JPH01190634A - コクシジウムスポロゾイトを使用するコクシジウム症に対する生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １、序論 本発明は、コクシジウムスポロゾイトの生命力または寿
命を大いに長引かせる安定化キャリアー中に懸濁され、
マイクロカプセル化された生きている脱錫コクシジウム
スポロゾイトを利用して、温血動物にコクシジウム症に
対するワクチンを接種する方法、並びにそのための組成
物に関する。

より詳細には、水溶性高分子安定剤を含み、全ての成分
の等張性およびｐＨＫ関して生理学的に平衡化された水
性組成物がスポロゾイトの懸濁用媒体およびキャリアー
として使用される。水溶性高分子安定剤はゲル、ゼラチ
ン、セルロース、セルロース誘導体および多糖ガム（特
に水溶性アルギン酸塩）と類別される。好ましくは、水
溶性高分子安定剤を含むこれらのスポロゾイト懸濁体は
初めに微細に分割され、その後粒子の表面を硬化させて
、安定化水性媒体中のスポロゾイトの懸濁体を内相とし
て含むマイクロカプセルが形成される。

２、発明の背景 ２．１　　コクシジウム原生動物の生物学および生活環 コクシジウム原生動物は大部分の温血動物８１に感染し
てそれらの胃腸管に寄生し、そして動物がおりに入れら
れて密飼い状態にある場合には最も頻繁に最もひどく感
染症が発生する。大抵は、動物宿主種に対して特定的な
コクシジウム種により感染が起こり、１種より多いコク
シジウム稲が所定の動物種に感染する。例えば、７種類
の主要なコクシジウム種はニワトリに感染することが知
られている。

コクシジウム寄生虫の生活環（ライフサイクル）はいく
つかの複雑な段階を伴う。自然条件下において、そのラ
イフサイクルは同一種の別の動物からの胞子形成オーシ
スト（ｏｏｃｙｓｔ）が分散した糞便を宿主動物が経口
摂取することから開始される、その後、胞子形成オーシ
ストの外被は宿主動物の消化系の作用により破壊される
。例えば、宿主動物がニワトリである１合、胞子形成オ
ーシストの外被は機械的に破壊されて初めにスポロシス
ト（ｓｐｏｒｏｃｙａｔ）を放出し、その後生化学的に
破壊されて最終的な伝染性生物のスポロゾイトを放出す
る。約７日以内で再発生に従うこのライフサイクルの他
の段階はシゾントＩ、メロゾイトＩ、シゾン）ＩＩ、メ
ロシイ）ＩＩ、生殖母細胞、配偶子、およびオーシスト
形成による生活環の完結を包含する。

さらに詳しく説明すると、ニワトリの例では、重要なア
イメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）　１１の１つ、すなわちア
イメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）
、Ｋよる自然感染が圧倒的多量の胞子形成オーシストの
摂取により開始される。胞子形成Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ
オーシストはそれぞれ４つのスポロシストを含み、各ス
ポロシストは２つのスポロゾイトを含む。胃において、
胞子形成オーシストは破壊されてスポロシストを放出す
る、スポロゾイトは酵素の作用によりスポロシストから
放出されて消化管を下り、最終的に盲腸嚢に到達し、そ
こでそれらは盲腸粘膜の上皮細胞に入って無性生殖サイ
クルを開始する。上記ライフサイクルの完結の細部につ
いては当分野でよく知られている、 本発明における生きたスポロゾイトによるワクチン接種
の論理的根拠は、動物（例えばニワトリ）の成長を遅ら
せることなく、その動物の誕生の初めの数日間に低いレ
ベルの感染（無症状）を起こさせることである、このよ
うＫして確立された無症状の感染は免疫を誘発する。一
方宿主（例えばニワトリ）は母性抗体によりもたらされ
る受動保護の利点を有している、母性抗体はまた感染を
弱めるのに役立ち、従って動物飼養舎中の不必要な寄生
虫の蓄積を減少させるのに役立つ。このことは、この病
気の症状が環境から宿主によって摂取される胞子形成オ
ーシストの数に直接比例するので、ワクチンの成功にと
って大変重要なことである。フィールド冷性下において
、ニワトリは例えば母性抗体が第３週目までに極めて低
レベルに減少し、もしもそれらの免疫系がワクチン接種
によって訴起されない場合には、寄生虫に感染しやすく
なる。ワクチンを接種していない宿主が遭遇するチャレ
ンジは、特に密飼い状態の動物集団に対してしばしば破
壊的であり、死または疾病および／または発生もしくは
成長の低下をもたらし、その結果動物飼養業者に経済的
損失を与える。

２．２　　従来の関連ワクチン 英国特許第２００８４０４号は、家禽にコクシジウムの
生きている胞子形成オーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）を与え
ることによって家禽の成長を促進する方法を開示してい
る。同様に、米国特許＠３１４７１８６号は、ニット７
ノが生きている胞子形成オーシストによって盲腸コクシ
ジウム症に対して免疫化された旨開示している。

被嚢した生存原生動物（例えばコクシジウム）を含有す
る、経口投与用の免疫抗原性のある組成物が英国特許出
願第２１４４３３１Ａ号に開示されており、この場合に
は硬質ゲルマド＋７ツクス中に埋入された被嚢した胞子
形成コクシジウムオーシストまたは被嚢したコクシジウ
ムスポロシスト（Ｓｐｏｒｏｃｙｓｔ）がふ化したばか
りのヒヨコのような宿主動物に経口投与された。アルギ
ン酸化合物系のゲルがマトリックスとして用いられた。

