JPH0119380B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は下記一般式〔〕 （ただし、式中

【式】は置換基R₃を有 する低級アルキレン基、ｎは０〜３，R₃は水素
原子、―CH₃または―OH基、R₁およびR₂は同一
または異なつて水素原子、―CH₃、―SO₂NH₂、
―CI、―NO₂または―COO基を示す）で表され
る化合物またはその塩に関するものである。 本発明の化合物は、ロイシンアミノペプチダー
ゼ（True LAPともいう）やアリルアミダーゼ
（Clinical LAPともいう、以下時としてAAと称
する）などのアミノペプチターゼ（以下、True
LAPとClinical LAPを併せて単にLAPと称す
る）の活性測定用基質として有用な新規化合物で
ある。 LAPは生体内のあらゆる組織に広く分布し、
血清中にも存在するもので、また病的条件によつ
て増加することが知られている。LAP活性の測
定は、種々の病変の診断および予後の観察に必要
な臨床検査の対象となつており、その臨床化学的
分析値としてＧ―Ｒ単位（Goldbarg
Rutenburg）を使用し、Ｇ―Ｒ単位＝2.72×LAP
国際単位（mU.／ml）としている〔Cancer.11，
283（1958）〕。 LAP活性の測定法としては種々知られている
がいずれも一長一短があり、現在、一般に用いら
れている測定法としては、Ｌ―ロイシンとアミン
化合物よりなる合成基質を用いてLAPの酵素作
用により生成されるアミン化合物の比色定量法で
ある。この比色定量法において、合成基質を用い
る場合には、その合成基質としてＬ―ロイシル―
ｐ―ニトロアニリドを用い、LAPの酵素作用で
生成するｐ―ニトロアニリンの黄色を比色してい
る。しかしこの比色定量に当つては、その合成基
質と生成したｐ―ニトロアニリンは比色の際に測
定波長がオーバーラツプする欠点があり、また血
清成分、特にビリルビン系色素による測定への影
響も免れることができないなどという欠点があつ
た。さらにＬ―ロイシル―β―ナフチルアミドを
基質として用いる場合には、生成するβ―ナフチ
ルアミンに、５―ニトロ―２―アミノメトキシベ
ンゼンジアゾテートなどをカツプリングさせて色
素を形成させるか、または生成するβ―ナフチル
アミンを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、Ｎ―
（１―ナフチル）―エチレンジアミンにカツプリ
ングさせるか、もしくはｐ―ジメチルアミノベン
ズアルデヒドまたはｐ―ジメチルアミノケイ皮ア
ルデヒドを縮合させて色素を形成せしめ、次いで
これを比色定量する方法がとられている。しかし
これらの比色定量法は、反応過程が複雑で、かつ
厳密な操作を必要とするために、検査法としては
なお不便なものであつた。また標準物質として使
用されるβ―ナフチルアミンは、毒性が著しく、
特に近年膀胱の腫瘍および癌を発生することが明
らかとなり、発癌物質としてその使用に特に厳密
な注意を要するものであつた。その他、酵素を用
いるLAP活性の測定法としては、その基質とし
てＬ―ロイシナミド（Ｌ―Leucinamide）を用
い、LAPにより生成したアンモニアを、α―ケ
トグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素および還
元型ニコチンアデニンジヌクレオチド
（NADH₂）と反応せしめてグルタミン酸に変化
せしめ、この際に反応系のNADH₂の減少を分光
学的に追跡する方法が知られている。またＬ―ロ
イシル―Ｌ―アラニンを基質として用いた場合に
は、LAPの作用により生じたＬ―アラニンに、
α―クトグルタン酸および、グルタミン酸―ピル
ビン酸―トランスアミナーゼを用いて反応せし
め、ピルビン酸を生成させ、このピルビン酸を乳
酸脱水素酵素を用いて乳酸に変化せしめ、その際
に消費されるNADH₂を分光学的に追跡する方法
も知られている。さらにＬ―ロイシン脱水素酵素
を用いる測定法も知られている。即ち、Ｌ―ロイ
シル―グリシンなどの基質を用いて、LAPによ
り生成したＬ―ロイシンを、Ｌ―ロイシン脱水素
酵素を用いて反応させ、その際に変化する
NADH₂を分光学的に測定してなる方法である。
（特開昭54−119290号）。また、Ｌ―ロイシナミド
を基質として用い、生成するＬ―ロイシンをＬ―
アミノ酸酸化酵素を用いて反応させ、反応系に生
ずる過酸化水素を比色定量してなる測定法も知ら
れている〔フアルマシア、14，872（1978）〕。 しかしながら、これらの酵素を用いる測定法
は、反応系が複雑であり、かつ比色による測定法
であるがために、血清中のビリルビン系色素など
や乳濁血清などによる白濁の影響も大きく、その
ために必ずブランクを取らねばならない。特にＬ
―アミノ酸酸化酵素を用いる測定法においては、
