JPH01174373A - シャーレ、シャーレシステム及びこれを用いた細胞培養装置並びに培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、皮膚移植に使用する上皮細胞の培養や移植片
培養成いは正常組織由来の細胞培養等、特に継代に日数
がかかる細胞培養を行うための、細胞培養方法及び装置
並びに主としてこの装置に使用するシャーレシステムに
関するものである。

〔従来の技術及び問題点〕

従来、例えば広範囲の皮膚が熱傷を受け、しかも熱傷創
面を被覆するだけの健常な皮膚が残っていない場合、わ
ずかに残った健常皮膚を時期をおいて繰り返し採皮して
創面に移植し、少しずつ創面を被覆するようにして治療
していたが、治療期間の長期化に伴ってヨ病を併発して
死亡する率が高かった。

一方、他の方法として、採皮した上皮を培養することに
よって、その面積を増大させた上で創面に移植するよう
にした治療方法も、近時試みられている。このような、
例えば上皮細胞の如き細胞の培養方法としては、一般に
以下の方法が利用されている。

即ち、先ず通常のシャーレ内にフィーダーレイヤー（ｆ
ｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ）として線維芽細胞を播種し、
これをマイトマイシンＣなる試薬にて培養抑制の処理を
した後、培養すべき細胞、例えば上皮細胞を播く。この
状態で一定時間培養させた後、フィーダーレイヤーを取
り除き、さらに上皮細胞を培養させる。その際、上皮細
胞は増殖が遅く、シャーレ内面で培養させる期間が約２
週間程度を要するため、その間２日乃至３日おきにシャ
ーレの蓋をあけてピペットを使用して培地を交換する。

しかしながら、上記の培養方法では、シャーレ内面に２
種類の性質の異なる細胞、即ち線維芽細胞及び上皮細胞
を播種して培養させているので、線維芽細胞に培養抑制
処理を施しているものの、上皮細胞のみの培養は困難で
ある。また、フィーダーレイヤーを利用していることか
ら、このフィーダーレイヤーとしての線維芽細胞の播種
、試薬処理や線維芽細胞の除去等の多くの操作を必要と
し、培養作業が煩雑であり、特に大量培養が必要とされ
る場合には２日乃至３日おきに行う培地交換が非常に労
力を要していた。

さらに、培養した上皮は、２層程度のものであるため、
皮膚に比較して非常に薄く、移植の際には別の膜、例え
ばコラーゲンシート等により補強しなければならず、ま
た培養した上皮は、皮膚と同一構造ではなく上皮の膜に
すぎないため、移植の効率もよくない。さらに培養の際
にシャーレ内面に付着した状態で培地を上から満たして
培養することから、培養した上皮の細胞は、下側の面が
接着面となり、上側の面が栄養補給面となって、表裏面
で別々の極性をもってしまい、このため移植後に体内か
らの充分な栄養の吸収ができない等の不都合が生じてい
た。

また、上述した上皮培養の他にも、例えば生体から取り
出した組織片より遊出する細胞の継代培養を行う、所謂
移植片培養や、正常組織由来の細胞培養を行う場合、さ
らに株化細胞のうち培養に日数がかかるものの培養にお
いては、継代から次の継代まで日数がかかるため、培養
の途中で数回の培地交換が必要となり、その作業が面倒
で、培養自体が面倒なものとなっていた。

〔発明の目的〕 本発明は以上の点に鑑み、培養作業が簡単で、且つ複数
回の培地交換が必要な細胞培養に有用であり、特に皮膚
と同一構造を有し接着面と栄養補給面とが同じ裏面側に
形成される上皮細胞の培養に好適な細胞培養方法及び装
置並びにこれに使用するシャーレシステムを提供するこ
とを目的としている。