シ＋ルマ（Ｓｈａｒｍａ、Ｎ、Ｎ、）は、Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、
　５０．　／１６４（１９８４）　ｐ−５０９−５１７
の中で、胞子形成した生存コクシジウムオーシストを用
いた免疫感作実験、あるいはコクシン・・ジウムのオー
シストおよびスポロシストと共にスポロゾイトを含むと
記載されている純粋でな（・混合物（経口的、静脈内、
腹腔内、筋肉内、または皮下的にニワトリへ投与）を用
いた免疫感作実験が不成功であったと開示している。

２．３　　解決すべき問題点 病気の症状はフィールド中の摂取可能な胞子形成オーシ
ストの数に直接比例するので、胞子形成オーシストまた
はマイクロカプセル化オーシストの投与を基本とする現
在のワクチンは、非常に数多くの摂取可能なオーシスト
が一自重から往々にして重症の感染症を引き起こすとい
う点で、ブロイラー産業での利用可能性を制限している
。その結果、経ロワクチン七ね自体の使用はしばしば抗
コクシジウム剤の使用を必要とする。従りて、生ワクチ
ンとしての胞子形成オーシストの使用は適用範囲が制限
される。さらに、スポロゾイトは二−ワトリに経口投与
した場合感染を生じさせるのに効果的でない。

今までに、保護されていないスポロゾイトを全身的に接
極して免疫を作り出す試みが失敗に終ったことはＳｈａ
ｒｍａの上記文献に記載されており、この場合スポロゾ
イトを用いて感染を生じさせる試験は、スポロゾイトを
冷蔵下で数日間以上生存させておく方法が以前にはなか
ったので、脱嚢しだてのスポロゾイトの使用に限定され
ていた。その結果、スポロゾイトを用いるワクチン接種
は商業的に実用的でなかった。

恩濁体を微細に分割し、水溶性高分子安定剤を硬化させ
てマイクロカプセル化することにより、スポロゾイトの
生理学的に平衡化された懸濁体を内包することから成る
好適な本発明方法は、スポロゾイトの生存期間（生存能
力および伝染性に関して）を少なくとも５週間まで引き
延ばすので、ワクチンをいつ使用しなければならないか
について時間的猶予をもたらす。水溶性高分子安定剤（
好ましくは水溶性アルギン酸塩）を用いて、等張性およ
びｐＨについて生理学的に平衡化された媒体中にスポロ
ゾイトを懸濁する第二の本発明方法は、スポロゾイトの
生存期間を少なくとも２週間まで引き延ばし、従ってこ
の場合もワクチンの使用時期に関して融通性をもたらす
。

ここで用いるスポロゾイトのマイクロカプセル化技術は
、ニワトリが誕生の第１８目に売買される場合にそれら
をワクチン接種するための実際的方法を提供するばかり
でなく、例えば生きているオーシストを商業的に用いる
場合（すなわち動物舎やおりの中にまき散らすか、ある
いは接種すべき飼料中で使用する）、ワクチン接種の間
およ、びそれ以後に宿主内で寄生虫が増殖することによ
り起こる動物舎またはおりの中でのオーシストの蓄積を
避け、従ってオーシスト源による初期の不可抗的なチャ
レンジを回避するという他の利点を提供する。アルギン
酸塩Ｓ温体およびスポロゾイト懸濁体を内包するマイク
ロカプセルの使用は、対照的に、より一層遅い低レベル
の地面へのオーシスト蓄積をもたらす。

３、発明の要約 ３．１発見 Ｅｉｍｅｒｉａ　　ｓのスポロゾイトは、ひとたびそれ
らの保護外被（すなわちオーシストおよびスポロシスト
）から放出されると、非常に弱く数日以内でそれらの伝
染力を失う。本発明は、Ｅｉｍｅｒｉａスポロゾイトが
マイクロカプセル化により少なくとも５週間生存し続け
ることができ、さらに生きている脱鱈スポロゾイトの生
命力がアルギン酸ナトリウムを含む水溶性高分子安定剤
の溶液にスポロゾイトの緩衝化水性懸濁体を加えること
により少なくとも２週間まで引き延ばされるという発見
に基づいている。生存スポロゾイトのマイクロカプセル
化は水溶性高分子安定剤（該安定剤は好ましくはアルギ
ン酸ナトリウムである）の溶液から成る寄生虫用の粘性
緩衝化水性媒体を提供する。

安定化スポロゾイトを内包するマイクロカプセルはヒヨ
コに投与し【無症状の感染を起こさせ、それによりＥ、
　ｔｅｎｅｌｌａ　　オーシストの今後の不可抗的チャ
レンジに対するワクチン接種を行うことができる。ニワ
トリによく見られる他のコクシジウム種を用いた同様の
効果的ワクチン接種、並びに動物種に適する脱嚢した生
存コクシジウムスポロゾイトを用いた他の動物（家禽を
含む）の同様のワクチン接種も相当に期待できる、また
、水溶性高分子安定剤を含む非カプセル化スポロゾイト
緩衝！ｇ温体を用いた同様の効果的ワクチン接種もかな
り期待がもてる。

