JPH01193228A - 組換えｈｔｌｖ−３タンパクとその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は組換ＨＴＬＶ−ｍ蛋白質とその用途に関する。

〔従来の技術］ ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−ｍ　）、リンパ
節障害間連ウィルス（ＬＡＶ）、又はＡＩＤＳ間連レト
ロウィルス（ＡＲＶ）は、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ
）の原因として確認された［ボボビックφエム（Ｐｏｐ
ｏｖｉｃ＋門、）、サルンガドハラン・エム拳ジー（Ｓ
ａｒｎｇａｄｈａ−ｒａｎ、　Ｍ、Ｇ、）、リード・イ
ー（Ｒｅａｄ、　Ｅ、）、及びガロ・アールφシー（Ｇ
ａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，）［１９８４年］　５ｃｉｅｎｃ
ｅ２２４巻４９７−５００頁］、このウィルスは、０に
Ｔ４″リンパ球サブセットに対して向性を示す［クララ
ラマン・デイ−（にｌａｔｚｍａｎ、　Ｄ、）、バレ＝
シノッシ・エフ（Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ
、）、ヌゲイレ・エムΦティー（ＮＢｅｙｒｅ、　Ｍ、
Ｔ、）、ドウジｘ　ットφシー（Ｄａｕｇｕｅｔ。

Ｃ，）、ヴイルマーφイー（ＶｉｌＩＩｅｒ、　Ｅ、）
、グリセリ・シー（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉ、　Ｃ，）、プ
ルン＝ヴエジネ−：ｒ−フ（Ｂｒｕｎ−Ｖｅｚｉｎｅｔ
、Ｆ、）、ルジュウ・シー（Ｒｏｕｚｉｏｕｘ＊Ｃ，）
、グル・ンクマン番ジェイ・シー（Ｇｌｕｃｋｍａｎ、
　Ｊ。

Ｃ，）、シｘ）レマン・ジエイ・シー（Ｃｈｅｒｍａｎ
ｎ、　Ｊ、Ｃ，）及びモンタニエールー２ル（Ｍｏｎｔ
ａｇｎｉｅｒ、Ｌ−）（１９８４年）　５ｃｉｅｎｃｅ
　２２５巻５９−６３頁］、はとんどのエイズ・　患者
とエイズ関連複合症候群（ＡＢＣ）患者、及び同ウィル
スに感染した無症状の人々［サルンガドハラン・エム・
ジー、ボボビック・エム、プラッチ・エル（８ｒｕｃｈ
、　Ｌ、）、シャプバッチ・ジエイ（Ｓｃｈ−ｕｐｂａ
ｃｈ、　Ｊ）及びガロ・アール・シー（Ｇａｌｌｏ、　
Ｒ，Ｃ，）（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻５
Ｇ＋３−５０８頁］の血清中の■孔ｖ−■タンパクに対
する抗原は、これらの抗原に対する抗体を検出するため
の免疫学を基盤とする試験の開発を可能にした。これら
の試験は、ウィルスに感染した人々の血液試料を調べる
ことによって、輸血によるＨＴＬＶ−ｍの伝播を抑える
ために使用される。現在市販されている診断試験は、抗
原として不活性化ウィルスのタンパクを使用する。

診断への新しい手がかりとなるほか、組換え開Ａは細菌
とウィルス双方に対するワクチンの開発にとって大きな
有望性をもっている［ウィルソン・テ４−（ｌＪｉｌｓ
ｏｎ、　Ｔ、）［１９８４年］　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ２巻２９−３９頁］０組換えワクチンを発現さ
せるのに最も広く使用される生物は、大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ）、Ｓ。

セレビシｘ　（ｓ、　ｃｅｒｅｖｔｓｔａｅ）及び培！
ＩＩＩＩＩ乳類細胞であった０例えば１、手足０病［ク
ライト・デイ−・ジー（にＩｅｌＬ　Ｄ、Ｇ、）、ヤン
スラ・デ４−　（Ｙａｎｓｕｒａ＋Ｄ、）、スモール会
ビー（Ｓｍａｌｌ、　８．）、ダウベンコψデ４−　（
Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、　Ｄ、）、ムーアΦデ４−−ｘム（
Ｍｏｏｒｅ、Ｄ、Ｍ、）、ブラプマン・エム・ジエイ（
Ｂｒｕｂ−ｍａｎ、　Ｍ、Ｊ、）、マツカーチャー・ビ
ー・デイ−（Ｍｃ−にｅｒｃｈｅｒ、　Ｐ、Ｄ、）、モ
ーガン拳デイ−・オー（Ｍｏｒ−ｇａｎ＊Ｄ、０−）＋
ロバートソン・ビー・エッチ（Ｒｏｂｅｒｔ−ｓｏｎ、
　Ｂ、１１．）、及びパックラッチ・エッチ・エル（Ｂ
ｃ１１ｒａｃｌ＋、Ｈ，Ｌ、）（１９８１年）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２１４巻１１２５−１１２９頁）］及びマラリ
ア〔ヤング・ジエイ・エフ（Ｙｏｕｎｇ。

、Ｉ　、　Ｆ　、　）　、ホックメイヤー・ダブリユウ
・ティー（Ｈｏｅｋｍｅｙｅｒ、　Ｖ、Ｔ、）、グロス
・エム（Ｇｒｏｓｓ、　Ｍ、）、リプレイエバロウ・ダ
ブリユウ（Ｒｉｐｌｅｙ　Ｂａ１ｌｏｕ、Ｗ、）、ワー
フ・アール・エイ（Ｗｉｒｔｚ、　Ｒ，Ａ、）、トロス
パー・ジエイ・エッチ（Ｔｒｏｓｐｅｒｐ　Ｊ・■・）
・ボードイン中アール・エル（Ｂｅａｕｄｏｉｎ、　Ｒ
，Ｌ、）、ホリンゾール・エム・アール（Ｈｏｌｌｉｎ
ｄａｌｅ、　Ｍ、Ｒ，）、ミラー・エル・エム（旧１ｌ
ｅｒ、　Ｌ、Ｍ−）、デイッグズ番シー命エル（Ｄｉｇ
ｇｓ、　Ｃ，Ｌ、）、及び６−ゼンバーグ・エム（Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒ３．　Ｍ、）（１９８５年）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２８巻９５８−９６２頁）に対するサブユニッ
トワクチンは、大腸菌で合成された。他の例は、酵母で
つくられるＢ型肝炎表面抗原〔マカリー７・ダブリユウ
・ジエイ（ＭｃＡｌｅｅｒｅＶ、Ｊ、）、バイナク・イ
ー・ビー（Ｂｕｙｎａｋ、　Ｅ。

Ｂ、）、メイゲッターｅアールΦセット（Ｍａｉｇｅｔ
ｔｅｒ、Ｒ。

Ｚ、）、’７　ンプラー・デイ−・イー（ＷａＢＩｅｒ
、　Ｄ、Ｅ、）、ミラー・ダブリユウ・ジエイ（旧＋１
ｅｒｅ　ＩＪ−」、）及びヒルマン命エム・アール（ｌ
ｌｉｌ’ｌｅｍａｎ、　Ｆｌ、Ｒ，８１９８４年）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３０？巻１７８−１８０頁］、及び哺乳類
細胞でつくられるヘルペスワクチン［バーマン・ビー・
ダブリユウ（Ｂｅｒ腸ａｎ、　Ｐ、ＩＪ、）、グレゴリ
−・ティー（Ｇｒｅ３ｏｒｙ＋　Ｔ−）、チェースφデ
４−（Ｃｈａｓｅ、　Ｄ、）及びラスキー・エル・エイ
（Ｌａｓｋｙ、　Ｌ、Ａ、）（１９８４年）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　２２７巻鳳４Ｏ０−１４９２頁］である。

［発明が解決すべき課Ｂ］ ０１時点て、エイズワクチンを開発する差迫った必要性
がある。そのようなワクチンは存在することが知られて
いない。

［課題を解決する手段］ 本発明は新規な組換えＨＴＬＶ−ＩＨタンパクとそのＩ
Ｊ用に関する。更に詳しくは、本発明はエイズの診断、
予防又は治療に使用できる新規な組換えＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉエンベロープタンパクに間する。更に、本発明の組換
えＩＩＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープタンパクはＨＴＬＶ
−１１１に感染したヒトのリンパ細胞増殖応答を刺激ず
ろのに使用できる０次にこれは免疫系を刺激して、この
ようなヒトでＩＩＴＬＶ−ｍに応答させ、従ってエンベ
ａ−ブタンバク断片が保護をｔｅｌ　１Ｍでき、治１ａ
　ｌ＋Ｉ　ＩＩＩのあるものとなる。これらの新規なタ
ンパクは標準手順を使用して細菌プラスミドにコートさ
れ、適当なホスト、例えば大腸菌を形質転換するのにこ
れを使用できる。

発現ベクタープラスミドｐＲＥＶ２．２をプラスミドｐ
ＢＧ＋から構築した。このプラスミドの構築を示す流れ
図を図面の第１図に示す。

プラスミドｐＲ１ｏは本質的ににｐｎ１位置からＢｇｌ
ＩＩまでのＨＴＬＶ−ｍ　ｅｎｖ遺伝子をコードした［
１ＮＡＰＪ＋２７５塩基対を含有している。適当な細菌
−ホスト、例えば大ＩＩ　ｉ内のこのプラスミドは、Ｒ
１０で指定される９５　ｋＤの新規な組換えＩＩＴＬＶ
−ｍ融合タンパクをつくるのに使用できる。融合タンパ
クＲＩＯのアミノ酸配列を第８表に示す、このタンパク
をコードしたＤＮＡ配列を第８Ａ表に示す、タンパクＲ
１０の１１１ｖ部分のアミノ酸配列を第１２表に示す、
タンパクＲ１０の１Ｖ部分をコードしたＦＩＮ＾配列を
第１２Ａ表に示す。

プラスミドｐＰＢ　Ｉは、本質的にＰｖｕ１１位置から
Ｂｇｌ■位置までのＨＴＬＶ−ｍ　ｅｎｖ遺伝子をコー
ドしたＤＮＡ約５４０塩基対を含む、適当なホスト、例
えば大腸菌内のこのプラスミドを用いて、ＦＢＩと指定
される２６　ｋＤの新規な絹換えＩＩＴＬＶ−１１１融
合タンパクをつくることができる。融合タンパクＰａｌ
のアミノ酸配列を第９表に示す、このタンパクをコード
したＤＮＡ配列を第９Ａ表に示す、タンパクＰＢＩの旧
Ｖ部分のアミノ酸配列を第１３表に示す、タンパクＰａ
ｌのＨＩＶ部分をコードしたＤＮＡ配列を第１３Ａ表に
示す。

プラスミド１１５９０は本質的にＰｖｕ■位置からＨｉ
ｎｄＩＩＩ　ＩＩ２置までのＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｅｎｖ
遺伝子をコードしたＤＮＡ約１０５５塩基対を含んでい
る。適当なホスト、例えは大腸菌内のこのプラスミドを
用いて、５９０と指定される８１１ｋｏの新規な組換え
ＩＩＴＬＶ−ｍタンパクをつくることができろ、融合タ
ンパク５９０のアミノ酸配列を第１ｎ表に示す、このタ
ンパクをコードしたＤＮＡ配列を第１０Ａ表に示す、タ
ンパク５９０のｌ−１１Ｖ部分のアミノ酸配列を第１４
表に示す、タンパク５９０の１１１ｖ部分をコートした
ＤＮＡ配列を第１４Ａ表に示す。

プラスミドＩ］に■１は、本質的にＫｐｎ　１位置から
１ｌｉｎ旧ＩＩ　ｋ？置までのＩＩＴＬＶ−［１１ｅｎ
ｖｉｌ　ｆＦ、子をコードした［ｌＮＡ約１８３０塩基
対を含んでいる。適当なホスト、例えζＪ大腸菌内のこ
のプラスミドを用いて、Ｋ旧と指定されるＴＯｋＤの新
規な組換えＩＩＴＬＶ−ｍタンパクをつくることができ
る。融合タンパクに■！のアミノ酸配列を第１１表に示
す、このタンパクをコードした［ｌＮＡ配列を第＋１Ａ
に示す。タンパクにＨｌのＨＩＶ部分のアミノ酸配列を
第１５表に示す、タンパクに旧の■１ｖ部分をコードし
たＤＮＡ配列を第１５Ａ表に示す。