〔問題点を解決するための手段及び作用〕上記目的は、
本発明によれば、対向する側壁の底面付近に各々接続口
を備えたシャーレと、シャーレ内部で中間の高さに膜を
固定する固定支持具と、培地貯蔵ピンから上記シャーレ
の一方の接続口へそして他方の接続口から廃液ピンへ培
地を一定速度で流すための定流ポンプとを含んでおり、
上記固定支持具にコラーゲンシート等の膜を固定し、該
膜の一面に例えば線維芽細胞等の各種因子を分泌するよ
うな細胞を、他方の面に例えば上皮細胞の如き培養すべ
き細胞を播種して培養させるようにした細胞培養装置に
より達成される。

また上記目的は、本発明によれば、対向する側壁の底面
付近に各々接続口を備えたシャーレを使用して、該シャ
ーレ内部で中間の高さに固定支持具によりコラーゲンシ
ート等の膜を固定し、該膜の一面に例えば線維芽細胞等
の各種因子を分泌するような細胞を、他方の面に培養す
べき細胞を播種して、培地貯蔵源から上記シャーレの一
方の接続口へ、そして他方の接続口から使用済みの培地
を流出することにより、培養を行う細胞培養方法により
達成される。

さらに、上記シャーレは、固定支持具が好ましくは下方
又は上方に突出する脚部を有する外側リングと上方又は
下方に突出する脚部を有する内側リングとで構成され、
これらのリングの間に膜が張架固定されるとともに、シ
ャーレ本体の底部付近に形成された流体の流入及び流出
用のポートを有することによってシャーレシステムを構
成している。

この発明によれば、対向する側壁の底面付近に各々接続
口を備えたシャーレシステムを使用することにより、シ
ャーレ本体内で中間の高さに固定支持された膜の下面に
一つの細胞例えば線維芽細胞を、その上面にこれと同種
又は異種の細胞、例えば上皮細胞を播種して、シャーレ
の一方の接続口から他方の接続口へ培地を流すようにし
たから、該細胞は、線維芽細胞等の各種因子を分泌する
ような細胞及び膜を通して、そのまわりを流れる培地か
ら栄養を吸収するので、接着面と栄養補給面とが同じ側
に形成される。皮膚の細胞を培養する場合は、シャーレ
本体内で上から順に培養すべき細胞、この場合上皮細胞
、膜、線維芽細胞と並んで培養されるので、皮膚と同一
構造の上皮が得られ、移植の際には膜の固定支持具を外
すだけでそのまま全体を移植することができ、移植後も
体内から充分な栄養補給が可能であるので、従来のよう
にフィーダーレイヤーを除去する等の作業が不要となる
。

さらに培地交換も定流ポンプを使用することにより自動
的に行われるので、大量培養が必要な場合でも、培地貯
蔵ピン及び廃液ピンの交換のみを行えばよく、培地作業
が著しく簡単になる。

尚、複数のシャーレシステムを用意して、各シャーレの
接続口を連続して接続すれば、培地が順次善シャーレを
流れるので、培地に含まれる微量成分が無駄なく利用さ
れ得るようになる。

〔実施例〕

以下、図面に示した一実施例に基づいて本発明の詳細な
説明する。

第１図は本発明で使用するシャーレを示しており、この
シャーレ１は、本体２及び該本体２を覆うカバー３から
成っている。シャーレ１の本体２には、はぼ対向する側
壁の底面付近に、流体、特に細胞培養用培地を流入及び
流出させるための少なくとも１つ、本例では一対の接続
口２ａ、　２ｂが設けられている。

第２図は上記シャーレ１内に受容され得る固定支持具４
を示しており、この固定支持具４は、下方に突出する脚
部５ａを有する外側リング５と上方に突出する脚部６ａ
を有する内側リング６とから構成されており（第２図（
Ｂ）参照）、外側リング５と内側リング６とは例えば、
コラーゲンシートや“バイオプレン”°　（日本バイリ
ーン■の登録商標）等の薄い膜７を挟んで固く嵌合する
ようになっている（第２図（Ｃ）参照）。このように構
成された固定支持具４は、膜７を挟んで固定した状態で
第３図に示すようにシャーレ本体２内に受容されシャー
レシステム８を構成する。

