JPH0118794B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、パーオキシダーゼ、アルコールオキ
シダーゼまたはグルコースオキシダーゼ酵素を使
用して廃水から芳香族ヒドロキシ化合物および
（または）芳香族アミンを除去する方法に関する。 芳香族ヒドロキシ化合物および芳香族アミンは
多数の産業の廃水中に普通に存在する。かような
芳香族ヒドロキシ化合物および芳香族アミンは、
高められた濃度で存在するときは有毒である。こ
れに加えて、芳香族ヒドロキシ化合物および芳香
族アミンは、また、生物学的酸素要求量が比較的
高く、従つて十分な濃度で存在するときは、これ
らを含有する水本体の酸素を著しく減少または激
減させる。 産業廃水から芳香族ヒドロキシ化合物および芳
香族アミンを除去する慣用の方法には、抽出、活
性炭素への収着、水蒸気蒸留、細菌的または化学
的反応（酸化）、電気化学的方法および照射が含
まれる。これらの方法のすべては、確かに実行し
易すさおよび有用性があるが、重大な欠点、例え
ば、高い費用、不完全な精製、有害な副成物の形
成または低い効率がある。かような状況にあるた
め、これらに代り得る方法の探求が必要とされて
いる。 ジアーナル オブ アプライド バイオケミス
トリー（Journal of Applied Biochemistry）２
巻、414〜421頁（1980年）に最近、廃水中に存在
するフエノールおよびアニリンを、廃水にパーオ
キシダーゼと過酸化水素とを添加し、それによつ
てフエノールおよび芳香族アミンを不溶性の、外
見上無毒性ポリマーの形態に沈殿させて除去でき
ることが開示されている。 前記の方式は、それが意図する目的用としては
有効であるが、この方法を商業的に魅力的でない
ものにしている重大な欠点を有する。すなわち、
過酸化水素は高価であり、貯蔵中に不安定であ
り、金属塩や日光および細菌が過酸化水素を迅速
に酸素と水とに分解する現実の廃水流中では寿命
が短かい。従つて、今までに経験されている問題
を回避する方法の開発は極めて望ましいことであ
る。 本発明の目的は、廃水流から芳香族ヒドロキシ
化合物または芳香族アミンを除去する改良された
方法を提供することである。 本発明の他の特徴、目的および利点は、本明細
書および特許請求の範囲から明らかになるであろ
う。 本発明において、発明者は、水溶性芳香族ヒド
ロキシ化合物および（または）芳香族アミンが、
これらを含有する廃水を、パーオキシダーゼとア
ルコールオキシダーゼおよび直鎖C₁〜C₄アルコ
ール、またはグルコースオキシダーゼおよびグル
コースから成る群から選ばれる少なくとも１種の
薬剤とで処理することによつて芳香族ヒドロキシ
化合物および芳香族アミンを含有する廃水本体か
ら効率的かつ経済的に除去できることを発見し
た。 このような方法で廃水を処理することによつ
て、H₂O₂がその場所で連続的に生成され、それ
によつてH₂O₂の貯蔵不安定性の問題が回避でき、
しかも、アルコールオキシダーゼまたはグルコー
スオキシダーゼ、それらの個々の基質および酸素
間の反応によつてH₂O₂の一定の供給源が確保さ
れる。 本発明において、芳香族ヒドロキシ化合物の語
は、OH基が芳香核または置換芳香核に結合して
いる化合物と定義する。芳香核は、フエノールの
ような単一芳香族化合物または２−ナフトールの
ような多核芳香族化合物のいずれでもよい。芳香
核の好適な置換基の例には、OH，SH，OR，
SR，RSO，RSO₂（式中、ＲはC₁〜C₂₀ヒドロカ
ルビル基である）、C₁〜C₂₀ヒドロカルビル基自
体、ハロゲン、SO₃M（式中、Ｍは水素または第
Ａ族金属である）、アミド、アミン、カルボン
酸およびシアノ官能基が含まれる。 かような芳香族ヒドロキシ化合物の代表的例に
は、フエノール、グアヤコール、クレゾール、レ
ソルシノール、クロロフエノール、アミノフエノ
ール、2′，7′−ジクロロフルオレセイン、５，７
−ジクロロ−８−ヒドロキシキノリン、１，８−
ジヒドロキシアントラキノン、２，４−ジヒドロ
キシ−５，６−ジメチルピリミジン、４，６−ジ
ヒドロキシ−２−メルカプトピリミジン、３，６
−ジヒドロキシピリダジン、４，８−ジヒドロキ
シキノリン−２−カルボン酸、２，３−ジヒドロ
キシキノキサリン、１，５−ジヒドロキシ−１，
２，３，４−テトラヒドロナフタレン、２−（ジ
メチルアミノメチル）−３−ヒドロキシピリジン、
１−ナフトール、１，３−ナフタレンジオール、