３．２　　ワクチンの一般的製法 精製された生きている脱禽コクシジウムスポロゾイトは
、初めに胞子形成コクシジウムオーシストおよびスポロ
シストを機械的、化学的および酵素的に破壊して胞子嚢
カバーを取り除く既知方法により等張緩漬水溶液の懸濁
体として得られ、その後クロマトグラフィーでｆ！！ｉ
裏される。等張緩衝化スポロゾイト懸濁体は、スポロゾ
イトの死を遅らせて貯蔵中にスポロゾイトが生存し続け
る時間を引き延ばす保護物質の溶液（等張緩衝化高分子
安定剤）に加えられる、この檻の適当な保護物質はハイ
ドロコロイド、ゼラチン、セルロース、セルロース湧導
体および多糖（特にアルギン酸アルカリ金属塩）から選
ばれる。好ましくは、このようにして得られた懸濁体は
スプレーとして微細に分割し、硬化剤と混合して等張緩
衝媒体中の生きている脱講スポロゾイトのＭ温体を包囲
または含有するマイクロカプセルを形成させる。

３．３　　ワクチン接種（投与）方法 本発明のワクチン接種方法によれば、保護物質を含む等
張緩衝スポロゾイト懸濁体（マイクロカプセル化された
もの、またはカプセル化されていないもの）は、コクシ
ジウムオーシストの不可抗的チャレンジによる腸器官へ
の重度の損傷を保護するためＫ、温血動物へ投与される
。マイクロカプセル化調製物は少なくとも５週間貯蔵で
きる。

好適な方法はマイクロカプセル化することであるが、非
カプセル化調製物も冷蔵下（冷凍下ではない）で使用前
に少なくとも２週間貯蔵できる。幼若動物はその動物種
のために適宜に選ばれた限定数のマイクロカプセル化脱
嚢スポロゾイトを含む調製物で処理される。投与経路は
どれも使用できるが、ニワ）　＋３の場合は皮下経路が
特に適している。

４、定義 本明細書中で用いるいくつかの用語は、それらのそれぞ
れの意味に関して読者が著者と同じ考えであることを確
実にすべくこの時点で詳しく説明されるであろう。従っ
て、以下の定義は本発明の範囲を明らかにし且つその公
式化および使用を可能にするために提供される。

４．１′オーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）　’　　は硬い外
コートを有するコクシジウム原生動物の休眠中のライフ
サイクル段階である。その初期形成において、オーシス
トのコアは伝染力をまだもたない未成熟な状９＆Ｃあり
、１非胞子形成オーシス）　（ｕｎｓｐｏｒｕ−１ａｔ
ｅｄ　ｏｏｃｙａｔ）　’　と呼ばれている。このよう
な１オーシスト”は排泄前の動物の消化管または排泄直
後の地面に存在する。

４．２１胞子形成オーシスト（ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄｏ
ｏｃｙｓｔ）”は自然にあるいは人工的Ｋ（ある温度と
酸素暴露条件下）引き起こされた生化学的成熟を受けた
オーシストである。１つの人工的胞子形成条件は重クロ
ム酸塩溶液への暴露である。成熟の間に、多数の’珈泌
ト（ｓｐｏｒｏｃｙｓｔ）　’（それぞれそれ自体の外
被内にある）がその外被内に発生して′１つの嚢内で複
数の嚢胞”になる。ニワトリの場合には、例えばＥ、　
ｔｅｎｅｌｌａはオーシストが胞子を形成した後でその
外被内に４つの別個の被嚢したスポロシストな含む。生
きている胞子形成オーシストは通常１生存可能な胞子形
成オーシスト″と呼ばれる、 ４．３　　”被嚢したコクシジウム原生動物“、′被嚢
したオーシスト“および１被嚢したスポロシスト“はす
べて嚢内に存在する生物、すなわちそれら自体の外被ま
たは胞子嚢を有する生物を意味する。

４．４　　スポロシストの外被はそれぞれ最終的な伝染
性生物の１スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）　’
を包囲する。　Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａの場合にはそれぞ
れのスポロシスト外被が２つのスポロゾイトを包入して
いる。

４．５１脱嚢したスポロゾイト（ｅｘｃｙｓｔｅｄｓｐ
ｏｒｏｚｏｉｔｅ）　’　　なる用語はスポロシストの
保護外被が除去された生きているスポロゾイトを意味す
る。脱嚢は生化学的反応によって自然に起こるが、脱嚢
スポロゾイトの使用のために本発明方法に従って、純粋
な胞子形成オーシストの懸濁体を均質化し、遠心して可
溶性物質を除き、固体をｐＨ７，４のハンクス液（Ｈａ
ｎｋ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）中のトリプシンおよびタ
ウロデオキシコール酸の溶液で処理し、続いて以下でよ
り詳しく述べるアニオン交換クロマトグラフィーを用い
て精製することにより達成される。本明細書中で述べる
スポロゾイト調製方法はスポロシストそれ自体の単離な
回避するものである。

４．６　１カプセル壁材料′は水溶性高分子安定剤を適
当な架橋剤で架橋することＫより生じるマイクロカプセ
ルの硬化した外側表面を意味する。

４．７　　適当な１架橋剤′は多糖ガムの場合には２価
カチオンであり、ゲルおよびゼラチンの場合にはグルタ
ルアルデヒドやホルムアルデヒドのようなアルデヒド類
である、 ４．８′水溶性高分子安定剤′または１高分子安定剤“
およびゝ粘度上昇剤′はすべて本発明組成物中で必要と
される１種以上のゲル、ゼラチン、セルロース、セルロ
ース誘導体および多糖ガムを意味する。この物質群には
高粘度および低粘度のアルギン酸塩、アラビアゴム、寒
天、アガロース、アルブミン、デキストラン、椎々のゼ
ラチン、ポリビニルアルコール、ナトリウムカルボキシ
セルロースおよびデンプンが含まれる。

