JPH01199595A - ジペプチドの酵素的製法 - Google Patents
ジペプチドの酵素的製法Info
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- JPH01199595A JPH01199595A JP63309016A JP30901688A JPH01199595A JP H01199595 A JPH01199595 A JP H01199595A JP 63309016 A JP63309016 A JP 63309016A JP 30901688 A JP30901688 A JP 30901688A JP H01199595 A JPH01199595 A JP H01199595A
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- carboxyl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ｐＨ最低７および室温〜６０’Ｃの範囲の温
度で、システイン−プロテアーゼ〔ＥＣ３．４，２２Ｉ
ｌｌの存在下に、Ｎ−保護α−アミノカルボン酸アルキ
ルエステルとアミノ成分との反応によりジペプチドを酵
素的に製造する方法に関する。
度で、システイン−プロテアーゼ〔ＥＣ３．４，２２Ｉ
ｌｌの存在下に、Ｎ−保護α−アミノカルボン酸アルキ
ルエステルとアミノ成分との反応によりジペプチドを酵
素的に製造する方法に関する。
Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ
ｅｓ、 ２３．１９８４゜５２８−５３４頁から、最低
７のｐＨ１直および室温〜５０’Ｏの範囲の温度、シス
ティン−プロテアーゼパパインの存在下にカルボキシル
成分としてのＮ−保護α−アミノカルボン酸アルキルエ
ステルとアミノ成分との反応によるジペプチドの酵素的
製法は、すでに公知である。アミノ成分として、アミド
およびアミノカルボン酸のも一ブチルエステルがその機
能を果たす。アミノカルボン酸がアミノ成分として不適
当であることは明確に確認される。さらにカルボキシル
成分を過剰量で使用することが推奨される。それという
のもペプチドの収量を尚めるためにはこれが必要である
からである。
ｅｓ、 ２３．１９８４゜５２８−５３４頁から、最低
７のｐＨ１直および室温〜５０’Ｏの範囲の温度、シス
ティン−プロテアーゼパパインの存在下にカルボキシル
成分としてのＮ−保護α−アミノカルボン酸アルキルエ
ステルとアミノ成分との反応によるジペプチドの酵素的
製法は、すでに公知である。アミノ成分として、アミド
およびアミノカルボン酸のも一ブチルエステルがその機
能を果たす。アミノカルボン酸がアミノ成分として不適
当であることは明確に確認される。さらにカルボキシル
成分を過剰量で使用することが推奨される。それという
のもペプチドの収量を尚めるためにはこれが必要である
からである。
〔発明が解決し７ようとする課題〕
この公知法の欠点は、生じるジペプチドがカルボキシル
末端で誘導体化されていることにある。保護基、殊にア
ミド基の選択的脱離は、ペプチド結合の同時分離なしで
は、はとんど不可能であるので、この方法で遊離のカル
ボキシル基を有するジペプチドを得ることはできない。
末端で誘導体化されていることにある。保護基、殊にア
ミド基の選択的脱離は、ペプチド結合の同時分離なしで
は、はとんど不可能であるので、この方法で遊離のカル
ボキシル基を有するジペプチドを得ることはできない。
ところで、本発明方法は、アミノ成分として誘導体化さ
れていないα−アミノ−およびカルボキシル基を有する
α−アミノカルボン酸ヲ使用することより成る。
れていないα−アミノ−およびカルボキシル基を有する
α−アミノカルボン酸ヲ使用することより成る。
特に本発明の方法は、カルボキシル成分としてのＮ−保
護α−アミノカルボン酸アルキルエステルとアミノ成分
としての塩基性または中性の脂肪族α−アミノカルボン
酸との間のペプチド結合の連結のために好適である。
護α−アミノカルボン酸アルキルエステルとアミノ成分
としての塩基性または中性の脂肪族α−アミノカルボン
酸との間のペプチド結合の連結のために好適である。
アミノ成分を使用カルボキシル成分に対して過剰モルで
使用する場合に特に有利である。この過剰は一般に１〜
１５０倍である。
使用する場合に特に有利である。この過剰は一般に１〜
１５０倍である。
本発明方法の決定的な利点は、直接、誘導体化されてい
ないカルボキシル末端基を有するＮ〜保護ジペプチドが