１，２−ニトロソ−１−ナフトール、２，７−ナ
フタレンジオール、ｐ−フエニルフエノール、５
−インダノール、および８−ヒドロキシキノリン
が含まれる。 本発明で使用される芳香族アミンの語は、芳香
核または置換芳香核に第一アミン基が結合されて
いるアミンをいう。芳香核は、アニリンの場合の
ように単一芳香核または１−アミノナフタレンの
場合のように多核のいずれでも良い。芳香核上の
可能性のある置換基の例は、芳香族ヒドロキシ化
合物で前記に示したものと同じである。 かような芳香族アミンの代表的の例には、アニ
リン、ベンジジン、４−クロロアニリン、４−ブ
ロモアニリン、４−フルオロアニリン、４−ブロ
モ−２−メチルアニリン、ｍ−フエニレンジアミ
ン、Ｎ（１−ナフチル）エチレンジアミン、１−
アミノナフタレン、２−アミノナフタレン、エチ
ジウムブロマイド、６−ヒドロキシ−２，４，５
−トリアミノピリミジンサルフエート、N′−（６
−インダゾリル）スルフアニルアミド、5′−ヨー
ド−5′−デオキシアデノシン、ｏ−ジアニシジ
ン、３，3′−ジアミノベンジジン、３，3′−ジク
ロロベンジジン、ｏ−トリジン、ｐ−フエニルア
ゾアニリン、４−アミノフエノール、１−ナフチ
ルアミン、２−ナフチルアミンおよび５−ニトロ
−１−ナフチルアミンが含まれる。 除去される芳香族ヒドロキシ化合物または芳香
族アミンは、いずれも一般に、少なくとも約0.01
mg／ｌ、好ましくは少なくとも約0.05mg／ｌの水
への溶解度がなければならない。 パーオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼ酵素は、セントルイ
ス市、シグマケミカル社（Sigma Chemical
Company）のような生物学的薬剤供給商社から
商業的に入手できる。 本発明で使用されるアルコールオキシダーゼ
は、H₂O₂に対して感受性が低いことで公知のピ
チアパストリス（Pichia pastoris）から精製す
るのが好ましい。使用する精製アルコールオキシ
ダーゼは、カタラーゼ活性が本質的に無いものが
好ましい。 本発明で使用されるグルコースオキシダーゼ
は、アスペルギルス ニガー（Aspergillus
niger）から精製される。 パーオキシダーゼ酵素の好適な供給源は、植
物、動物および微生物源である。セイヨウワサビ
（horse radish）パーオキシダーゼ、チユーリツ
プパーオキシダーゼ、海草パーオキシダーゼ、カ
ルダリオマイセス フマゴ（Caldariomyces
fumago）から単離されるようなクロロパーオキ
シダーゼ、哺乳動物のミルクから単離されるよう
なラクトパーオキシダーゼも含まれる。 本発明に有用なアルコール基質は、直鎖C₁〜
C₄アルコールである。最も普通に使用されるの
はメタノールとエタノールとであり、メタノール
が最も好ましい。 グルコースオキシダーゼ用の基質には、デキス
トロースとしても公知のβ−Ｄ−グルコースであ
る。 さらに、グルコースオキシダーゼ基質は、適当
な加水分解酵素と組合せて前駆体炭水化物を使用
することによつて間接的に反応混合物中に供給す
ることもできる。例えば、デンプンは、アミラー
ゼおよびグルコアミラーゼの存在下でグルコース
に転化でき、蔗糖は、インベルターゼの存在下で
グルコースとフラクトースとに転化でき、乳糖
は、ラクターゼの存在下でグルコースとガラクト
ースとに転化でき、セルロースは、セルラーゼの
存在下でグルコースに転化できる。 水本体に添加されるパーオキシダーゼおよびオ
キシダーゼ酵素の量は、一般に存在する芳香族ヒ
ドロキシ化合物または芳香族アミンの濃度によつ
て決まる。最終的に発生することができるH₂O₂
の量は供給される基質の量によつて限定されるか
ら、さらに重要な変数は、使用されるオキシダー
ゼ酵素基の量にあるようである。従つて、処理す
べき溶液中の芳香族ヒドロキシ化合物または芳香
族アミンの濃度が高ければ、それに応じてオキシ
ダーゼ基質の使用量を多くするのが好ましい。反
応混合物へのこれら薬剤の添加の順序は、本発明
では重要とは見做されない。 次表に、有効であると考えられている廃水1l当
りの薬剤の範囲を示す： 【表】 酵素単位（Ｕ）は、標準条件下で１分当り基質
1μモルの変換の触媒作用をする酵素の量として
表わされる。いかなる濃度の薬剤を使用するにし
ても、存在する芳香族ヒドロキシ化合物および
（または）芳香族アミン全部または本質的に全部
を効果的に除去するのに十分な量でなければなら
