JPH0119880B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0119880B2 JPH0119880B2 JP55039726A JP3972680A JPH0119880B2 JP H0119880 B2 JPH0119880 B2 JP H0119880B2 JP 55039726 A JP55039726 A JP 55039726A JP 3972680 A JP3972680 A JP 3972680A JP H0119880 B2 JPH0119880 B2 JP H0119880B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- electrode
- enzyme
- immobilized
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、固定化されたグルコースオキシダー
ゼと電気化学的電極とを組み合わせてグルコース
濃度を測定する酵素電極の改良に関する。さらに
詳しくは固定化されたグルコースオキシダーゼ
に、さらに固定されたムタロターゼを組み合わせ
た複合固定化酵素を用いることにより、上記複合
酵素固定化反応において生成あるいは消費される
物質濃度を電気化学的に測定しグルコース濃度を
求める方法の測定感度を上げることを目的として
いる。
ゼと電気化学的電極とを組み合わせてグルコース
濃度を測定する酵素電極の改良に関する。さらに
詳しくは固定化されたグルコースオキシダーゼ
に、さらに固定されたムタロターゼを組み合わせ
た複合固定化酵素を用いることにより、上記複合
酵素固定化反応において生成あるいは消費される
物質濃度を電気化学的に測定しグルコース濃度を
求める方法の測定感度を上げることを目的として
いる。
グルコースオキシダーゼと電気化学的電極、例
えば酸素濃度測定用電極あるいは過酸化水素濃度
測定用電極を組み合わせてグルコース濃度を測定
する方法については従来からよく知られている。
一般に、グルコースは、水溶液中では以下に示す
ようにα型とβ型の平衡混合物として存在してい
る。
えば酸素濃度測定用電極あるいは過酸化水素濃度
測定用電極を組み合わせてグルコース濃度を測定
する方法については従来からよく知られている。
一般に、グルコースは、水溶液中では以下に示す
ようにα型とβ型の平衡混合物として存在してい
る。
ここで、α型とβ型の違いは、C1位のOH基の
向きが異なるのみである。現在グルコースオキシ
ダーゼとして知られている酵素は、このα型とβ
型の中でβ型のみに作用し、これをＤ―グルコノ
ラクトンに変換する。
向きが異なるのみである。現在グルコースオキシ
ダーゼとして知られている酵素は、このα型とβ
型の中でβ型のみに作用し、これをＤ―グルコノ
ラクトンに変換する。
β―Ｄ―グルコース＋O2グルコースオキシダーゼ
――――――――――――→
Ｄ―グルコノラクトン＋H2O2 ……(1)
ここでβ―Ｄ―グルコース濃度が減少するとα
とβ間の平衡値を保つためにα→βの変換反応が
起こりうるが、この反応は上記のグルコースオキ
シダーゼが触媒する反応に比較すると速度が遅
い。したがつてグルコースオキシダーゼ単独酵素
と電気化学的電極を組み合わせてグルコース濃度
を測定する方法では、実際上はαとβの平衡混合
物の中でβ型のみを測定していることになる。
とβ間の平衡値を保つためにα→βの変換反応が
起こりうるが、この反応は上記のグルコースオキ
シダーゼが触媒する反応に比較すると速度が遅
い。したがつてグルコースオキシダーゼ単独酵素
と電気化学的電極を組み合わせてグルコース濃度
を測定する方法では、実際上はαとβの平衡混合
物の中でβ型のみを測定していることになる。
本発明のグルコース濃度測定用酵素電極では、
α，β間の平衡反応を促進する酵素であるムタロ
ターゼをグルコースオキシダーゼに組み合わせる
ことを特徴としている。この方法によれば、溶液
中のα型グルコースはβ型グルコースにすみやか
に変換されるため、α，β両グルコース濃度を同
時に測定することとなり、結果として測定感度が
向上することになる。以下に本発明の実施例につ