大ＩＩＩＷホストＭＳ３７１内のブしスミドｐｅＧｔは
、合衆国イリノイ州ビオリア、合衆国農務省北部地域研
究所（ＮＲＲＬ）に寄託される。プラスミドはこの寄託
所の永久保存施設内にある。大腸菌ＭＳ３７１（ｐＢＧ
ｌ）。

ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９０４，は１９８４年目月！日に寄
託された。大引ＩＭＳ３？１．　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５１
２９は現在、一般に人手で・きる、大ＩＩＩ菌５Ｇ２０
２５１．　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９１８，は１９８４年１
２月１２日に寄託された。　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９０４
とＮＲＲＬ　Ｂ−１５９１８は、これらを明らかにした
特許の授与によって一般に入手できよう、　ＮＲＲＬに
寄託されたその他の培養基と寄託期日と番号は以下のと
おりである。

上の寄託物は、少なくとも３０年間ＮＲＲＬ受託施設に
保存され、これらを明らかにした特許の授与によって一
般に人手できよう、寄託物はまた、本出願の対応特許又
は子孫特許が出願される諸国の外国特許法の要求に応じ
て人手できる。しかし、寄託物が人手できるからといっ
て、政府措置によって授与されル特許権を侵害してまで
本発明を実施する実施権を構成するものではないことを
了解すべきである。

本発明の新規なＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ・ｍタンパクは、サツ
カロミセスΦセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの誘発可能なガラクトー
ス・・プロモータを含有するプラスミドを使用して、こ
の微生物中で発■１させることができる［ブローチ争ジ
エイ働アール（Ｂｒｏａｃｈ、　、１．Ｒ，）、リ−・
ワイ（Ｌｉ、　Ｙ、）、ウー・エル・シー（ｖｕ、　Ｌ
、Ｃ，）、及びジャヤラム・エム（」ａｙａｒａ＋ｍ、
Ｍ、）ｒ遺伝子発現の実験操作Ｊ（１９８３年）８３頁
、エム・イノウニ編、アカデミツク・プレス社］。

これらのプラスミドはＹＥｐ５１及びＶＥｐ５２　［ブ
ローチ・ジェイ・アールら（１９８３年）］と呼ばれ、
大＋＋ｉｉの複Ｉ！開始点、β−ラクタマーゼ遺伝子、
酵母Ｌａ１２遺伝子、２μｍ複！１開始点、及び２μ−
円形ＲＥＰ３位置を含んでいる。＆［Ｉ換え遺伝子の発
現は酵母ＧＡＬＩＯ遺伝子プロモータによって駆動され
る。

酵母プロモータは、ガラクトース及びアルコールデヒド
ロゲナーゼ［ベネッツエン・グレイ・エル（Ｂｅｎｎｅ
ｔｚｅｎ、　Ｊ、Ｌ、）、及びハル・ビー・デイ−（Ｈ
ａｌｌ、　Ｂ、口、）（１９８２年）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｗ、　２５７巻３０１８頁；アメシー・ジー（
Ａ■ｍｅｒｅｒ、　Ｇ、）ｒ酵素学の方法」（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＸ１９８３年）
１０１巻１９２頁］、ホスホグリセレート争キナーゼ［
プリンク−アール（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，）、ヒッツ
ェマンφアール舎エイ（Ｈｉｔｚｅｓ＋ａｎ、　Ｒ，Ａ
、）、グレイ・ビーーダブリユウ（Ｇｒａｙ、　Ｐ、Ｖ
、）、ゲーデル・デイー拳ヴ４−　（Ｇｏｅｄ−ｄｅｌ
、　Ｄ、Ｖ、）、「遺伝子発現の実験操作Ｊ（１９８３
年）２４７頁、エム・イノウニ編、アカデミツク・プレ
ス社］、トリオース・フォスフェート・イソメラーゼ［
アルバー・ティー（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、）、及びカワサ
キ・ジー（１９８２年）Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、１巻４１９頁］、又はエノ
ラーゼ［イネス・エム・エイ（ｌｎｎｅｓ、Ｍ、Ａ、）
ら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２６巻２１頁］な
とを１史用できる。

本明細書で明らかにされた遺伝子は、シミアン細胞内で
発ＩＱできる。これらのタンパクをコードした遺１云子
が、オカヤマ及びバーブ［Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ。

ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、（１９８３年）Ｍｏｌｅｃ、
　ａｎｄ　Ｃｅ１１．１０１．３巻２８０頁］とその４
参考文献に記述されたプラスミドの一つか、又はこれら
のプラスミドで形質転換されたＣＩＪＳ細胞にクローン
化されると、ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクの合成を免疫的
に検出できる。

その他の叶乳類細胞遺伝子の発現ｌタンパク生産系を使
用できる。　ｆｌｉ！のこのような系の例にはワクシニ
アウィルス発現系［モス・ビー（Ｍｏｓｓ、　Ｂ、）（
１霊））１５年）Ｉ＊ｍｕｎｏｌｏｘｙ　Ｔｏｄａｙ　
６巻２４３頁；チャクラパルティ・ニス（ＣＩ＋ａｋｒ
ａｂａｒｔｉ　、　Ｓ、）、プレッチリング・ケイ（Ｂ
ｒｅｃｌｌｌ　ｉｎｇ、に、）、及びモス・ビー（１９
８５年）Ｍｏｌｅｃ、　ａｎｄ　ｔｈｅｆｔ、　Ｂｉｏ
ｌ、　５巻３４０３頁］及びねずみレトロウィルスから
誘導されるベクター類［マリガン・アール・シー（Ｍｕ
ｌｌｉｎｇａｎ、　Ｒ，（、）ｒ遺伝子弁ＩＱの実験操
作Ｊ（１９８３年）１５５頁、エム・イノウニ旙、アカ
デミツクブレス社］がある。

本発明のＨＴＬＶ・■タンパクはＢＯＣやＦＭＯＣ［メ
リフィールド・アール・ビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、
　Ｒ，Ｂ、）（１９６３年）Ｊ、　Ａｔａｅｒ、　Ｃｈ
ｅｗ、　Ｓｏｃ、　８５巻２１４９頁；チャン・シー（
Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，）及びマイエンホーファー・グレイ
（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｊ、）（１９７８年）Ｉｎ
ｔ、　　Ｊ、　ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ
、　１１巻２４６頁］のような固体相ペプチド合成手法
によって化学的に合成できる。

この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、
［ｌＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺伝
暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使
用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化
ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるため
、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列
がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描く
ことができる。

フェニルアラニン（Ｐｂｅ）　　　ＴＴにロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（ｌｌｅ）
　　　　　ＡＴＭメチオニン（ＭｅＬ）　　　　　　Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｔ）　　　　　　　　　ＧＴＬセリン
（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＧＲＳプロリン（１’　
ｒ　ｏ　）　　　　　　　　ＣＣＩ。

スレオニン（ＴＩ＋ｒ）　　　　　　ＡＣＬアラニン（
Ａｌａ）　　　　　　　ＧＣＬチロシン（Ｔｙｒ）　　
　　　　　ＴＡにヒスチジン（ｌｌｉｓ）　　　　　　
ＣＡにグルタミン（Ｇｌｎ）　　　　　　ＣＡＪアスパ
ラギン（＾ｓｎ）　　　　　ＡＡにリジン（Ｌｙｓ）　
　　　　　　　　ＡＡＪアスパラギン酸（Ａｓｐ）　　
　　ＧＡＫグルタミン酸（ＧＩＬＩ）　　　　　　ＣＡ
Ｊシスティン（Ｃｙｓ）　　　　　　ＴＧにトリプトフ
ァン（Ｔｒｐ）　　　　ＴＧＧアルギニン（Ａｒｇ）　
　　　　　ＶＧＺグリシン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　
＋；ＧＬ終結信号　　　　　　　　　ＴＡＪ 終結信号　　　　　　　　　ＴＧＡ 解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に５９末端、右側に３′末端をもつ伝令ＲＮＡのト
リヌクレオチドに対応する０本明細書に記載のＤＮＡは
すべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｍＲＮＡの
配列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである０文字はデ
オキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジ
ン塩基を示す。

Ａ＝アデニン ６＝グアニン Ｃ：シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたは６の場合は、Ｘ＝Ｔ又は１：。

ＶがＣまたはＴの場合は、Ｘ＝Ｃ。

ＸがＣノ場合は、Ｙ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ又はＴ。

ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又は６゜ ＺがＡ又はＧの場合は、Ｖ＝（：又はＡ６ＺがＣ又はＴ
の場合は、Ｖ＝Ｃ。

讐がＣの場合は、Ｚ＝Ａ、　Ｇ、　Ｃ叉はＴ。

すがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ。

ＳがＡ、　Ｇ、　Ｃ又はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ，又は
その代わりにＳがＴ又はＣの場合は、ＱＲＦＡＧ。

、１＝Ａ叉はに に＝Ｔ又はＣ １、＝Ａ、　Ｔ、　Ｃ又はＧ。

Ｍ＝Ａ、　ｌ：又はＴ。

］二記は、本発明のＨＴＬＶ−［１１タンパクの新規な
アミノ１Ｉｌｔｌ配列が、木切＊＊で明らかにされたも
の以外のヌクレオチド配列によって調製できることを示
す。これらのＩＩＴＬＶ−ｍタンパク、又はＨＴＬＶ−
Ｉｌｌの抗ＪＨ：ｉ　ｉ９性又は免疫原活性又は治療活
性をもつその断片、の新規なアミノ酸配列をコー！・シ
た機能的ここ同２・γなヌクレオチド配列を、既知合成
手順によ・〕でつくることができる。ｔｒｔっで１本発
明はこのような機能的に同等なヌクレオチド配列を包含
する。

このように、本発明の範囲は木切＊書に記述された特定
的なヌクレオチド配列のみならず、実質的に同じＩＩ　
Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｌｌ抗原活性又は免疫原活性又は治療
活性をもつ分子をコードしたすべての同等なヌクレオチ
ド配列をも包含している。

更に、本発明の範囲は明らかにされた特定的なアミノ酸
配列を含むだけでなく、特異的なＩＩＴＬＶ−■抗体類
の形成を誘発し、及び／又はこ九らに結びつく相当な能
力をもつタンパク又はタンパク断片をコードした類似の
配列をも含める意図がある。

「同等」という用語は、通常の特許用語としての用法の
とおりであって、本質的に同じ種類のホスト中で、実質
的に同じＨＴＬＶ−ｍ抗原活性又は免疫原活性又は治療
活性をもった分子をつくることが本明細書で確認されて
いるヌクレオチド配列として実質的に役目を果たすよう
なヌクレオチド配列を指すのに用いられている。この定
義の範囲には、ＩＩＴＬＶ−１１１の抗原活性又は免疫
原活性又は治療活性をもった二次断片も含まれる。

上で明らかにされたように、微生物的な方法によってＩ
ＩＴＬＶ−ＩＩＩタンパクをつくるために、本発明のＨ
ＴＬＶ−ｍの抗原活性又は免疫原活性又は治療活性をコ
ードしたヌクレオチド配列を使用することは、遺伝子工
学の当業者に周知である０発現ベクターへ配列を融合し
、真核生物（酵母又は哺乳類細胞）か原核生物（纏Ｗａ
Ｉ胞）のホストへの形質転換ないしトランスフェクショ
ンを行なわせるのは、他の周知のタンパク類、例えばイ
ンスリン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、Ｉし
−１、ＩＬ−２等をつくるのに使用される標準手順であ
る。本発明に従って、微生物手段又は組織培養技術によ
ってＨＴＬＶ−ｍタンパクをつくるために、同様な手順
又はその明白な変法を使用できる。

