JPH01206253A - 尿酸センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は尿酸センサに関し、詳しくは重金属耐性を有す
るウリカーゼを用いて長時間安定した酵素活性を保つこ
とができる尿酸センサに関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕尿酸
は、生体において摂取された蛋白質の最終産物の１つで
あり、通常人体では尿中に排せつされる。健康な人体の
血液中の尿酸濃度は血清１００ｄあたり約２．０〜８．
０■であるが、腎臓機能の低下や尿毒症、痛風などの病
的状態では血中濃度の増加が見られ、１０ｍｇ／ｄｊ２
またはそれ以上に達することもある。従って、血清中の
尿酸濃度の測定は上記病態の診断上、重要な意味を有し
ている。

一般に、血中の尿酸濃度を測定する方法としてはウリカ
ーゼ（Ｅ　Ｃ１，７，３，３）を用いた酵素法が用いら
れている。ウリカーゼによる尿酸の化学反応は下記のよ
うに表わされる。

この酵素反応を利用して電気化学的に尿酸を測定するに
は、電極近傍にウリカーゼを固定化し、反応系中の尿酸
量に比例して消費あるいは生成する電極活物質によって
生じる電極における電流値あるいは電圧値の変化を取り
出せばよい。具体的には、電流値としては消費される酸
素の還元電流、あるいは過酸化水素の酸化電流を、また
電圧値としてはイオン電極などにより生成する二酸化炭
素を測定すればよい０通常は、酸素または過酸化水素を
測定する電極装置の場合では、ウリカーゼを近傍に固定
した作用電極として金あるいは白金電極などを用い、対
極として銀・塩化銀電極を用いる。また、二酸化炭素を
測定するイオン電極の場合、イオン感応膜付近にウリカ
ーゼを固定し、参照電極として銀・塩化銀電極を用いる
。

このように酵素を電極に固定して作成したセンサで多数
の検体を連続的に分析する場合において最も重要なこと
は、酵素が長期間所定の活性を維持することであるが、
対極あるいは参照電極として用いる銀・塩化銀電極から
銀イオンが流路に溶は出したり、感応膜を通って酵素固
定膜側に拡散し、その結果酵素活性を低下させ、尿酸分
析能力の低下を惹起することが知られている。

そこで、酵素活性を維持する方法について様々な提案が
されており、例えば対極をパラジウムを含む金属材料で
構成して銀イオンの影響を除く方法（特開昭５９−１３
３４５５号公報）があるが、金属パラジウムは高価であ
り電極素材として一般的でない。また、重金属捕捉剤と
してＳＨ基（メルカプト基）を有する化合物のトラップ
を設けたり、ＳＨ化合物を緩衝液に溶解して装置を運転
しない夜間も流して電極を保護する方法（特開昭５９−
１６２８９８号公報）もあるが、トラップを設けること
は装置として煩雑である上、ＳＨ化合物自体が不安定で
ある等の問題点があり、満足できるものが得られていな
い。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、酵素活性を長期間維持するには酵
素自体が重金属に対し耐性を有することが必要であると
し、この観点から鋭意検討した結果、銀に対し耐性を有
するウリカーゼを見出し、かかる知見に基いて本発明を
完成した。

すなわち、本発明は電極に重金属耐性を有するウリカー
ゼを固定したことを特徴とする尿酸センサを提供するも
のである。

本発明に用いるウリカーゼは、特開昭６１−２８０２７
２号公報記載の好熱性バチルス属に属する微生物、バチ
ルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　鉦ユＴＢ−９０（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−τ４５　　　）が生産するウリカー
ゼ（以下、ウリカーゼＴＢ−９０と称す。）であり、そ
の性質、製法等は同公報に記載されている。このウリカ
ーゼＴＢ−９０は１艮イオンに対して耐性があるため、
長期間に亘って十分な酵素活性を維持することが可能で
ある。また、酵素活性の減少したウリカーゼＴＢ−９０
は、金属キレート剤により活性を回復できるので、繰り
返し使用することも可能である。

本発明は、このウリカーゼＴＢ−９０を電極に固定して
なる尿酸センサに関する。

本発明の尿酸センサは、対極に銀・塩化銀電極を用いる
過酸化水素センサおよび酸素センサ、参照電極に銀・塩
化銀電極を用いる二酸化炭素測定イオン電極、二酸化炭
素測定用イオン感応型電界効果トランジスタなど銀を用
いた電気化学的測定装置を意味する。従って、ウリカー
ゼＴＢ−９０を固定する電極は各々のセンサが測定する
物質の信号を受は取りやすいものを選べばよく、具体的
には０２電極、ＨｔＯ□電掻、イオン電極などである。