いて述べる。
α，β間の平衡反応を促進する酵素であるムタロ
ターゼをグルコースオキシダーゼに組み合わせる
ことを特徴としている。この方法によれば、溶液
中のα型グルコースはβ型グルコースにすみやか
に変換されるため、α，β両グルコース濃度を同
時に測定することとなり、結果として測定感度が
向上することになる。以下に本発明の実施例につ
いて述べる。
実施例 １
グルコースオキシダーゼの凍結乾燥品100mgを
１mlのリン酸緩衝液（PH5.6）中に溶解させ、さ
らにこの混合液中にムタロターゼ6000ユニツト相
当を溶解させる。作製したグルコースオキシダー
ゼとムタロターゼとの混合溶液を市販のガルバニ
ツクセル方式の酵素濃度計に用いるテフロン膜上
に塗布した後、架橋固定化試薬であるグルタルア
ルデヒドを作用させる。このようにしてグルコー
スオキシダーゼームタロターゼ複合酵素固定化テ
フロン膜が作製できる。またムタロターゼを加え
ないて上記と同様にしてグルコースオキシダーゼ
単独固定化テフロン膜を作製した。これら２種類
の膜を上記酸素濃度計の電極先端にとりつけ同一
グルコース標準液に対する応答電流値を比較し
た。
１mlのリン酸緩衝液（PH5.6）中に溶解させ、さ
らにこの混合液中にムタロターゼ6000ユニツト相
当を溶解させる。作製したグルコースオキシダー
ゼとムタロターゼとの混合溶液を市販のガルバニ
ツクセル方式の酵素濃度計に用いるテフロン膜上
に塗布した後、架橋固定化試薬であるグルタルア
ルデヒドを作用させる。このようにしてグルコー
スオキシダーゼームタロターゼ複合酵素固定化テ
フロン膜が作製できる。またムタロターゼを加え
ないて上記と同様にしてグルコースオキシダーゼ
単独固定化テフロン膜を作製した。これら２種類
の膜を上記酸素濃度計の電極先端にとりつけ同一
グルコース標準液に対する応答電流値を比較し
た。
第１図は酸素濃度計に接触した緩衝液中にグル
コース標準液を添加し、緩衝液中のグルコース濃
度を０から10-4Mに変化させた場合の酸素濃度計
の応答電流の比較を示した。曲線ａはグルコース
オキシダーゼとムタロターゼとの複合酵素固定化
膜を用いた場合のもので、ｂはグルコースオキシ
ダーゼ単独固定化膜を用いた場合のものである。
コース標準液を添加し、緩衝液中のグルコース濃
度を０から10-4Mに変化させた場合の酸素濃度計
の応答電流の比較を示した。曲線ａはグルコース
オキシダーゼとムタロターゼとの複合酵素固定化
膜を用いた場合のもので、ｂはグルコースオキシ
ダーゼ単独固定化膜を用いた場合のものである。
これからわかるように、複合酵素固定化膜を用
いた場合は、単独固定化膜を用いた場合に比較し
て応答電流値の大きさが約1.5倍で応答感度が向
上している。なおガルバニツクセル方式の酸素濃
度計では酸素の還元電流を測定しており、グルコ
ース濃度が上昇すると(1)式に示した反応で酸素濃
度が減少し、結果としてこの還元電流が減少す
る。応答電流の大きさはこの還元電流の減少の大
きさを示している。
いた場合は、単独固定化膜を用いた場合に比較し
て応答電流値の大きさが約1.5倍で応答感度が向
上している。なおガルバニツクセル方式の酸素濃
度計では酸素の還元電流を測定しており、グルコ
ース濃度が上昇すると(1)式に示した反応で酸素濃
度が減少し、結果としてこの還元電流が減少す
る。応答電流の大きさはこの還元電流の減少の大
きさを示している。
実施例 ２
テフロン膜に代えて多孔質セルロースアセテー
ト膜を使用する以外は実施例１と同様にして作製
したグルコースオキシダーゼ単独あるいはムタロ
ターゼとの複合固定化膜を白金電極に密着させ、
この白金電極作用極をポテンシヨスタツトを用い
て、参照電極（飽和カロメル電極）に対し＋
0.6Vの定電位に設定し、対極との間に流れる電
流値を測定する。
ト膜を使用する以外は実施例１と同様にして作製
したグルコースオキシダーゼ単独あるいはムタロ
ターゼとの複合固定化膜を白金電極に密着させ、
この白金電極作用極をポテンシヨスタツトを用い
て、参照電極（飽和カロメル電極）に対し＋
0.6Vの定電位に設定し、対極との間に流れる電
流値を測定する。
第２図はこの３電極を組み込んだ測定系の構成
を示す。１は白金電極、１′は白金電極の表面に