本明細書で明らかにされたヌクレオチド配列は、この技
術で周知の手順により、“遺伝子機械”によってつくる
ことができる。これは、ヌクレオチド配列の開示のゆえ
に可能である。

開示された制限酵素は、ベテスダ研究所（メリーランド
州ゲイサーズバーグ）又はニューイングランドΦバイオ
ラボ（マサチューセッツ州ビバリー）から購入できる。

酵素類は、供給者側から提供された指示に従って使用さ
れる。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法は、この技術において周知である。これらの
手順はすべて、マニアティス・テ４−（Ｍａｎｉａｔｌ
ｓ＋Ｔ、）、フリッチ・イーーｘフ（Ｆｒｉ−ｔｓｃｈ
、　Ｅ、Ｆ、）及びサムプルツク・ジェイ（Ｓａｓｂｒ
ｏｏｋ。

Ｊ、）（１９８２年）「分子クローニング」（実験マニ
ュアル）コールドスプリングハーバ−研究所にューヨー
ク）に記述されている。このように、０ＮＡｌｔ微生物
細胞から抽出し、制限酵素による消化を行ない、ＤＮＡ
断片を電気泳動にかけ、プラスミドをテーリングとアニ
ーリングにかけ、ＤＮＡを挿入し、ＤＮＡを再結合させ
、細胞、例えば大ａｍ細胞を形質転換し、プラスミドＤ
ＮＡを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、ＤＮＡの配
列決定をするのは、当業者の技術範囲内にある。

本発明のＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを使用する免疫化学
的検定は、種々の形態を取りうる。好ましいタイプは固
体相免疫検定である。このタイプの検定では、ＨＴＬＶ
−ｍタンパクは固体相に固定されて、抗原−免疫吸着剤
を形成する。免疫吸着剤は、試験しようとする試料と一
緒に培養される。適当な培養期間後、免疫吸着剤を試料
から分離し、標識つき抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体を使用し
て、免疫吸着剤に結合されたヒトの抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
抗体を検出する。免疫吸着剤と結びついた標識の量を陽
性・陰性の対照群と比較すると、抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗
体が存在するか存在しないかについて評価ができる。

免疫吸着剤は、精製ＨＴＬＶ−ｍタンパクを固体相に吸
着又は結合させることによってつくられる。

固体相は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デ
キストラン、又は他の材料のビーズなど、種々のものを
使用できる。他の適した固体相は、これらの材料からつ
くられるか、これらで被覆された管又はプレートを包含
する。

ＨＴＬＶ−ｍタンパクは、アミドやエステル結合経由の
共有結合のような技術や吸着によって、共有又は非共有
的に固体相へ結合できる。　ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク
が固体相へ固定された後、固体相を動物タンパク、例え
ば３χ魚ゼラチンで後被覆できる。これは免疫吸着剤表
面へのタンパクの非特異的吸着を減少させるような封鎖
タンパクを提供している。

次に免疫吸着剤を、抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体について試
験しようとする試料と一緒に培養する。血液検査では血
漿又は血清を使用する。血漿又は血清を正常な動物の血
漿又は血清で希釈する。希釈血漿又は血清は、抗（ヒト
ＩｇＧ）抗体源である同じ動物種に由来している。好ま
しい抗（ヒト１８Ｇ）抗体はヤギの抗（ヒトＩｇＧ）抗
体である。このように、好ましい態様では、希釈剤はヤ
ギの血清又は血漿である。

培養条件、例えばｐＨと温度、また培養期間は決定的な
ものではない、これらのパラメータは定常的な実験によ
って最適化できる。概して、培養はｐＨ７−８の緩衝液
中で約４５℃、１−２時間行なわれる。

培養後、免疫吸着剤と試料を分離する。分離は、沈降又
は遠心分離のような慣用の分離技術によって実施できる
０次に干渉物質を排除するために、免疫吸着剤を洗って
試料を含まないようにすることができる。

免疫吸着剤に結合されたヒト抗体を検出するには、免疫
吸着剤を標識つき抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体（トレーサー）
と−緒に培養する。一般に、抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体源と
して働く動物種の少量（約ｌχ）の血清又は血漿を含有
する標識つき抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体溶液と一緒に免疫
吸着剤を培養する。抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体は任意の動物
源から得られる。しかし、ヤギの抗（ヒト１８Ｇ）抗体
が好ましい。抗（ヒトＩｇＧ）抗体は、ヒ）ＩｇＧのＦ
ｃ断片に対する抗体、例えばヤギの抗（ヒトＩｇＧ）Ｆ
ｃ抗体でありうる。

抗（ヒ）　ＩｇＧ）抗体又は抗（ヒ）　ＩｇＧ）Ｆｃを
、放射性材料、例えばヨウ１９１２５で；蛍光材料のよ
うな光学的標識で；又はワサビダイコンペルオキシダー
ゼのような酵素で標識をつけることができる。抗ヒト抗
体をバイオタイニレート化し、標識つきアビジンを用い
て免疫吸着剤へのその結合を検出することもできる。

標識つき抗体と共に培養後、免疫吸着剤をＮａ液から分
離し、免疫吸着剤と結びついた標識を評価する。標識の
選択にもよるが、評価は種々の方法で行なうことができ
る。標識が放射性ガンマ放出体である場合はガンマカウ
ンターで、蛍光材料の場合は蛍光計で標識を検出できる
。酵素の場合には、標識検出は酵素用基質を使用して、
比色法で行なうことができる。

抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体の存在を決定するためには、免疫吸
着剤に結びついた標識量を陽性及び陰性対照群と比較す
る。対照群は、一般に試験試料と同時に処理される。陽
性対照は抗ＨＴＬＶ−ｍ抗体を含有する血清である。陰
性対照は、抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を含有しない健康な
人々からの血清である。

便宜上及び標準化のため、免疫検定実施用の試薬を検定
キットにまとめることができる。血液検査キットは、例
えば以下を包含する。

（ａ）免疫吸着剤、例えばＨＴＬＶ・ｍタンパクで被覆
されたポリスチレンビーズ； （ｂ）血清又は血漿試料用の希釈剤、例えば正　常なり
ギ血清又は血漿； （ｃ）抗（ヒトＩｇＧ）抗体、例えば約ＩＫのヤギ血清
又は血漿を含有する緩衝水溶液中のヤギ抗（ヒトＩｇＧ
）抗体； （ｄ）陽性対照、例えば新規なＨＴＬＶ−ｍタンパクの
少なくとも一つに対する抗体を含有する血清；及び （ｅ）陰性対照、例えば新規なＨＴＬＶ−ｍタンパクの
少なくとも一つに対する抗体を含有しない健康な人から
の保存血清。

標識が酵素の場合は、キットの追加分は酵素用基質であ
りうる。

もう一つのタイプの抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体検定は抗原
サンドイッチ検定である。この検定では、抗（ヒトＩｇ
Ｇ）抗体の代わりに標識つきＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク
を使用して、免疫吸着剤に結合された抗ＨＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ抗体を検出する。この検定は、原則として抗体分子の
二価性に基づいている。抗体の一つの結合位置が、固体
相に固定された抗原と結びつく。第二位置は標識つき抗
原を結合させるのに利用できる。

検定手順は免疫検定で述べたものと本質的に同じである
が、但し試料と一緒に培養後、免疫吸着剤を標識つきＨ
ＴＬＶ−ｍタンパク溶液と一緒に培養する。このタイプ
の検定のため、ＨＴＬＶ−ｍタンパクを放射性同位元素
、酵素等で標識をつけることができる。

第三の形式では、抗原−抗体の相互作用に干渉せずにＩ
ｇＧ分子のＦｃ切片に結合する細菌タンパクのプロティ
ンＡを標識つきトレーサーとして使用して、免疫吸着剤
に吸着された抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を検出できる。プ
ロティンＡに、放射性同位元素、酵素又は他の検出可能
な種で容易に標識をつけることができる。

ＨＴＬＶ−ｍタンパクを使用する免疫化学的検定は、丸
ごとの（又は破砕した）ウィルスを使用するものより幾
つかの利点をもっている。　ＨＴＬＶ−ｍタンパクに基
づく検定は、増殖する多量の感染性ウィルスや繍胞培養
とウィルス生産に関連する固有の多様性に対する懸念を
軽減しよう、更に、検定は病院や診療所、血液銀行で試
験を行なう技能者がもつエイズら患の現実的ないしは感
覚的な恐れを緩和する助けになるであろう。

本明細書に明らかにされたＨＴＬＶ−ｍタンパクの一つ
以上、及び抗原性をもつその変異型を含めてなるワクチ
ンは、この技術で周知の手順によってつくることができ
る０例えば、このようなワクチンを注射液、例えば液体
溶液や懸濁液として調製できる。注射に先立って液体中
の溶液又は懸濁液とするための固体型も調製できる。任
意に製剤を乳化することもできる。活性抗原成分を、活
性成分と相溶性のある薬学的に受は入れられる助剤と混
合できる。適当な賦形剤の例は水、食塩水１、デキスト
ロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組
合わせである。更に所望により、ワクチンは少量の湿潤
剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような補助的物質やワクチン
の有効性を強化する助剤を含有できる。ワクチンを注射
で、例えば皮下又は筋肉内に非経口投与するのが好都合
である。池の投与方式に適した追加の処方剤は、座薬、
またある場合には経口処方剤である。座薬用゛の伝統的
な結合剤と担体は、例えばポリアルキレングリコール又
はトリグリセリド類を包含する。座薬は、約０．５ｚな
いし約１０ｚ１好ましくは約ｌχないし約２ｚの範囲の
活性成分を含有する混合物から形成できる。経口処方剤
は、例えば製薬等級のマニトール、乳糖、澱粉、ステア
リン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロー
ス、炭酸マグネシウム等のような通常使用される助剤を
包含できる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸
薬、カプセル剤、持続放出処方剤、又は散剤の形を取り
、約１０％ないし約９５ｚ、好ましくは約２５χないし
約７０１の活性成分を含有できる。

タンパクを中性型又は塩型としてワクチンに処方できる
。薬学的に受は入れられる塩類は、（ペプチドの遊離ア
ミノ基で形成される）酸付加塩類と、例えば塩酸や燐酸
のような無機酸、又は酢酸、峰酸、酒石酸、マンデル酸
等のような有機酸によって形成されるものを包含する。

遊離カルボキシル基で生成する塩類は、例えば水酸化ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は
第二鉄のような無機塩基から、及びイソプロピルアミン
、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒ
スチジン、プロ力イン等のような有機塩基からも誘導で
きる。

ワクチンは適量処方剤と両立できる形で、また治療上有
効で免疫原性であるような量で投与される。投与量は処
置を受ける被験者、抗体を合成する被験者の免疫系の能
力、及び望んでいる保護程度に左右される。投与される
活性成分の正確な必要量は実施者の判断に依存しており
、各個人に特有である。しかし、適した適量範囲は、−
人当たり活性成分数百マイクログラムのオーダである。