ウリカーゼＴＢ−９０を電極に固定する方法は常法によ
ればよく、ウリカーゼＴＢ−９０を分析装置の測定系内
に不溶化する態様については、作用極近傍あるいは感応
膜近傍に位置して尿酸に作用するものであれば、どのよ
うな手法であってもよい。例えば、酵素を含む水溶液中
でピロール。

アニリンなどの芳香族化合物の電解重合を行い、酵素活
性を有する高分子薄膜を電極表面に形成させるなどの方
法がある（第６回化学センサ研究発表会講演要旨集、第
６３〜６４頁、電気化学協会化学センサ研究会、昭和６
２年）。また、固定するウリカーゼＴＢ−９０の量は尿
酸センサの応答速度、感度、寿命などの目的に応じて適
宜法めればよいが、酵素固定化膜１ｍｍ”あたり０．１
〜１００ｍＵが好ましい。

本発明の尿酸センサは、適当な対極あるいは参照電極と
組合せて電気化学的測定装置として用いることができる
。第１図に本発明の尿酸センサを、フローセル型尿酸測
定装置に装着した場合の流路構成を示した。図中の１は
緩衝液、２はポンプ。

３はサンプルインジェクタ、４は尿酸センサ、５はフロ
ーセル、６は電流電圧変換器、７は電位差計、８は記録
計をそれぞれ示す。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により説明する。

実施例 １ｍ１当り２０単位のウリカーゼＴＢ−９０を含むｐＨ
８，５のホウ酸緩衝液ｌＯμ！と０．５％グルタルアル
デヒド１０μｌを混合し、この混合液をニトロセルロー
ス製多孔質膜に含浸させ、該酵素の多孔質膜への架橋反
応を行った。なお、酵素単位は３７°Ｃ１０，０５Ｍホ
ウ酸緩衝液ｐＨ８，５中で１分間に１マイクロモルの尿
酸を酸化する酵素活性を１単位とした。５分間反応させ
た後、前記ホウ酸緩衝液１００ｄにニトロセルロース膜
を移し、３０分間洗浄することによりウリカーゼ固定化
膜を得た。得られたウリカーゼＴＢ−９０固定化膜をポ
ーラ口型酸素電極の酸素透過膜へ密着することにより溶
存酸素消費量測定型の尿酸センサを構築した。

次いで、得られた尿酸センサをフローセル型尿酸測定装
置に用い、ここにｐＨ８，５の０．０５Ｍホウ酸緩衝液
１２に硝酸銀８５．０■、８．５０■または０．８５■
をそれぞれ溶解した溶液を毎時３３−の流速で４０分間
通液した。続いて、０．１　Ｍホウ酸緩衝液１１に３．
７２２ｇのエチレンジアミン４酢酸ナトリウムを溶解し
てＰＨ８，５に調整した金属キレ−Ｈ９液を毎時３３ｒ
ｎＩｌの流速で４０分間通液した。第１表に硝酸銀溶液
通液４０分後のウリカーゼ活性の減少値および金属キレ
ート溶液通液後のウリカーゼ活性の回復値を、硝酸銀溶
液通液前のウリカーゼ活性値を１００として示した。

なお、対照として、ウリカーゼ固定膜を得るにあたり１
５！ｌ！当り８７８単位の活性を有するカンジダ酵母由
来のウリカーゼを用いたこと以外は上記と同様の操作を
行った。その結果を第１表に示す。

第１表 表より明らかなように、ウリカーゼＴＢ−９０はカンジ
ダ酵母由来ウリカーゼと比較して銀イオンによる酵素活
性の低下が少ない上、金属キレート剤による活性回復処
理で活性のほとんどが回復する。

〔発明の効果〕

本発明により得られる尿酸センサは重金属耐性ウリカー
ゼを用いているため、銀イオンによる酵素活性の低下が
少なく長期間安定して十分な酵素活性を維持できる。ま
た、たとえ活性が低下しても簡単な活性回復処理で酵素
活性が回復できるため、繰り返し使用も可能である。従
って、本発明は床暇分灯の分野においてｎ用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の尿酸センサをフローセル型尿酸測定
装置に装着した場合の流路構成を示す。 図中、１は緩衝液、４は尿酸センサ、５はフローセル、
６は電流電圧変換器、７は電位差計、８は記録計をそれ
ぞれ示す。 特許出願人　サッポロビール株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）電極に重金属耐性を有するウリカーゼを固定して
   なる尿酸センサ。
2. （２）重金属が銀である請求項１記載の尿酸センサ。
3. （３）ウリカーゼがバチルス・エスピーＴＢ−９０（Ｆ
   ＥＲＭ　ＢＰ−７９５）の産生するウリカーゼＴＢ−９
   ０である請求項１記載の尿酸センサ。