LAPによつて生成するＬ―ロイシンの量に比べ
て相当量のＬ―アミノ酸が血清中に存在している
上に、この血清中のＬ―アミノ酸含量も栄養剤や
食事等の摂取により著しく変化しているために、
LAPを用いたＬ―ロイシンの定量には血清中の
多量のＬ―アミノ酸の影響が著しく強く現われ、
LAPよりのＬ―ロイシンの定量が著しく困難で
ある、等の欠点があつた。 本発明者らは、かかる欠点を有する従来の
LAP活性の測定法を改善すべく鋭意研究した結
果、全く意外にも、血清中に存在しない置換メチ
ルアミン化合物またはＤ―アミノ酸化合物をＬ―
ロイシンに結合せしめて得られる合成基質は
LAPにより定量的に分解されて著しく良好に置
換メチルアミン化合物、例えばチラミンなどや、
Ｄ―アミノ酸を生成せしめ得ることを知つた。さ
らにこの合成基質にLAPを作用せしめて生成す
る置換メチルアミン化合物またはＤ―アミノ酸化
合物に、対応する酸化酵素を作用させ、次いで反
応によつて消費される酸素または生成される過酸
化水素の量を測定し、LAP活性の測定を行うこ
とにより、従来の如き複雑な方法を行うことのな
い簡便かつ良好な再現性を示すLAP活性の新規
な測定法を見い出した。またそれに有用な新規な
合成基質である下記式 で表わされるＮ―Ｌ―ロイシル―チラミンを見い
出した（特願昭55―46085号参照）。 またさらに本発明者らは下記式 （ただし、式中Ｒは低級アルキル基、特にメチ
ルおよびイソブチル基を示す）で表わされる化合
物が、LAPの作用により良好にチラミンを遊離、
生成せしめ、この生成するチラミンを、対応する
酸化酵素にて酸化せしめ、次いで反応によつて消
費される酵素または生成される過酸化水素の量を
測定してLAP活性の測定を行うことができるこ
とを見い出した（特願昭55―171263号（特開昭57
−95949号公報））。 さらに本発明者らは種々研究した結果、下記式 （ただし、式中R₁，R₂，R₃およびｎは前記と
同じ意味を示す）で表される化合物、またはその
塩で示される新規なＮ―Ｌ―ロイシル―置換メチ
ルアミド化合物LAPの作用により良好に置換メ
チルアミン化合物を遊離、生成せしめ、この生成
する置換メチルアミン化合物に、対応する酸化酵
素を作用せしめ、次いで反応によつて消費される
酸素または生成される過酸化水素の量を測定する
ことによつてLAP活性の測定を行うことができ
ることを見い出した。 本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、下記一般式〔〕 （ただし、式中R₁，R₂，R₃およびｎは前記と
同じ意味を示す。）で表される化合物またはその
塩に関するもので、LAP活性の測定に有用な新
規化合物である。 本発明の化合物を製造するに当つては、ペプチ
ド合成のための常法手段に従つて、

【式】で表わされるＬ ―ロイシンと、

【式】で表わされる 置換メチルアミン化合物の縮合反応により行われ
る。 反応に際しては、必要に応じて官能基が保護さ
れる。保護基としては、ペプチド合成反応におい
て汎用される通常の保護基をあげることができ
る。例えば、Ｌ―ロイシンのα―アミノ基を、通
常の保護基、例えばｔ―ブトキシカルボニル、ｔ
―アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｏ―ニ
トロフエニルチオ、ニトロ置換ベンジルオキシカ
ルボニル基などにて保護すればよい。ついでその
カルボキシル基は、例えば酸アジド、酸無水物、
酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えばシア
ノメチルエステル、ｐ―ニトロフエニルエステ
ル、２，４―ジニトロフエニルエステル、Ｎ―ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ―ヒドロキ
シフタル酸イミドエステルなどに変換することに
よつて、あるいはカルボジイミド、Ｎ，N′―カ
ルボニル―ジイミダゾールまたはイソオキサゾリ
ウム塩、例えばウツドワード反応剤などを使用し
て反応せしめて活性化せしめる。さらにこの活性
化した化合物と置換メチルアミン化合物とを反応
せしめる。置換メチルアミン化合物の具体例とし
て、フエネチルアミン、フエニルプロピルアミ
ン、ｐ―メチルフエネチルアミン、ｐ―メトキシ
フエネチルアミン、ｐ―クロロフエネチルアミ
ン、ｐ―ニトロフエネチルアミン、ｐ―ニトロベ
ンジルアミン、β―メチルフエネルアミン、β―
ヒドロキシフエネチルアミン、ｐ―カルボキシフ
エネチルアミン、ベンジルアミン、などがあげら
れる。 好ましい縮合反応手段としては、上述したよう
にカルボジイミド法、アジド法、活性エステル法
や酸無水物法である。また反応に当つては不活性
溶媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルア
セトアミド、ジメチルスルホキサイド、テトラヒ
ドロフランなどの溶媒中にＬ―ロイシンと置換メ
チルアミン化合物の両者ほぼ等モル量を溶解し、
約−30℃〜室温中にて撹拌すればよい。一般に反
応は30分〜50時間で完了する。反応後、α―アミ
ノ基の保護基を脱離せしめる。脱離反応は好まし
くはｔ―ブトキシカルボニル基の場合では2N―
HClの酢酸溶液やトリフルオロ酢酸を用いて、ま
たはベンジルオキシカルボニル基の場合ではパラ
ジウム―炭素を用いる接触還元手段またはHBr
の酢酸溶液を用いて行われる。目的物は分離手
段、例えば抽出、洗浄、クロマト操作、結晶化な
ど操作により得ることができる。さらに目的物
は、塩形成に適する酸、例えば塩酸、臭化水素
酸、リン酸などの無機酸、ギ酸、酢酸、プロピオ
ン酸、シユウ酸などの有機酸と反応させることに
よつて相当する塩を形成することができる。 このようにして得られた本発明の目的物たるＮ
―Ｌ―ロイシル―アミド化合物またはそれらの塩
などの一般式〔〕で表わされる化合物またはそ
の塩は、LAP活性の測定のための合成基質とし
て用いられるものである。例えばそのLAP活性
測定の一例をあげればこの合成基質に、LAP含
有被検液を作用せしめ、その酵素活性により生成
される置換メチルアミン化合物を、対応するその
酸化酵素、例えばアミンオキシダーゼ、好ましく
は豚や牛血清またはアスペルギルス・ニガーなど
より得られた酵素やサルシナ・ルテア・
IAM1099より得られた酵素〔Biochem.Biophys.
Res.Commn.，27，350（1967）、Methods in
Enzymology，17，722（1971）〕や市販のアミン
オキシダーゼを用いて反応せしめ、反応によつて
消費される酸素または生成される過酸化水素の量
を測定する方法をあげることができる。測定反応
に使用される酸化酵素は固定化酵素として使用し
てもよい。この場合には、自動分析装置へ組み込
んで測定を行うことが可能となり、酸素電極や過
酸化水素電極にて測定を行うことにより、有用か
つ高価な酵素の使用を著しく少量ならしめること
ができるため特に有効である。さらに酵素電極た
る固定化酵素と上記電極とを組み合わせたセンサ
ーとして用いることにより、迅速に、しかも種々
の試薬も必要とせず、さらに繰り返し測定に利用
でき、さらにまた有色物質を含むLAP活性測定
用試料にも適用できるために極めて有効な測定方
法とすることができる。またこの固定化酵素は、
公知の種々の固定化手段により調製できる。例え
ば、アクリルアミドで包括固定化する方法、アル
ブミンなどの蛋白質と共に混合した後、蛋白質同
士を架橋して固定化する方法、コラーゲンやフイ
ブロインなどに包括するか、またはこれを共有結
合せしめて固定化する方法、多孔性有機高分子樹
脂に吸着または共有結合にて固定化する方法、光
硬化性樹脂を用いて包括固定化する方法などの
種々の包括、吸着、結合等の手段が用いられる。
このようにして調製された固定化酵素は酵素電極
用の形として使用に好ましい膜状繊維状物、粒状
またはチユーブ状として加工使用される。 つぎに、LAP活性測定を行う場合の例を以下
に述べる。まず本発明の合成基質の一定濃度溶液
を調製し、これと、LAP活性測定用被検液、例
えば血清、および緩衝液を加えて反応せしめる。
反応にあたつては通常37℃近辺にて行えばよく、
反応時間としてはLAPにより合成基質から置換
メチルアミン化合物が生成される時間であれば特
に限定されるものではない。次いで反応後、生じ
た置換メチルアミン化合物を対応する酸化酵素に
より酸化せしめる。その際反応終了液と対応する
酸化酵素が反応し、それによつて酵素が消費さ
れ、また過酸化水素が生成されればよい。通常対
応する酸化酵素の溶液を添加して反応せしめる
か、または対応する酸化酵素の固定化酵素に接触
せしめて反応を進行せしめればよい。反応は通常
37℃近辺にて行なわれる。反応後、消費される酸
素または生成される過酸化水素の量を測定するの
であるが、好ましくは酸素電極または過酸化水素
電極にて測定すればよい。この測定は上記固定化
酵素と電極とを組み合せてなる酵素電極を使用す
ることによつてより簡便に行なわれる。さらにこ
れらの電極によつて測定された値は電気的変化と
して、必要に応じて記録するか表示し、LAP活
性値として換算すればよい。また上記過酸化水素
の量の測定に当つては、４―アミノアンチピリ
ン、フエノール、パーオキシダーゼを含有する呈
色試薬やルミノールなどの発光試薬を用いて定量
してもよく、適量公知の種々の過酸化水素の定量
手段を用いることができる。 またLAP活性測定のための系としては、例え
ば、LAP活性測定用試料、合成基質溶液、反応
媒体たる緩衝液の注入口を、合成基質より置換メ
チルアミン化合物を生成せしめるためのLAP反
応槽に導き、さらに反応によつて生成した置換メ
チルアミン化合物に対応する酸化酵素を作用せし