最初の投与に適した投薬量と追加投与量は可変であるが
、典型的には最初の投与に続いて１週間ないし２週間の
間隔で二度目以降の注射その他の投与を行なう。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩは特にエンベロープ遺伝子内において
、アミノ酸配列の変動を受けることが知られている［ス
ターシッチ・ビーφアール（Ｓｔａｒｃｉｃｈ、　Ｂ、
Ｒ，）（１９８６年）Ｃｅｌｌ　４５巻６３７−６４８
頁；バーン・ビー・エッチ（Ｈａｈｎ、　Ｂ、Ｈ，）（
１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２巻１５４８−１５
５３頁］、　１００以上の変異型が分子クローン化及び
制限酵素認識分析によって分析され、またこれらの幾つ
かはヌクレオチド配列決定によって分析された。これら
の幾つかはＲＦ［ボボビック・エム（Ｐｏ−ｐｏｖｉｃ
＋Ｍ、）ら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４巻
４９７−５００頁］、ＷＭＪ−１［バーン番ビーーエッ
チ（Ｈａｈｎ、　Ｂ、Ｈ，）ら（１９８６年）Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２３２巻１５４８−１５５３頁］、ＬＡＶ　［
ウェイン＝ホブソンφニス（Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、
Ｓ、）ら、（１９８５年）Ｃｅｌ１４Ｇ巻９−１７頁］
及びＡＲＶ−２Ｃサンチェス＝ペスカドル・アール（Ｓ
ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ、　Ｒ，）ら、　（１
９８５年）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７巻４８４−４９２
頁］として知られるＨＴＬＶ−ｍ分離体である０本発明
は一つのＨＴＬＶ−ｍ分離体からの配列について記述し
ているが、ＲＩＯ，ＰＢＩ、５９０及びに旧の調製のた
め本明細書に記述された手順を使用して、任意のＨＴＬ
Ｖ−ＩＩＩ分離体の適当なエンベロープ領域をつくるこ
とができる。異なるウィルス分離体からのＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩタンパクを、上で明らかにされたようにワクチン製
剤に使用して、異なる）ＩＴＬＶ−ｍ分離体による感染
を防ぐことができる。更に、一つ以上のＨＴＬＶ−ｍ分
離体からの一つの組換え抗原タンパクを用いてワクチン
製剤をつくると、エイズに対する免疫が提供され、いっ
そうすぐれた予防となる。

［実施例］ 以下は、最善の態様を含めた本発明方法を例示する実施
例である。これらの実施例は限定的に考えられてはなら
ない、他に注意がなければ、溶媒混合物の割合はすべて
容量による。

実施例１　プラスミドｐＲＥＶ２．２の構築ｐＲＥＶ２
．２プラスミド発現ベクターをプラスミドｐＢＧＩから
構築した。プラスミドｐＢＧ１は、周知の手順、例えば
透明溶菌物１等密度勾配法等を用いて、大腸菌ホストか
ら単離できる。　ｐＢＧｌのように、ｐＲＥＶ２．２は
大腸菌プロモーターのうしろの挿入遺伝子を発現させる
。　ｐＢＧｌとρＲＥＶ２．２との差は、次のとおりで
ある。

１、　　ｐＲＥＶ２．２はプラスミド（ｒｏｐ）タンパ
クツ機能的複製を欠いている。

２、　１ｌＲＥＶ２．２はＡａｔＩＩ位置へ挿入された
ｔｒｐＡ転写ターミネータ−をもっている、この配列は
過剰発現された遺伝子の転写終結を確実にする。

３、　　ｐＲＥＶ２．２は、アンピシリンとクロラムフ
ェニコールに対する耐性を提供する遺伝子をもつが、ｐ
ＢＧｌはアンピシリンのみの耐性を提供する。

４、　　ｐＲＥＶ２．２は幾つかの制限酵素の位置をコ
ードした配列を含んでいる。

図面の第１図に示す以下の手順を使用して、上に列挙さ
れた四つの相違の各々を生じさせた。

Ｉａ、　　プラスミドｐＢＧ１（５ｕ　ｇ）をＮｄｅ　
Ｉで制限すると、約２１６０及び３４４０塩基対の２断
片を生じた。

ｌｂ、　　Ｎｄｅｌの不活性化後、消化混合物からのＤ
ＮＡ０．１ａｇを、分子内再結合に好ましい条件下にＴ
４ＤＮＡリガーゼで処理したく標準的Ｔ４リガーゼ反応
条件を使用し、反応容ｊｉ２００μ＋）［ニューイング
ランド・バイオラブ、マサチューセッツ州ビバリー］。

３４４０塩基対の断片の分子内再結合はアンピシリン耐
性プラスミドをもたらした。再結合混合物を受容菌株の
大％ＩＷＪ旧０３にューイングランド・バイオラブから
入手）へ形質転換し、アンピシリン耐性クローンを標準
手順によって選択した。

ｌｃ、　　ｐＢＧｌから２１６０塩基対のＮｄｅ　Ｉ断
片を削除した場合の生成物プラスミドｐＢＧ１ΔＮは、
アンピシリン耐性クローンからプラスミドをつくり、Ｎ
ｄｅＩ及びＳａｌ　Ｉでの制限消化パターンを決定する
ことによって選択されたく生成物断片は約１７９０と１
６５０）、この削除で、プラスミドの複製を制御するｒ
Ｏｐ遺伝子が不活性化される。

２ａ、　　次にｐＢＧＩΔＮ（５μｇ）をＥｃｏＲＩと
Ｂｅ１ｌで消化させ、約２４５５塩基対の大きい方の断
片を単離した。　２ｂ、　　第１表に示す構造の二本鎖
合成断片をイタクラら［イタクラ・ケイ（ｌｔａｋｕｒ
ａ、に、）、ロッジ・ジェイ番ジエイ（Ｒｏｓｓｉ、　
、１−Ｊ、）及びウォーレス・アール・ビー（讐ａｌｌ
ａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、Ｘｌ９８４年）Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　５３巻３２３−３５６頁、
及びその中の参考文献］の手順によってつくった。この
断片はｅｅｌ　ＩとＥｃｏＲＩの粘着末端をもち、幾つ
かの制限酵素に対する認識配列を含んでいる。

２ｃ、　　２４５５塩基対のＥｃｏＲＩ　−ｅｅｌ　Ｉ
断片０．１ａｇと合成断片０．０１μｇをＴ４０ＮＡリ
ガーゼで合体させ、菌株Ｊ旧０３のコンピテント細胞を
形質転換させた。

合成断片がｐ８ＧＩΔＮのＢｃｌＩとＥｃｏＲ１位置の
間に挿入されている組換えプラスミドを受入れた細胞は
、Ｈｐａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩでプラスミドを消化させる
ことによって選択された０診断断片の大きさは約２３５
５及び２００塩基対である。このプラスミドはｐＲＥＶ
ｌと呼ばれる。

２ｄ、　　ｐＲＥＶｌ（５μｇ＞をＡａｔＩＩで消化さ
せると、特異な開裂をする。

２ｅ、　　第２表に示す二本鎖断片を合成した。この断
片はＡａｔ　Ｕの粘着末端をもち、ｔｒｐＡ転写終結配
列を含んでいる。

２ｆ、　　Ａａｔｌｌで消化させたｐＲＥＶｌ（０，１
ａｇ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｍの容
量中で合成断片０、Ｏ１μｇと再結合させた。

２ｇ、　　コンピテントにされた菌株ＪＭ１０３の細胞
を形質転換し、アンピシリン耐性クローンを選択した。

２ｈ、　　選択されたコロニーから単離されたプラスミ
ドのにｐｎｒとＥｃｏＲＩによる二重制限消化物を用い
て、正しい構造を含む細胞を単離した。　ＫｐｎｉとＥ
ｃｏＲＩで生じた断片の大きさは約２４７５と８０塩基
対である。このプラスミドはｐＲＥＶＩＴＴと呼ばれ、
ｔｒｐＡ転写ターミネータ−を含んでいる。

３ａ、　　上記のとおり（標準的な方法で）調製される
ｐＲＥＶＩＴＴ（５ｕ　ｇ）をＮｄｅ　Ｉ及びＸｍｎ１
で開裂し、約８５０塩基対の断片を単離した。

３ｂ、　　クロラムフェニコール並びにアンピシリンと
テトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子を含有す
るプラスミドｐＢＲ３２５（ＢＲＬ、メリーランド州ゲ
イサーズバーグ）５μｇをＢｃｌ　Ｉで開裂し、末端を
クレノフボリメラーゼ及びデオキシヌクレオチドでプラ
ントにした。酵素を不活性化してから、混合物をＮｄｅ
　Ｉで処理し、約３１８５塩基対の断片を単離した。こ
の断片はクロラムフェニコール及びアンピシリン耐性の
遺伝子と複製の開始点を含んでいる。

３ｃ、　　ｐＲＥＶＩＴＴからのＮｄｅ　Ｉ　−Ｘｍｎ
　Ｉ断片０．１ｇｇとｐＢＲ３２５からのＮｄｅ　Ｉ　
−ｅｅｌ　Ｉ断片とを７４ＤＮＡリガーゼにより２０μ
ｍ中で再結合し、混合物を菌株Ｊ旧０３のコンピテント
細胞の形質転換に使用した。アンピシリンとクロラムフ
ェニコール双方に耐性のある細胞を選択した。

３ｄ、　　選択されたクローンからのプラスミドをＥｃ
ｏＲＩ及びＮｄｅ　Ｉで二重消化させ、この消化物を使
用して約２４８０．１１４５及び４１０塩基対の断片規
模を生ずるプラスミドを選択した。これはプラスミドｐ
ＲＥＶＩＴＴ／Ｃ旧と呼ばれ、アンピシリン及びクロラ
ムフェニコール双方に耐性のある遺伝子をもっている。

４ａ、　　第３表に示す二本鎖断片を合成した。この断
片はプラント末端とＳｓｔ　Ｉ粘着末端をもち、幾つか
の制限酵素位置に対する認識配列を含んでいる。　４ｂ
、　　ｐＲＥＶＩＴＴ／ｃｈｉ（５μｇ）をＮｒｕ　Ｉ
　（Ｂｃｌ　１位置から約２０ヌクレオチドを開裂する
）及び５ｓｔｌ（複数クローン化位置内で開裂する）に
よフて開裂した。大きい方の約３９９０塩基対を７ガロ
ースゲルから単離した。

４ｃ、　　ｐＲＥＶＩＴＴ／ｃｈｌからのＮｒｕ　Ｉ　
−５ｓｔ　Ｉ断片０．１　＃８と合成断片０．０１ａｇ
を２０μｍの容量中でＴ４ＤＮＡリガーゼによって処理
した。

４ｄ、　　この混合物を菌株Ｊ旧０３に形質転換し、ア
ンピシリン耐性クローンを選択した。

４ｅ、　　プラスミドを幾つかのクローンから精製し、
旧ｕＩ又はＣｌａ　Ｉで消化させて選定した。新しい複
数クローン化位置をもつ組換えクローンは、これらの酵
素のどちらで消化させても、いずれもプラスミドを１回
だけ開裂するため、一つの断片を与える。

４ｆ、　　複数クローン化位置の配列を検証した。

これを行なうには、プラスミドをＨｐａ　ＩとＰｖｕ■
で制限し、１３９５塩基対の断片を単離し、これをｍｐ
１８のＳｅａ　１位置へクローン化し、標準方法を使用
するジデオキシヌクレオチド・シーフェンシングによっ
てその配列を決定する。

４ｇ、　　ｐＲＥＶ２．２と呼ばれるこのプラスミドは
、図面の第２図に図示されている。

実施例２　　ｐＲｌｏの構築とその発現プラスミドρＲ
ＩＯは、本質的ににｐｎ１位置からＢｇｌ■位置までの
ＨＴＬＶ−ｍ　ｅｎｖ遺伝子をコードしたＤＮＡ約１２
７５塩基対を含有しており、これからｇｐ１２０エンベ
ロープタンパクのこの部分を含んだ約９５　ｋｎの融合
タンパクが合成される。このプラスミドを以下のように
構築できる。

１、第４表に示す配列をもつＤＮＡを合成する。このＤ
ＮＡ断片は標準的な方法［前掲イタクラら、及びその中
の参考文献］で合成でき、ｇｐ１２０の一部をコードし
ている。これは５９にプラント末端をもち、３′末端に
ＢａｍＨＩ張り出し部分と再結合する末端をもっている
。

２、プラスミドρＢＧ１５μｇｌｔ　ａｃｔ　Ｉで制限
し、クレノフボリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド
三燐酸（ｄＮＴＰｓ）で張り出し末端を満たし、この断
片をＢａｍＨＩで制限し、約８．９　ｋｂの大きい断片
をアガロースゲルから単離する。