生じることである。Ｎ−保護基が自体公知の方法で選択
的に脱離される場合は、問題なく遊離ジペプチドが得ら
れる。
ないカルボキシル末端基を有するＮ〜保護ジペプチドが
生じることである。Ｎ−保護基が自体公知の方法で選択
的に脱離される場合は、問題なく遊離ジペプチドが得ら
れる。
カルボキシル成分として、有利にアルキル基に炭素原子
数１〜４を有するＮ−保護α−アミノカルボン酸アルキ
ルエステル、殊にメチルエステルおよびエチルエステル
が機能を果たす。
数１〜４を有するＮ−保護α−アミノカルボン酸アルキ
ルエステル、殊にメチルエステルおよびエチルエステル
が機能を果たす。
好適なＮ−保護基は、殊に、ベンツル基、カルボベンゾ
キシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ−基）
、またはアセチル−またはベンゾイル基である。
キシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ−基）
、またはアセチル−またはベンゾイル基である。
システィン−プロテアーゼとしては、有利なパパイン［
Ｅ Ｃ３，４，２２，２〕の他に、例えばフィシン［Ｅ
Ｃ３，４，２２，３”’ＪまたはプロメラインＣＥ
Ｃ３，４，２２，４〕も使用できる。これらの酵素は固
体形で、例えば凍結乾燥、または溶解された形で反応混
合物に添加することかできる。この際、酵素は高度に精
製された形で存在する必要はない。従って、パパイヤ（
Ｃａｒｊ、ｃａｐａｐａｙａ ）イチジク（Ｆｉｃｕ、
ｓ ｃａｒｉｃａ ）またはパイナツプル（Ａｎａｎａ
Ｓ Ｃ０ｍ０８ｕ、Ｓ ）からの凍結乾燥された粗生成
物の使用も十分な合成の結果をもたらす。しかしながら
、システィン−プロテアーゼをその使用の前に、１〜１
０ ｍＭエチレンシアミノ四酢ｅ （ＥＤＴＡ ）およ
び選択的に５〜２０ ｍＭシスティン、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ ）またはβ−メルカプトエタノールの存
在下に、２５〜４０℃の範囲の温度で、６０〜６０分間
活性化させる場合に、有利である。この処理は、酵素の
特異的活性を高め、それに伴ない必要な反応時間を短縮
するかもしくは同じ反応時間でより少ない酵素を必要と
するという利点金もたらす。酵素は反応混合物中で遊離
（そのまま）の形でも、担体に結合して（固定されて）
存在していてもよい。
Ｅ Ｃ３，４，２２，２〕の他に、例えばフィシン［Ｅ
Ｃ３，４，２２，３”’ＪまたはプロメラインＣＥ
Ｃ３，４，２２，４〕も使用できる。これらの酵素は固
体形で、例えば凍結乾燥、または溶解された形で反応混
合物に添加することかできる。この際、酵素は高度に精
製された形で存在する必要はない。従って、パパイヤ（
Ｃａｒｊ、ｃａｐａｐａｙａ ）イチジク（Ｆｉｃｕ、
ｓ ｃａｒｉｃａ ）またはパイナツプル（Ａｎａｎａ
Ｓ Ｃ０ｍ０８ｕ、Ｓ ）からの凍結乾燥された粗生成
物の使用も十分な合成の結果をもたらす。しかしながら
、システィン−プロテアーゼをその使用の前に、１〜１
０ ｍＭエチレンシアミノ四酢ｅ （ＥＤＴＡ ）およ
び選択的に５〜２０ ｍＭシスティン、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ ）またはβ−メルカプトエタノールの存
在下に、２５〜４０℃の範囲の温度で、６０〜６０分間
活性化させる場合に、有利である。この処理は、酵素の
特異的活性を高め、それに伴ない必要な反応時間を短縮
するかもしくは同じ反応時間でより少ない酵素を必要と
するという利点金もたらす。酵素は反応混合物中で遊離
（そのまま）の形でも、担体に結合して（固定されて）
存在していてもよい。
反応開始のためのカルボキシル成分の譲１更は厳密では
ない。当初濃度の選択は、むしろ、本質的にカルボキシ
ル成分の溶解度によって決定される。例えばＣｂｚ −
Ａｌａ 、−ＯＭｅが０．０１〜０．２０ ］ｔの濃度
範囲では、合成されるべきペプチドの収量はＣｂｚ −
Ａｈａ−ＯＭｅの当初濃度によって影響されない。他方
、部分的に、純水中に４溶性の１リー保護α−アミノカ
ルボン酸アルキルエステルの溶解度を改良するために、
有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、インプロピ
ルアルコール、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジ
メチルスルホキシド、ジメトキシエタン、テトラメチル
尿素、ジメチルプロピレン尿素、またはＮ−メチルピロ