保持された固定化酵素膜、２は参照電極、３は対
極、４は緩衝液、５はセパレータである。
を示す。１は白金電極、１′は白金電極の表面に
保持された固定化酵素膜、２は参照電極、３は対
極、４は緩衝液、５はセパレータである。
上記の測定系の緩衝液中のグルコース濃度を実
施例１と同様にして０から10-4Mに変化させた場
合の応答電流値を第３図に示した。ｃは複合酵素
固定化膜を用いた場合、ｄは単独酵素固定化膜の
場合である。この結果から複合酵素固定化膜の方
が約1.5倍応答電流が大であり、応答感度の向上
が認められる。なお、ここで測定しているのは前
記反応式(1)によつて生成するH2O2の酸化電流で
ある。
施例１と同様にして０から10-4Mに変化させた場
合の応答電流値を第３図に示した。ｃは複合酵素
固定化膜を用いた場合、ｄは単独酵素固定化膜の
場合である。この結果から複合酵素固定化膜の方
が約1.5倍応答電流が大であり、応答感度の向上
が認められる。なお、ここで測定しているのは前
記反応式(1)によつて生成するH2O2の酸化電流で
ある。
実施例 ３
カーボン電極表面に実施例１で用いたのと同じ
酵素溶液を塗布し、グルタルアルデヒドで処理し
て、電極表面に直接グルコースオキシダーゼ単独
あるいはムタロターゼとの複合酵素固定化膜を形
成する。このようにして作製した２種の電極を実
施例２と同様の測定系に組み入れる。この場合緩
衝液中には10-3Mの濃度でレドツクス化合物の一
種であるＰ―ベンゾキノンが溶解されている。
酵素溶液を塗布し、グルタルアルデヒドで処理し
て、電極表面に直接グルコースオキシダーゼ単独
あるいはムタロターゼとの複合酵素固定化膜を形
成する。このようにして作製した２種の電極を実
施例２と同様の測定系に組み入れる。この場合緩
衝液中には10-3Mの濃度でレドツクス化合物の一
種であるＰ―ベンゾキノンが溶解されている。
上記酵素固定化カーボン電極を飽和カロメル電
極に対し0.4Vに電位設定し、実施例１，２と同
様グルコース濃度変化（０から１×10-4M）にと
もなう電流値の変化を求めた。
極に対し0.4Vに電位設定し、実施例１，２と同
様グルコース濃度変化（０から１×10-4M）にと
もなう電流値の変化を求めた。
第４図に複合酵素固定化の場合ｅと単独酵素固
定化の場合ｆとの比較を示す。これから複合固定
化酵素を用いる場合の方が約1.5倍応答感度が大
であることがわかる。ここでは、式(1)のO2にか
わつてＰ―ベンゾキノンが酵素反応にともなつて
ヒドロキノンになり、この生成したヒドロキノン
の酸化電流を測定していることになる。
定化の場合ｆとの比較を示す。これから複合固定
化酵素を用いる場合の方が約1.5倍応答感度が大
であることがわかる。ここでは、式(1)のO2にか
わつてＰ―ベンゾキノンが酵素反応にともなつて
ヒドロキノンになり、この生成したヒドロキノン
の酸化電流を測定していることになる。
レドツクス化合物としてはＰ―ベンゾキノン以
外にチオニン、インドフエノール、フエリシアン
化カリ等のレドツクス色素を用いることができ
る。またこれらのレドツクス色素はすでに本発明
者らが提案しているごとく電極に固定化して用い
ることも可能である。
外にチオニン、インドフエノール、フエリシアン
化カリ等のレドツクス色素を用いることができ
る。またこれらのレドツクス色素はすでに本発明
者らが提案しているごとく電極に固定化して用い
ることも可能である。
さらにグルコースオキシダーゼとムタロターゼ
の固定化の割合は、ムタロターゼの活性がグルコ
ースオキシダーゼの活性に比較して十分高いこと
が望ましい。
の固定化の割合は、ムタロターゼの活性がグルコ
ースオキシダーゼの活性に比較して十分高いこと
が望ましい。
以上実施例１〜３いずれにおいてもムタロター
ゼとの複合固定化酵素を用いる方法がグルコース
オキシダーゼ単独を用いる方法に比較して約1.5
倍の応答電流値を示している。水溶液中（20℃）
においてグルコースのα型とβ型の比率α／βは
36／64であることが知られており、この数字を考
慮すると上記の1.5倍という数字はほぼ説明がつ
く。すなわちαグルコースがムタロターゼの作用
できわめてすみやかにβグルコースに変換される