３、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、第４表の断片０
．１ａｇを２０μＩ容量中でｐＢＧ１断片０．１ａｇと
再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌株５Ｇ
２０２５１　［ゴッテスマン・ニス（Ｇｏｔｔｅｓｍａ
ｎ、　Ｓ、）、ハルパーンｅイー（Ｈａｌｐｅｒｎ、Ｅ
、）及びトリスラー壷ピー（Ｔｒｉｓ−Ｉｅｒ、　Ｐ、
）（１９８１年）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ１４Ｂ巻２６７−２７３頁］へ形質転換し
、アンピシリン耐性形質転換体を選択する。

４、精製プラスミドのＡｈａＩ［Ｉ制限パターンを使用
して、合成断片をもつ組換えプラスミドが受入れられた
細胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端
がρＢＧＩ断片の補充されたＢｃ目目端端再結合され、
Ｂａｓ＋ＨＩ張り出し末端どうしが一緒に再結合される
ような方向にある。適当なプラスミドをＡｈａｍで消化
させると、約５３００．３１７０．６９０．６４０．３
３０、及び２０塩基対の断片長さが得られる。５．　　
この組換えプラスミドを受入れた菌株を、５０μ８）■
１のアンピシリンを含有する２ｘ培地［２２酵母エキス
、バクトドリブトン、カサミノ酸（デイフコ製、ミシガ
ン州デトロイト）、０．２χ−塩基カリウム、０．Ｂ二
環基カリウム、及び０．２に塩基ナトリウム］中で生育
させ、細胞タンパクの全量を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動にかけると、約９５　ｋｎの有力タ
ンパクをクマシープルー染色により、又はエイズ、ＡＲ
Ｃ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩに感染した人から選択された血
清をプローブとして使用するウェスタン・プロット分析
によって視覚化できる。

実施例３　プラスミドρＲＩＯからの）ＩＴＬＶ−ＩＩ
Ｉエンベロープ配列を含有する組換えタンパクの 精製 １、１１胞の生育 チエマツプ発酵装置（チエマツプ社、ニューヨ−ク州ウ
ッドベリ）中で２ｘ培地中の細胞を１０リツトル容量で
生育させた０発酵温度３７℃、ｐＨａ、ｓ、及び空気を
ｌ　ｖｖｍで供給した。プラスミド選択は、５０ａｇ／
＋ｇｌアンピシリンで提供された。典型的な細胞収率（
湿潤重量）は３０　ｇ／Ｉであった゛。

２、細胞溶菌 組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープ融合タンパクを含
有する大腸菌５０８（湿潤細胞［１を、５０ＩＩＭトリ
スーＭＣＩ（ｐＨ８，０）、５＋＋＋Ｍ４チレンジアミ
ンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、１５ｍＭのβ−メルカプトＸ　９　／　−
ル、０．５ＸＴＲＩＴＯＮＲＸ−１００、及び５ｍＭフ
ッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）中の最終容
量１００１中に懸濁させた。リゾチーム３００　ｍｇを
加え、懸濁液を室温で３０分培養した。

この材料は同量の０．１−０．１５μ潮ガラスピーズを
含有するＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲＴＭ（バイオスペック
・プロダクツ社、オクラホマ州パードルビル）を使用し
て溶菌化された。室温で、１分閏隔て６公開、溶菌を行
なった。液体をビーズから分離し、２０．０００ｘｇで
２．５時間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレ’７
）を８Ｍ尿素、２０ｓ＋Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，
０）、５ｍＭ　ＤＴｒ。

１５ｓ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、５ｍＭ　ＰＭＳ
Ｆ及び１１ＥＤＴＡからなる１００　ｍｌに溶解した。

ポリトロン番ホモジナイザー（ベックマン社、カリフォ
ルニア州バークレー）を使用してペレットを溶解化し、
２０゜０００ｘｇで２時間遠心分離した。

３、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフ
ィ ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　５ＥＰＨＡＲＯ５Ｅ”
　（ファーマシア社、ニューシャーシー州ビス力タウエ
ー）を充填し、８阿尿素、２０＋ｗＭ　）リス−）１ｃ
Ｉ（ρ）ｌ　８．０）、ｌ　５＋１Ｍβ−メルカプトエ
タノール、及びＩｍＭにＥ［ｌＴＡで平衡化した５５〇
−１カラム（５ｃ■ｘ　２８　ｃ−）に上澄み液を室温
で装填した。カラムを１．５リツトル平衡化緩衝液で洗
い、タンパクを平衡緩衝液中で０−０．８Ｍ　ＮａＣｌ
の５．０リツトル線形勾配で溶離した。　ＨＴＬＶ−ｍ
タンパクは、０゜２Ｍ　ＮａＣｌで溶離され、５ＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動を使用し、約９５ｋＯの有
力タンパクを追跡して検定された。

ＨＴＬＶ−ｍタンパクを含有するフラクションを一緒に
し、分子量ＩＯ，０００カットオフ膜（ＹＭ−１０、ア
ミコン社）を取り付けた応力化細胞正圧濃縮器（アミコ
ン社、マサチューセッツ州ダンバース）を使用して、タ
ンパクを１０　ｍｌに濃縮した。スーパーファインセフ
ァクリルＳ−３００（ファーマシア社）を充填し、８Ｍ
尿素、２０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１５
ｓ＋Ｍβ−メルカプトエタノール、及び１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａで平衡化した５５０１カラム（２，５ｃｓ　ｘ　１０
０　ｃｍ）に、濃縮液を装填した。カラムを室温で平衡
化緩衝液で溶離したｓｉｉ分０．５　ｍｌ（Ｄ流量を維
持した。　ＨＴＬＶ−ｍタンパクはカラム容量の約４０
％で溶離した。

実施例４　プラスミドｐＰ８１　＋　＋　＋ｓの構築と
発現プラスミドρＰＢＩは、Ｐｖｕｎ位置からｓ３＋■
位置までのＨＴＬＶ−ＩＩ［ｅｎｖ遺伝子を本質的にコ
ードした［ｌＮＡ約５４０塩基対を含有しており、ｇｐ
ｒ２０エンベロープタンパクのこの部分を含有する約２
６　ｋＤの融合タンパクがこれから合成される。このプ
ラスミドを次のように構築できる。

１、第１５表に示す配列のＤＮＡを合成する。このＯＮ
Ａ断片は標準方法で合成でき、ｇｐ１２０の一部をコー
ドしている。これは５′末端にプラント末端をもち、３
′末端にＢａｍＨＩ張り出し部分と再結合する末端をも
っている。

２、　プラスミドｐＲＥＶ２．２（５μｇ）ヲＥｃｏＲ
ＶとＢａｍＨＩで制限し、約４　ｋＤの大きな断片をア
ガロースゲルから単離する。

３、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、第１５表の断片
０．１ａ　ｇｌｔ　２０ａ　ｌｃＤ容量テｐＲＥＶ２．
２Ｍ片０．１μｇと再結合させ、再結合混合物をコンピ
テント細胞菌株５６２０２５１へ形質転換し、アンピシ
リン耐性形質転換体を選択する。

４、精製プラスミドのＡ’ｈａＩＩＩ制限パターンを使
用して、合成断片をもつ絹換えプラスミドが受入れられ
た細胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末
端がｐＲＥＶ２．２のＥｃｏＲＶ末端に再結合され、Ｂ
ａｍＨＩ張り出し末端どうしが一緒に再結合されるよう
な方向にある。適当なプラスミドをＡｈａ■で消化させ
ると約１２１０．１０２０．７５０．６９０．５００．
３４０及び２０塩基対の断片長さが得られる。この組換
えプラスミドを受入れた菌株を、５０ａｇ／ｓ＋ｌのア
ンビシリンを含有する２ｚ培地中で生育させ、細胞タン
パクの全量をＳ［）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動にかけると、約２６　ｋＤのタンパクをクマシー
ブルー染色により、又はエイズ、ＡＲＣ又はＨＴＬＶ−
ｍに感染した人から選択された血清をプローブとして使
用するウェスタン・プロット分析によって視覚化できる
。

実施例５　７　ラスミＦ　ｐＰＢ１＋ｚｓカら＋７）　
ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｍンベローブ配列を含有する組換え
タンパ クの精製 １、細胞生育 チエマツプ発酵装置中で２１培地中の細胞を１０リツト
ル容量で生育させた０発酵塩度３７℃、ｐＨ６，８、及
び空気を１　ｖｖ＋ｍで供給した。プラスミド選択は、
５０μ８１１アンピシリンと２０μｇ／ｍｌクロラムフ
ェニコールで提供された。典型的な細胞収率（湿潤重量
）は３０　ｇ／ｌであった。

２．１ｉｌｌ＠溶菌 組換えＩ（ＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープ融合タンパクを
含有する大腸菌５０ｇ（湿潤細胞重量）を、５０１Ｍ　
）リス−ＩＣＩ（ｐＨ８，０）、５清Ｈエチレンジアミ
ンテトラ酢酸（Ｅｌ）ＴＡ　）、５＋ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、１５ｎ＋Ｍβメルカプトエタノール
、０．５χＴＲＩＴＯＮ”　Ｘ−１００，及び５ｍＭフ
ッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）からなる液
の最終容量１００１中に再懸濁させた。リゾチーム３０
０　Ｂを加え、懸濁液を室温で３０分培養した。

この材料は同量の０．１−０．１５μｍガラスピーズを
含有するＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ””（バイオスペック
・プロダクツ社、オクラホマ州パードルスピル）を使用
して溶菌化された。室温で、１分間隔で６分間、溶菌を
行なった。液体をビーズから分離し、２０　、０００λ
ｇで２６５時間遠心分離した。上澄み液を除去し、ペレ
ットを６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭ　）リス−ＩＩ
　ＣＩ　（１１８８，０）、５ｍＭ　ＤＴＴ、　１５＊
Ｍβ−メルカプトエタノール、５ｎ＋Ｍ　ＰＭＳＦ及び
１ｍＭ　ＥＤＴＡ（１００ａ＋Ｉ）に溶解した。ポリト
ロンホモジナイザーを使用してペレットを溶解化し、２
０．０００ｘｇで２時間遠心分離した。

上澄み液（９０ｍｌ）を８Ｍ尿素、２０　ｍＭ燐酸カリ
ウム（ｐｎ　７．０）、１　ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、及び１
５　ｍＭβ−メルカプトエタノール（４リツトル）に対
して透析した。透析は、緩衝液を３回代えて、１回ごと
に８時間以上行なった０分子量３．５　ｋＤのカットオ
フをもつスペクトラファー透析管（Ｓ／Ｐ社、イリノイ
州マグローヒル）を使用した。

３、　　ＣＭクロマトグラフィ ＣＭファスト　フロー　セファロース（Ｆａｓｔ　Ｆｌ
ｏｗＳＥＰＨＡＲＯ５Ｅ”）　（ファーマシア社）を充
填し、８Ｍ尿素、ｌ（ｌｓＭ燐酸カリウム（ｐＨ７，０
）、１５腸Ｈβ−メルカプトエタノール、及びＩｍＭε
ＤＴＡで平衡化した５５０１１１カラム（５ｃｓ＋　ｘ
　２８　ｃｍ）に透析物を室温で装填した。

カラムを２リツトル平衡化緩衝液で洗い、タンパクを０
・０．４Ｍ　ＮａＣ１の５．０リツトル線形勾配で溶離
した。ＨＴＬＶ−１１１タンパク（２６に口）は、５Ｏ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検定されると、
約０．２Ｍ　Ｎａｃｌで溶離された。

実施例６　プラスミドｐ５９０の構築と発現プラスミド
ｐ５９０は、ＰｖｕＩＩ位置から旧ｎｄＩ［１位置まで
の）ＩＴＬＶ・ＩＩＩｅｎｖ遺伝子を本質的にコードし
たＤＮＡ約１０５５塩基対を含有しており、ｇｐ１６０
エンベロープタンパクのこの部分を含有する約８６　ｋ
Ｄの融合タンパクがこれから合成される。このプラスミ
ドを次のように構築できる。