ない。 本発明の現在の好ましい態様では、パーオキシ
ダーゼとアルコールオキシダーゼまたはグルコー
スオキシダーゼのいずれかとの濃厚な原溶液にア
ジ化ナトリウムが添加される。アジドイオンは、
蛋白質との物理的相互作用によつて酵素を安定化
させる。従つて、本発明におけるアジ化ナトリウ
ムの使用は、パーオキシダーゼとアルコールオキ
シダーゼまたはグルコースオキシダーゼのいずれ
かとの組合せを安定化させる作用とするものと考
えられる。一般に濃厚な原溶液中のNaN₃は、約
100〜約500を超えるmg／ｌ、好ましくは約200
mg／ｌの量で存在する。廃水に濃厚な酵素原液を
添加するとアジド塩は著しく希薄になり、もはや
酵素に対する制菌性または阻害剤としての作用は
ない。 反応温度は、一般に０℃〜約50℃、好ましくは
20℃〜45℃でなければならない。 この反応は、一般に、約４〜11、好ましくは約
６〜10の範囲内のPHで行うべきである。 一般に、反応または処理時間は、約５分〜約48
時間であろう。 一般に、この反応は、撹拌または溶液に気泡を
通して通気しなければならない。 反応の終りで、沈殿した芳香族ヒドロキシ化合
物または芳香族アミンを濾過、遠心分離、沈降、
フローテーシヨンなどのような慣用の方法でこれ
ら沈殿を含有する廃水から分離してもよい。この
重合した最終生成物は、無毒のようであるから、
これらを処理廃水流中に残しておいてもよい。 本発明の実施に当つて固定化酵素でも作業でき
る。パーオキシダーゼおよびオキシダーゼは固定
化することができ、これを流通反応装置に装填
し、この中を処理すべき流体を通過させる。かよ
うな作業方式は、連続的の廃水処理および酵素の
再用が可能である。 次の実施例によつて本発明をさらに説明する。 実施例 アルコールオキシダーゼの製造および精製 連続式好気醗酵法において、酵母種、ピチアパ
ストリスNRR Ｙ−11430株が接種されている醗
酵槽へ、それぞれ約40：60の容積比でメタノール
と水性無機塩培養基とを別々に、メタノールが生
長限定因子になるような速度で供給した。この醗
酵槽は、1500l泡充填醗酵槽で、液体容積は約
610lであり、自動的のPH、温度および水準コント
ロール付であつた。1000rpmの２基のパドル型タ
ービンによつて撹拌された。通気速度は、醗酵槽
中の酵素の容積当り毎分約４容積の空気（約
38psiおよび約25℃）であつた。醗酵混合物のPH
を約3.5に維持するような割合で無水アンモニア
を添加した。 水性無機塩培養基は、各1lの水道水に、15.86
mlの75％H₃PO₄、9.53ｇのK₂SO₄、7.8ｇの
MgSO₄・7H₂O、0.6ｇのCacl₂・2H₂Oおよび2.6
ｇの85％KOHを混合して製造した。痕跡無機物
溶液プラスビチオンは、メタノール1l当り10mlの
割合でメタノール流を通して別に供給した、痕跡
無機物溶液プラスビオチンは、780mlの痕跡無機
物溶液、20mlの水、200mlのメタノールおよび
0.032ｇのビオチンを混合して製造した。 痕跡無機物溶液は、溶液各1l毎に、65ｇの
FeSO₄・7H₂O、20ｇのZnSO₄・7H₂O、3.0ｇの
MnSO₄・H₂O、6.0ｇのCuSO₄・5H₂O、5.0mlの
濃H₂SO₄および1lの溶液になるに十分な脱イオン
水を混合して製造した。 水性無機塩培養基は、31.5l／時間で、メタノ
ールは21l／時間の割合で供給した。 醗酵は、約30℃、および約38psigの圧力で、醗
酵時間11.6時間行つた。 分析目的用として、得られた酵母細胞を遠心分
離によつて醗酵流出物（酵素）から分離し、水に
懸濁して洗浄し、再び遠心分離し、100℃で一晩
乾燥させ、秤量した。乾燥物に基づいて、酵母細
胞の収量は、典型的に約40.6ｇ／供給された100
ｇメタノールであつた。細胞密度は、約128.4ｇ
細胞／ｌ醗酵槽流出物であつた。酵素の固形物含
量は、典型的に約134.7ｇ／ｌ細胞＋溶解固形物
であつた。醗酵槽流出物の一部は凍結させ、貯蔵
した。 ピチア パストリスNRRL Ｙ−1140株の醗酵
は、典型的な方法である前記の方法で行つた。醗
酵槽流出物の一部を取出し、水酸化アンモニウム
でPH7.5に調整し、0.6l容器を使用するダイノミル
（Dyno−Mill）モデルKDLで、＃３ベルト組
合せを使用する30℃の連続運転および20〜30ml／
時間の流量で均質化した。前記ミル中のビーズ
は、直径0.3〜0.5mmの無鉛ガラスビーズであつ
た。得られたホモジネート（homogenate）を５