こわもの物質がスポロゾイトを安定化してそれらの寿命
を長引かせるように機能する特定の作用機序は知られて
いないが、本発明懸濁体中のスポロゾイト安定性（生存
能力）を高める適当な粘度範囲は約２５℃で測定して１
００〜４００センチポイズである。

、４．９　　本明細書中で用いるゝ改質されたカプセル
壁′なる用語は、マイクロカプセルからのスポロゾイト
の容易な放出を可能にするために、形成後に（通常は貯
蔵後であって投与前に）処理された形・成済みマイクロ
カプセル壁（例えばアルギン酸カルシウム）を意味する
。アルギン酸塩系忙適するカプセル壁改質剤はクエン酸
、フマル酸およびマレイン酸のような弱酸の塩である。

　　　４．１０　　本明細書中に記載の組成物と共に用
いられる１生理学的に平衡化された“なる用語は、組成
物が生細胞の等張性およびｐＨＫ関して生理学的に平衡
化されていることを意味し、Ｉ）Ｈは６．８〜Ｚ５の範
囲（好ましくは約７．２　）であり、２６０〜３５０　
ミＩＪオスモルの範囲の重量オスモル濃度を有する。従
って、スポロゾイト懸濁体は生細胞に関して生理学的ｐ
Ｈに緩衝化され、浸透圧的に平衡化される。一般に、生
理学的に平衡化するためにアミン緩衝液が用いられ、例
えばトリス緩衝液およびヘベス緩衝液が有効な緩衝剤で
ある。

４．１１　　本明則書中で用いるゝ懸濁体〃なる用語は
、液体および固体の両方の懸濁体を意味し、マイクロカ
プセル内では後者の懸濁体を考えるべきである。

５、発明の詳細な記述 ５．１　　範囲および適用可能性 本発明のワクチン接種方法において有用な組成物はコク
シジウムの単一株または単一種のスポロゾイトを含み５
６−が、広範な宿主特異的免疫が必要とされる場合には
、通常のコクシジウム株または種のスポロゾイトが単一
の組成物中に含まれるべきである。

本発明はコクシジウム症にかかりやすいあらゆる動物宿
主種においてその疾病を防御すべく適用される。トリの
種類に加えて、ブタおよびウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ
のような反別動物もこの病気にかかり、本発明方法の使
用によりすべて利益を得ることができる。

ニワトリでは、約７３類の主要なコクシジウム種が十二
指腸から始まって腸管に寄生する。それらはＥｉｍｅｒ
ｉａ　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、　Ｅ、ｍ１ｖａｔｉ、　
Ｅ、Ｍａｘｉｍａ。

Ｅ、　ｎｅｃａｔｒｉｘ、　Ｅ、　ｂｒｕｎｅｔｔｉ、
　Ｅ、ｍ１ｔｉｓ、およびＥ。

−−＋□− ｔｅｎｅｌｌａ　である、七面鳥では次のコクシジウム
ｉｄｅｇ；　Ｅ、　１ｎｎｏｃｕｓおよびＥ、　５ｕｂ
ｒｏｔｕｎｄａ、ブタでは次のコクシジウムが観察され
た：　Ｅ、　ｄｅｂｌｉ−ｅｃｋｉ、　Ｅ、　５ｃａｂ
ｒａ、　Ｅ、　５ｕｉｓ、　Ｅ、　５ｐｉｎｏｓａ、　
Ｅ−ウシでは次のコクシジウムが観察された二Ｅ。

ｂｏｖｉｓ、　Ｅ、　ｚｕｅｒｎｉｊ、　Ｅ、　ｅｌｌ
ｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ、　Ｅ、　ａｕｂｕｒ−ｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ　ｉｓ、　Ｅ、　ｆ　１ａｖｅｓｅｎｓ、
　Ｅ、　ｒｙ３ｇｇｙ　Ｅ。

よって感染される。

５．２　　製造例１．緩衝溶液中の脱嚢したＥ。

ｔｅｎｅｌｌａ　　スポロゾイト ５、２．１　　脱嚢スポロゾイトの一般的分離方法精製
されたＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイトを
得るために用いた方法は、Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｌ　３１
　（１）（１９８４）ｐｐ、　１８１−１８３（参照に
よりここに引用される）に記載され且つ以下に段階的に
略記されるシュマッツ（Ｓｃｈｍａｔｚ、　０９Ｍ−）
　　の方法であった。さらに、顕微鏡による観察が時折
用いられた。

５、２．２　　前駆体胞子形成オーシストの調製オーシ
ストの凝集塊は７日前Ｋ　Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌ
ｌａ（Ａ、Ｈ，Ｒｏｂｉｎｓ株８５５）に感染させてお
いたニワトリのｉ腸嚢を破砕することにより分離した。

蒸留水中の盲腸芯部はワーリングプレンダー（Ｗａｒｉ
ｎｇＢｌｅｎｄｅｒ■）中で破壊し、ペプシンを用いて
ｐＨ２，０，６９℃で１時間消化した。蒸留水中で遠心
することＫより破片とペプシンを取り除いた。部分的に
精製されたオーシスト画分は１．１モル蔗糖水溶液中で
の浮遊により分離した。この半純粋なオーシスト画分を
冷りロロックス（Ｃｈｌｏｒｏｘ■）溶液中４℃で１５
分間インキエペートした。クロロックス成分は滅菌リン
酸緩衝溶液（ＰＢＳＸｐＨ７，３）中で数回洗うことに
より除去した。この精製された無菌生存可能オーシスト
を重クロム酸塩溶液中に懸濁・し、次いで水浴中２９℃
で４８時間振とうすることＫより胞子を形成させた、次
の工程で使用するまでＰＢＳ中の胞子形成オーシストを
４℃で貯蔵した。