■、第６表に示ψ配列のＤＮＡを合成する。このＤＮＡ
断片は標準方法で合成でき、ｇｐｔｅｏの一部をコード
している。これは５′末端にプラント末端をもち、３′
末端に旧ｎｄｎＩ張り出し部分と再結合する末端をもっ
ている。

２、　プラスミドｐＲＥＶ２．２（５Ｍｇ）をＥｃｏＲ
Ｖと）Ｉｉｎｄｍで制限し、約４　ｋ［＋の大きな断片
をアガロースゲルから単離する。

３、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、第６表の断片０
．１Ｍｇを２０　ｍｌ（７）容量でｐＲＥＶ２．２断片
０．１μｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテント
細胞菌株５Ｇ２０２５１へ形質転１負し、アンピシリン
耐性形質転換体を選択する。

４、精製プラスミドのＡｈａＩＩＩ制限パターンを使用
して、合成断片をもつ絹換えプラスミドが受入れられた
細胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端
がｐＲＥＶ２．２のＥｃｏＲＶ末端に再結合され、）Ｉ
ｉｎｄｍ張り出し末端どうしが一緒に再結合されるよう
な方向にある。適当なプラスミドをＡｈａ■で消化させ
ると約１７４０．１０２０．７５０．６９０．５００．
３４０及び２０塩基対の断片長さが得られる。

５、　この菌株から精製されたプラスミド５μｇをＮｄ
ｅ　Ｉ及びＳ＋ｇａ　Ｉで制限する。約１４２５塩基対
の断片をアガロースゲルから単離する。　ｇｐｔｅｏの
切片をコードしたＤＮＡに１５０５塩基対の断片を融合
する。

６、プラスミドρＢＧＩＯＩをＢａｍＨＩで制限し、ク
レノフボリメラーゼとｄＮＴＰｓで張り出し末端を補充
してから、この断片をＮｄｅ　Ｉで制限する。約６．５
ｋＯの断片がアガロースゲルから単離される。

？、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｎｄｅ　Ｉ　−
５＋ｗａ　Ｉの断片０．１ＭｇをｐＢＧ＋断片０．１Ｍ
ｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌株
５Ｇ２０２５１へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体を選択する。

８、精製プラスミドのＡｈａｎｌ制限パターンを使用し
て、合成断片をもつ組損えプラスミドが受入れられた細
胞を選択するが、この合成断片は断片のＳｍａ　Ｉプラ
ント末端が補充されたＢａｍＨＩ末端に再結合され、Ｎ
ｄｅ　Ｉ張り出し末端どうしが一緒に再結合されるよう
な方向にある。適当なプラスミドをＡｈａＩＩ［で消化
させると、約５９００．１０２０．６９０．４３０、及
び２０塩基対の断片長さが得られる。

９、この組換えプラスミドを受入れた菌株を、５０Ｍｇ
ｅｍ　ｌのアンピシリンを含有する２ｚ培地中で生育さ
せ、細胞タンパクの全量を５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動にかけると、約８６　ｋＤのタンパク
をクマシーブルー染色により、又はエイズ、ＡＲＣ又は
ＨＴＬＶ−ｍに感染した人から選択された血清をプロー
ブとして使用するウェスタンφプロット分析によって視
覚化できる。

実施例７　プラスミドｐ５９０からのＨＴＬＶ−ｍエン
ベロープ配列を含有する組換えタンパクの 精製 １、細胞の生育 チエマツプ発酵装置中で２ｘ培地中の細胞を１０＋７ツ
トル容量で生育させた０発酵温度３７℃、ｐＨ６，８、
及び空気をｌ　ｖｖ■で供給した。プラスミド選択は、
５０μ８／−１アンピシリンで提供された。典型的な細
胞収率（湿潤重量）は３０　ｇ／Ｉであった。

２、細胞溶菌 組換えＨＴＬＶ−ｍエンベロープ融合タンパクを含有す
る大關菌５０８（湿潤細胞重量）を、５（１ｗＭ　）リ
ス−ＭＣＩ（ＰＨ８，０）、５ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、　５
ｍＭ　ＤＴＴ、　　１５ｍＭ　β−メルカプトエタノー
ル、０．５ＸＴＲＩＴＯＮｌｌＸ−１００、及び５１１
ＭＰＭＳＦからなる液の最終容量１００１中に再懸濁さ
せた。リゾチーム３００　ａ＋ｇを加え、懸濁液を室温
で３０分培養した。

この材料は同量の０．１−０．１５ａｖ＋ガラスピーズ
を含有するＢＥＡＤ−ＨＥＡＴＥＲＴＭを使用して溶菌
化された。

室温で、１分間隔で６分間、溶菌を行なった。液体をビ
ーズから分離し、２０．０００ｘｇで２．５時間遠心分
離した。上澄み液を除去し、ペレットを６Ｍグアニジン
塩酸塩、２０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、５
１Ｍ　ＤＴＴ。

１５剛阿β・メルカプトエタノール、５ＭＭ　ＰＭＳＦ
及びＩＩＩＭＥＤＴＡ（１００ｗ＋Ｉ）に再懸濁した。

ポリトロンホモジナイザーを使用してベレットを溶解化
し、２０，０００ｘｇで２時間遠心分離した。

上澄み液（９０１）を８Ｍ尿素、２０ｍＭ）リス−ＨＣ
Ｉ（＋）Ｈ８，Ｏ）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び１５　
ｍＭβ−メルカプトエタノール（４リツトル）に対して
透析した。透析は、緩衝液を３回代えて、１回ごとに８
時間以上行なった。

３、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）クロマトグラフ
ィ ＤＥＡＥファストフロー（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）セファ
ロース（５ＥＰＨＡＲＯＳＥ”）　（ファーマシア社）
を充填し、団尿素、２０ａ＋ＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８
，０）、１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、及びＩｍ
Ｍ　ＥＤＴＡで平衡化した５５０１１１カラム（５ｃｍ
　ｘ　２Ｂ　ｃｍ＋）に透析物を室温で装填した。

カラムを１．５リツトル平衡化緩衝液で洗い、タンパク
を緩衝液中の０−０．８Ｍ　ＮａＣｌの５リツトル線形
勾配で溶離した。　ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクは約０．
４Ｍ　ＮａＣ１で溶離され、５Ｏ５−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を使用し、約８６ｋＯの有力タンパクを
追跡して検定された。

ＨＴＬＶ−ｔ［Ｉタンパクを含有するフラクションを一
緒ニシ、分子量１Ｏ９０００ノカツトオフＩｌｌ　（Ｙ
Ｍ−１０、アミコン社）を取り付けた応力セル正圧濃縮
器（アミコン社）を使用して、タンパクを１０　ｍｌに
濃縮した。

スーパーファイン５ＥＰ）ＩＡＣＲＹＬＲ５−３００（
ファーマシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０ｍｒｌ　）
リス−〇ＣＩ（１１Ｈ８，０）、１５ｍＭβ−メルカプ
トエタノール、及び１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化した５０
０１カラム（２，５ｃｍ　ｘ　１００　ｃｍ）に、濃縮
液を装填した。カラムを室温で平衡化緩衝液で溶離した
。毎分０．５１の流量を維持した。　ＨＴＬＶ−■タン
パクはカラム容量の約４０Ｘで溶離した。

実施例８　プラスミドρに旧の構築と発現プラスミドｐ
ＫＨ１は、本質的ににｐｎＩ位置からＨｉｎｄｕ１１位
置までのＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｅｎｖ遺伝子をコードした
ＤＮＡ約１８３０塩基対を含有しており、ｇｐ１６０エ
ンベロープタンパクのこの部分を含有する約７０　ｋＤ
の融合タンパクがこれから合成される。このプラスミド
を次のように構築できる。

１、第７表に示す配列のＤＮＡを合成する。この［ｌＮ
Ａ断片は標準方法で合成でき、ｇｐ１６０の一部をコー
ドしている。これは５′末端にプラント末端をもち、３
′末端にＨｉｎｄｍ張り出し部分と再結合する末端をも
っている。

２．１ラスミドｐＲＥＶ２．２（５ｇ　ｇ）を旧ｕｌで
制限し、末端をプラントにするためにＤＮＡをクレノフ
ボリメラーゼで処理してから、旧ｎｄＩ［Ｉで処理して
、約５　ｋＤの大きな断片を７ガロースゲルから単離す
る。

３、　　Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、第７表の断片０
．１ｇｇを２０μｍの容量でｐＲＥＶ２．２断片０．１
μｇと再結合させ、再結合混合物をコンピテント細胞菌
株ＣＡＧ６２９へ形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体を選択する。

４、精製プラスミドのＡｈａ［［制限パターンを使用し
て、合成断片をもつ絹換えプラスミドが受入れられた細
胞を選択するが、この合成断片は断片のプラント末端が
ρＲＥＶ２．２の旧ｕｌ末端に再結合され、旧ｎｄｎｌ
張り出し末端どうしが一緒に再結合されるような方向に
ある。適当なプラスミドをＡｈａ■で消化させると約１
７３０、＋０２０．７５０．６９０．６４０．６００．
３４０及び２０塩基対の断片長さが得られる。この紐換
えプラスミドを受入れた菌株を、５０μｇ／１１１のア
ンピシリンを含有する２ｚ培地中で生育させ、細胞タン
パクの全量を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動にかけると、約７０ｋＯのタンパクをクマシーブル
ー染色により、又はエイズ、ＡＲＣ又はＨＴＬＶ−ｎＩ
に感染した人から選択された血清をプローブとして使用
するウェスタン・プロット分析によって視覚化できる。

実施例９　プラスミドｐに旧からのＨＴＬＶ−ｍエンベ
ロープ配列を含有する組換えタンパクの 精製 ■、細胞の生育 チエマツプ発酵装置中で２ｘ培地中の細胞を１０リツト
ル容量で生育させた０発酵温度３２℃、ｐＨ６，８、及
び空気を１　ｖｖ＋ｇで供給した。プラスミド選択は、
５０μｇ／ｍｌアンピシリンで提供された。典型的な細
胞収率（湿潤重量）は３０　ｇ／Ｉであった。

２、細胞溶菌 絹換えＨＴＬＶ−ｍエンベロープ融合タンパクを含んだ
大腸菌５０ｇ（湿潤細胞重量）を、５０ＩＩＭトリスー
ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、５＋ｗ　ＥＤＴＡ、５＋ｗＭジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）　、１５ｍＭ／１３−メル
カプトエタノールＩＴＯＮ’　Ｘ−１００、及び５＋ｍ
Ｍ　ＰＭＳＦからなる液の最終容量１００１中に再懸濁
させた。リゾチーム３００　１ｍ８を加え、懸濁液を室
温で３０分培養した。

この材料は同量の０．１−０．１５μｍガラスピーズを
含有するＢＥＡ［１−ＢＥＡＴＥＲＴＭ（バイオスペッ
ク拳プロダクツ社）を使用して溶菌化された．室温で、
１分間隔で６分間、溶菌を行なった．液体をビーズから
分離し、２０，０００ｘ８で２．５時間遠心分離した．
上澄み液を除去し、ペレットを８Ｍ尿素、２０ｗ＋Ｍ　
）リス−■ＣＩ（ｐＨ８．０）、５ｓ＋Ｍ　［ｌＴＴ，
　１５ｍＭβ−メルカプトエタノール、５■Ｍ　ＰＭＳ
Ｆ及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ（１００　＋ｗｌ）に溶解した
。

ポリトロンホモジナイザー（ベックマン社、カリフォル
ニア州バークレー）を使用してペレットを溶解化し、２
０．０００ｘｇで２時間遠心分離した。

３、　　ＤＥＡＥクロマトグラフィ ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”
　（ファーマシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０ｎ＋Ｍ
）リス−ＨＣＩ（ｐＨ　８．０）、１５ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、及び１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化した５
５０１カラム（５ｃｍ　ｘ　２８　ｃｍ）に上澄み液を
室温で装填した．カラムを１．５リツトル平衡化緩衝液
で洗い、タンパクを緩衝液中のＯ−０．８Ｍ　ＮａＣｌ
の５リツトル線形勾配で溶離した．　ＨＴＬＶ・■タン
バりは約０．２Ｍ　ＮａＣｌで溶離され、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を使用し約７０ｋＯのタン
パクを追跡して検定された。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパクを含有するフラクションを一
緒にし、分子量１０，０００のカットオフ膜（ＶＭ−ｔ
ｏ、アミコン社）を取り付けた応力セル正圧濃縮器（ア
ミコン社）を使用して、タンパクを１０　ｍｌに濃縮し
た。