め、酸素または過酸化水素の量を検出することよ
り反応一検出槽を有する測定系をあげることがで
きる。また好ましくは、その反応一検出槽におい
て、対応する酸化酵素の固定化酵素カラム部と検
出のための電極部とに分離してもよい。さらに、
または電極部の検知部にその固定化酵素を具備し
た酵素電極部として一体化せしめたものであつて
もよい。さらに、LAP反応槽と反応一検出槽と
は対の系に限定されるものではなく、例えば複数
のLAP反応槽よりサンプリング装置にて順次反
応一検出槽に測定サンプルを注入し、順次検出、
洗浄を繰り返すことよりてなる２以上のLAP反
応槽と反応一検出槽を有する測定系であつてもよ
い。 本明細書中の記載の略記号は、次の意味を有す
るものである。 Boc：ｔ―ブトキシカルボニル基 HOSu：Ｎ―ヒドロキシスクシンイミド HoBt：１―ヒドロキシベンゾトリアゾール OSu：Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドエステル DCC：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド THF：テトラヒドロフラン DCU：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルウレア ｎ―BuOH：ｎ―ブチルアルコール EtOH：エチルアルコール AcOH：酢酸 DMF：ジメチルホルムアミド NMM：Ｎ―メチルモルホリン Ｚ：ベンジルオキシカルボニル基 さらに赤外線吸収スペクトルの測定において、
シロツプ状物は食塩板に塗布した後に測定に供
し、また他のものは通常のKBr法に基いて測定
に供して行なつた。 次に、本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例(1) Ｎ―Ｌ―ロイシル―フエネルアミド Ｚ―Ｌ―ロイシン（4.72ｇ、17.8mM）をTHF
（20ml）に溶解させて、Ｎ―ヒドロキシベンゾト
リアゾール（2.64ｇ、19.5mM）、フエネチル―ア
ミン（2.45ml、19.5mM）を加えて０℃でDCC
（4.03ｇ、19.5ml）のTHF（20ml）溶液を滴下し
た。 室温にて一夜撹拌して、析出したDCUを去
し、液を減圧にて濃縮して、酢酸エチル（50
ml）に溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム溶液
（20ml）で２回、飽和食塩水（20ml）、冷1N―
HCl（20ml）で２回、飽和食塩水（20ml）で２回
夫々洗浄し、無水MgSO₄で乾燥した。酢酸エチ
ルを留去し残渣に25％HBrの酢酸溶液（10ml）
を加えて室温で１時間撹拌した。30℃以下で減圧
留去し、油状の残渣に水（20ml）を加え不溶物を
のぞいて冷4N―NaOHでPHを約11に調節した。
クロロホルム（30ml）で３回抽出して抽出液を合
わせ、飽和食塩水で洗浄し無水MgSO₄で乾燥し
た。クロロホルムを留去して油状のＮ−Ｌ―ロイ
シン―フエネチルアミドを得た。 収率：2.50ｇ（60％） 〔α〕²² _D＝−2.9（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.63（ｎ―BuoH：AcOH：H₂O＝４：
１：１）（シリカゲル―薄層クロマトグ
ラフイー） 実施例(2) Ｎ―Ｌ―ロイシル―フエニルプロピル
アミド

【式】 BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、フエニル
プロピルアミン（2.70ｇ、20mM）をTHF（50
ml）に溶解し、−５〜０℃でDCC（4.13ｇ、
20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下した。 反応混合物を一夜室温で撹拌し、析出した
DCCを去する。液を30℃以下で減圧濃縮し
て酢酸エチル（300ml）に溶解する。飽和
NaHCO₃、飽和食塩水、1N―HCl、飽和食塩水
（各50ml）で３回洗浄を繰り返し、無水MgSO₄で
乾燥する。酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフイ（溶媒系：クロロホルム：酢
酸エチル＝１：１）により精製した。得られた （3.48ｇ、10mM）に室温にて2N―HClの酢酸溶
液20mlを加え１時間撹拌し30℃以下で酢酸を留去
した。残渣に水（10ml）を加えて不溶物をのぞき
冷4N―NaOHでPH約11とした。クロロホルム
（50ml×３）で３回抽出して飽和食塩水（50ml）
で２回洗浄、無水MgSO₄で乾燥した。 クロロホルムを留去してＮ―Ｌ―ロイシル―フ
エニルプロピルアミドを得た。 収率：1.51ｇ（61.0％）シロツプ状 〔α〕²² _D＝＋4.6（Ｃ＝1.0、EtOH） Rf＝0.55（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 実施例(3) Ｎ―Ｌ―ロイシル―Ｐ―メチルフエネ
