JPH01196299A - バイオアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、化学的、物理的、あるいは免疫学的手法によ
らず、化学物質の受容、該化学物質の受容に関する情報
の細胞内伝達、該情報に対応した鞭毛運動からなる一連
の機構による生物現象である細菌が示す走化性を指標と
して利用する化学物質のバイオアッセイ法に関する。

特に、本発明は、細菌等の走化性を示す生物の走化性を
、軟寒天プレートあるいは毛細管で検定することにより
、メタンフェタミン、アンフェタミンなどのアンフェタ
ミン類やアセチルコリン等の各種神経生理活性（神経作
用、神経伝達）物質の微量定量、微量検定に好適な方法
に関する。

［従来の技術］ 神経生理活性物質であるメタンフェタミン（Ｍｅｔｈａ
ｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ、以下ＭＡと略記する）は日本に
おいて主に用いられている覚醒剤の一つである。なお、
ＭＡの類似化合物であるＤＬ−アンフェタミン（ＤＬ−
Ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）は、ヨーロッパやアメリカに
おいて覚醒剤として用いられている。

覚醒剤の事犯は戦後の混乱した社会情勢の中で急激に広
がったが、その後の厳しい取締や中毒者に対する医療処
置の徹底によって、−時鎮静化した。しかしながら、昭
和４５年頃から再び急激に増加し始め、昭和６０年には
若干減少したものの検挙者が２３．３４４名にのぼった
ことが厚生省の統計に示されている。

ＭＡの一般社会への浸透にともなう学術及び医療以外で
の使用やＭＡ中毒者の増加による社会的影響は深刻であ
り、それに対するより効果的な予防対策の確立が急務と
なっている。

ＭＡによる社会汚染に対する対策の一環として、ＭＡ使
用者やＭＡ中毒患者の鑑定と、これらへの適切な医療処
置がある。

ＭＡ使用者やＭＡ中毒患者の鑑定には、これらの尿など
からＭＡを検出する方法がもっばら利用されてきている
。

従来のＭＡの検出法としては、マスフラグメントグラフ
ィー法（Ｎｉｗａｇｕｃｈｉ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａ
ｒｃｈ。

Ｔｏｘｉｃｏｌ、、５２．１５７−１６４（１９８３）
　；及び鈴木真−ら、衛生化学、廷（１）　、２３−２
６（１９８４）　］　、ラジオイムノアッセイ法［神田
征夫ら、科学警察研究所報告、旦（３）　、１５８−１
６１（１９７８）　；及び三井利幸、分析、４　、１０
３−１０５（１９８５）］及び発色法［庄山正敏ら、衛
生化学、３１　（６）、４１０−４１３（１９８５）］
　　等が利用されてきた。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、ＭＡ使用者やＭＡ中毒患者の鑑定件数は
年間約４万件（昭和６０年）にも達しており、多大な時
間と労力が必要とされてきた。

そこで、より迅速かつ簡便であり、しかも実用的なＭＡ
検出方法の開発が要望されている。

ところが、上述したような従来のＭＡ検出方法］よその
実用性において必ずしも十分なものとは言えなかった。

例えば、マスフラグメントグラフィー法は、検出感度が
Ｏ，ｌｌｐｍｏｌと極めて高いという利点を有している
が、用いる装置が非常に高価であり、広く一般に利用で
きない。

また、ラジオイムノアッセイ法の検出感度は１０ｐｍｏ
　ｌと高いが、ＩｔｓＩＭＡや３Ｈ−Ｍ　Ａなどのラジ
オアイソトープを利用するので、特別な施設と検出器が
必要とされる。

更に、イオン会合性試薬を用いる発色法は簡便であると
いう利点を有するが、試薬のＭＡに対する特異性に欠け
る場合が多くその信頼性が低く、また検出感度が５．４
ｎｍｏ１程度と低く、低濃度のＭＡの測定ができないな
どの欠点を有する。