スーパーファイン５ＥＰＨＡＣＲＹＬ”　Ｓ−３００（
ファーマシア社）を充填し、８Ｍ尿素、２０＋ｇＭ）リ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ８゜０）、１５ｍＭβ−メルカプトエ
タノールで平衡化した５００１カラム（２．５ｃｍ　ｘ
　１００　ｃｍ）に濃縮液を装填した。カラムを室温で
平衡化緩衝液で溶離した。毎分０．５１の流量を維持し
た，　）ＩＴＬＶ−■タンパクはカラム容量の約４０％
で溶離した。

４、　　ＳＯＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にＨｌを
含有するフラクションを一緒にし、分子量１０，０００
のカットオフ膜を取り付けた応力セル正圧濃縮器を使用
して、タンパクを濃縮した．タンパク２　１ｇを装填緩
衝液と混合し、エム・ダブリュウ串バンカピラー（Ｍ．
Ｗ．　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）、イー・ルジャン（Ｅ
．　Ｌｕｊａｎ）、エフ・オストランダ−（Ｆ．Ｏｓｔ
ｒａｎｄｅｒ）、及びエル拳イー・フード（Ｌ．Ｅ．　
Ｈｏｏｄ）Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏ
ｇｙ　９１巻２２７−２３６頁（１９８３年）に記述さ
れたとおりに、分離用ＳＤＳーポリアクリルアミドゲル
（４０　ｃｍ　ｘ　２０　ｃｔｓ　ｘ　４　ａｍ）に通
して電気泳動ニカけた．　７０ｋＤ（Ｄ　１１ＴＬＶ−
１１１タンハクヲ０．２５Ｍ　ＭＣＩで視覚化し、上記
のようにゲルから溶離した。タンパクをアセトンで沈殿
させてＳＤＳから除去できる［ダイナン・ダブリュウ・
ジエイ（Ｄｙｎａｎ．ｌｊ．Ｊ．）、ジエントリサック
・ジエイ・ジエイ（Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ，Ｊ。

Ｊ．）、ヘイガーφデイー会エイ（Ｈａｇｅｒ．　０．
Ａ．）及びバージニス・アールφアール（Ｂｕｒｇｅｓ
ｓ，　Ｒ．Ｒ．）（１９８１年）Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃ
ｈｅｍ．　２５６巻５８６０−５８６５頁コ。

実施例１０　　ＰＢＩの非融合誘導体の構築Ｎ・末端メ
チオニン以外の非ＨＴＬＶ・■アミノ酸を含有しないＰ
ＢＩタンパクの非融合誘導体は、オリゴヌクレオチド指
向の部位特異的変異誘発［イノウニ・ニス、イノウニ・
エムｒ　ＤＮＡ及びＲＮＡの合成と応用Ｊ　（Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　＆　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｄ
ＮＡ　＆　ＲＨＡ）、ナラングφサラン・エイ編、アカ
デミツクブレス社、１９８７年］を用いて構築された．
この手順では、ｐＰＢｌのｅｎｖ遺伝子配列から上流の
非Ｈ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−Ｉ［１９０ｂｐと下流の３９　ｂｐ
とが、合成オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に
よって生ずるＤＮＡループアウトを経て削除された。

Ｎ−末端ループアウトのために合成されるオリゴヌクレ
オチドは、β−グルクロニダーゼ遺伝子の出発コドンが
ＨＴＬＶ・ｍ　ｅｎｖ遺伝子配列の５′末端に隣接して
置かれるように意図されている（第４図）。

オリゴヌクレオチドは、新しくつくられたこの連結点の
両側と相同の配列を含んでおり、これによってプラスミ
ドＤＮＡへの適当なハイブリッド形成が可能となる。

ハイブリッド形成の基質である１本鎖ギャップと共にヘ
テロデュプレックスを形成するために使用される二つの
ＤＮＡ分子は、ｐｐｅｔをＳａｌｌとＨｐａ　１で、又
はＰｓｔ　Ｉのみで消化させてつくった．線状化したｐ
ｐｅ　ｌをＰｓｔ　Ｉで消化し、またＳａｌ　ＩとＨｐ
ａ　［で二重に消化すると、３８００とＴＯＯ　ｂｐの
断片を生じ、その大きい方を変異誘発用にゲル単離した
。

オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理、ハイブリッド形成
、重合、及び閉環分子をつくるための再結合は、上記の
イノウニ及びイノウニの方法に従って行なわれた．欠失
を含んだＤＮＡ分子を濃縮するために、削除される領域
内で切断を行なう旧ＵＩでＤＮＡ混合物を消化させた。

消化済みＤＮＡを使用して、コンピテント大腸菌３Ｍ１
０５細胞を形質転換し、ＶＴ（リットル当たりトリプト
ン８ｇ、酵母エキス５　ｇ，及びＮａＣｌ　５　ｇ）Ｃ
ｍプレート上で３７℃で一夜生育させて、プラスミドを
含有する形質転換体を単離した。

プラスミドＤＮＡを各形質転換体から単離し、旧ＵＩと
Ｈｉｎｄｍでの同時消化によって正しい構造について審
査した．削除されなかった分子は、約３９００と６００
　ｂｐの断片を生じた．欠失を含んでいる分子は旧ｕ１
位置をもたず、約４４００　ｂｐの線状分子を生じた．
欠失を含むと思われる形質転換体からのプラスミドＤＮ
Ａを再形質転換させ、欠失及び無欠失プラスミドの分離
と純粋なプラスミド集団の回収を確実にした．これらの
第二の形質転換体からのＤＮＡを前の消化物でのように
分析し、正しい構造をもつことを決定した。このプラス
ミドはｐΔＰＢＩと指定された。

Ｃ末端の非ＨＴＬＶ−ＩＩＩアミノ酸を排除するために
、ｐΔＰＢＩプラスミドを基質として使用し、オリゴヌ
クレオチド指向性の部位特異的変異誘発を行なった。オ
リゴヌクレオチド（第５図）は、ＴＧＡコドンが枠外で
はｅｎｖ遺伝子配列から下流に生じ、これがｅｎｖ遺伝
子配列の３′末端にすぐ隣接するようにＴＧＡコドンを
位置させ、また枠内では翻訳停止コドンとして作用させ
ることを意図している。

ハイブリッド形成に使用されるヘテロデュプレックスを
形成する分子は、ｐΔＰＢＩをＰｓｔｌのみで、又はＫ
ｐｎ　ＩとＨｐａ　Ｉで消化させてつくった。ベクター
のほとんどを包括する大きなＫｐｎ　Ｉ　／）Ｉｐａ　
Ｉ断片を、変異誘発用にゲル単離した。キナーゼ処理、
ハイブリッド形成、重合、及び再結合は上のように実施
された。欠失分子の濃縮は、削除される領域内で切断を
行なう旧ｎｄｍでの消化によフて達成された０ＤＮＡを
上のように細胞の形質転損に使用した。

プラスミド［ｌＮＡを各形質転換体から単離し、Ｅｃ。

Ｒ１とＨｐａ　Ｉでの同時消化によって正しい構造につ
いて審査した。欠失プラスミドは２９００と１７５０　
ｂｐの二つの制限断片をもたらす、このパターンを示す
プラスミドＤＮＡを上のとおりに再形質転換し、これら
の形質転換体からのＤＮＡを同じ消化で分析した。Ｎ−
末端とＣ−末端の欠失を含有するこのプラスミドは、ｐ
ｄ２ＰＢ１と指定される。

プラスミドｐΔＰａｌを受入れた菌株を、５０μ３／ｍ
ｌのアンピシリンを含有する２ｚ培地［２％酵母エキス
、バクトドリブトン、カサミノ酸くデイフコ製、ミシガ
ン州デトロイト）、０．２ニー塩基カリウム、０．２χ
二塩基カリウム、及び０．２ｘ二塩基ナトリウム］中で
生育させ、細胞タンパクの全量を５Ｏ５−ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動にかけると、約２２ｋＤのタン
パクをクマシーブルー染色により、又は鞘換えｅｎｖ遺
伝子タンパクで免疫化された動物から選択される血清を
プローブとして使用するウェスタン・プロット分析によ
って視覚化できる。同じ条件下に約２０ｋＯのタンパク
がｐｄ２ＰＢ１を含有する菌株中でつくられる。

オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的変異誘発の手法
は、ｅｎＶ遺伝子の融合タンパクＲＩＯ１５９０、及び
に旧を迂回して非ＨＴＬＶ−ｎｌアミノ酸を排除するた
めに、同様な方法で使用できる。

上記の手順で、融合タンパクからの非ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
配列の除去は、タンパクのＮ−末端とＣ−末端の双方で
アミノ酸を除去するものであり、連続した二段階で達成
される。

Ｎ−末！４位置のメチオニンが酵素メチオニンアミノペ
プチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的に開裂されること
は、この技術で周知である。　ＭＡＰは大腸菌［ベン：
バサット・エイ（Ｈｅｎ−Ｂａｓｓａｔ、　Ａ、）、バ
ウアー・ケイ（Ｂａｕｅｒ、に、）、チャン・ニス、・
ワイ（（ｈａｎｇ。

Ｓ、Ｙ、）、ミャンボ・ケイ（Ｍｙａｍｂｏ、に、）、
ブースマン−ｘイ（Ｂｏｏｓｓ＋ａｎ、Ａ、）及びチャ
ン・ニス（Ｃｈａｐ、　Ｓ、）（１９８７年）　Ｊ、　
ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６９巻（２号）７５
１−７５７頁］とねずみチフス菌（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌ
ａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓ＋）からクローン化され、
生体外活性は鞘換えタンパクで実証された［ミラー◆シ
ー・ジー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｃ。

Ｇ、）、ストラウチφケイ・エル（Ｓｔｒａｕｃｈ＋に
、Ｌ、）、ククシール・エイΦエム（Ｋｕｋｒａｌ、　
Ａ、Ｍ、）、ミラー・ジェイ・エル（Ｍｉｌｌｅｒ、　
Ｊ、Ｌ、）、ウィングフィールド寺と−・テ４−’（Ｗ
ｉｎｇｆｉｅｌｄ、　Ｐ、Ｔ、）、マツセイ辱ジー・ジ
エイ（Ｍａｓｓｅｉ、　Ｇ、Ｊ−）、ワーレン争アール
・シー（Ｗｅｒｌｅｎ、　Ｒ，Ｃ，）、グレーバー・ビ
ー（Ｇｒａｂｅｒ、　Ｐ、）及びモヴ７”エヌ・アール
（Ｍｏｖｖａ　＋Ｎ、Ｒ，）（１９８７年）　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４巻
２７１８−２７２２頁］、従って、Ｎ−末端メチオニン
除去は生体内で、ＭＡＰをつくるホスト（例えば大ｌｌ
Ｉ菌ＣＭ８９又はＳ、セレビシェ）中でタンパクを発現
させるか、又は生体外で精製ＭＡＰを用いて（例えばミ
ラーらの手順で）達成できる。

ｐｄ２ＰＢ１の精製 他に特定されなければ、段階はすべて室温で実施される
。

〔溶１ｌｌ−ｐｄ２ＰＢｌを含有する冷凍細胞ペースト
の７００■１びん３本を３７℃で解凍し、ＪＳ−４，２
０−夕付きＪ−６８遠心分離器（ベックマン社、カリフ
オルニア州パロアルト）にかけ、４℃、ＬＯＧＯｒｐｍ
＋で３０分回転させる。上澄み液を捨て、細胞ペレット
重量を測定する。細胞ペレット（典型的には１　ｋｇ）
を８ト１尿素、２０　ｍＭ）　’／　ス−ＨＣＩ（ｐＨ
７，５±０．１）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１４．７ａ＋
Ｍ　２−メルカプトエタノール及び１ｍＭ　ＰＭＳＦか
らなる溶菌緩衝液（ｖ／ｗ）２倍量に再懸濁する。

