JPH01206994A - 組換えベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、主にｌｌｌ１ｉ瘍細胞より分泌されるポリ
ペプチドで、ｌ１ｔｉ瘍の増殖に重要な役割を果たしテ
ィるＩ＋瘍増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｓｉｎｇ　Ｇｒ
ｏｗｔｌ＋Ｆａｃｔｏｒ）　ａ　（ＴＧＦ−ａ　）の誘
導体をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターに関
する。

［従来技術及びその欠点］ ＲＮＡ腫瘍ウィルスにより腫瘍化したマウス線維芽細胞
の無血清培養上清から分離された物質が正常線維芽細胞
を可逆的に腫瘍化することが見出され、このようなＩｌ
’ｉｉ瘍化活性を有する［１か腫瘍増殖因子（Ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（Ｔ
ＧＦ））と命名された（Ｔｏｄａｒｏ、　Ｇ、　Ｊ、ら
、Ｐｒｏｃ、　’ＮａＬｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．４００１　（
１９７８））、その後、ＴＧＦは物理化学的及び生物学
的性質を異にする複数の増殖因子の総称であることかわ
かり（Ｓｐｏｒｎ。

Ｍ、　　Ｉｌ、：　　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　　Ｐｒｏ
ｃ、、　　４２．　２６２１　　（１９８：ｌ））。

現在、ＴＧＦはα、β及びγ２の存在か確認されている
（　Ｄｅｌａｒｃｏ、　Ｊ、Ｅ、　：Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、鮭、　６２６４　（＋９８１））。

種１７の腫瘍細胞からＴＧＦは産生されていることか知
られているか（Ｔａｄａｒｏ、　Ｇ、Ｊ、：Ｊ、　１ｌ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２５６．６８５９　（＋９８１）；　ｆ
ｌｏｚｅｎｇｕｒＬ、　Ｅ、：Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　　１ｌｅｓ、　　ｊユ５．　２２１　　（１
９８１）；　　ＡｎＬｏｎｉａｃｌｅｓ、　　１１．Ｎ
、：Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓ、、　４３．８３　（＋９８
３）；　ｌ＃１ｌｌｉａ＋ｓｓ、　Ｌ、Ｔ、：Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｒ
Ｉ、　７４６６（１９８４））、ＴＧＦは腫瘍細胞に特
有の増殖という現象にオートタリン的に関ｔトすると考
えられている（Ｔｏｄａｒｏ、　　Ｇ、Ｊ、：　　Ｎｅ
ｗ　　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、　　Ｍａｄ、、　　３０３．
　５２］（１９８＋１）。すなわち、産生細胞自身にも
レセプターがあり、ガン化の機構の解明に興味がもたれ
ている。

、ＴＧＦα、β、γ２はいずれも細胞腫瘍化に伴い細胞
外へ分泌されることか知られているが’ｒｏｄａｒｏ、
　Ｇ、　Ｊ、：　、１．　Ｃｅ１１．　Ｐｌ＋１ｓｉｏ
１．、１０２．　’１００１（１９８０）；　　５ｐｏ
ｒｎ、Ｍ、Ｂ、：　　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　
　互。

２４２　（１９８５））　、　正常細胞に存在すること
も知られている。特にＴＧＦ−βは血小板中に不活性型
で大騒に蓄積されている（　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、１１．
：　Ｊ、　Ｒｉｏｔ。

Ｃｈｅｍ、、　２５８．７１５５　（１９８３））。

しかし、ＴＧＦ−αは正常細胞から分泌されているとい
う報告は少なく腫瘍が特異的に産生ずると考えられ、そ
のモノクローナル抗体はガンの診断薬及び治療薬として
有効である。また、　ＴＧＦ−〇は組織培養系で骨吸収
を惹起することがわかっており、骨疾患の治療及び損傷
の治療薬ともなり得る。

５０個のアミノ酸から成るヒト成熟ＴＧＦ−αを含むヒ
ト前駆体ＴＧＦ−αの塩基配列及びアミノ酸配列は既に
Ｄｅｒｙｎｋらによって決定されているＤｅｒｙｎｃｋ
、　Ｒ，：　Ｃｅ１ｌ、　３８．２８７　（１９８４）
）　（第２図）、プリンクらは腎細胞腫から１１）られ
たｃＤＮＡ配列より、第２図中の　　　　　て囲まれた
第４０−第８９アミノ酸から成る成熟ＴＧＦ−α遺伝子
？切り出し、発現、精製及び活性の確認を行っている。

しかしながら、　ＴＧＦ−αは分子橡が５５００と小さ
いため、菌体内では分解され易く不安定である。

従って、これまで、ＴＧＦ−αを菌体内で発現するには
、大腸菌のＴｒｐＥ蛋白質との融合蛋白質として発現し
ているが、発現量は不十分であり、蛋白質か疎水性であ
るため精製が困難であるという問題かある。