とともに、グルコースオキシダーゼの作用を受け
るために、結果として溶液中のαグルコースもβ
グルコースもともにグルコースオキシダーゼの作
用を受けることになり、本発明のグルコース濃度
測定用酵素電極を用いた方法ではαグルコースと
βグルコースの総グルコース濃度を測定している
わけである。実際α型も同時に反応に関与すると
すると36＋64／64＝1.56倍の応答が得られることに なり、この値は実施例で得られている値にかなり
近い。
ゼとの複合固定化酵素を用いる方法がグルコース
オキシダーゼ単独を用いる方法に比較して約1.5
倍の応答電流値を示している。水溶液中（20℃）
においてグルコースのα型とβ型の比率α／βは
36／64であることが知られており、この数字を考
慮すると上記の1.5倍という数字はほぼ説明がつ
く。すなわちαグルコースがムタロターゼの作用
できわめてすみやかにβグルコースに変換される
とともに、グルコースオキシダーゼの作用を受け
るために、結果として溶液中のαグルコースもβ
グルコースもともにグルコースオキシダーゼの作
用を受けることになり、本発明のグルコース濃度
測定用酵素電極を用いた方法ではαグルコースと
βグルコースの総グルコース濃度を測定している
わけである。実際α型も同時に反応に関与すると
すると36＋64／64＝1.56倍の応答が得られることに なり、この値は実施例で得られている値にかなり
近い。
グルコースオキシダーゼ単独を電極に固定化し
た酵素電極によつてグルコース全濃度を測定する
には、濃度測定を目的とするグルコース含有被検
液の応答と濃度既知の標準液の濃度とを比較する
ことによつて行われる。すなわち濃度測定を目的
とするグルコース含有液と濃度既知のグルコース
標準液とでαとβの含有割合が一定であると仮定
して両液のβ型に対して得られた応答を比較して
求めているわけである。ところが実際の被検液で
は液の温度、PH、夾雑物等によつてαとβの平衡
値は当然変動しうる。そして標準液を被検液とま
つたく同じα，β間干衡状態に保つことは当然の
ことながら困難であり、分析の誤差をまねきやす
い。このことからα，β両グルコースに活性を有
する複合酵素系を用いる本発明の方法は、より精
度良く全グルコース濃度を測定しうるという利点
も有している。
た酵素電極によつてグルコース全濃度を測定する
には、濃度測定を目的とするグルコース含有被検
液の応答と濃度既知の標準液の濃度とを比較する
ことによつて行われる。すなわち濃度測定を目的
とするグルコース含有液と濃度既知のグルコース
標準液とでαとβの含有割合が一定であると仮定
して両液のβ型に対して得られた応答を比較して
求めているわけである。ところが実際の被検液で
は液の温度、PH、夾雑物等によつてαとβの平衡
値は当然変動しうる。そして標準液を被検液とま
つたく同じα，β間干衡状態に保つことは当然の
ことながら困難であり、分析の誤差をまねきやす
い。このことからα，β両グルコースに活性を有
する複合酵素系を用いる本発明の方法は、より精
度良く全グルコース濃度を測定しうるという利点
も有している。
また、上記２種の酵素をリン酸緩衝液に溶解し
た状態で室温保存すると急速に活性が低下するの
に対して、実施例１〜３に示した複合固定化酵素
系においては、緩衝液中300日の室温保存後にお
いても初期の約75％の応答性を維持しており、保
存性に優れたものであつた。
た状態で室温保存すると急速に活性が低下するの
に対して、実施例１〜３に示した複合固定化酵素
系においては、緩衝液中300日の室温保存後にお
いても初期の約75％の応答性を維持しており、保
存性に優れたものであつた。
以上のようにムタロターゼとグルコースオキシ
ダーゼからなる複合固定化酵素を用い、グルコー
ス濃度を電気化学的に測定する酵素電極において
は、全グルコース濃度を測定していることにな
り、応答感度、測定精度が向上し、さらには保存
性にも優れるという効果がある。
ダーゼからなる複合固定化酵素を用い、グルコー
ス濃度を電気化学的に測定する酵素電極において
は、全グルコース濃度を測定していることにな
り、応答感度、測定精度が向上し、さらには保存
性にも優れるという効果がある。
第１図は酸素濃度計の応答曲線を示す図、第２