本発明者らは、上記問題点に鑑み、より実用的なＭＡ検
出法を確立するために種々の検討を行なう過程で、魚類
等のを推動物から細菌に至る運動性を有する生物が、環
境の変化（外部からの光、重力、温度または化学物質な
どの刺激）を感知することにより起す一定の方向性を持
つ移動運動［低次の生得的行動（本能）］として定暑さ
れる走性（ｔａｘｉｓ）のなかで、化学物質が刺激とな
る走化性に注目し、なかでも細菌が示す走化性を利用し
てＭＡのみならずアセチルコリン等の各種神経生理活性
（神経作用、神経伝達）物質の微量定量、微量検定が、
簡便かつ迅速に実施できるとの新たな知見を得るに至っ
た。

すなわち、まず、本発明者らは、高等生物の神経系にお
けるシナプスの情報伝達機構と細菌の走化性における鞭
毛駆動機構の比較検討により、高等生物の神経系におけ
るシナプスの情報伝達機構におけるレセプターでの神経
伝達物質の受容が情報伝達の引金となっている事実と、
細菌類の走化性における鞭毛駆動機構において、走化性
レセプターが化学物質を受容することが情報伝達の引金
である事実とが類似・対応するとの認識を得た。

更に、大腸菌が走化性を示す各種アミノ酸、例えばグリ
シンは神経末梢で産生された中枢神経系における抑制性
の伝達物質として、またアスパラギン酸やグルタミン酸
などはを推動物の脳、視細胞などで同定され、神経伝達
物質として働くだけでなく、神経末端から遊離して拡散
し、局所的に多くの細胞に働く局所性化学仲介物質（神
経調節物質）として知られている点に注目し、細菌の走
化性が高次な情報伝達機構である神経系の起源である可
能性があるとの考えを持つに至った。

なお、細菌が走化性を示す化学物質については、Ａｄｌ
ｅｒらにより数多く調べられ、大腸菌、サルモネラ菌、
枯草菌などの有鞭毛細菌類は、糖、アミノ酸などの栄養
物質（誘因物質）には引きつけられ、各種有害物質など
の忌避物質から遠ざかることが明らかにされている（　
Ａｄｌｅｒ、　Ｊ。

：５ｃｉｅｎｃｅ、　１５３　、７０８−７１６（１９
６６）；　Ｔｓｏ、　Ｗ、　Ｗ、＆Ａｄｌｅｒ、　Ｊ、
：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、旦８．５６０−
５７６（１９７４）　、及びＡｄｌｅｒ、　Ｊ、：　Ａ
ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

月、　３４１−３５６　（１９７５）等参照］。

また、Ａｄｌｅｒらの用いた毛細管法によれば、大腸菌
は誘因物質であるアスパラギン酸に対して、１μβの容
量において１０−’Ｍ　Ｎ１０−８Ｍの濃度から走化性
を示すことが報告されている［Ａｄｌｅｒ、　Ｊ、：Ａ
ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４４．３４１−
３５６　（１９７５）　］　。

しかしながらこれらの報告においては、本発明者らが想
定した上述の走化性と神経系との関連については全く示
唆されてｄ）ない。

このような背景から、本発明者らは、神経生理活性物質
であるＭＡやアセチルコリンなども高い感度で、細菌の
走化性を惹起させたり、あるいは細菌の走化性に影響を
与える可能性を想到した。

