JPH01180451A

JPH01180451A - アフィニティー分離用吸着体

Info

Publication number: JPH01180451A
Application number: JP63003567A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Suzuki; 雅博鈴木; Norio Moriya; 則雄守屋; Kunio Nishimura; 邦夫西村
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1988-01-11
Filing date: 1988-01-11
Publication date: 1989-07-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は、蛋白質分解酵素（ｆロチアーゼ）の分離、精
製等に有用なアフィニティー分離用吸着体に関する。

（２）従来の技術及び問題点近年、蛋白質の精製法の一つとして、アフィニティー分
離を利用する方法が一般的に広く行なわれており、その
為のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体が各種
開発され、実用化されている。

しかし、これらアフィニティー分離法は大部分のものが
ある程度精製されたものの精製、つまり、全精製プロセ
スの最終ステップに用いられることが多く、この場合、
精製プロセス全体としては多くのステツブからなるため
複雑で目的物の回収率も低くなる。今までに、比較的単
純なプロセスで、且、工業的大量精製に適したアフィニ
ティー分離法はなかった。

また、酵素を精製する分野、特にアルカリグロチアーゼ
の精製分野では、アミノ酸、アミノ酸誘導体、蛋白性阻
害剤、ペグチド性阻害剤等の種々のリガンドが開発され
ているが、実用的溶離特性を得るための溶離条件は酵素
にとって苛酷なものが多く１例えば、アルコール、アセ
トン等の有機溶媒系、高または低−系、尿素、塩酸グア
ニジン等の蛋白質変性剤系等を用いたものがほとんどで
ある。これらの方法では溶離液中でプロテアーゼは不安
定となるため、溶離の時間や温度が制限され、工業的大
規模な精製には向いていない。また、プロテアーゼを安
定な条件下に移す必要があるため、有機溶媒回収系、Ｐ
Ｈ中和槽、変性剤の除外系等が必要となり、プロセスが
複雑になる欠点を有する。

一方、温和な条件でアルカリプロテアーゼヲ溶離可能な
ものとしては、今までにフェニルアルソン酸系及びフェ
ニルホウ酸系のリガンドが知られていたが、フェニルア
ルソン酸系のリガンドはヒ素を含有しており有毒である
ため、吸着体調製時に大量に扱うには危険性を伴い、ま
た、プロテアーゼの精製時に於てもリガンドの脱離を完
全に防ぐことも難しい。したがって、このリガンドを扱
う方法は除害系が必要となり、プロセスが複雑になる等
の欠点を有する。また、フェニルホウ酸系のリガンドで
は吸着のプロテアーゼに対する選択が低く、プロテアー
ゼの吸着と競合するような物質を充分線いておく必要が
あり、また、溶離時では、このリガンドが吸着したプロ
テアーゼが溶離しにくいため、溶離液量を多く必要とし
、溶離時間も長くなる等の欠点を有する。

本発明の目的は、前記従来のアフィニティー分離用吸着
体の欠点を克服して、プロテアーゼ、例えば、アルカリ
グロチアーゼを中性〜弱塩基性の水溶液で溶離可能で、
大量精製に十分対応できる吸着溶離特性を持つ安全なア
フィニティー分離用吸着体およびそれを用いるプロテア
ーゼの精製法を提供することＫある。

（３）問題点を解決するための手段本発明によれば、サリチル酸、フタル酸またはこレラの
誘導体で少くとも１つのカルボキシル基が修飾されずに
残存するものをリガンドとするアフィニティー分離用吸
着体が提供される。

本発明のアフィニティー分離用吸着体は、上記リガンド
を直接担体に固定化したもの又は担体上で、該リガンド
となり得る物質を合成したものである。リガンドを直接
担体に固定化する場合、リガンドの分子中にアミン基、
水酸基等の担体と結合反応させやすい官能基（以後、特
にことわりのない限り「官能基」と略す）が少なくとも
一つ以上含まれている必要がある。