０．５−０．７　ｓ■ガラスピーズを含有するＴＤＫ型
パイロットＤＹＮＯ−旧ＬＬ〜（インパンデックス社、
ニューシャーシー州メイウッド）に、再！Ｊ濁された細
胞ペレットを毎分２００−４００　ｍｌで通す、使用に
先立って、Ｄ’／ＮＯ−ＭＩＬＬＪＺ溶Ｗ！１ｌｊｆｆ
ｌリットルを仕込み、溶液が周囲温度より低温で流れる
ように装置を冷却する。再懸濁された細胞ペレットをＤ
ＹＮＯ−旧ＬＬ”に２回通し、二回目の通過後、ＤＹＮ
Ｏ−旧ＬＬ′″を溶菌ａ衝１αｌリットルで洗う。溶菌
細胞懸濁液と洗浄液を一緒に蓄える。

［濃縮と濾過］−溶菌細胞懸濁液に洗浄液１リツトルを
加えたものを、ペリコン４　ＧＰＭ系（ミリポア社、マ
サチューセッツ州ベトフォード）中の０．４５μデユラ
ボア（ＤｔＪＲＡＰＯＲＥＴＭ）ペリコンカセットを使
用して、８００１に濃縮する＊　４０　ｐｓＩ以下の人
口圧とＩＯないし２０ｐｓｉの出口圧で濃縮を行なう。

濃縮後、溶菌細胞懸濁液は、透析濾過用の配管を取り付
けた同じペリコン系、カセット、及び圧力設定を使用し
て、溶菌緩衝液４リツトルと共に濾過される。

［抽出］−洗浄された溶菌細胞懸濁液は、上記のように
透析濾過用の配管を取り付けた同じペリコン系、カセッ
ト及び圧力設定を使用して、６ＭグアニジンＨＣＩ、＋
００ａ＋Ｍ　）リス−）ＩＣＩ（ｐＨ７，６±０．１）
、及び１０ｍＭ　ＥＤＴＡからなる抽出緩′＃１液ｌＯ
リットルで抽出される。

［緩衝液交換］−ＰＴＧ（Ｊ　セット二つ（１０，００
０ＮＭＭＬ）をもつベリコン４ＧＰＭ系を使用して、前
段階からの濾液を典型的にはｌリットルに濃縮する。５
０ρｓｉ以下の人口圧と３０ないし４５　ｐｓｉの出口
圧で濃縮を行なう、濃縮後、上澄み液を８Ｍ尿素、２５
ｍＭ燐酸カリウム、及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６，
８±０．１）からなる３、０−Ｓ／Ｃ−以下の伝導率を
もつＣＭカラム緩衝液と緩衝液交換する。緩衝液の交換
には、上記のように透析濾過用の配管を取り付けた同じ
ペリコン系、同じカセット及び同じ圧力設定が使用され
る。

濃縮抽出液１リツトルを緩衝液交換するのに、ＣＭカラ
ム緩衝液８リットルが使われる。緩衝液交換後、緩衝液
交換された抽出液を系から抜出し、ωカラム緩衝液１リ
ットルで系を洗う、緩衝液交換した抽出液と洗浄液を一
緒にし、溶液の伝導率とｐＨを測定する。溶液伝導率を
脱イオン化された肥尿素で３．０　ｍｓ／ｃｍに調整し
、ｐＨを６．５−７．０の範囲内に調整する。

［ＣＭクロマトグラフィ］−ＣＭセファロース（ＳＥＰ
ＨＡＲＯ５Ｅ’）ファスト７ｃ２−　（ＦＡＳＴ　　Ｆ
ＬＯＷ）　（７７−マシア社、ニューシャーシー州ビス
力タウエー）の５０　ｘ　５１　ｃ−カラムを、４カラ
ム容量の０．５Ｍ　ＮａＯＨ。

２カラム容量の脱イオン水、及び２−３カラム容量のＣ
Ｍカラム緩衝液で次々に洗浄することによって平衡化す
る。流出液のｐＨがＣＭカラム緩衝液の０．２単位内に
あり、流出液の伝導率がＣＭカラム緩衝液の０．３　＋
＊ｓ／ｃｍ内にある時に、カラムは平衡状態と考えられ
る。

装填には、緩衝液交換された抽出液を１０ないし！５　
ｐｓｉの人口圧でカラムにポンプで送る。装填後、流出
液の２８０　ｎｓ＋での光学密度（００）が０．１未満
になるまで、ＣＭカラムをＣＭカラム緩衝液で洗う０次
にＣＭカラム＆１衡液液中０−０．５Ｍ　ＮａＣｌの８
リツトル線形勾配でｐｄ２ＰＢ１を溶離し、１００■１
フラクシヨンを集める。フラクションを５０５−ＰＡＧ
Ｅと抗ｇｐ１６０抗体によるウェスタンで検定し、有意
のｐｄ２ＰＢ１と痕跡量の汚染物質を含有するフラクシ
ョンを一緒にする。

［有機抽出］−前段階からの一緒にしたタンパク溶液を
゛、かきまぜながら純粋なアセトニトリルを徐々に添加
することにより、アセトニトリル５５χ対タンパク溶液
４５χ（Ｖ／Ｖ）の比にもっていく、全部のアセトニト
リルを添加してから、ＪＡＩＯロータ（ベックマン）を
使用するＪ２−２１遠心分離器で、溶液を１０，０００
　ｒｐ−１４℃、１５分の遠心分離にかける。

遠心分離後、上澄み液を集め、ペレットを捨てる。

かきまぜながら純粋な９５Ｘエタノールを徐々に添加す
ることにより、遠心分離の上澄み液を、エタノール３５
ｚ対上澄み液６５％（ｖ／ｖ）の比にもっていく、全部
のエタノールを添加した後、ＪＡ−１０ロータを使用す
るＪ２−２１遠心分離器で、溶液を１０，０００ｒｐｍ
、４℃で１５分の遠心分離にかける。遠心分離後、ペレ
ットを集め、上澄み液を捨てる。

ペレットを１５分空気乾燥し、８Ｍ尿素、０．３Ｍグリ
シン、５ｓＭ　ＥＤＴＡ、　＋５■Ｍ２−メルカプトエ
タノール、ＩｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ
８，５０±０．０１）からなるＳ−３００カラム緩衝液
に再溶解する。この段階の初めに蓄えたタンパク溶液の
１０分の１の容量に等しい容量のＳ−３００カラム緩衝
液にペレットを溶解する。

［濃縮］−上からの再溶解タンパク溶液の吸光度を２８
０ｎ−で測定し、タンパクのｌ　ｍｇ／ｓ＋ｌ溶液が２
８０　ｎ−で１．０の吸光度をもつことを仮定して、大
体のタンパク濃度を測定する。　ＹＭ−１０膜を備えた
２００−１アミコン製のかきまぜ機付き細胞濃縮装置を
使用して、溶液を１０−ｇ／ｍｌに濃縮する。

［Ｓ−３００クロマトグラフィ］−濃縮タンパク溶液３
０・７０■１をセファクリル（５ＥＰＨＡＣＲＹＬ”）
　Ｓ−３００（）７−マシア社）の５．０ｘ１３５　ｃ
ｍカラムに装填する。

８Ｍ尿素、０．３Ｍグリシン、５＊Ｍ　ＥＤＴＡ、　１
５５Ｍ　２−メルカプトエタノール、Ｉｇ＋Ｍジチオス
レイトール（［１ＴＴ）（ｐＨｓ、ｓｏ±０．０１）か
らなるＳ・３００カラム緩衝液で予めカラムを平衡化し
ておく、装填後、カラムを同じ緩衝液でまんべんなく操
作する。２０１フラクシヨンを集め、フラクションを５
ＯＳ−ＰＡＧＥでｐｄ２Ｐ８１含有量の検定を行なう。

ρｄ２ＰＢ１を含有する適当なフラクションから同量の
７リコートを取り、どのフラクションが蓄えるのに満足
かを決めるために使用する。アリコートを蓄え、８Ｍ尿
素、２５ｓ＋Ｍ燐酸ナトリウム、１　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　
ＴＡ（ｐＨ６，８±０．１）に対して一夜透析し、透析
緩衝液をブランクとして使用して、透析された貯蔵液の
ｐＨを測定する。溶液のタンパク１度は、ｐｄ２ＰＢ１
の計算吸光係数１．０（■ｇ／＋ｗｌ）−’を用いて決
定される。

５ＤＳ−ＰＡＧＥは、１５％　５０５７クリルアミドゲ
ルを使用して、透析貯蔵物ｌＯμｇ上で操作される。ク
マシー染色及び脱染色後、ウォータース（マサチューセ
ッツ州ミルフォード）＄１７４０インテグレータに接続
されたＬＫＢ（メリーランド州ゲイサーズバーグ）製の
走査式濃度計を使用して、ゲルを走査する。

ゲル上のｐｄ２ＰＢ１バンドが９７％純度より大きい場
合は、アリコートに使用されたフラクションは、０゜０
６　ｅｕ／ｍｌ管を使用するリムラス・アメーバ様細胞
溶菌物（ｌｉｓｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ　Ｌｙｚ
ａｔｅ）（ＬＡＬ）検定で、１−２０倍希釈の菌体内毒
素について検査される。希釈フラクションでのＬＡＬ試
験が陰性の場合は、フラクションを蓄え、その後の操作
に使用される。

ゲルが純度仕様に満たない場合は、異なる組のフラクシ
ョンからの同量のアリコートを用いて、方法を繰り返す
、　１−２０倍希釈で陰性のＬＡＬ試験をもつフラクシ
ョンのみを蓄える。

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Ｍｅｔ；ｕＴ＋ｒＬｖｓＴ＋ｙｒＬｙｓすａｌすａｌＬ
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【図面の簡単な説明】

第１図−これは新規なタンパクをコードしたベクターを
構築するために使用されるプラスミドｐＲＥＶ２．２の
構築の流れ図である。 第２図・−これは複数のクローン化位置を示すプラスミ
ドｐｉＥＶ２．２の図である。 第３図−これはＨＴＬＶ−ＩＩＩエンベロープ遺伝子と
それから得られる新規な組換えタンパクの作図である。 第４図−ＰＢＩからのＮ−末端における非ＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩ配列の除去を示す図。 第５図−Ｐｅｔから（７）Ｃ−末端における非ＨＴＬＶ
−ｍ配列の除去を示す図。 出願人　レプリゲン　コーポレーション代理人　佐々井
　弥太部　（外１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リンパ球増殖応答の刺激を必要としているヒトを処
   置する為の、Ｒ１０、ＰＢ１、５９０及びＫＨ１からな
   る群から選ばれるＨＴＬＶ−IIIタンパクの組換えＨＴ
   ＬＶ−IIIエンベロープタンパク部分を含む、ヒトのリ
   ンパ球増殖応答刺激剤。 ２、組換えＨＴＬＶ−IIIエンベロープタンパク断片が
   Ｒ１０のＨＴＬＶ−IIIタンパク部分である、特許請求
   の範囲第１項に記載の刺激剤。 ３、組換えＨＴＬＶ−IIIエンベロープタンパク断片が
   ＰＢ１のＨＴＬＶ−IIIタンパク部分である、特許請求
   の範囲第１項に記載の刺激剤。 ４、組換えＨＴＬＶ−IIIエンベロープタンパク断片が
   ５９０のＨＴＬＶ−IIIタンパク部分である、特許請求
   の範囲第１項に記載の刺激剤。 ５、組換えＨＴＬＶ−IIIエンベロープタンパク断片が
   ＫＨ１のＨＴＬＶ−IIIタンパク部分である、特許請求
   の範囲第１項に記載の刺激剤。