５、２．３　　スポロゾイトの脱嚢およびその緩衝液胞
子形成オーシストを含む上記のＰＢＳ懸濁体（ｐＨ７，
３）　２”は組織ホモジナイザーを用いて約５００ｒｐ
ｍ、４℃で５分間破砕した。胞子形成オーシストの破砕
により生じた可溶性物質は遠心により除去した。破壊さ
れていないオーシスト、スポロシストおよびオーシスト
外被から成るペレットは脱嚢剤としてハンクスの平衡塩
類溶液（ｐＨ７，４）中の０．２５（重量／容量）チド
リプシン（１：２５０）および４（重量／容量）チタウ
ロデオキシコール酸（ミズーリ州　セントルイス、Ｓｉ
ｇｍａ　社）　’ｘ含む親画用溶液中に再懸濁した。こ
の混合物を５チＣＯ６の雰囲気中４１℃で１時間インキ
ュベートした。脱臭用溶液はカラム緩衝液で２回洗浄し
て除いた。このための、そして次のカラム精製のための
カラム緩衝液は次のようにして調製した：２Ｘリン酸緩
衝溶液の緩衝原液（２ＸＰＢＳ、ＩＪン酸二ナトリウム
２６．９６１／ｌ、　　リン酸二ナトリウム１．５６９
／ｌ、塩化ナトリウム８．５１１／ｌ）を用いてイオン
（Ｉ）強度０．１４５のＰＢＳ　：几０２：８（容量／
容ｉｉ）溶液を調製した。

５、２．４　　脱臭スポロゾイトのクロマトグラフィー
ｊｎＩ展 緩衝液中の脱錆スポロゾイトはＳｃｈｍａｔｚの上記文
献に記載の特別に作製したセルロース（ＤＥ−５２セル
ロース）充填カラムを用いてアニオン交換カラムクロマ
トグラフィーにより精製した。溶液の状態を顕微鏡で観
察して、精製の完了を確認した。

ＤＥ−５２セルロースアニオン交換カラム充填物は、２
：８緩衝液（Ｉ＝０．１４５　）　１５Ｑ＋＋＋Ｊ中２
．０ｇの割合で予備膨潤ワットマン（英国）　ＤＥ−５
２セルロースを平衡化することにより作製した。

沈澱後、微粒物を含む上溝を除いた。この洗浄方法を２
回以上繰り返し、最後の洗浄前に５（重量／容ｉｋ　）
　％　’）　７酸テｐＨ８，０ニＤＥ−５２セルｏ−ス
を調整した。その後、この材料は２：８緩衝液５０ｍ１
中に再懸濁し、カラムの充填に使用した。

脱臭スポロゾイト精製用のカラムは充填前にオートクレ
ーブで滅菌した。そのカラムに上記のように調製したＤ
Ｅ−５２セルロースを高さ２．５閏まで充填し、その充
填物を２：８緩衝液（Ｉ＝０．１４５）５０１ｍで洗っ
た。

２：８緩衝液中の脱臭したでの上記スポロゾイトは、先
に調製した２：８緩衝液平衡化ＤＥ−５２セルロース充
填カラムに装入した。２：８緩衝液・を段階的に分けて
カラムに流した。その両分を集めて、内容物を位相差顕
微鏡下でヘモサイトメーターにより評価し、定量化した
。このようにして得られた緩衝液中の脱臭スポロゾイト
の懸濁体は、アルギン酸ナトリウム溶液のような安定剤
含有溶液に加えるのに適していた。

５．３　　製造例２０等張緩衝化アルギン酸す）　ＩＪ
ウム水溶液中の脱＠　Ｅ、　ｔｅｎｅｌ１ｇスポロゾイ
トの懸濁体 直接使用されるワクチン又はマイクロカプセル化ワクチ
ンとして適しているアルギン酸塩安定化スポロゾイト懸
濁体の調製を、以下に段階的に記述する。

５．３．１　　）リス（ＴＲＩＳ）緩衝液トリス緩衝液
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕の０．１
Ｍ溶液は、トリス結晶６．０５７ｇを精確に量り、蒸留
水５０ＯＮで希釈することにより調製した。

５、３．２　　緩衝化アルギン酸ナトリウム溶液１．５
チアルギン酸ナトリウム（低粘度）ｌＷ液は、上記の如
く調製したトリス緩衝液５００ゴにアルギン酸ナトリウ
ム７、５９を溶解することにより調製した。この溶液は
４℃に冷却した。

５．３゜３　子ウシ血清の添加 トリス緩衝液５ゴ中に１ｘｉｏ’個のスポロゾイトを含
む司縮懸濁体を製造例１から新たに調製し、５容量％の
ウシ胎児血清を加えてこの懸濁体を４℃尤保持した。

５、３．４　　緩衝化スポロゾイト−アルギン酸塩懸濁
体 上記の５．３．３で調製した１ＸＩＱ’個のスポロゾイ
トを含む緩衝溶液５ｒＩＬｌを、上記の５．３．２で調
製したアルギン酸塩溶液１４５１に、混合が完了するま
で攪拌しながら添加した。その後このスポロゾイト懸濁
体を４℃に保持した。これらの割合は製造例６（そこで
計算について説明する）でのマイクロカプセル化の必要
性に応じて定められた。