本発明に用いるリガンドの官能基は使用する担体とリガ
ンドとを結合可能なものであればよく、例えば、アミノ
基、カルボキシル基、ホルミル基。

水酸基等が挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。また、これらリガンドの種類は種々あり、特に゛
限定されるものではないが、例えば、官能基がアミノ基
の場合、５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸、
４−・アミンサリチル酸。

フタル酸、４−アミノフタル酸、２．３−ジヒドロ安息
香酸、２．４−ジヒドロ安息香酸、オルセリン酸、キノ
リン酸等がある。

本発明のリガンドを担体上で合成する場合、５−（４−
アミノフェニルアゾ）サリチル酸、フタル酸モノアミド
等が合成でき、合成法としては、脱水縮合やジアゾカッ
プリング等の一般的合成法を適応すればよい。

本発明に用いる担体としては、アガロース、セルロース
、デキストラン、ポリアクリルアミド。

ポリビニルアルコ−・ル、キトサン、多孔性ガラス等の
アフィニティー分離に於て通常用いられる担体はいずれ
も例外なく用いられる。アガロース系担体の具体的商品
としては、例えば、セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ｍ社登録商標、以下■と略称する）。

バイオグルＡ　（ＢＩＯ−ＲＡＤ社■）等があり、セル
ロース系のものとしては、例えば、セルロファイン（チ
ッソ（株）■）、デキストラン系のものとしては、例え
ば、セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社■）、ポリ
アクリルアミド系のものとしては、例えば、エンデフィ
ックスＰ（和光紬薬＠）■）、ポリビニルアルコール系
のものとしては、例えば、トヨパール（東洋曹達（株）
■）、セＡ？ビーズ（三菱化成（株）■）、キトサン系
のものとしては、例えば、キ）　ノ４−ル（昭和電工（
株）■）等が各々市販されているが、これらクロマトグ
ラフィー用担体に限定されるものではない。また、これ
ら担体の種類は種々あり、特に限定されるものではない
が、例えば、官能基がアミン基の場合には担体にＣＮＢ
　ｒ活性化セファロース４　Ｂ　、　ＣＨ−セファロー
ス４Ｂ。

活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ、エポキシ活性化セファ
ロース４Ｂ等も用いることができる。

リガンドを担体に固定化する場合、担体の種類、即ち担
体側の活性基及び官能基により異なるが、いずれも一般
的固定化担体の調整法が適応できる。

一方、本発明のアフィニティー分離用吸着体で精製可能
な酵素としては、アルカリグロテアーピを中心にして、
スブチリシンＢＰＮ’　、スプチリシンカールスベルグ
、カズサーゼ（昭和電工＠）■）。

アルカラーゼ（ＮｏＶＯ社■）、サビナーゼ（ＮｏＶＯ
社■）、エスペラーゼ（ＮｏＶＯ社■）、キモトリグシ
ン等があるが、これらに限定されるものではない。

（４）作用本発明によって得られたアフィニティー分離用吸着体は
一般的な担体を使用できるため、充填塔方式や流動層方
式をはじめとする移動層方式等によって実用化できる。

しかも、本発明のリガンドは水系の溶液で吸着溶離がで
きる所にメリットおよび特徴がある。

従って、従来のように溶離に有機溶媒を用いて分離精製
する工程や、除害設備の必要なアルソン酸系のリガンド
を用いたものに比較して、はるかにプロセスが単純であ
り、また、フェニルホウ酸系のリガンドを用いたものよ
り溶離しやすく高い回収率を得やすいので、工業的に有
利な方法である。

（５）実施例以下に実施例を挙げる。実施例中の酵素の定量は、ＴＮ
ＢＳ法により行なった。

実施例１５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸の固定化活
性化ＣＨ−セファロ−ｙ、　４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社■）３Ｓに氷冷した１　０　ｍＭ　ＨＣＬ水溶液
１５−を加え、約１５分間攪拌し樹脂を膨潤させ、グラ
スフィルター上に樹脂を移し、氷冷した１　０　ｍＭ　
ＨＣｔ水溶液６００ｍ１で洗浄した。次いで氷冷した１
００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｒｎｌで手早く
洗浄し、ただちに樹脂を１０ｍＭ　５−　（４−アミノ
フェニルアゾ）サリチル酸を含む１００ｍＭ炭酸水素ナ
トリウム水溶１（ｐ）１８．０）５０ゴ中に移し、室温
で一昼夜攪拌した。反応後、樹脂を再びグラスフィルタ
ー上に移し、Ｐ液に色がなくなるまで１００　ｍＭ炭酸
水素す）　ＩＪウム水溶液で洗浄し、目的とする吸着体
を得た。この吸着体には、Ｉ　Ｑ−’ｍＱｔＳ（樹脂）
の５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸が固定化
された。