ルアミド BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、ｐ―メチ
ルフエネチルアミン（2.70ｇ、20mM）をTHF
（50ml）に溶解させて−５でDCC（4.13ｇ、
20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下した。 反応混合物を一夜室温で撹拌し、析出した
DCCを去する。液を30℃以下で減圧濃縮し
て酢酸エチル（300ml）に溶解する。飽和
NaHCO₃、飽和食塩水、1N―HCl、飽昭食塩水
（各50ml）で３回洗浄を繰り返し、無水MgSO₄で
乾燥する。酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフイ（溶媒系：クロロホルム：酢
酸エチル＝１：１）により精製した。得られた （3.48ｇ、10mM）に室温にて2N―HClの酢酸溶
液（20ml）を加えて１時間撹拌した。30℃以下で
酢酸を減圧留去し、残渣に水（10ml）を加えて不
溶物を除去し、冷4N―NClでPHを約11に調節し
た。クロロホルム（50ml）で３回抽水して飽和食
塩水（50ml）で２回洗浄し、無水MgSO₄で乾燥
した。 クロロホルムを留去してＮ―Ｌ―ロイシル―Ｐ
―メチルフエネチルアミドを得た。 収率：1.63ｇ（65.6％） 融点：48−50℃ 〔α〕²² _D＝−6.5（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.54（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 元素分析値〔C₁₅H₂₄N₂O（248.370）として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値： 72.60 9.35 11.00 計算値： 72：54 9.74 11.28 実施例(4) Ｎ―Ｌ―ロイシル―ｐ―クロロフエネ
チルアミド BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、ｐ―クロ
ロフエネチルアミン（3.11ｇ、20mM）をTHF
（50ml）に溶解し−5゜〜０℃でDCC（4.13ｇ、
20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下した。 反応混合物を一夜室温で撹拌し、析出した
DCUを去する。液を30℃以下で減圧濃縮し
て酢酸エチル（300ml）に溶解する。飽和
NaHCO₃、飽和食塩水、1N―HCl、飽和食塩水
（各50ml）で３回洗浄を繰り返し、無水MgSO₄で
乾燥する。酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフイ（溶媒系：クロロホルム：酢
酸エチル＝１：１）により精製した。得られた
BoC―Leu―ｐ―クロロフエネチルアミン（3.69
ｇ、10mM）に室温で2N―HClの酢酸溶液（20
ml）を加え１時間撹拌した。30℃以下で酢酸を減
圧留去し、残渣に水（10ml）を加えて不溶物を除
去し、冷4N―NClでPHを約11に調節した。クロ
ロホルム（50ml）で３回抽水して飽和食塩水（50
ml）で２回洗浄し、無水MgSO₄で乾燥した。 クロロホルムを留去してＮ―Ｌ―ロイシル―ｐ
―クロロフエネチルアミドを得た。 収率：1.68ｇ（62.3％） 融点：41−43℃ 〔α〕²² _D＝−2.9（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.56（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 元素分析値〔C₁₄H₂₁N₂OCl・1/18H₂Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ Cl％ 測定値： 62.56 8.16 9.74 13.10 計算値： 62.33 7.89 10.38 13.14 実施例(5) Ｎ―Ｌ―ロイシル―Ｐ―ニトロフエネ
チルアミド BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）ｐ―ニトロ
フエネチルアミン塩酸塩（5.12ｇ、20mM）を
THF（50ml）に懸濁して０℃でトリエチルアミン
（2.8ml、20mM）を加え30分撹拌した。０〜−５
℃でDCC（4.13ｇ、20mM）のTHF（100ml）溶液
を滴下した。 反応混合物を一夜室温で撹拌し、析出した
DCUを去する。液を30℃以下で減圧濃縮し
て酢酸エチル（300ml）に溶解する。飽和