リドンを反応混合物に添加することもできる。
ない。当初濃度の選択は、むしろ、本質的にカルボキシ
ル成分の溶解度によって決定される。例えばＣｂｚ −
Ａｌａ 、−ＯＭｅが０．０１〜０．２０ ］ｔの濃度
範囲では、合成されるべきペプチドの収量はＣｂｚ −
Ａｈａ−ＯＭｅの当初濃度によって影響されない。他方
、部分的に、純水中に４溶性の１リー保護α−アミノカ
ルボン酸アルキルエステルの溶解度を改良するために、
有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、インプロピ
ルアルコール、１．４−ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジ
メチルスルホキシド、ジメトキシエタン、テトラメチル
尿素、ジメチルプロピレン尿素、またはＮ−メチルピロ
リドンを反応混合物に添加することもできる。
有機溶剤の種類およびその量は、使用酵素の活性度およ
び安定性が本質的には損われないように選択すべきであ
る。さもないと、所望のジペプチドの収量は低下される
こともあり得るからである。
び安定性が本質的には損われないように選択すべきであ
る。さもないと、所望のジペプチドの収量は低下される
こともあり得るからである。
本発明の方法は、７．０〜１０．０の範囲、有利に８．
８〜９．５の範囲のＰＨ甑で実施する。反応温度は室温
〜６０℃１有利には６５〜４０’Ｃの範囲（Ｃあってよ
い。
８〜９．５の範囲のＰＨ甑で実施する。反応温度は室温
〜６０℃１有利には６５〜４０’Ｃの範囲（Ｃあってよ
い。
アミノ成分としては、遊離のα−アミノ基および遊離の
カルボキシル基を有するα−アミノカルボン酸全使用す
る。不所望の副反応を避けるために、付加的な官能基、
例えばリジンのε−アミノ基、アルギニンのグアニジノ
基、スレオニン、セリンマタハチロシンのヒドロキシル
基、またはシスティンのメルカプト基を、慣用の保護基
でマスキングすることが有利である。
カルボキシル基を有するα−アミノカルボン酸全使用す
る。不所望の副反応を避けるために、付加的な官能基、
例えばリジンのε−アミノ基、アルギニンのグアニジノ
基、スレオニン、セリンマタハチロシンのヒドロキシル
基、またはシスティンのメルカプト基を、慣用の保護基
でマスキングすることが有利である。
しかしながら、これはすべての場合に必要なのではない
。
。
おそらく、使用アミノ成分の種類および反応混合物中に
おけるその一度は、ジペプチドの収量に重要な影響を与
える。環基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、オ
ルニチンおよびシトルリン、並びに中性脂肪＄７アミノ
酸、例えばグリシンおよびアラニンは、特に容易に変換
される。これに反して、α−イミノカルボンばとしての
プロリンおよびヒドロキシプロリンは、まったく変換さ
れない。カルボキシル成分の濃度とは反対に、アミノ成
分の濃度は、ジペプチドの収量に重要な影響を与える。
おけるその一度は、ジペプチドの収量に重要な影響を与
える。環基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、オ
ルニチンおよびシトルリン、並びに中性脂肪＄７アミノ
酸、例えばグリシンおよびアラニンは、特に容易に変換
される。これに反して、α−イミノカルボンばとしての
プロリンおよびヒドロキシプロリンは、まったく変換さ
れない。カルボキシル成分の濃度とは反対に、アミノ成
分の濃度は、ジペプチドの収量に重要な影響を与える。
従って、アミノ成分を大過剰で使用するのが有利である
。消費されなかったアミノ成分過剰分は、自体公知の方
法で容易に回収でき、改めて使用することができる。
。消費されなかったアミノ成分過剰分は、自体公知の方
法で容易に回収でき、改めて使用することができる。
本発明方法は、バッチ法として、または好適なバイオリ
アクターの使用下に、水性または水性−有機緩衝系中で
連続的に実施することができる。必要な反応時間は、一
般に１〜２時間の範囲であり、第一に酵素の使用量およ
び反応成分の種類と濃度に依存する。その他には、長期
間のインキュベーションの際でもおよびカルボキシル成
分の完全な消費の後にも生成ジペプチドは存在する酵素
による二次加水分解を受けないので、反応時間は厳密で
はない。
アクターの使用下に、水性または水性−有機緩衝系中で
連続的に実施することができる。必要な反応時間は、一
般に１〜２時間の範囲であり、第一に酵素の使用量およ
び反応成分の種類と濃度に依存する。その他には、長期
