JPS5768138A (en) | 1980-10-11 | 1980-10-11 | Chromatography adsorbent and refining method of enzyme using this |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55141130A JPS5768138A (en) | 1980-10-11 | 1980-10-11 | Chromatography adsorbent and refining method of enzyme using this |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5768138A JPS5768138A (en) | 1982-04-26 |
| JPH0117410B2 true JPH0117410B2 (ja) | 1989-03-30 |
Family
ID=15284858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55141130A Granted JPS5768138A (en) | 1980-10-11 | 1980-10-11 | Chromatography adsorbent and refining method of enzyme using this |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5768138A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62262990A (ja) * | 1986-05-08 | 1987-11-16 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | ３−オキソ−５β−ステロイド−Δ↑４−デヒドロゲナ−ゼの単離精製方法 |
| ATE528393T1 (de) * | 2002-08-30 | 2011-10-15 | Arkray Inc | Verfahren zur reinigung von protein und glucosedehydrogenase |
-
1980
- 1980-10-11 JP JP55141130A patent/JPS5768138A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5768138A (en) | 1982-04-26 |
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