℃および20000×ｇで30分遠心分離し、無細胞の
上澄液を得た。下記に説明する染料−パーオキシ
ダーゼ法によつて測定した前記の無細胞上澄液の
酵素活性度は、約330EU／mlであつた。この上澄
液は将来使用するために冷凍貯蔵した。前記が、
粗酵母ホモジネートの製法の説明である。 ６個の各130ml部の上澄液を酢酸セルロース透
析袋中に入れ、５℃で約8lの蒸留水に対して透析
した。４日後、各袋の水相をデカントした。袋中
に残つた固体は二種の固体から成つた。うすい上
部の白色層を慎重に除去して捨てた。下部の層
は、黄かつ色であり、結晶アルコールオキシダー
ゼであつた。このアルコールオキシダーゼの一部
を蒸留水（固体の約10倍容の）に溶解し、下記の
染料−パーオキシダーゼ法による効力検定によつ
て94EU／mlの活性度を示した。アルコールオキ
シダーゼの比活性度は、10.4EU／mg蛋白質であ
つた。 前記の固体アルコールオキシダーゼ試料を、
SDSゲル電気泳動法によつて検査し、単一バンド
が観察されたことは均質な純粋酵素であることを
示している。電気泳動移動度を既知の分子量の蛋
白質と比較すると約72000±3000（概算）の亜単位
（subunit）分子量を示す。以上がピチア パスト
リスからの純粋な酵母アルコールオキダーゼの製
法の説明である。 メタノールとの反応のためのアルコールオキシ
ダーゼ活性度は、染料−パーオキシダーゼ法によ
つて測定した。0.1mlのｏ−ジアニシジン溶液
（水中の１重量％のｏ−ジアニシジン）と12mlの
曝気した0.1M燐酸ナトリウム緩衝液（PH＝7.5）
とを混合して染料−緩衝液混合物を製造した。検
定混合物は、2.5mlの染料−緩衝液混合物、50μl
のメタノール、10μlのパーオキシダーゼ溶液（１
mgのセイヨウワサビパーオキシダーゼ−シグマ、
タイプ）および25μlのアルコールオキシダーゼ
溶液とで調製した。検定混合物は、25℃で４×１
×１cmのキユーベツト（cuvette）中に維持し、
460nmにおける染料の吸光度の増加を２〜４分間
記録した。酵素活性度は、 活性度（μモル／分／mlまたは酵素単位／ml）
＝△Ａ／分×11.5 （式中、11.5は、既知アリコートのH₂O₂で作
製した標準曲線に基づく係数であり、△Ａは、実
験間の吸光度の変化である）の式によつて計算し
た。 実施例 フエノールを含有する廃水の従来技術による処
理を次のように繰返した。250mlのビーカーに、
100mlの50ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液（PH
3.5または5.5）または100mlの10ミリモルの燐酸
カリウム緩衝液（PH＝7.5）、１mlのセイヨウワサ
ビのパーオキシダーゼ（100u／ml）、10μlの水を
飽和させたフエノールまたはグアイアコール（２
−メトキシフエノール）および10μlの30％水性
H₂O₂を装填した。混合物を、撹拌せずに室温で
３時間温置した。気−液クロマトグラフイー
（glc）でフエノールの除去率を測定し、その結果
を下記に示す。 【表】 H₂O₂の代りに、アルコールオキシダーゼプラ
スアルコールを使用し、同様な混合物を1000mlビ
ーカー内で調製した。100mlの50ミリモルの燐酸
カリウム緩衝液（PH＝7.5）、１mlのセイヨウワサ
ビパーオキシダーゼ（1000U／ml）、10μlのグア
ヤコール、100μlのアルコールオキシダーゼ
（AO）溶液（1000U／ml）、および100μlのメタノ
ールまたはエタノールを混合し、次いで、室温で
３時間撹拌した。フエノールの除去率を上記のよ
うに測定した。３時間後のグアヤコールの除去率
は、メタノールまたはエタノールのいずれを使用
したときも本質的に定量的（〜100％）であつた。 これらの実験結果は、本発明の廃水処理法が、
従来技術による酵素処理方法と少なくとも同じ効
果があることを証明している。 実施例 芳香族ヒドロキシ化合物の除去率に及ぼすアル
コールオキシダーゼの効果を検討した。100mlの
50ミリモル燐酸カリウム緩衝液（PH＝7.5）、１ml
のパーオキシダーゼ（100U／ml）、10μlのフエノ
ール（水で飽和）またはグアヤコールおよび
100μlのメタノールを1000mlのビーカー中に含有
する標準混合物を、所定量のアルコールオキシダ
ーゼ（1000U／ml合計）で処理し、次いで、ガス
クロマトグラフイーでフエノールまたはグアヤコ
ール除去率を測定する前に室温で３時間撹拌し