実施例２５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチル酸の担体上で
の合成モノやビーズＣＭ−１３１００ｇをジオキサ７５００ｍ
１で３回洗浄し、樹脂をジオキサン３００　ｍｌ中に移
した。これに、ジシクロへキシルカルどジイミド５Ｉと
ｐ−フェニレンジアミン１０ｇとを加え、室温で一昼夜
攪拌した。次に、樹脂をジオキサンｓｏｏｍｚ及び水５
ＱＱｍＪで３回ずつ洗浄し、樹脂を氷冷した１Ｍ塩酸５
００ｄ中に少しずつ加え、液温を４℃に保ちながら、亜
硝酸ナトリウム２９を少しずつ加え、約３時間反応させ
た。反応後、樹脂を氷冷水５ＱＱｍ／で洗浄し、樹脂を
水３００ｍ１中に移し液温１０℃以下、ｐＨ８〜９に保
ちながら、サリチル酸５ｇを加え、約３時間反応させた
。

反応後１０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、１０ｍＭ塩酸。

水で各５００ｄずつで順次洗浄し、目的とする吸着体を
得た。この吸着体には、１０−４〜１０−５ｍｏｔ／ｍ
ｌ　（樹脂）の５−（４−アミノフェニルアゾ）サリチ
ル酸が固定化された。

実施例３フタル酸モノアミドの担体上での合成セパビーズ臥−１３１００Ｎをジオキサン５００ｍ１で
３回洗浄し、無水フタル酸１０％ジオキサン溶液３０Ｏ
ｒｎｌ中に樹脂を移し、室温で一昼夜攪拌した。次に、
樹脂ｆ、３回ず・つ、ジオキサン５００ｍ１次いで水５
００　ｍｌで洗浄し、目的とする吸着体を得た。この吸
着体には、１０−’　〜１０−’　ｍｏｌ／ｍｌ（樹脂
）のフタル酸モノアミドが固定化された。

実施例４アフィニティークロマトグラフィー法による精製１）吸
着分離実施例１〜３の吸着体それぞれＫついてアフィニティー
クロマトグラフィーを行なった。

１．２ｃＷＩφ×４０傭のカラムに樹脂を充填し、２〇
−燐酸緩衝液（ｐＨ９）であらかじめカラムを平衡化し
ておき、アフィニティークロマトグラフィーを開始した
。ｐＨ９Ｆｃ調製した１チカズサーゼ（昭和電工（株）
）酵素原木水溶液１０００１１１／　’ｉ粗試料として
カラムに添加し、酵素を樹脂に吸着させた。

次に２０　ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ９）　５００ｍｌテカ
ラＡを洗浄し、２００ｍＭ硫酸ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６）５０ｏｍＪ（実施例３のみ１０
００ｍ／）で酵素を溶出させた。結果を表ＩＫ示した０２）分離条件実施例２の吸着体について、粗試料の−及び溶出液の声
、塩濃度、塩の種類を変えて実施例４−１）と同様にア
フィニティークロマトグラフィーを行なった。なお、カ
ラムの平衡化の−及び洗浄の声は粗試料の−と同じにし
た。結果を表２，３に示した０３）拳法によって精製された酵素の比活性は３００　ｎ
ｋ／Ａ２８ｏ以上であり、著しく高純度の酵素が得られ
た。本酵素溶液は無色透明であり、この凍結乾燥粉末は
白色であり、酵素造粒品に使用すれば、化粧剤を使用し
なくても充分使用に耐えるきれいなものができる。