間のインキュベーションの際でもおよびカルボキシル成
分の完全な消費の後にも生成ジペプチドは存在する酵素
による二次加水分解を受けないので、反応時間は厳密で
はない。
生成ジペプチドの精製は、自体公知の方法で、ケゞルク
ロマトグラフイー、イオン交換体クロマトゲラフイーま
たは逆相クロマトグラノイーによって行なうことができ
る。定性、定量および収量測定のために、等速電気泳動
および高性能液体クロマドグシフイーを使用することが
できる。
ロマトグラフイー、イオン交換体クロマトゲラフイーま
たは逆相クロマトグラノイーによって行なうことができ
る。定性、定量および収量測定のために、等速電気泳動
および高性能液体クロマドグシフイーを使用することが
できる。
本発明を次の実施例につき詳述する。
例 １ ：
カルボベンゾキシ−ルーアラニル−Ｌ−アラニン（Ｚ
−Ａｌａ −Ａｌａ ）の合成０．１ＭＫＣｆ、８ｍＭ
ＥＤＴＡ、 ２ ＯｍＭ ＤＴＴ中の１．９ＭＬ−７
う＝ ７４ ｍｌを、４０℃の恒温にした反応容器内に
入れ、濃苛性ソーダ液を用いテｐＨ９，２に調節し、次
いでパパイン（（ＥＣ３−４，２２，２）、３．５ ｍ
アンソン−ｗ／ｍ９）２Ｑｍ９ｆ添加した。反応を、エ
フノール中の１Ｍカルボベンゾキシ−Ｌ−アラニンメチ
ルエステル０．２１ｎｌ（バッチ中の濃度４８ ｍＭ
）の添加によって開始させた。布苛性ソーダの装入によ
って、この合成法の間中の反応混合物のＰＩ（直ヲｐＨ
９，２で一定保持した（ ｐＨ−８ｔａｔ−Ｖｅｒｆａ
ｈｒｅｎ ：ＰＨ−スタンド法）。２時間後に、ＨＣ’
Ｊの添加（ｐＨｉ［を約１に低下させる）によってこの
合成を停止させた。
−Ａｌａ −Ａｌａ ）の合成０．１ＭＫＣｆ、８ｍＭ
ＥＤＴＡ、 ２ ＯｍＭ ＤＴＴ中の１．９ＭＬ−７
う＝ ７４ ｍｌを、４０℃の恒温にした反応容器内に
入れ、濃苛性ソーダ液を用いテｐＨ９，２に調節し、次
いでパパイン（（ＥＣ３−４，２２，２）、３．５ ｍ
アンソン−ｗ／ｍ９）２Ｑｍ９ｆ添加した。反応を、エ
フノール中の１Ｍカルボベンゾキシ−Ｌ−アラニンメチ
ルエステル０．２１ｎｌ（バッチ中の濃度４８ ｍＭ
）の添加によって開始させた。布苛性ソーダの装入によ
って、この合成法の間中の反応混合物のＰＩ（直ヲｐＨ
９，２で一定保持した（ ｐＨ−８ｔａｔ−Ｖｅｒｆａ
ｈｒｅｎ ：ＰＨ−スタンド法）。２時間後に、ＨＣ’
Ｊの添加（ｐＨｉ［を約１に低下させる）によってこの
合成を停止させた。
反応経過を把握するために、種々の時点で少量を取り出
し、希Ｈ俄を加え、引続き等速電気泳動もしくは、リク
ロソルブＲＰ ｉ８−カラム（Ｌｌｃｈｒｏｓｏｒｂ
ＲＰ １８− Ｓ：ｆｆ１ｕｌｅ ） （５μア；
２５０ Ｘ ４ ｍｎ）の使用下でのＨＰＬＣによって
分析した。カラム温度４０℃および溶離速度ｉ＋ｎ１Ａ
）で、アセトニトリル４０％／ １２．５ ｍＭリン醒
緩衝液（ｐＨ２に対する）６０％で溶離の後に、２１０
ｎｍでのＵＶ−吸光度の測定によってＺ−Ａｌａ−Ａ
ｌａを検出した。
し、希Ｈ俄を加え、引続き等速電気泳動もしくは、リク
ロソルブＲＰ ｉ８−カラム（Ｌｌｃｈｒｏｓｏｒｂ
ＲＰ １８− Ｓ：ｆｆ１ｕｌｅ ） （５μア；
２５０ Ｘ ４ ｍｎ）の使用下でのＨＰＬＣによって
分析した。カラム温度４０℃および溶離速度ｉ＋ｎ１Ａ
）で、アセトニトリル４０％／ １２．５ ｍＭリン醒
緩衝液（ｐＨ２に対する）６０％で溶離の後に、２１０
ｎｍでのＵＶ−吸光度の測定によってＺ−Ａｌａ−Ａ
ｌａを検出した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ −Ａ
］、ａ −Ａ］、ａの収率は理論値の６５％であった。
］、ａ −Ａ］、ａの収率は理論値の６５％であった。
例 ２
カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニル−［（Ｓ−アセトアミ
ドメチル）−Ｌ−システィン）（Ｚ−Ａｌａ −［Ａｃ
ｍ ］ Ｃｙｓ ）の合成例１に記載のように実施する
が、反応混合物は、アミノ成分として０．１ Ｍ Ｋ
ｃｖ、８ｍＭＥＤＴＡおよび２ Ｃ１ｍＭ ＤＴＴ中
の２Ｍ Ｓ−アセトアミドメチル−■１−ンステイン
Ｘ Ｈ（Ｊ ４ ｍｌを含有した。
ドメチル）−Ｌ−システィン）（Ｚ−Ａｌａ −［Ａｃ
ｍ ］ Ｃｙｓ ）の合成例１に記載のように実施する
が、反応混合物は、アミノ成分として０．１ Ｍ Ｋ
ｃｖ、８ｍＭＥＤＴＡおよび２ Ｃ１ｍＭ ＤＴＴ中
の２Ｍ Ｓ−アセトアミドメチル−■１−ンステイン
Ｘ Ｈ（Ｊ ４ ｍｌを含有した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ −Ａ