た。 【表】 これらの実験結果は、本発明の方法が水性溶液
からグアヤコールのような芳香族ヒドロキシ化合
物の除去用としての有効性を証明している。非常
に低水準のアルコールオキシダーゼ（〜1UAO／
100ml溶液）ですら芳香族ヒドロキシ化合物の除
去が達成できる。 実施例 水性溶液からの芳香族ヒドロキシ化合物の除去
速度を、次の薬剤混合物を用いて時間の函数とし
てのグアヤコールの消失を追跡して試験した： 10μlのグアヤコール 100mlの50ミリモル燐酸カリウム緩衝液（PH＝
7.5） １mlのセイヨウワサビパーオキシダーゼ
（100U／ml） 5μlのアルコールオキシダーゼ（1000U／ml） 100μlのメタノール 1000mlビーカー中のこの混合物を室温で撹拌
し、グアヤコールの消失を、ときどきガスクロマ
トグラフイーで監視した。 【表】 これらの実験結果は、本発明の方法による芳香
族ヒドロキシ化合物の除去が極めて迅速であり、
僅か12分（試料２）でグアヤコールの半分以上が
除去され、僅か１時間後（試料４）には本質的に
完全にグアヤコールが除去されたことを示してい
る。 実施例 本発明の廃水浄化方式の効率に及ぼすPHの影響
を広範囲のPHで検討した。1000mlビーカーに、 10μlの水で飽和させたフエノール 100μlのメタノール 200μlのアルコールオキシダーゼ（1000U／ml） １mlのセイヨウワサビパーオキシダーゼ
（100U／ml）および、 100mlの50ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液
（PH４〜６）または、 100mlの50ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH
７〜11） を装填した。 各種の混合物を室温で３時間撹拌し、ガスクロ
マトグラフイーでフエノール除去率を監視した。 【表】 【表】 これらの実験結果は、本発明の廃水処理方法
が、４〜11のPH範囲に亘つて有効なことを証明し
ている。６〜10のPH範囲で特に良結果が得られて
いる。PH＝10では、パーオキシダーゼ、メタノー
ルおよびアルコールオキシダーゼの存在下で最大
の粒径に集合した固体が形成されたことは、固体
除去が望ましい場合の好ましいPHが示されてい
る。 実施例 100mlの50ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH
＝7.5）、 １mlのセイヨウワサビパーオキシダーゼ
（100U／ml）、 200μlのアルコールオキシダーゼ（1000U／
ml）、 10μlのグアヤコール を含有する1000mlビーカー中に種々の量のメタノ
ールを添加して、芳香族ヒドロキシ化合物除去率
に及ぼすメタノール濃度の影響を検討した。 得られた混合物を、室温で３時間撹拌し、次い
で、グアヤコール除去率をガスクロマトグラフイ
ーで監視した。 【表】 僅か10μlのアルコールオキシダーゼを使用して
上記実験を繰返した。 【表】 これらの実験結果は、本発明の廃水処理法で
は、メタノールのようなアルコールの非常に低水
準の存在によつて芳香族ヒドロキシ化合物の効果
的の除去ができることを示している。フエノール
化合物を含有する100mlの水に、僅か10μlのアル
コールオキシダーゼと5μlのメタノールとを添加
しただけで98％以上のグアイアコールの除去率が
観察された。 実施例 芳香族ヒドロキシ化合物の除去効率に及ぼすパ
ーオキシダーゼ濃度の影響を検討した。1000mlの
ビーカーに、100mlの50ミリモルの燐酸カリウム
緩衝液（PH＝7.5）、10μlのアルコールオキシダー
ゼ（1000U／ml）、10μlのメタノール、10μlのグ
アイアコールまたはフエノールおよび０〜１mlの
パーオキシダーゼ（100U／ml）を装填した。混
合物を、室温で３時間撹拌して、次いで、芳香族
ヒドロキシ化合物の消失をガスクロマトグラフイ
ーで監視した。 【表】 これらの実験の結果は、非常に低水準のセイヨ
ウワサビパーオキシダーゼ、すなわち、芳香族ヒ
ドロキシ化合物を含有する溶液100ml当り25μlと
いう低い水準を使用しても芳香族ヒドロキシ化合
物が効果的に除去されることを示している。グア
ヤコールの除去用としては、約100U／ml、フエ
ノール除去用としては約1000U／mlのセイヨウワ
サビパーオキシダーゼを使用してすぐれた結果が
得られている。 実施例 本発明の廃水処理方法の１−ナフトールとベン