本発明者らは、この推論に基づき、種々検討を重ねた結
果、大腸菌等がＭＡに対して正の走化性（刺激源に向っ
て進む）を示すことを見い出した。

更に、Ａｄｌｅｒらの細菌の走化性のキャピラリー測定
系の改良により、より簡便なスクリーニング、検定方法
を確立し［岩本昌之、篠沢隆雄ら：生物教材としての細
菌工、大腸菌の簡便な取り扱いと走化性の観察、科学教
育研究、１１．　Ｎｏ、３．１０８−１１３（１９８７
）および福永晋哉、篠沢隆雄ら：生物教材としての細菌
■、大腸菌の走化性の定量的検定法、科学教育研究、１
１．　Ｎｏ、４（１９８７）］　、並びに、ろ紙法も採
用してＭＡやアセチルコリンを定性的、定量的にバイオ
アッセイすることに成功し、１０−’Ｍ以上のＭＡ濃度
でのＭＡの検出が可能であり、しかも試料の量が１μβ
で十分であることからラジオアイソトープを用いること
なく、ラジオイムノアッセイ法なみの１０ｐｍｏ　ｌと
いう微量のＭＡを検出できることを見い出し、本発明を
完成した。

なお、ＤＬ−アンフェタミンについてはＣｈｅｔらがシ
ュードモナス　フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓ　）の走化性を利用して検定し
ている（Ｃｈｅｔ、　１．　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１１５（３）。

１２１５−１２１８　（１９７３）。しかしながら、こ
の検定は簡便なアッセイ法である軟寒天プレート法で行
なわれたものでない。

本発明の目的は、ＭＡ等のアンフェタミン類やアセチル
コリンなどの各種神経生理活性（神経作用、神経伝達）
物質の微量定量、微量検定に好適であり、簡便かつ迅速
に実施できる極めて実用的な方法を提供することにある
。

［課題を解決するための手段］ 本発明のバイオアッセイ法は、細菌の走化性を利用する
ことを特徴とする。

本発明の方法に用いることができる細菌としは、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｋ１２　Ｗ３１１０　（
野生株、東京大学応用微生物研究所あるいは発酵研究所
等から一般に容易に入手できる）などの大腸菌、サルモ
ネラ菌、枯草菌などを挙げることができるが、なかでも
大腸菌はその遺伝学的および生化学的性質が最も良く解
明されているので、取り扱い易い。

また、これらの耐熱性菌も有用である。

本発明の方法は、細菌を含む系に試料を添加した際の細
菌の挙動（走化性）を検定することにより行なうことが
できる。

本発明で用いる細菌を含む系は、例えば以下に示すよう
な液体あるいは軟寒天プレート等として必要に応じて種
々の形態とすることができる。

以下本発明の方法に適用し得る軟寒天プレート法及び毛
細管法について説明する。

本発明に用い得る軟寒天プレート法としては、ａ）細菌
を含有させた軟寒天プレート上の所定位置に試料を容易
に拡散しない状態で添加し、所定時間放置後、該プレー
ト中での菌体の移動状態を観察して試料中に細菌が走化
性を示すＭＡやアセチルコリン等の各種神経生理活性物
質が存在するかどうか検定する方法、 ｂ）試料を含有する軟寒天プレート上の所定位置に細菌
を含有させた溶液を滴下し、所定時間放置後、該プレー
ト中での菌体の移動状態を観察して試料中に細菌が走化
性を示すＭＡやアセチルコリン等の各種神経生理活性物
質が存在するかどうか検定する方法、 などが利用できる。

例えば、試料中に細菌を誘因する物質、すなわち細菌が
刺激源に向って進む正の走化性を示す物質が存在する場
合には、上記ａ）の方法においては、試料添加位置周辺
に菌体が集合し、菌体密度の高い部分が形成され、それ
が白いリングとして目視できるようになる。

軟寒天プレート法に用いるプレートは、操作上の取り扱
いが容易であり、かつプレート内の細菌を良好に維持で
き、更に該細菌の走化性が効率良く現われるようにその
組成を適宜選択して調整することができる。

例えば、通常用いられている各種細菌用培地や細菌を取
り扱う際に用いる各種溶液から、用いる細菌に応じて選
択したものに、寒天を０．２８重量％程度加えて調整す
ることができる。