図は３電極電気化学測定系の構成図、第３図は
H2O2の酸化電流を測定する場合の電流応答曲線、
第４図はヒドロキノンの酸化電流を測定する場合
の電流応答曲線である。
図は３電極電気化学測定系の構成図、第３図は
H2O2の酸化電流を測定する場合の電流応答曲線、
第４図はヒドロキノンの酸化電流を測定する場合
の電流応答曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 固定化されたグルコースオキシダーゼとムタ
ロターゼからなる複合固定化酵素膜を電極近傍に
備えてなり、複合固定化酵素反応により生成ある
いは消費される物質の濃度を前記電極で電気化学
的に検知することを特徴とするグルコース濃度測
定用酵素電極。 ２ 複合固定化酵素反応により生成される物質
が、H2O2あるいは還元型のレドツクス化合物で
ある特許請求の範囲第１項に記載のグルコース濃
度測定用酵素電極。 ３ 複合固定化酵素反応により消費される物質
が、O2である特許請求の範囲第１項に記載のグ
ルコース濃度測定用酵素電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3972680A JPS56137899A (en) | 1980-03-27 | 1980-03-27 | Determining method of glucose concentration |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3972680A JPS56137899A (en) | 1980-03-27 | 1980-03-27 | Determining method of glucose concentration |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56137899A JPS56137899A (en) | 1981-10-28 |
| JPH0119880B2 true JPH0119880B2 (ja) | 1989-04-13 |
Family
ID=12560978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3972680A Granted JPS56137899A (en) | 1980-03-27 | 1980-03-27 | Determining method of glucose concentration |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56137899A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6024444A (ja) * | 1983-07-19 | 1985-02-07 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | バイオセンサ |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CS164231B2 (ja) * | 1972-09-28 | 1975-11-07 | ||
| JPS5236092A (en) * | 1975-09-17 | 1977-03-19 | Omron Tateisi Electronics Co | Measuring electrode |
| JPS5258995A (en) * | 1975-11-07 | 1977-05-14 | Owens Illinois Inc | Measuring method and apparatus for glucose |
-
1980
- 1980-03-27 JP JP3972680A patent/JPS56137899A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56137899A (en) | 1981-10-28 |
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