ｌａ −［Ａｃｍ：ｌ Ｃｙｓの収率は理論値の８８係
であった。
ｌａ −［Ａｃｍ：ｌ Ｃｙｓの収率は理論値の８８係
であった。
例 ６
カルホヘンゾキシーグリシルーＬ −７７＝ ７（Ｚ
−Ｇ］、ｙ−Ａｌａ ）の合成 例１に記載のように実施するが、反応混合物はカルボキ
シル成分としてエタノール中の１Ｍカルボペンツゞキシ
〜グリシンメチルエステル０．２ｍ１（バッチ中の濃度
４８ ｍＭ ）を含有した。
−Ｇ］、ｙ−Ａｌａ ）の合成 例１に記載のように実施するが、反応混合物はカルボキ
シル成分としてエタノール中の１Ｍカルボペンツゞキシ
〜グリシンメチルエステル０．２ｍ１（バッチ中の濃度
４８ ｍＭ ）を含有した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ −Ｇ
ｌｙ −Ａ、ｌａの収率は理論値の７６チであった。
ｌｙ −Ａ、ｌａの収率は理論値の７６チであった。
例 ４ ：
カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニル−クリシン（Ｚ ＝
Ａｌａ−Ｇｕｙ ）の合成 ０、ｉ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３’１ １ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、 １０ ｍＭ ＤＴＴ中の３．３３ ＭグＶノン
ｉ、８ｍ１（バッチ中の濃度２１Ｊ＋）を、３７℃の恒
温にした反応容器内で、エタノール０．６ｍｌおよびパ
パイン酸１０．３ｍ１（０，ｉ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／
ＮａＨＣＯ３，１ｍＭ ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ
ＤＴＴ ｐＨ９，０中のパパイン（［： Ｅ Ｃ３，４
，２２゜２］、３．５ ｍ ７７ソ”−Ｅ／ｍ９） １
５ｙｎｇに相当）と混合し、かつ、Ｐｌ（−値をＰＨ９
，０に調節した。
Ａｌａ−Ｇｕｙ ）の合成 ０、ｉ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３’１ １ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、 １０ ｍＭ ＤＴＴ中の３．３３ ＭグＶノン
ｉ、８ｍ１（バッチ中の濃度２１Ｊ＋）を、３７℃の恒
温にした反応容器内で、エタノール０．６ｍｌおよびパ
パイン酸１０．３ｍ１（０，ｉ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／
ＮａＨＣＯ３，１ｍＭ ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ
ＤＴＴ ｐＨ９，０中のパパイン（［： Ｅ Ｃ３，４
，２２゜２］、３．５ ｍ ７７ソ”−Ｅ／ｍ９） １
５ｙｎｇに相当）と混合し、かつ、Ｐｌ（−値をＰＨ９
，０に調節した。
反応を、エタノール中の０．４５Ｍカルポベノゾキシー
Ｌ−７ラニンメチルエステル０．６ｍｌ＜バッチ中の濃
度４５ｍ１φ）の添加によって開始させた。口、Ｉ Ｎ
ＮａＯＨの添加によって、反応工程中の反応混合物
のＰＩ′Ｉ値ｉ１． ＰＨ５）、０に一定保持した（Ｐ
Ｈ−スタンド法）。２時間後に、１０チ（ｗ／ｖ ）
ｌ−’Ｊジクロロ酸３ ｍｌの添加によって合成を停止
させた。
Ｌ−７ラニンメチルエステル０．６ｍｌ＜バッチ中の濃
度４５ｍ１φ）の添加によって開始させた。口、Ｉ Ｎ
ＮａＯＨの添加によって、反応工程中の反応混合物
のＰＩ′Ｉ値ｉ１． ＰＨ５）、０に一定保持した（Ｐ
Ｈ−スタンド法）。２時間後に、１０チ（ｗ／ｖ ）
ｌ−’Ｊジクロロ酸３ ｍｌの添加によって合成を停止
させた。
反応経、過を杷握するために、神々の時点で少量ヲ取り
出し、１０ ％ （ｗ／ｖ ） ＴＣＡを用いて１：２
に希釈した。変性タンパク負を、１０口００ｒｐｍで１
０分間遠心分離し、上澄’ｔ２５ｍＭ！７ンｅ緩衝液（
ｐＨ２，０、） ／ ＭｅＯ）Ｊ ３ Ｄ ％ ／テト
ラヒドロンラン１チを用いて１：２に希釈し、引続きヌ
クレオンルＲＰ１８−カラム（ＮｕｃｌｅｏｓｉｌＲＰ
１８ ５ａｕｌｅ ） （１０μｍ ：２５０Ｘ４ｔ
ｍ ）の使用下にＨＰＬＣによって分析した。カラムの
温度５０℃および溶出速度ｌ ｍｌ ７分でＭｅＯＨ２
９％／テトラヒドロフラン１ ％ ／ ２５ ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ２，０）７０チを用いて溶離の後に、２