なお、該プレートは菌の増殖を目的としたものでないの
で、培地の組成を菌体の良好な維持が可能なものに適宜
変更すると良い。

具体的には、後述の実施例で用いているし一グロスやポ
リペプトンブロスを用いた軟寒天プレートが好適に利用
できる。

軟寒天プレート上への試料の添加は、試料を含ませた適
当な大きさのろ紙をプレート上に載置して行ない、プレ
ートは３７℃で保温する。

一方、毛細管法は、その一端を閉管して試料を含む溶液
を封入し毛細管の他方の開口端を、スライドガラス等の
適当な基体上に用意した細菌含有液に接触させ、所定時
間静置後、菌体の移動状態を観察して試料中に細菌が走
化性を示すＭＡやアセチルコリン等の各種神経生理活性
物質が存在するかどうか検定するものである。

なお、第１図に毛細管内に誘因物質、すなわち大腸菌が
正の走化性を示す物質を含有させた場合における菌体の
動きを示した 該毛細管法に用いる菌体な含む溶液は、細菌を良好に維
持でき、かつ該細菌の走化性が効率良く現われるように
その組成を適宜選択して調製することができ、例えば、
通常用いられている各種細菌用培地や細菌を取り扱う際
に用いる各種溶液から、用いる細菌に応じて選択したも
のを使用できる。

な都、該溶液もまた菌の増殖を目的としたものでないの
で、培地の組成を菌体の良好な維持が可能なものに適宜
変更すると良い。

具体的には、後述の実施例で用いている溶液が好適に利
用できる。

細菌含有液をスライドガラス等の上に用意するには、例
えば、第２図および第３図に示すようにスライドガラス
上に直管やＵ字管を置きその中に細菌含有液を入れ、更
に、直管またはＵ字管上にカバーガラスを載せる方法、
第４図に示すようにホールスライドガラスの凹部表面に
シリコングリス等の疎水性を示す物質を塗布し、そこに
細菌含有液を滴下する方法などを用いることができる。

本発明に用いる細菌は、必要に応じて前培養する等の方
法によりその菌体活性な走化性の検出に適した状態にし
ておくと良い。

なお、本発明の方法は、例えば岩本昌之、篠沢隆雄ら：
生物教材としての細菌工、大腸菌の簡便な取り扱いと走
化性の観察、科学教育研究、Ｕ、Ｎｏ、　３．１０Ｂ−
１１３＜１９８７）および福永晋哉、篠沢隆雄ら：生物
教材としての細菌■、大腸菌の走化性の定量的検定法、
科学教育研究、貝、Ｎｏ、　４　（１９８７）等を参考
として実施することができる。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ （軟寒天プレートの調製） 乾熱殺菌したアルミキャップ付きの３０ｍｆ２試験管（
１８ｍｍＸ　１８ｍｍ）にオートクレーブ処理しである
下記組成のグリセリン塩類培地５ｍβを入れ、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｋ１２　Ｗ３１１０　（野
生株、東京大学応用微生物研究所より入手）接種し、３
７℃、７０〜８０回振盪／分の条件で一晩振盪培養し、
培養の定常期状態を得た。なお、培養終了時の菌体濃度
は、２〜４Ｘ１０”個／ｍｌであった。

グリセリン塩類培地組成： グリセリン　　　　　　　　　　５．０ｇ（他の組成分
とは別に煮 沸して使用直前に混合） ＮａＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　５．　ＯｇＫ
、ＨＰＯ，１１，２ｇ Ｋ）１２ＰＯ４４，８ｇ （Ｎ）１４）　２Ｓ０４　　　　　　　　　　　　２．
０ｇＭｇ５０４・ＨＪ　　　　　　　　　　　　　０．
２５ｇＦｅｗ　（ＳＯ４）　ｓ・ｘＨ２Ｏ０，５ｍｇ全
容量１０００　＋ｎＪ２　（ｐＨ７，０）なお、この培
養菌体液は４℃で２〜３週間保存可能であった。