NaHCO₃、飽和食塩水、1N―HCl、飽和食塩水
（各50ml）で３回洗浄を繰り返し、無水MgSO₄で
乾燥する。酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフイ（溶媒系：クロロホルム：酢
酸エチル＝１：１）により精製した。得られた
BoC―ｐ―ニトロフエネチルアミン（4.16ｇ、
10mM）に室温で2N―HClの酢酸溶液（20ml）
を加え１時間撹拌した。30℃以下で酢酸を減圧留
去し、残渣に水（10ml）を加えて不溶物を除去
し、冷4N―NClでPHを約11に調節した。クロロ
ホルム（50ml）で３回抽水して飽和食塩水（50
ml）で２回洗浄し、無水MgSO₄で乾燥した。 クロロホルムを留去してＮ―Ｌ―ロイシル―Ｐ
―ニトロフエネチルアミドを得た。 収率：1.82ｇ（65.0％） 融点：105−108℃ 〔α〕²² _D＝＋2.5（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.66（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 実施例(6) Ｎ―Ｌ―ロイシル―ｐ―ニトロベンジ
ルアミド塩酸塩 BoC―Ｌ―Leu―OH、（4.63ｇ、20mM）、ｐ
―ニトロベンジルアミン・HCl（3.77ｇ、20mM）
をTFH（50ml）に溶解し０℃でTEA（2.80ml、
20mM）を加えた。30分後にDCC（4.13ｇ、
20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下して室温に
て一晩撹拌した。 生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHF
を減圧留去乾燥した。酢酸エチル（300ml）に溶
解させて、飽和NaHCO₃、飽和食塩水、1N―
HCl、飽和食塩水（各50ml）で３回洗浄して無水
MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフイ（溶媒系：ク
ロロホルム：酢酸エチル＝（１：１）にて精製し
た。得られたBoC―Leu―ｐ―ニトロベンジルア
ミド（3.66ｇ、10mM）に室温で2N―HClの酢酸
溶液（20ml）を加え１時間撹拌した。 無水エーテル（100ml）を加え生じた白色沈殿
を取し、乾燥してＮ―Ｌ―ロイシル―ｐ―ニト
ロベンジルアミド塩酸塩を得た。 収率：2.54ｇ（84.2％） 融点：173−175℃ 〔α〕²² _D＝＋24.2（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.54（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 元素分析値〔C₁₃H₁₉N₃O₃・HClとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ Cl％ 測定値 51.62 6.71 13.94 11.80 計算値 51.74 6.68 13.92 11.75 実施例(7) Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―メチル・フエ
ネチルアミド

【式】 BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、β―メチ
ルフエネチルアミン（2.70ｇ、20mM）をTHF
（50ml）に溶解して−５〜０℃でDCC（4.13ｇ、
20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下した。 生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHF
を減圧留去乾燥した。酢酸エチル（300ml）に溶
解させて、飽和NaHCO₃、飽和食塩水、1N―
HCl、飽和食塩水（各50ml）で３回洗浄して無水
MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフイ（溶媒系：ク
ロロホルム：酢酸エチル＝１：１）にて精製し
た。得られたBoC―Leu―NH

【式】（3.48ｇ、10mM）に室温 にて2N―HCl／AcOH（20ml）を加えて１時間撹
拌し、30℃以下で酢酸を留去した。 残渣に水（10ml）を加えて不溶物を除去し、冷
4N―NaOHでPHを約11に調節した。クロロホル
ム（50ml）で３回抽出して、抽出液を合わせ、飽
和食塩水（50ml）で２回洗浄し、無水硫酸マグネ
シウムで乾燥した。 クロロホルム溶液を減圧乾固して油状のＮ―Ｌ
―ロイシル―β―メチルフエネチルアミドを得