５．４　　製造例６０等張緩衝化水溶液中の安定化脱臭
蚕ｔｅｎｅｌｌａ　スポロゾイ トを含有するマイクロカプセ ル 安定化された脱臭スポロゾイト懸濁体をカプセル化する
方法を以下に記述する、 ５、４．１　　体積比についての計算 製造例２の生成物をつくるために用いた緩衝化アルギン
酸ナトリウム溶液対緩衝化スポロゾイト懸濁体の比は、
次の事実および仮定二すなわち１）緩衝化スポロゾイト
懸濁体はｌＸ１０’個のスポロゾイトを含む、２）直径
３５０ミクロンのマイクロカプセルが製造されるであろ
う、３）各マイクロカプセルは１５個のスポロゾイトを
含むようＫする、およびり半径１７５ミクロンおよび球
の体積の計算式（４／３πｒ’）　ＶＣ基づいて、最終
のアルギン酸塩溶液１１当たり４４．５４５個のマイク
ロカプセルが存在するであろう、に従って、下記式：＝
　１５［１ｍＪの最終アルギン酸塩懸濁体を用いる一定
サイズのマイクロカプセルを製造するための計算に基づ
いていた。

それ故に、アルギン酸塩溶液１４５ゴが製造例２で調製
された１Ｘ１０’スポロゾイト含有緩衝溶液５反に添加
された。

５、４．２　　硬化浴の調製 １．５係塩化カルシウム溶液の硬化浴は、蒸留水１１に
塩化カルシウムニ水和物（塩化カルシウム７６．４９）
１９．６３ｇを溶解することにより調製した。この溶液
の重量オスモル濃度は約６６５ミリオスモル／に９であ
った。

５、４．３　　ガスフロードロップレットジェネレータ
ー（ジェットスプレーヘッド）の説 明 アルギン酸ナトリウム−スポロゾイト懸濁体を微細に分
割するため釦用いたジェットスプレーヘッド（ｊｅｔ　
５ｐｒａｙ　ｈｅａｄ）は、硬化浴の上方で浴表面に対
して垂直に縦方向に取り付けた、ジェットスプレーヘッ
ドは高さ３／４’（インチ）Ｘ頂部内径に″（インチ）
および底部内径１／１６　’（インチ）の小さい細長い
円錐形チャンバーでありて、より広い頂部端にゴム製円
板キャップが付いており、より狭い端部で開口している
上記チャンバーを有するノ・ウジングから成り、そのチ
ャンバーはガス用サイドボートと液体供給針を有し、そ
の液体供給針はキャップを貫通して、針の開放端がチャ
ンバー内に十分に延びるようにチャンノく−の長さにわ
たって下方に突き出ている。針を通る液体の流れを調節
するためにポンプを使用し、またサイドボートからチャ
ンバーに流入するガス流を制御するためにガス圧バルブ
を使用した。用いた針は２１ゲ一ジ×１％′（インチ）
の円錐形先端をもつ注射針であった。

５、４．４　　安定化用水溶液中に懸濁されたスポロゾ
イトを含むマイクロカプセルの作製 ジェットスプレーヘッドの底部端を硬化浴より約１．５
ｃｒＩＬ上方に設置し、製造例２からのスポロゾイト−
アルギン酸塩懸濁体を４℃で絶えず攪拌しながら、情動
ポンプを用いて約８１／分のサイドボートからのガス流
に向けて０．４６１ｄ／分の流速で送り、硬化浴中に微
小球体を噴出させた。微小球体の大きさは、ガスの流速
および針開放端の位置を操作すること罠より、大きさを
調べるために採取したマイクロカプセルの顕微鏡観察を
用いて、直径が約６５０ミクロンに調整された。微小球
体は硬化浴に入るとすぐに硬化した。上記のスポロゾイ
ト懸濁体１５０ｄのうち１３５ゴを用いた今回のバッチ
では、全部でｌＸ１０’個のマイクロカプセルが得られ
た。

５、４．５　　マイクロカプセルの食塩水による洗浄上
記のように作製したマイクロカプセルは硬化浴中で安定
した体積になるまで沈降させ、その後過剰の塩化カルシ
ウムをデカントして除去した。

塩化カルシウム溶液でしめっている残留マイクロカプセ
ルを４℃で等容量の生理食塩水（すなわち０．９重食塩
塩化ナトリウム水溶液）中に再懸濁し、そして再び沈降
させた。この洗浄方法を３回繰り返した。その後、それ
らをワクチンとして使用するまで、あるいは以下のパラ
グラフ５．９の如く改質後にワクチンとして使用するま
で、生理食塩水中のマイクロカプセルを約４℃で冷蔵し
た。

５、４．６　　マイクロカプセル化したスポロゾイトの
生存能力に関する貯蔵試験 ５、４．５で得られた生理食塩水中のマイクロカプセル
は４℃で５週間貯蔵した。食塩水をデカントし、マイク
ロカプセルをＰＢＳ溶液（ｐＨ７，３）中に再懸濁した
。この懸濁液は生後−週目のＨｕｂｂ−ａｒｄ　ＸＨｕ
ｂｂａｒｄ　　雄ヒヨコの首のうしろに皮下投与した。

ヒヨコは投与後７日または８日目に殺し、盲腸嚢にコク
シジウムが感染していることが判明した。従りて、生理
学的に適合しうるアルギン酸塩含有媒体の懸濁体中に含
まれるスポロゾイト（そのスポロゾイト懸濁体はすべて
２価陽イオンでアルギン酸塩を架橋することによりマイ
クロカプセル化される）は、４℃で生理食塩水中に貯蔵
したとき、少なくとも５週間生存したままであると結論
づけられた。