次に、該培養菌体液の０．２５ｍＩ２を４ｍＩ２のグリ
セリン塩類培地に接種し、３７℃、７０〜８０回振盪／
分で２時間培養し、最も運動性が高い対数増殖期の菌を
得た。なお、得られた培養菌体液の５９０ｎｍでの濁度
（光路１　ｃｍ）は０．２〜０．４であり、菌体数は３
〜４Ｘ１０”個／ｍＩ２であった。

更に、この対数増殖期の菌を含む培養菌体液１．０ｍｌ
を３０００ｒｐｍ　、１５分の遠心分離で集菌し、得ら
れた菌体に１．０ｍｇの洗浄液［１０−’Ｍのエチレン
ジアミン四酢酸カリウム塩（Ｋ−ＥＤＴＡ）を含む１０
−”Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　］を加
えてよく攪拌して菌体を洗浄し、更に上記と同様の条件
の遠心分離により集菌し、再度同様の操作を繰り返した
。

次に、洗浄菌体に１．０ｍｇの検定用緩衝液［１０１Ｍ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　］を加え検定
用として用いた。なお、この菌体液は氷冷しておくこと
によって１日は十分に使用できた。

これとは別に、ろ紙を利用した集菌、洗浄を行なって検
定用菌体の調製を行なった。

すなわち、上記対数増殖期の菌を含む培養菌体液（２０
ｍｇ）を、予め乾熱殺菌（１６０℃、３時間）したろ紙
（Ｎｏ、２、東洋ろ紙株式会社）でろ過し、ろ紙上に残
った菌体を洗浄液１０　ｍＩ２で２度洗浄し、ろ紙の中
心部を半径的２ｃｍに切り取り検定用緩衝液と接触させ
て、ろ紙上の菌体を検定用緩衝液に懸濁し、その菌体濃
度を６．８Ｘ１０’個７ｍ１２に調製し検定用として用
いた。

なお、上記の遠心分離法による方法で調製した検定用菌
体液、およびろ紙性により検定用菌体液はともに後述の
検定に良好に用いることができた。

次に、シャーレ中へ０．２８％の寒天を溶解させた下記
組成のポリペプトンブロス９ｍβと上記のようにして検
定用に調製した菌体液（菌体濃度を２〜４Ｘ１０８個／
ｍＩ２に調製）の１．０＋＋＋Ｊ２とを加え、十分に混
合した後静置し、寒天を固化し軟寒天プレートを得た。

ポリペプトンブロス組成： ポリペプトン　　　　　　ｌｏｇ ＮａＣ１５ｇ 全量１０００　ｍＩ２（ｐＨ７，０） 実施例２ （軟寒天プレート法によるＭＡに対する大腸菌の走化性
の検定） 実施例１で得た軟寒天プレート上の中央に１０ｍＭＭＡ
（大日本製薬社製）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，５）　２０μβをしみ込ませた円形ろ紙
（ペーパーディスク、厚手、東洋ろ紙株式会社）を置き
、３７℃、１２時間静置した。

その結果、ろ紙の周辺に白いリングが形成された。この
白いリングは、大腸菌が集合し、菌の濃度があがったた
めにできたものであった。

これはろ紙からしみ出したＭＡに対して大腸菌が正の走
化性を示したためである。すなわち、ＭＡが大腸菌が正
の走化性を示す誘因物質であることが明らかとされた。

実施例３ （毛細管法によるＭＡの定量） まず、各種濃度のＭＡを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）に溶解して、濃度の異なるＭＡ温溶液
調製し、以下の操作に用いた。

１μ℃の毛細管［両端開口、内径０．２ｍｍ、長さ３．
０ＣＩ１１％商品名Ｍｉｃｒｏｃａｐｓ、叶ｕｍｎｏｄ
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製コの一方の先端にＭＡ温溶
液つけ、管内へ毛細管現象を利用して該溶液を吸い上げ
た後、その−方の開口を溶融により封じた。