５８ｎｍにおけるＵＶ−吸光度測定によってＺ −Ａｌ
ａ−（）ｌｙが検出された。
出し、１０ ％ （ｗ／ｖ ） ＴＣＡを用いて１：２
に希釈した。変性タンパク負を、１０口００ｒｐｍで１
０分間遠心分離し、上澄’ｔ２５ｍＭ！７ンｅ緩衝液（
ｐＨ２，０、） ／ ＭｅＯ）Ｊ ３ Ｄ ％ ／テト
ラヒドロンラン１チを用いて１：２に希釈し、引続きヌ
クレオンルＲＰ１８−カラム（ＮｕｃｌｅｏｓｉｌＲＰ
１８ ５ａｕｌｅ ） （１０μｍ ：２５０Ｘ４ｔ
ｍ ）の使用下にＨＰＬＣによって分析した。カラムの
温度５０℃および溶出速度ｌ ｍｌ ７分でＭｅＯＨ２
９％／テトラヒドロフラン１ ％ ／ ２５ ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ２，０）７０チを用いて溶離の後に、２
５８ｎｍにおけるＵＶ−吸光度測定によってＺ −Ａｌ
ａ−（）ｌｙが検出された。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ Ａ
ｌａ−Ｇｕｙの収率は理論値の４８襲であった。
ｌａ−Ｇｕｙの収率は理論値の４８襲であった。
例 ５
カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ｚ
−Ａｌａ−Ｍｅｔ ）の合成例４に記載のように実施
したが、反応混合物はアミノ成分として、Ｑ、Ｉ Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３，１ｍＭＥＤＴ、Ａ、 １０ ｍＭ
ＤＴＴ中の０．４ＭＬ−メチオニン’１．８ｍｌ＜バ
ッチ中の濃度０．２４ Ｍ ）を含有した。
−Ａｌａ−Ｍｅｔ ）の合成例４に記載のように実施
したが、反応混合物はアミノ成分として、Ｑ、Ｉ Ｍ
Ｎａ２ＣＯ３，１ｍＭＥＤＴ、Ａ、 １０ ｍＭ
ＤＴＴ中の０．４ＭＬ−メチオニン’１．８ｍｌ＜バ
ッチ中の濃度０．２４ Ｍ ）を含有した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算してＺ −Ａｌ
ａ Ｍｅｔの収率（は理論値の２９％であった。
ａ Ｍｅｔの収率（は理論値の２９％であった。
例 ６ 。
カルボベノゾキシ〜Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン（Ｚ −
Ａ、１ａ−Ｖａｌ ）の合成例４に記載のように実施し
たが、反応混合物はアミノ成分どしてＤ 、Ｉ Ｍ ７
Ｎａ２ＣＯ３，１ｍＭＥＤＴＡ、 １０ ｍＭ
ＤＴＴ中の０．６７１ｔ Ｌ−バリン１．８＋ｑｌ（
パン、チ中の濃度は０．４Ｍ）を含有した。
Ａ、１ａ−Ｖａｌ ）の合成例４に記載のように実施し
たが、反応混合物はアミノ成分どしてＤ 、Ｉ Ｍ ７
Ｎａ２ＣＯ３，１ｍＭＥＤＴＡ、 １０ ｍＭ
ＤＴＴ中の０．６７１ｔ Ｌ−バリン１．８＋ｑｌ（
パン、チ中の濃度は０．４Ｍ）を含有した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌの収率は理論匝の１６係であった。
ａ−Ｖａｌの収率は理論匝の１６係であった。
例 ７ 二
カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニン（Ｚ
−Ａｌａ −Ａｒｇ ）の合成例４に記載のように実
施したが、反応混合物はアミノ成分として、Ｑ、ｉＭＫ
ｃｆ、 １ ｍＭＥＤＴＡｌ ０ ｍＭ ＤＴＴ中の
θ、８ＭＬ−アルギニン１．８ｍ１（バッチ中濃度０．
４８ Ｍ ）を含有した。
−Ａｌａ −Ａｒｇ ）の合成例４に記載のように実
施したが、反応混合物はアミノ成分として、Ｑ、ｉＭＫ
ｃｆ、 １ ｍＭＥＤＴＡｌ ０ ｍＭ ＤＴＴ中の
θ、８ＭＬ−アルギニン１．８ｍ１（バッチ中濃度０．
４８ Ｍ ）を含有した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算してＺ −Ａ、
］、ａ −Ａｒｇの収率は理論値の７２％であった。
］、ａ −Ａｒｇの収率は理論値の７２％であった。
例 ８ ：
例７に記載のように実施したが、反応混合物は、 ０．
０１ Ｍ 酢酸Ｎａ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ｓ
１ ０ ｍＭシスティン、ｐＨ４，５中のフィシン
（［Ｅ Ｃ３，４゜２２．３〕、約３Ｕ／１７１ｇ、２
５℃１基質としてＢＡ、ＥＥ ） ３ ｍ９に相当する
フィシン溶液０．３ｍ１ｒ含有した。反応はｐＨ９，０
で実施した。