第４図は本発明による細胞培養装置を示しており、この
装置１０は、培地貯蔵ピン１１．定流ポンプ１２、シャ
ーレシステム８及び廃液ピン１３とから構成されている
。

培地貯蔵ピン１１は、培養に用いる培地を貯蔵している
とともに、バクテリア、カビ等の混入を防止するために
綿栓をした空気取入れ用、のガラス管１１ａ　と、底部
まで延びる培地取出し用のガラス管１１ｂ　とを取り付
けたシリコン栓１１ｃにより密閉されている。

廃液ピン１３は、培地貯蔵ピン１１のガラス管１・１ａ
と同様の綿栓をしたガラス管１３ａ及び廃液取入れ用の
ガラス管１３ｂ　とを取り付けたシリコン栓１３ｃによ
り密閉されている。この場合、ガラス管１３ｂは１、底
部まで延びている必要はない。

培地貯蔵ピン１１の培地取出し用ガラス管１１ｂから定
流ポンプ１２、定流ポンプ１２からシャーレシステム８
の一方の接続口２ａ、他方の接続口２ｂから定流ポンプ
１２、さらに定流ポンプ１２から廃液ピン１３のガラス
管１３ｂに至る一連の導通経路は各々シリコンチューブ
により接続されており、定流ポンプ１２からシャーレＩ
の一方の接続口２ａへ接続されたシリコンチューブには
、上流側から順に、バクテリア、カビ等がシャーレシス
テム８内へ混入するのを防止するためのキャップを取り
付けた三方活栓１４と、コック１５とが介挿されている
。

本培養装置１０は以上のように構成されており、この装
置を使用して細胞の培養、例えば上皮細胞の培養を行う
場合には、以下のようにして行う。

即ち、先ず固定支持具４の外側リング５と内側リング６
とを第２図（Ｂ）のように互いに外してその間にコラー
ゲンシート等の薄い膜７を挿入し、再び外側リング５と
内側リング６とを嵌合させることにより、膜を固定支持
する（第２図（Ｃ）参照）。続いて、この状態から固定
支持具４を、第３図に示すようにシャーレ１の本体２内
に収容して、シャーレシステム８を構成した後、このシ
ャーレシステム８の両接続口２ａ、　２ｂをシリコンチ
ューブにそれぞれ接続する。次番こ、シャーレ１内の固
定支持具４に固定支持された膜７上に線維芽細胞を播種
した後、固定支持具４を上下反転させ、再び膜７上に上
皮細胞を播種する。

ここで、定流ポンプ１２を作動させると、培地貯蔵ピン
１１からガラス管１．１ｂ、シリコフチ１−ブを介して
、さらに定流ポンプ１２からシリコンチューブを通り三
方活栓１４．コック１５を介してシャーレ１の接続口２
ａからシャーレ１の本体２内に培地が導入される。シャ
ーレｊの本体２内で、培地は膜７の下方を流れ、その際
その成分が膜の下面に付着した線維芽細胞及び膜を通っ
て上皮細胞に達し、上皮細胞に吸収されることにより、
上皮細胞への栄養補給が行われ−、該上皮細胞が培養さ
れることになる。

その後、培地はシャーレ１の接続口２ｂを通ってシリコ
ンチューブを介して定流ポンプ１２に、さらにシリコン
チューブを介してガラス管１３．ｂがら廃液ピン１３内
に達する。

かくして、本培養装置１０によれば、シャーレ１内で膜
７が中間の高さに支持され、しかもこの膜７の下面に線
維芽細胞が、また１！７の上面には上皮細胞が各々播種
され、シャーレ１内の該膜の下方を培地が流れるように
なっているので、培養された上皮細胞は下側が接着面及
び栄養補給面の両特性を有することとなり、移植した場
合にも充分な栄養補給ができることになる。