５５　例１．　ニワトリにおけるマイクロカプセル化お
よび非カプセル化Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａスポロシイ）Ｋ
よる無症状感染の 証明 短期間の初期実験で、製造例２で得られた非カプセル化
生存脱臭スポロゾイトと製造例６で得られたマイクロカ
プセル化生存脱臭スポロゾイトの両方によって、低レベ
ルの感染が生じることが確認できた。生後１日目のヒフ
３４群を７日または８日の暴露後に殺し、それらの盲腸
嚢の傷害について調べた。この実験を表ＩＫ要約する。

５．６　　例２．ニワトリにおける安定化されマイクロ
カプセル化された脱臭スポロ ゾイトによるＥ、　ｔｅｎｅｌｌａ　コクシジウムに対
するワクチン接種能の証 明 ２４０羽の生後１日目のＨｕｂｂａｒｄ　Ｘ　Ｈｕｂｂ
ａｒｄ焼肉用ヒヨコを４群に分け、その際ニワトリは体
重が平均の１０係以内に入るように無作為に選んだ。１
群と２群は各群の合計８０羽のヒヨコを２つの養鶏舎（
各養鶏舎は４０羽を収容する）にそれぞれ入れた。３群
と４群は各養鶏舎当たり４０羽を収容する１つの養鶏舎
にそれぞれ入れた。各群のヒヨコは次のようにして第１
白目に首のうしろに皮下（Ｓ、Ｑ、）注射された： １群：ヒョコにそれぞれ１０’生存脱嚢スポロゾイトの
マイクロカプセル化ＰＢＳ−アルギン酸ナトリウム懸濁
体を皮下投与した。

マイクロカプセルは生理食塩水中に懸濁し、合計０．１
ｄの容量とした。マイクロカプセルは製造例６で作製し
たものであった。

２群：ヒョコにそれぞれ５Ｘ１０”生存脱臭スポロゾイ
トのマイクロカプセル化ＰＢＳ−アルギン酸ナトリウム
懸濁体を皮下投与した。マイクロカプセルは生理食塩水
中に懸濁し、全体の容量をＱ、１−とした。

マイクロカプセルは製造例３で作製したものであった。

６群：各ヒヨコに１０５個の脱臭したばかりの生存スポ
ロゾイトを含むＰＢＳ懸濁液０．１ｄを皮下投与した。

スポロゾイトの調製方法については製造例１を参照され
たい。

マイクロカプセル化は行わなかった。

４群：ヒョコにそれぞれＰＢＳ溶液０．１ｄのみを投与
した。

２８日後、各ヒヨコを８５０００のＥ、　ｔｅｎｅｌｌ
ａオーシストで経口チャレンジした。

３４日目（すなわち、オーシストチャレンジの６日後）
にヒヨコを殺し、ヒヨコの両方の盲腸嚢はＥｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ’　２ａ　３
Ｏ−３６（１９７０）ｐ、　３１　Ｋ記載されるジ１イ
ス・ジョンソンＵｏｙｃｅ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）およびＷ
、　ｗルカム・レイド（Ｗ、Ｆｉｉａｌｃｏｌｍ　Ｒｅ
１ｄ）のＥ、　ｔｅｎｅｌｌａ　Ｋついての評価方法を
用いて盲腸壁の損傷を調べた。グレード評価は以下の通
りである： ０　肉眼で見える傷害なし。

＋１　盲腸壁に非常にわずかな分散された点・　　状出
血あり；盲腸壁の肥厚なし；正常な盲腸内容物あり。

＋２　盲腸内容物中にあきらかな出血を伴う傷害が多数
あり；盲腸壁はやや肥厚； 正常な盲腸内容物あり、 ＋６　多量の血液または盲腸芯部あり：盲腸壁はかなり
肥厚：盲腸内容物は盲腸内 にあるにしても少ない。

＋４　盲腸壁は血液または大きい乾酪性芯部により非常
に拡張する；糞便かすが芯 部に不在であるか又は存在する；死亡 したヒヨコは＋４と評価した。

表■はこの試験の重要な特徴を要約するものであり、低
い得点範囲０−１．５、中程度の得点範囲２−２．５ま
たは高い得点範囲３−４を示す全個体群の百分率として
各群に対する正味の累積的試験結果を示している。当業
者には容易に理解できるように、低得点範囲０−１５で
の百分ホが高い場合が望ましく、ワクチン接種方法の有
効性を表している。

５．７　　例６．ニワトリにおける安定化されマイクロ
カプセル化された脱糞スポロ ゾイトによるＥ、　ｔｅｎｅｌｌａ　ｓクシジウムに対
するワクチン接穐能の証 明 ６６０羽の生後１８目のＨｕｂｂａｒｄ　ＸＨｕｂｂａ
ｒｄ焼肉用ヒヨコを各舎２０羽ずつの１８舎に分け、そ
の際体重が平均の１１以内に入るよう化無作為に選んだ
。１８群は６つの処理群のために各群３舎ずつに無作為
に分けた。１群から５群までは隣り合わせに配置し、６
群は別の場所に置いた。

処理群は以下の通りであった。第１８目の各群の処理は
次の通りであった： １群：３舎のヒョ：ｚＶｃ１ｘ１０’生存脱嚢Ｅ、　ｔ
ｅｎｅｌｌａスポロゾイトの製造後２週目のマイクロカ
プセル化ＰＢＳ懸濁体を皮下投与した。

マイクロカプセルは生理食塩水中忙懸濁し、全体の容量
をＱ、１１１１とした。マイクロカプセルは平均サイズ
約２５０ミクロンのものを製造例３に類似した方法で作
製した。