一方、ホールスライドガラスの凹部にシリコングリスを
塗布し、その上に実施例１で検定用に調製した菌体液（
菌体濃度２〜４Ｘ１０”個／ｍβ）の０．８ｍβを滴下
し、第５図に示すように先に調整した毛細管を、その開
口が菌体液の液滴と接触するようにセットした。

その状態で、これらを３０℃で５０分間静置した後、毛
細管を取り出し、菌体液と接触していた開口部を洗浄液
で洗浄し毛細管外壁に付着した菌を除去した。

次に、閉じている端を破壊し、マイクロとペラターで毛
細管中の液を洗浄液内に押し出し、１０’倍に希釈した
。

得られた希釈液中の菌体数を重層寒天法により測定した
。

すなわち、まず第５図に示すようにシャーレ中に以下に
示す組成のし一ブロスに１．７％の寒天を含有させたプ
レートを調製し、その上に希釈液０、１＋ｎＩ２をのせ
、更に０．３％寒天水溶液をのせた後、加えた寒天を固
化させ、上下を逆にして３７℃で一晩放置し、プレート
に現われるコロニー数を計測した。

Ｌ−ブロス組成： ポリペプトン　　　　　　　　　ｌＯ，０ｇ酵母エキス
トラクト　　　　　　　５．０ｇブドウ糖　　　　　　
　　　　　　　１．０ｇＮａＯＨ２Ｎ　　　　　　　　
　　　　　　３．Ｏｎ＋ｊ２全量１０００　ｍ１２　（
ｐＨ７，２）ＭＡ濃度と毛細管へ移動した菌体数との関
係を第６図に示す。

第６図に示した結果から明らかなように、ＭＡ濃度１０
−’Ｍから毛細管中への大腸菌の移動個数が増加し始め
、ＭＡ濃度ｌ０−３〜１０−”Ｍで誘因された大腸菌数
が最大となり、ＭＡ濃度１０−’Ｍから大腸菌がＭＡに
対して正の走化性を示すことが明らかとされた。

なお、この毛細管法で用いた毛細管の容量は１μｎであ
るので、ＭＡ濃度１０−’Ｍは１０ｐｍｏｌに相当する
。

実施例４ （軟寒天プレート法によるアセチルコリンに対する大腸
菌の走化性の検定） 実施例１で調製した軟寒天プレート上に、１０ｍＭアセ
チルコリン（和光純薬社製）を含む１０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，５）　２０μβをしみ込ま。

せたろ紙（実施例２で用いたのと同様）及び１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐｉ（７，５）のみ（２０μβ）をしみ込
ませたろ紙（実施例２で用いたのと同様）を置き、３７
℃、１２時間静置した。

その結果、アセチルコリンに対して大腸菌は走化性を示
さなかった。

更に、アスパラギン酸１０ｍＭとアセチルコリン１０ｍ
Ｍの混合液をろ紙にしみ込ませた場合と、アスパラギン
酸１０ｍＭのみをしみ込ませた場合とで、軟寒天プレー
ト法を実施例２と同様にして実施した。

その結果、アスパラギン酸のみでは、ろ紙上の周辺に走
化した大腸菌が明確に観察できたが、アセチルコリンと
の混合液では、大腸菌の走化性が抑えられることがわか
った。

実施例５ （毛細管法によるアスパラギン酸とアセチルコリンの定
量） ｌＯ−６〜１０−”Ｍ濃度のアスパラギン酸溶液（０，
１ｍｌ２）と、１０−’　〜１０−”Ｍ濃度のアスパラ
ギン酸溶液のそれぞれに１０ｍＭのアセチルコリンを混
合した溶液（０，１ｍβ）を各々調製し、それらを個々
に用いて、実施例３と同様にして、毛細管に移動する菌
体数を求めた。