尚、本培養装置１０を、例えば第５図に示す、ように、
専用トレー１６上にセットするようにすれば、装置全体
の移動が簡便となり、例えば培養のためにｃｏｚ、’Ｗ
卵器等の保温装置に入れて自動的に培地交換を行わせな
がら、培養を行うことができる。

さらに第６図に示すように、シャーレシステム８を複数
個用意して、各シャーレシステムのシャーレ１の接続口
を順次に接続するようにすれば、培地が順次に各シャー
レシステム８内を流れることになり、培地に含まれる微
小成分が無駄なく有効に利用されると共に、細胞が大量
に培養されることになる。この場合、好ましくは、各シ
ャーレシステム８に対して各々三方活栓１４及びコック
１５が備えられる。

尚、以上に説明した実施例においては、主として上皮細
胞を培養する場合について葎ぺたが、これに限らず例え
ば、移植片培養、又は正常組織由来の細胞培養等、又は
継代に日数かががる株化細胞の培養を行うために、本細
胞培養装置１ｏを使用し得ることは明白であり、これに
よって培地交換の作業が不要となることから、非常に簡
単に培養が行われ得ることになる。

さらに、本発明によるシャーレは、上記した各種の細胞
培養用に適用し得る他、種々の化学実験等において、流
体を導入・排出すべき場合に適用し得ることは勿論であ
る。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明によれば、シャーレ本体の側壁
に流体の流入及び流出用の少なくとも１個のポートが形
成され、また、シャーレシステムを、シャーレ本体内で
中間の高さに膜を固定する固定支持具と、該本体の側壁
の底面付近に形成した少なくとも１個の、好ましくは対
向して２・っの流体の流入及び流出用ポートとを有する
ように構成し５．且つ該シャーレシステムを使用し、培
地貯蔵ピンから上記流入用のポートへそして流出用のポ
ートから廃液ピンへ定流ポンプにより培地を−・定速度
で流すことにより、上記固定支持具に固定された膜の一
面に線維芽細胞等の各種因子を分泌するよ・ジな細胞を
、他方の面に培養すべき細胞を播種ｔ７て培養させるよ
うに細胞培養装置を構成し、さらに、上記シャーレを使
用して、該シャーレ内部で中間の高さに固定支持具によ
りコラーゲンシート等の膜を固定し、この膜の一面に線
維芽細胞等の各種因子を分泌するような細胞を、他方の
面に培養すべき、例えば上皮細胞を播種して、培地貯蔵
源から上記シャーレの一方の接続口−・、そして他方の
接続口から使用済みの培地を流出することにより培養を
行うように細胞培養方法を構成したから、該細胞は、そ
れのみが培養され、且つその下面でコラーゲンシート等
の膜上に接着すると共に、該下面で線維芽細胞等の各種
因子を分泌するような細胞及び膜を通してその下を流れ
る培地から栄養を吸収し得ることから、接着面と栄養補
給面とが同じ側に形成される。

従って、皮膚の細胞を培養する場合は、シャーレ本体内
で上から順に例えば上皮細胞、膜、線維芽細胞と並んで
培養されるので、皮膚と同一構造の細胞が得られる。そ
して、移植の際には膜の固定支持具を外すだけでそのま
ま全体を移植することができ、且つ移植後も体内から充
分な栄養補給が可能であることから、従来のようにフィ
ーダーレイヤーを除去する等の作業が不要となり、培地
交換も定流ポンプにより自動的に行われるので、大量培
養が必要な場合でも、培地貯蔵ピン及び廃液ピンの交換
のみを行えばよく、培地作業が著しく簡単になる。

尚、複数のシャーレを用意、して、各シャーレの接続口
を連続して接続すれば、培地が順次善シャーレを流れる
ので、培地に含まれる微量成分が無駄なく利用され得る
ようになる。