ジジンへの適用性を検討した。1000mlのビーカー
に、100mlの50ミリモルの燐酸カリウム緩衝液
（PH＝7.5）、10mgの１−ナフトールまたはベンジ
ジンを含有するメタノール100μlおよび下記の量
のセイヨウワサビパーオキシダーゼ溶液
（100U／ml）およびアルコールパーオキシダーゼ
溶液（1000U／ml）を装填した。試料を室温で７
時間撹拌した。１−ナフトールの除去は、ガスク
ロマトグラフイーで監視し、ベンジジンの除去は
試料の280nmにおける吸光度を測定し、標準曲線
と比較して監視した。 【表】 これらの実験の結果は、本発明の廃水処理方法
が、１−ナフトールおよびベンジジンのような水
中の各種の化合物の除去に有効であることを証明
している。これに加えて、これらの実験は、
10μl／100mlの低水準のアルコールオキシダーゼ
（または処理すべき水1l当り約10酵素単位）およ
び約50μl／100mlの低水準のパーオキシダーゼ
（または処理すべき水1l当り約50酵素単位）も使
用できることを示している。 実施例 100mlの50ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH
＝7.5）、 100μlのアルコールオキシダーゼ（1000U／ml） 100μlのセイヨウワサビパーオキシダーゼ
（100U／ml） 100μlのメタノール、 10mgのベンジジン を含有する溶液からベンジジンの消失を測定する
ことによつて、水性溶液からのベンジジンの除去
速度を検討した。 この溶液は、1000mlのビーカー中で室温で撹拌
した。ベンジジン除去の達成率を測定するため周
期的に試料を採取してUV測定をした。 【表】 これらの実験結果は、本発明の廃水処理方法に
よつてベンジジンのような芳香族アミン化合物の
実質的の量が迅速に、すなわち、わずか５分で70
％以上が除去されることを示している。 実施例 セイヨウワサビパーオキシダーゼプラスH₂O₂
を使用して、従来技術の廃水処理方法の効率に及
ぼす添加メタノールとホルムアルデヒドとの影響
を検討した。1000mlのビーカーに、100mlの50ミ
リモルの燐酸カリウム緩衝液（PH＝7.5）、１mlの
セイヨウワサビパーオキシダーゼ（100U／ml）、
10μlのフエノールおよび下記に示す種々の添加剤
を装填した。この溶液を、室温で３時間撹拌し、
次いで、フエノールの消失をガスクロマトグラフ
イーで検定した。 【表】 試料４は、メタノールとアルコールオキシダー
ゼとの添加によつて現場でH₂O₂が生成され、そ
の結果、最高のフエノール除去率になつたことを
示す。従来技術の廃水処理法に相当する試料１で
はH₂O₂を直接添加した。試料２と３とは、H₂O₂
と組合せてホルムアルデヒドおよびメタノールだ
けの廃水処理工程への添加は、不利な影響（試料
２）または有利な影響を及ぼすが、それでもなお
本発明の方法によつて達成される結果（試料４）
より低いことを示す。 実施例 XI 従来技術の廃水処理方法に、メタノールおよび
ホルムアルデヒドの添加の影響を測定するために
追加実験を行つた。100mlの10ミリモル燐酸カリ
ウム（PH＝7.0）、10μlのフエノール、100μlのセ
イヨウワサビパーオキシダーゼおよび下記に示す
追加薬剤を含有する1000mlのビーカーを、室温で
３時間撹拌し、次いで、フエノールの消失をガス
クロマトグラフイーで検定した。 【表】 試料２が従来技術の廃水処理法に相当する。実
施例で分かるように、ホルムアルデヒドの添加
は、その方法の効率にわずかに不利な影響を与
へ、メタノールの添加は、その方法の効率にわず
かな有利な影響を与える。しかし、実験５は、単
にメタノールおよびホルムアルデヒドの添加だけ
では、全処理工程に負の影響を与えることを示し
ている。実験５とメタノールとアルコールオキシ
ダーゼとを添加し、それによつて反応混合物中に
HCHOとH₂O₂とを生成させた実験６とを比較さ
れたい。観察されたフエノールの除去率％は、従
来技術方式と他の任意の薬剤との組合せより高い
値を示す。 実施例 XII 本発明の廃水処理方法用の好適な薬剤パツクに
は、防腐剤および酵素安定剤が含まれることが好
ましい。次の実験は、NaN₃のようなアジド化合
物が、酵素を不可逆的に抑制することなくアルコ
ールオキシダーゼ／セイヨウワサビパーオキシダ
ーゼの酵素組合せを保存するのに使用できること
を証明する。0.02重量％のNaN₃を含有する試料