る。 収率：1.85ｇ（75.0％）シロツプ状 〔α〕²² _D＝−5.5（Ｃ＝1.0、EtOH） Rf＝0.55（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：２） 実施例(8) Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―ヒドロキシ・
フエネチルアミド

【式】 BoC―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、２―アミ
ノ―１―フエニルエタノール（2.74ｇ、20mM）
をTHF（50ml）に溶解して−５〜０℃でDCC
（4.13ｇ、20mM）のTHF（100ml）溶液を滴下し
た。 生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHF
を減圧留去乾燥した。酢酸エチル（300ml）に溶
解させて、飽和NaHCO₃、飽和食塩水、1N―
HCl、飽和食塩水（各50ml）で３回洗浄して無水
MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフイ（溶媒系：ク
ロロホルム：酢酸エチル＝（１：１）にて精製し
た。得られたBoc―Leu―NHCH₂

【式】（3.50ｇ、10mM）に室温で2N ―HClの酢酸溶液（20ml）を加え１時間撹拌し、
30℃以下で酢酸を留去した。 残渣に水（10ml）を加えて不溶物を除去し、冷
4N―NaOHでPHを約11に調節した。クロロホル
ム（50ml）で３回抽出して、抽出液を合わせ、飽
和食塩水（50ml）で２回洗浄し、無水硫酸マグネ
シウムで乾燥した。 クロロホルム溶液を減圧乾固して油状のＮ―Ｌ
―ロイシル―β―ヒドロキシフエネチルアミドを
得た。 収率：1.26ｇ（50.2％） 〔α〕²³ _D＝−6.5（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.62ｇ（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 実施例(9) Ｎ―Ｌ―ロイシル―ｐ―カルボキシフ
エネチルアミド塩酸塩 BoC―Ｌ―Leu―OH、（4.63ｇ、20mM）、ｐ
―カルボキシフエネチルアミン（3.30ｇ、
20mM）をTHF（50ml）に溶解して−０〜５℃で
DCC（4.13ｇ、20mM）のTHF（100ml）溶液を滴
下した。 生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHF
を減圧留去乾燥した。酢酸エチル（300ml）に溶
解させて、飽和NaHCO₃、飽和食塩水、1N―
HCl、飽和食塩水（各50ml）で３回洗浄して無水
MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフイ（溶媒系：ク
ロロホルム：酢酸エチル＝（１：１）にて精製し
た。得られたBoC―Leu―ｐ―カルボキシフエネ
チルアミド（3.78ｇ、10mM）に室温で2N―HCl
の酢酸溶液（20ml）を加え、室温にて１時間撹拌
した。無水エーテル（100ml）を加えて生じた白
色沈殿を取し、乾燥してＮ―Ｌ―ロイシル―ｐ
―カルボキシフエネチルアミド塩酸塩を得た。 収率：1.56ｇ（61.9％） 融点：228−230℃ 〔α〕²² _D＝−4.1（Ｃ＝1.0，EtOH） Rf＝0.66（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 実施例(10) Ｎ―Ｌ―ロイシル―ベンジルアミド

【式】 Boc―Leu―OH（4.63ｇ、20mM）、ベンジルア
ミン（3.21ｇ、30mM）をTHF（50ml）に溶解
し、−５〜０℃でDCC（4.13ｇ、20mM）のTHF
（100ml）溶液を滴下した。 生じたDCUの沈澱を除去し、30℃でTHFを減
圧留去して乾燥した。酢酸エチル（300ml）に溶
解させて、飽和NaHCO₃、飽昭食塩水、1N―
HCl、飽和食塩水（各50ml）で３回洗浄して無水
MgSO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフイ（溶媒系：ク
ロロホルム：酢酸エチル＝（１：１）にて精製し
た。得られた

【式】 （3.20ｇ、10mM）に室温にて2N―HClの酢酸溶
液（20ml）を加え１時間撹拌し、30℃以下で酢酸
を留去した。残査に水（10ml）を加えて不溶物を
除き、冷4N―NaOHでPH約11に調節し、クロロ
ホルム（50ml）で３回抽出して、抽出液を合わせ
て飽和食塩水（50ml）で２回洗浄、無水硫酸マグ
ネシウムMgSO₄で乾燥した。クロロホルムを減
圧留去してＮ―Ｌ―ロイシル―ベンジルアミドを
得た。 収率：1.19ｇ（54.0％） 融点：56〜57℃ 〔α〕²² _D＝＋5.4（Ｃ＝１，EtOH） Rf＝0.55（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 実施例16 Ｎ―Ｌ―ロイシル―Ｐ―スルホンアミ