２群：１群と同じであったが、３舎のヒヨコに腹腔内（
ｉ、ｐ、）投与した。

６群：６舎のヒョコに調製したばかりの１ｘ１０”脱Ｉ
ＲＥ、　ｔｅｎｅｌｌａスポロゾイト−ＰＢＳ懸濁液（
０，１、ｗｊ　）を皮下投与した。

４群：６群と同じであったが、スポロゾイト懸濁液（０
，１１１７）を３舎のヒ″ｉ；に腹腔内投与した。

５詳：３舎ノヒ：ｉ　”ｊＫＰ　Ｂ　Ｓ溶液０．１ｍｊ
ノみを皮下投与した。

６詳：６舎のヒヨコを隔離しておき、処理を全く施さな
かった。

２７日後、各ヒヨコを５００００のＥ、　ｔｅｎｅｌｌ
ａオーシストで経口チャレンジした。

３３日ＩＣすなわち、オーシストチャレンジの６日後）
にヒョコを殺し、各ヒヨコの両方の盲腸嚢は例２に記載
したＪｏｙｃｅ　ＪｏｈｎａｏｎおよびＷ。

Ｍａｌｃｏｌｍ　Ｒｅ１ｄ　　の評価方法を用いて盲腸
壁の損傷について調べた。

表■はこの試験の重要な特徴を要約するものであり、得
点範囲ｏ　−ｉ、　ｓ、２−２．５および２，７５−４
を示す全個体群の百分率として各群の正味の累積的試験
結果を示している。

５．８　　例４．旦ｔｅｎｅｌ１ｍスポロゾイトに対す
るアルギン酸ナトリウムの安定化効 果 １．５憾アルギン酸ナトリウム溶液（低粘度）２００Ｒ
ＩＶｃ、パラグ：７７５．３−３で調製したウシ血清含
有トリス緩衝溶液１−当たり１０６〜１０丁　スポロゾ
イトを含む新た忙調製した懸濁ｆｆＬ１１Ｌｌを加え、
それたより５０００脱嚢スポロゾイト／ｄの懸濁液を得
た６４℃で１４日間貯蔵後、ヒョコにこの懸濁液０．２
１１１７（１０００個のスポロゾイト）を排泄腔から注
入した。この時点で感染能はまだ存在していた（盲腸嚢
の損傷度により検査）。一方、子ウシ血清含有トリス緩
衝液中のスポロゾイトは４℃で１４日間貯蔵後感染力を
もっていなかった。

５．９　　クエン醗塩で改質されたカプセル壁を有する
マイクロカプセル忙よるワクチン接種能 パラグラフ５．４のようＫしてアルギン酸塩から炸裂し
、等張溶液中に＠濁し、そして４℃で５週間まで貯蔵し
たフィクロカブ七ルは、１，５憾クエン酸ナトリウム水
溶液（ｐＨ７，２）と１〜２分間混合した。顕微鏡を用
いて、スポロゾイトの放出が観察された。このように処
理された懸濁体は、ふ化したばかりのヒョコに皮下投与
したとき、マイクロカプセルからのスポロゾイト放出の
効藁および速度の向上により、未改質マイクロカプセル
と比較してＥ、　ｔｅｎｅｌｌａオーシス）Ｋ対する改
善された接種法を与えることが期待される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性媒体中の脱嚢された生存コクシジウムスポロゾ
   イトの懸濁体から成る、コクシジウム症に対するワクチ
   ンを温血動物に接種するための組成物であって、上記懸
   濁体が等張性およびｐＨに関して生理学的に平衡化され
   ており、且つ上記スポロゾイトの生存能力を有意に長引
   かせるに足る量のヒドロゾル、ゲル、ゼラチン、セルロ
   ース、セルロース誘導体および多糖ガム（アルギン酸塩
   を含む）から選ばれる少なくとも１種の粘度上昇用水溶
   性高分子物質を含むことを特徴とする組成物。 ２、水溶性多糖ガムはアルギン酸ナトリウムである、請
   求項１記載の組成物。 ３、スポロゾイトはアイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅ−ｒ
   ｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）種のものである、請求項１記載
   の組成物。 ４、マイクロカプセル壁の内側に、脱嚢された生存コク
   シジウムスポロゾイトの懸濁体を内包するマイクロカプ
   セルから成る、コクシジウム症に対するワクチンを温血
   動物に接種するための組成物であって、上記懸濁体が等
   張性およびｐＨに関して生理学的に平衡化されており、
   且つ上記スポロゾイトの生存能力を有意に長引かせるに
   足る量のヒドロゾル、ゲル、ゼラチン、セルロース、セ
   ルロース誘導体および多糖ガム（アルギン酸塩を含む）
   から選ばれる少なくとも１種の粘度上昇用水溶性高分子
   物質を含み、上記マイクロカプセル壁が硬化された高分
   子物質から成ることを特徴とする組成物。 ５、水溶性多糖ガムはアルギン酸ナトリウムであり、マ
   イクロカプセル壁はアルギン酸カルシウムである、請求
   項４記載の組成物。 ６、スポロゾイトはアイメリア・テネラ種のものである
   、請求項４記載の組成物。 ７、等張性およびｐＨに関して生理学的に平衡化され、
   且つアルギン酸ナトリウムを溶解状態で含む脱嚢された
   コクシジウムスポロゾイトの懸濁体から成り、２５℃で
   １００〜４００センチポイズの粘度を有する組成物。 ８、スポロゾイトの種はアイメリア・テネラである、請
   求項７記載の組成物。 ９、温血動物はニワトリである、請求項１記載の組成物
   。