とNaN₃を含有しない試料の二種の試料について
実験例１に記載の染料−パーオキシダーゼ効力検
定を行つた。前記の二種の試料の吸光度△Ａの変
化は、本質的に同じであつた（NaN₃の存在下で
53.8、NaN₃の不存在で54.0であつた）。 この実験は、アジ化ナトリウムが、アルコール
オキシダーゼ／パーオキシダーゼの酵素組合せの
可逆的抑制剤であること示している。 実施例 本発明の廃水処理方法を、フエノール除去用と
して細菌法と比較した。４基の反応器セル（300
ml）に、35mg／ｌのフエノールを含有する100ml
の溶液を装填した。これらのセルをさらに次のよ
うに、 劇しい空気吹込のみ、 パーオキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、メタノールおよび劇しい空気吹込み、 (ii)にプラス3.5mg／ｌのフエノールの連続供
給に順化させた細菌の接種、 (iii)で使用した細菌の接種と劇しい空気吹込
み、 で処理した。 パーオキシダーゼとアルコールオキシダーゼと
は、処理すべき溶液1l当り安定化した酵素溶液
｛1000Uのアルコールオキシダーゼ、1000Uのセ
イヨウワサビパーオキシダーゼおよび２mgの
NaN₃を10mlの50ミリモル燐酸カリウム緩衝液
（PH7.5）中に含む｝１mlの割合で(ii)と(iii)とに添加
した。メタノールは、0.1ml／ｌ処理すべき溶液
の割合で別に添加した。 前記の４種の試料を室温で３時間劇しく空気を
吹込み、次いで、フエノールの分析を行つた。 【表】 これらの実験の結果は、本発明の廃水処理方法
が、シユミレートした廃水流（試料２参照）から
フエノールを効果的に除去することを示してい
る。比較的低濃度のフエノール不純物中で生育す
るよう順化させた細菌が、試験した時間内では比
較的効果が無かつたことに注意されたい。さら
に、本明細書で開示した酵素処理と細菌との組合
せによるフエノール除去率は、本発明の方法が、
変動する廃水不純物を処理するのに好適な手段で
あるのに匹敵する方法であることが分かる。 実施例 XI 本発明の廃水処理方法と従来技術の方法との比
較を次のように行つた。1000mlのビーカーに、 100mlの50ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH
＝7.5）、 １mlのセイヨウワサビパーオキシダーゼ
（100U／ml）、 10μlの水で飽和したフエノール、および、 400μlの30％H₂O₂または、 100μlのメタノールプラス 100μlのアルコールオキシダーゼのいずれか を装填した。 活性度既知のアルコールオキシダーゼに基づい
て、使用したメタノール−アルコールオキシダー
ゼの組合せの量を、室温で１時間に400μlの30％
H₂O₂の当量を発生できるよう計算した。二種の
試料H₂O₂の当量を、直接（従来技術）または間
接（現場で発生）に添加した。各溶液を、室温で
１時間撹拌し、次いで、フエノールの消失を検定
した。従来技術の試料（H₂O₂の直接添加）は、
フエノール除去率50％を示したが、本発明処理
（H₂O₂の現場発生）では同じ処理時間で本質的に
定量的のフエノール除去率を示した。 これらの実験の結果は、パーオキシダーゼの存
在下でH₂O₂の直接添加に比較してH₂O₂の現場発
生による芳香族ヒドロキシ化合物の除去効率を驚
異的に向上させることを示している。 実施例 本発明の廃水処理方法を、パーオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼおよび好適な基質を使用
して行つた。1000mlのビーカーに、 100mlの0.02N酢酸ナトリウム緩衝液（PH＝
5.5）、 100Uのパーオキシダーゼ（シグマケミカル社、
タイプ）、 130Uのグルコースオキシダーゼ（シグマケミ
カル社、タイプ）、 10μlのグアヤコール を装填した。 一つの実験では、グルコースオキシダーゼ用の
基質として0.5ｇのＤ−グルコースを使用したが、
他の実験では、グルコースオキシダーゼ用の基質
として１ｇの蔗糖および370Uのインベルターゼ
（シグマケミカル社）を使用した。両試料を室温
で３時間撹拌し、次いで、グアヤコールの除去率
を試験した。両試料共に、本質的に定量的グアヤ
コール除去が達成された。 これらの実験結果は、本発明の廃水処理方法
が、H₂O₂の現場発生用としてグルコースオキシ
ダーゼプラスグルコースまたはグルコース前駆体