０１ Ｍ 酢酸Ｎａ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ｓ
１ ０ ｍＭシスティン、ｐＨ４，５中のフィシン
（［Ｅ Ｃ３，４゜２２．３〕、約３Ｕ／１７１ｇ、２
５℃１基質としてＢＡ、ＥＥ ） ３ ｍ９に相当する
フィシン溶液０．３ｍ１ｒ含有した。反応はｐＨ９，０
で実施した。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇの収率は理論値の７６チであった。
ａ−Ａｒｇの収率は理論値の７６チであった。
例 ９ ：
例７に記載のように実流したが、反応混合物は、Ｑ、３
ＭＬ−アルギニン、［］、ｉＭ ＫＣ，１，、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、 １０ ｍＭ ＤＴＴ （ｐＨ９，
０） ４０１’Ｌｌ中のパパイン６０ロノｎノおよびエ
タノール２０ ｍｌ中のカルボベンゾキシ−Ｌ−アラニ
ンメチルエステル３０００１ψ（１２，６４ｍモル〕（
バンチ中の濃度０．２１ Ｍ ）を含有した。２時間後
に合成を１０％（ｗ／ｖ ） ）リクロロ酢酸６０ｍ１
の添加によって停止させた。
ＭＬ−アルギニン、［］、ｉＭ ＫＣ，１，、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、 １０ ｍＭ ＤＴＴ （ｐＨ９，
０） ４０１’Ｌｌ中のパパイン６０ロノｎノおよびエ
タノール２０ ｍｌ中のカルボベンゾキシ−Ｌ−アラニ
ンメチルエステル３０００１ψ（１２，６４ｍモル〕（
バンチ中の濃度０．２１ Ｍ ）を含有した。２時間後
に合成を１０％（ｗ／ｖ ） ）リクロロ酢酸６０ｍ１
の添加によって停止させた。
カルボキシル成分の使用量に対して計算して、Ｚ−ＡＪ
ａ−Ａｌｇの収率は理論値の７１係であった。
ａ−Ａｌｇの収率は理論値の７１係であった。
生成されたカルボペンツゞキシーＬ−アラニル−Ｌ−ア
ルギニンの後処理のために、トリクロロ酢酸で１＝２に
希釈された反応混合物の６０ｍ１をＦＰＬＣ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ 、 Ｒｅｐ ＲＰＣＨＲ５１５、水／エタ
ノール、０．５ｍ１１分）を用いて分画した。
ルギニンの後処理のために、トリクロロ酢酸で１＝２に
希釈された反応混合物の６０ｍ１をＦＰＬＣ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ 、 Ｒｅｐ ＲＰＣＨＲ５１５、水／エタ
ノール、０．５ｍ１１分）を用いて分画した。
Ｚ−ＡＪａ −Ａｒｇ−含有フラクションを集め、４０
℃でエタノール４倍量の添加下に蒸発乾固させた。
℃でエタノール４倍量の添加下に蒸発乾固させた。
収量 理論値の５７％に相当する１６６０〜（３，５８
ｍモル９゜ ＨＰＬＣ−分析は、白色結晶状物質が副生酸物不含であ
ることを示している。加水分解（２４時間、６ＮＨＣ１
）後にアミノ酸分析を行った。
ｍモル９゜ ＨＰＬＣ−分析は、白色結晶状物質が副生酸物不含であ
ることを示している。加水分解（２４時間、６ＮＨＣ１
）後にアミノ酸分析を行った。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ｐＨ最低７および室温〜６０℃の範囲の温度で、シ
ステイン−プロテアーゼ〔ＥＣ３．４．２２〕の存在下
にＮ−保護α−アミノカルボン酸アルキルエステルとア
ミノ成分との反応によりジペプチドを酵素的に製造する
場合に、アミノ成分として、誘導体化されていないα−
アミノ−およびカルボキシル基を有するα−アミノカル
ボン酸を使用することを特徴とする、ジペプチドの酵素
的製法。 ２、アミノ成分として、塩基性または中性の脂肪族α−
アミノカルボン酸を使用する、請求項１記載の方法。 ３、アミノ成分を使用カルボキシル成分に対して１〜１
５０倍の過剰モルで使用する、請求項１または２記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873741515 DE3741515A1 (de) | 1987-12-08 | 1987-12-08 | Verfahren zur herstellung von dipeptiden |
| DE3741515.8 | 1987-12-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199595A true JPH01199595A (ja) | 1989-08-10 |
Family