実施例６酵素をアルカラーゼ（ＮｏＶＯ社）として同様に実施例
１のカラムを用いて分離した結果、ｐＨ９において吸着
し、ＰＨ６，硫酸ナトリウム２００ｍＭの溶離液で溶離
し、酵素吸着量４０Ｉｎ９／ｆｆ１Ａ’（樹脂）回収率
９９％で回収し、乾燥することによって白色の酵素原末
を得た。

実施例７酵素をスプチリシンＢＰＮ’（ＳＩＧＭＡ社）として同
様に実施例１のカラムを用いて分離した結果、−９にお
いて吸着し、ＰＨ６，硫酸ナトリウム２００ｍＭの溶離
液で溶離し、酵素吸着量４２Ｉｎ９／ｍ（樹脂）１回収
率９８チで回収し、乾燥することによって白色の酵素原
末を得た。

実施例８酵素をα−キモトリプシン（ＳＩＧＭＡ　社）　トして
同様に実施例１のカラムを用いて分離した結果、ｐ）１
８におイテ吸着し、ＰＨ６，硫酸ナトリウムＺｏ。

−の溶離液で溶離し、酵素吸着量２４１ｎ９７ｍｌ　（
樹脂）９回収率８８％で回収した。

表１　各アフィニティー分離剤による酵素の分離結果実
施例１　　　　　２８　　　　　　１０１　　　　　７
８実施例３　　　　　３３　　　　　　　９８　　　　
　７２実施例４　　　　　５１　　　　　　　９０　　
　　　６９注１）０回収率＝溶出酵素ｉ／吸着酵量注２
）、精製率＝溶出酵素の比活性／粗試料比活性（粗試料
の比活性＝　４．４　ｎｋａｔ／Ａ２８０　）表２　吸
着条件の影響粗試料の−酵素吸着量（ｍ９蛋白質／ａｔ樹脂）表３　
溶出条件の影響溶出液の−添　加　塩　　添加塩濃度（ｍＭ）　　溶出
率（％）９　　　塩化ナトリウム　　　　１００　　　
　　９８６　　　　　　　　＃　　　　　　　　　ｔｔ
　　　　　　　　７３９　　　硫酸ナトリウム　　　　
　５０　　　　６６６　　　　　　１／　　　　　　　
　１００　　　　　９５９　　　　　　　＃　　　　　
　　　５００　　　　　９１注１）、添加塩とは、２０
ｍＭ燐酸緩衝剤の他に添加した塩を指す。

注２）、溶出率＝溶出酵素量／吸着酵素量（７）発明の
効果本発明の吸着体は、吸着体１　ｍｌ当り酵素蛋白質を２
０〜３０■以上吸着することができ、従来のアフィニテ
ィー吸着体の２〜数十倍の吸着能を持つ。従来、酵素の
大量精製に於て、アフィニティ−分離法は十分効率の良
い方法ではなく実用化はされていなかったが、本発明の
吸着体を用いれば、洗剤用酵素等の大量精製を必要とす
るものに対しても十分にアフィニティー分離法を活用で
きる。

本発明の吸着体は、少なくともｐＨ６〜１０、好ましく
はｐＨ６〜９において酵素を吸着し、少なくともｐＨ６
〜９の溶出液に塩１１００ｍＭ以上添加することにより
溶出可能である。

このように、本発明の吸着体を用いたアフィニティー分
離法は、大量精製に於て十分な吸着容量で、有機溶媒等
を使わずに塩類の水溶液のみで、粗酵素液等からアルカ
リグロチアーゼを選択的に分離精製できることを大きな
特徴とする。

水沫によって得られた酵素はかなり比活性が高く、また
、不純物（例えば色成分）の少ないものが得られるので
各種用途の酵素、特に液体洗剤用酵素等として極めて有
用である。

特許出願人　　昭和電工株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

サリチル酸、フタル酸またはこれらの誘導体で少なくと
も１つのカルボキシル基が修飾されないで残存するもの
をリガンドとするプロテアーゼのアフィニティー分離用
吸着体。