得られた結果を第７図に示す。なお、・はアスパラギン
酸溶液での結果を、Ｏはアスパラギン酸とアセチルコリ
ンの混合液の結果を示す。

第７図に示されているように、１０”’Ｍ付近からアス
パラギン酸への大腸菌の走化性が抑えられた。

実施例６ 実施例５においてアスパラギン酸溶液濃度を１０ｍＭに
一定し、アセチルコリン溶液濃度を１０−８〜１０−”
Ｍ濃度に変えて、同様に毛細管法により検定した。

その結果、アセチルコリンは１０−’Ｍ付近からアスパ
ラギン酸への大腸菌の走化性を制御した。

実施例７ 覚醒剤患者（１０人）及び健康人（１０人）の尿（１（
ｌｒ＋＋Ｊ２）をそれぞれベンゼン１　　＋＋ｌに加え
抽出処理し、ベンゼン画分を分離後、ベンゼンを蒸発さ
せて、ベンゼン抽出物を得た。

得られた各ベンゼン抽出物に水０．０５ｍβを加えて溶
解させた溶液を実施例２で用いたろ紙にしみ込ませた。

こうして得られたろ紙のそれぞれを実施例１で調製した
軟寒天プレート上にのせ、実施例２と同様にして走化性
を検定した。

その結果、覚醒剤患者１０人中７人が陽性と判定され、
また健康人１０人中２人が陽性と判定された。

この覚醒剤患者と健康人とでの結果の差は、有為な差で
あり、本発明の方法が有効であることが確認された。

更に、上記ベンゼン抽出物溶液を用いて実施例３の毛細
管法を行なったところ、覚醒剤患者１０人からの試料で
走化性を示した菌体数の平均が、健康人１０人からの試
料で走化性を示した菌体数の平均の２倍の値を示した。

［発明の効果］ 本発明によれば、簡便かつ迅速な操作で、ラジオイムノ
アッセイなみの１０ｐｍｏｌという感度でのＭＡの検定
が可能となった。

すなわち、本発明は細菌の極めて高度な走化性を利用し
たので検出感度が高く、また特殊な分析機器、分析用施
設を用いる必要がなく、かつ用いる材料も安価であり、
低コストでの検定をどこでも容易に実施できる。更に、
操作が簡単であり、多数の試料を効率良く短時間で処理
可能である。

また、本発明によれば、アセチルコリンは大腸菌が走化
性を示す誘因物質や忌避物質ではないが、アセチルコリ
ンは誘引物質であるアスパラギン酸に対する大腸菌の正
の走化性を制御することが明らかとされた。このことよ
り、神経生理活性物質間の相互作用におけるアセチルコ
リンの役割、位置付けが明確にされるきっかけが与えら
れた。

また、本発明者らの新たな知見からアセチルコリンの定
量に困難さがある場合に、本発明の方法のように走化性
受容体（レセプター）を利用する方法がアセチルコリン
の検定に有用性を発揮する可能性が出てきた。

更に、種々の神経生理活性物質に特異性を有する菌株を
開発することにより、簡便で確実な検定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は毛細管法の操作を説明するための模式
図、第５図は重層寒天法の操作を示した模式図、第６図
は実施例３で得られたＭＡ（メタンフェタミン）濃度と
毛細管内への移動菌体数との関係を示すグラフ、第７図
は、アセチルコリンと毛細管内への移動菌体数との関係
を示すグラフである。なお、第７図において、・はアス
パラギン酸溶液での結果を、Ｏはアスパラギン酸とアセ
チルコリンの混合液の結果を示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 三井製薬工業株式会社 篠沢隆雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料に対する細菌の走化性を検定することにより、
   該試料中の化学物質を検出することを特徴とするバイオ
   アッセイ法。 ２）前記細菌が大腸菌である請求項１のバイオアッセイ
   法。 ３）前記走化性の検定法を、毛細管法により行なう請求
   項１または２のバイオアッセイ法。 ４）前記走化性の検定法を、軟寒天プレート法により行
   なう請求項１または２のバイオアッセイ法。 ５）前記化学物質がアンフェタミン類またはアセチルコ
   リンである請求項１〜４のいずれかに記載のバイオアッ
   セイ法。