かくして、本発明によれば、例えば皮膚移植に使用する
上皮細胞の培養にあっては、接着面と栄養補給面とを同
じ側に形成することができ、皮膚と同一構造の上皮細胞
の培養が可能となり、またかかる上皮細胞の培養に限ら
ず、他の移植片培養成いは正常組織由来の細胞培養等の
、継代に日数がかかる細胞培養を行うに好適な培養作業
が簡単で、極めて優れたシャーレシステム及びこれを用
いた細胞培養装置並びに培養方法が提供され得ることと
なる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で使用するシャーレを示す概略斜視図、
第２図は第１図のシャーレ内に受容される固定支持具を
示し、同図（Ａ）は斜視図、（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は
分解斜視図、第３図はシャーレ内に固定支持具を受容し
た状態を示す断面図、第４図は本発明による方法を実施
するための装置を示す概略図、第５図及び第６図は第４
図の装置の使用状態を示す概略平面図である。 １−−一、・シャーレ；　２−・−本体；３−−−一カ
バー；　４・−固足支持具；　５・・・−外側リング；
　６・・・・・内側リング：　７・−・・・コラーゲン
シート等の膜；Ｅｌ−シャーレシステム；１０−・・−
・上皮培養装置；１１−・−・培地貯蔵ピン；１２−・
・・定流ポンプ；　１３−廃液ピン；１４−・・−三方
活栓；　１５−コック；　１６−・・専用トレー。 特許出願人：株式会社アゾランス 代　理　人：弁理士　平　山　−拳

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）本体の側壁に培地等の各種流体の流入及び流出用
   のポートが少なくとも１個形成されていることを特徴と
   する、シャーレ。
2. （２）前記ポートが、前記本体側壁に対向して２個形成
   されていることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に
   記載のシャーレ。
3. （３）コラーゲンシート等の膜を挟んで下面に一種の細
   胞をまた上面にこれと同種又は異種の細胞を播種して培
   養するために、上記膜を張架固定した固定支持具を本体
   内のほぼ中間の高さに配置するとともに、該本体側壁の
   底面付近に培地の流入及び流出用の接続口を少なくとも
   １個形成したことを特徴とする、シャーレシステム。
4. （４）前記固定支持具が、下方又は上方に突出する脚部
   を有する外側リングと、上方又は下方に突出する脚部を
   有する内側リングとから構成されていて、前記コラーゲ
   ンシート等の膜を該両リング間に挟んで嵌合しているこ
   とを特徴とする、特許請求の範囲第３項に記載のシャー
   レシステム。
5. （５）前記接続口が、培地流入用の接続口と培地流出用
   の接続口との２個のポートを有することを特徴とする、
   特許請求の範囲第３項に記載のシャーレシステム。
6. （６）前記コラーゲンシート等の膜を挟んで下面に繊維
   芽細胞がまた上面に上皮細胞が播種されることを特徴と
   する、特許請求の範囲第３項に記載のシャーレシステム
   。
7. （７）対向する側壁の底面付近に各々接続口を備えたシ
   ャーレと、このシャーレの内部で中間の高さに膜を固定
   する固定支持具と、培地貯蔵ピンから上記シャーレの一
   方の接続口へ、そして他方の接続口から廃液ピンへ培地
   を一定速度で流すための定流ポンプとを含んでおり、上
   記固定支持具にコラーゲンシート等の膜を固定し、この
   膜の下面に一種の細胞を、上面にこれと同種又は異種の
   細胞を播種して培養させるようにしたことを特徴とする
   、細胞培養装置。
8. （８）対向する側壁の底面付近に各々接続口を備えたシ
   ャーレを使用して、このシャーレの内部で中間の高さに
   配置した固定支持具によりコラーゲンシート等の膜を固
   定し、この膜の下面に一種の細胞を、上面にこれと同種
   又は異種の細胞を播種して、培地貯蔵源から上記シャー
   レの一方の接続口へ、そして他方の接続口から使用済み
   の培地を流出することにより、培養を行うようにしたこ
   とを特徴とする細胞培養方法。