ド―ベンジルアミド Boc―Leu―OH（2.32ｇ、10mM）、Ｐ―アミノ
―メチルベンゼンスルホアミド塩酸塩（2.22ｇ、
10mM）、トリエチルアミン（1.40ml、10mM）
をTHF（25ml）に溶解した。次に０〜５℃でDCC
（2.07ｇ、10mM）のTHF（50ml）溶液を滴下し
室温で一晩撹拌した。 生じたDCUの沈澱を別して、30℃以下で
THFを留去した。残渣を酢酸エチル（300ml）に
溶解して飽和NaHCO₃、飽和食塩水、1N―HCl、
飽和食塩水（各50ml）の順で３回洗浄して無水硫
酸マグネシウムで乾燥する。酢酸エチルを濃縮し
て残渣をシリカゲルクロマトグラフイー（溶媒
系：クロロホルム：酢酸＝１：１）により精製し
た。 Boc―Leu―Ｐ―スルホンアミド―ベンジルア
ミド（1.60ｇ、4mM）に室温で2N―HClの酢酸
溶液（８ml）を加えて室温にて１時間撹拌した。
無水エーテル（50ml）を加えて結晶化させ、生じ
た結晶を取して減圧乾燥した。 収率：1.10ｇ（81.9％） 融点：120〜123℃ 〔α〕²³ _D＝＋11.9（Ｃ＝１、エタノール） Rf＝0.61（ｎ―BuOH：AcOH：H₂O＝４：
１：１） 参考例 １ Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―ヒドロキシフエネチル
アミド、アミンオキシダーゼを用いるLAP活
性測定法 前記実施例８で得られたＮ―Ｌ―ロイシル―β
―ヒドロキシフエネルアミドを、0.1M―リン酸
Buffer（PH7.0）に溶解して基質溶液（25mM）と
した。又、この基質溶液を用いて、以下の通りの
組成を有する溶液〔〕を調製した。 0.1Mリン酸バツフアー（PH7.0） 0.1ml ３mg／ml４―アミノアンチピリン 0.05ml 0.3％ ３―メチル―Ｎ―エチル―Ｎ（β―ヒド
ロキシエチル）Ｎ―エチルアニリン 0.05ml 0.5mg／mlパーオキシダーゼ（シグマ社製Yype
―１） 0.05ml 25mM基質（Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―ヒドロキ
シフエネチルアミド） 0.1ml 9.5U／mlアミンオキシダーゼ（起源：
Eurotiun chevalieri M4805：FERM―ＰNo.
5869、特願昭56―24231） 0.01ml 100mM MgCl₂ 0.025mlH₂O 1.065ml 溶液〔〕 計 1.45ml 上記の組成の溶液〔〕の1.45mlへ、患者血清
（Ａ，Ｂ，Ｃ）50μを加え、37℃、10分間イン
キユベートせしめ、反応後、550nmの波長にて吸
光度変化を測定した。 別に、LAP活性既知の血清（セラクリアＮ，
122G―Ｒ単位、日本商事社製）を用いて同様に
操作を行い、上記各血清中のLAP活性値を算出
した。 その結果は、第１表に示す通りであつた。 又、上記の測定法の比較として、既知のLAP
活性測定法（ヤトロン社製、イアトロセツト
LAP：RM154―Ｋ）により、上記の各血清を用
いてそのLAP活性の測定を行つた。 その結果、第１表に示す通りであつた。

【表】 この第１表に示す通り、本発明におけるＮ―Ｌ
―ロイシル―β―ヒドロキシフエネチルアミド
は、人血清中のLAP活性を適格にとらえる事の
出来る良好な合成基質であると認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第５図の各図は下記に示す本発明
の物質の赤外線吸収スペクトル図を示す。 第１図：Ｎ―Ｌ―ロイシルフエネチルアミド、
第２図：Ｎ―Ｌ―ロイシルフエニルプロピルアミ
ド、第３図：Ｎ―Ｌ―ロイシル―ｐ―メチルフエ
ネチルアミド、第４図：Ｎ―Ｌ―ロイシル―ｐ―
クロロフエネチルアミド、第５図：Ｎ―Ｌ―ロイ
シル―ｐ―ニトロフエネチルアミド、第６図：Ｎ
―Ｌ―ロイシル―ｐ―ニトロベンジルアミド塩酸
塩、第７図：Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―メチルフエ
ネチルアミド、第８図：Ｎ―Ｌ―ロイシル―β―
ヒドロキシフエネチルアミド、第９図：Ｎ―Ｌ―
ロイシル―ｐ―カルボキシフエネチルアミド塩酸
塩、第１０図：Ｎ―Ｌ―ロイシルベンジルアミ
ド、第１１図：Ｎ―Ｌ―ロイシル―Ｐ―スルホン
アミド―ベンジルアミド。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式〔〕 （ただし、式中【式】置換基R₃を有す る低級アルキレン基、ｎは０〜３，R₃は水素原
   子、―CH₃または―OH基、R₁およびR₂は同一ま
   たは異なつて水素原子、―CH₃、―SO₂NH₂、―
   CI、―NO₂または―COOH基を示す）で表され
   る化合物またはその塩。