ID=6342097
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63309016A Pending JPH01199595A (ja) | 1987-12-08 | 1988-12-08 | ジペプチドの酵素的製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0321722B1 (ja) |
| JP (1) | JPH01199595A (ja) |
| AT (1) | ATE101616T1 (ja) |
| DE (2) | DE3741515A1 (ja) |
| DK (1) | DK680888A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005052153A1 (ja) * | 2003-11-27 | 2007-06-21 | 協和醗酵工業株式会社 | ジペプチドの製造法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2708938B1 (fr) * | 1993-08-09 | 1995-11-03 | Bioeurope | Procédé enzymatique perfectionné de préparation d'oligomères de L-lysine. |
| NL1006069C2 (nl) * | 1997-05-16 | 1998-11-17 | Dsm Nv | Werkwijze voor de bereiding van peptiden. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI70597C (fi) * | 1979-04-06 | 1986-09-24 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Foerfarande foer enzymatisk framstaellning av peptider |
-
1987
- 1987-12-08 DE DE19873741515 patent/DE3741515A1/de active Granted
-
1988
- 1988-11-24 AT AT88119553T patent/ATE101616T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-11-24 DE DE88119553T patent/DE3887854D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-24 EP EP88119553A patent/EP0321722B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-07 DK DK680888A patent/DK680888A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-12-08 JP JP63309016A patent/JPH01199595A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005052153A1 (ja) * | 2003-11-27 | 2007-06-21 | 協和醗酵工業株式会社 | ジペプチドの製造法 |
| JP4731327B2 (ja) * | 2003-11-27 | 2011-07-20 | 協和発酵バイオ株式会社 | ジペプチドの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0321722A2 (de) | 1989-06-28 |
| ATE101616T1 (de) | 1994-03-15 |
| DE3741515A1 (de) | 1989-06-22 |
| EP0321722B1 (de) | 1994-02-16 |
| DK680888A (da) | 1989-06-09 |
| EP0321722A3 (en) | 1990-05-30 |
| DE3741515C2 (ja) | 1989-12-07 |
| DK680888D0 (da) | 1988-12-07 |
| DE3887854D1 (de) | 1994-03-24 |
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