を使用できることを示している。 実施例 グルコースオキシダーゼ濃度が、芳香族ヒドロ
キシ化合物の除去率に及ぼす影響を検討した。各
種量のグルコースオキシダーゼ（130U／ml）を、 100mlの20ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液
（PH＝5.5）、 １mlのパーオキシダーゼ（100U／ml）、 10μlのグアヤコール、 0.5ｇのＤ−グルコース、 から成る標準混合物を含有する1000mlビーカーに
添加した。グアヤコール除去率をガスクロマトグ
ラフイーで測定する前に、この溶液を室温で１時
間撹拌した。 【表】 これらの実験の結果は、本発明の方法が、水性
溶液からグアイアコールのような芳香族ヒドロキ
シ化合物の除去用として有効であることを示して
いる。グルコースオキシダーゼ濃度が、処理すべ
き溶液1l当り約50Uと低くてもすぐれたグアイア
コール除去率が達成される。 本発明の精神および範囲を逸脱することなく前
記の開示から合理的変法および改良が可能であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水への溶解度が、少なくとも約0.01mg／ｌで
   ある芳香族ヒドロキシ化合物および（または）芳
   香族アミンを含有する水からこのヒドロキシ化合
   物及び（又は）アミンを除去する方法において、
   前記の水をパーオキシダーゼおよび、アルコール
   オキシダーゼと直鎖C₁〜C₄アルコールとの組合
   せ、またはグルコースオキシダーゼとグルコース
   との組合せとで処理することを特徴とする、上記
   処理方法。 ２ 芳香族ヒドロキシ化合物または芳香族アミン
   の水への溶解度は少なくとも約0.05mg／ｌであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記のアルコールが、メタノールである特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４ アルコールはエタノールである、特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の方法。 ５ 芳香族ヒドロキシ化合物はグアヤコールであ
   る、特許請求の範囲第１〜第４項の任意の１項記
   載の方法。 ６ 芳香族ヒドロキシ化合物はフエノールであ
   る、特許請求の範囲第１項〜第４項の任意の１項
   記載の方法。 ７ 芳香族アミンはベンジジンである、特許請求
   の範囲第１項〜第４項の任意の１項記載の方法。 ８ 芳香族アミンはアリニンである、特許請求の
   範囲第１項〜第４項の任意の１項記載の方法。 ９ 約０℃〜約50℃の温度で処理する、特許請求
   の範囲第１項〜第８項の任意の１項記載の方法。 １０ 約５〜約10のPHで処理する、特許請求の範
   囲第１項〜第９項の任意の１項記載の方法。 １１ 約５分〜約48時間で処理する、特許請求の
   範囲第１項〜第１０項の任意の１項記載の方法。 １２ パーオキシダーゼ、アルコールおよびアル
   コールオキシダーゼは水1l当りそれぞれ0.1〜
   10000酵素単位、５〜10000mgおよび0.1〜10000酵
   素単位の量で存在しかつ表示する、特許請求の範
   囲第１〜第１１項の任意の１項記載の方法。 １３ パーオキシダーゼ、アルコール、およびア
   ルコールオキシダーゼは水1l当りそれぞれ、10〜
   1000酵素単位、25〜750mgおよび10〜1000酵素単
   位の量で表示しかつその量で存在する、特許請求
   の範囲第１項〜第１２項の任意の１項記載の方
   法。 １４ パーオキシダーゼ、グルコースおよびグル
   コースオキシダーゼの量は水1l当りそれぞれ0.10
   〜10000酵素単位、５〜10000mgおよび0.1〜10000
   酵素単位の量で表わし、かつ、その量で存在す
   る、特許請求の範囲第１〜第１１項の任意の１項
   記載の方法。 １５ パーオキシダーゼ、グルコースおよびグル
   コースオキシダーゼの量は水1l当り、それぞれ10
   〜1000酵素単位、25〜750mgおよび10〜1000酵素
   単位で表わし、かつ、その量で存在する、特許請
   求の範囲第１〜第１１項の任意の１項記載の方
   法。 １６ アジ化ナトリウムを追加的に添加する、特
   許請求の範囲第１項〜第１５項の任意の１項記載
   の方法。