［発明が解決しようとする問題点］ 従って、この発明の目的は、精製が容易なＴＧＦ−α誘
導体を遺伝子Ｔ学的手法により大九ｔに生産する技術を
提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、　ＴＧＦ−αのＣ末端側に、ＴＧＦ−
αに親水性を付午するアミノ酸配列を付加することによ
り、従来の方法に比較し、菌体内の発現量が８倍以上に
多くなり、しかもＴＧＦ−αの精製が容易になることを
見出し、この発明を完成した。

すなわち、この発明は、ＴＧＦ−αのＣ末端に。

ＴＧＦ−αに親水性を付与するアミノ酸配列か付加され
たＴＧＦ−α誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む組換
えベクターを提供する。

［発明の効果］ この発明により、精製が容易な親水性のＴＧＦ−α誘導
体の遺伝子工学的手法による大量生産を可能にする組換
えベクターが提供された。この発明の組換えベクターで
宿主を形質転換し、宿主を培養すると宿主によってＴＧ
Ｆ−α誘導体が生産される。このＴＧＦ−α誘導体は菌
体内で安定であると考えられ、従来の方法に比較し、８
倍以上発現量が多い０発現量が多いことはその精製が容
易になり純度も高いものが得られることを意味する。ま
た、このＴＧＦ−α誘導体はＴＧＦ−αに比較し、親水
性であるため、精製か容易である。このＴＧＦ−α誘導
体は、天然のＴＧＦ−α前駆体のアミノ酸配列を参考に
しており、そのため生物学的活性を維持してＪ、ｚるた
め、そのまま用いることができる。

［発明の詳細な説明］ 上述のように、この発明の組換えベクターは、ＴＧＦ−
αのＣ末端にＴＧＦ−αに親水性を付与するアミノ酸が
付加されたＴＧＦ−α誘導体をコードするＤＮＡ配列を
含む。ＴＧＦ−αに親水性を付グーするアミノ酸配列は
、配列中にＬｙｓ、　Ｇｌｙ、　Ａｒｇ、　Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕ、Ｓｃｒ、　Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＰｒｏのような比
較的親水性のアミノ酸を多数含む、すなわち、好ましく
は３０％以−し、さらに好ましくは５０％以上含むもの
である。この親水性付榮アミノ酸配列中のアミノ酸の数
は特に限定されないが、好ましくは２個ないし３個、さ
らに好ましくは７個ないし８個である。後述の実施例に
おいては、前駆体ＴＧＦ−α中のアミノ酸配列であって
成熟ＴＧＦ−αのＣ末端に結合された８個のアミノ酸を
そのまま親水性付与アミノ酸配列として用いている。す
なわち、第２図に示されるように、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−八Ｉａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを親水
性付与アミノ酸配列として用いている。

この発明の組換えベクターを構成するベクタ一部分は、
宿主細胞中で自律的に増殖することができ、発現のため
のプロモーターを有し、適名な選択マーカーを有するい
ずれのものでもよく、後述する２つの実施例では大腸菌
用のいくつかのベクターから誘導されたものを用いてい
る。

この発ＩＪＪの組換えベクターを用いて大腸菌を形質転
換して大１１ｇ菌に親水性ＴＧＦ−α誘導体を生産させ
る場合、以下の２つの方法が考えられる。

１つは宿主蛋白質との融合蛋白質としての生産であり、
もう１つは、シグナルペプチドを結合することによる菌
体外への分泌生産である。

〈融合蛋白質〉 ＴＧＦ−αのような低分子量の外来タンパク賀は菌体内
て発現後、プロテアーゼによる分解を受けやすく、また
転写の効率も低いとされている。そこで、一般に菌体の
ある蛋白質との融合蛋白質として生産し、後に特異的に
菌体蛋白質を除去し。

目的物を得るという方法が用いられる。後述の実施例で
はＴｒｐＥ蛋白質がＴＧＦ−α誘導体のＮ末端に融合さ
れている。また、このＴＧＦ−α誘導体は前述した通り
、従来のＴＧＦ−αと異なり、Ｃ末端は数個のアミノ酸
が付加したものである。こうすることにより、Ｎ末端及
びＣ末端が、プロテアーゼによる分解を受けにくくなり
、その発現！直も従来のＴＧＦ−α融合タンパク質より
８倍多く、飛躍的に生産性が向上した。

〈分泌生産〉 大１１ｇ菌にある外来蛋白質を発現させようとする場合
、上述の方法の他に精製及び経済性の観点から菌体外へ
分泌することが好ましい。

一般に、大腸菌によっ゛Ｃ遺伝子工学的に産生されるペ
プチドはそのままでは分泌されず、これを分泌させるた
めにはペプチドのＮ末端側にシグナルペプチドが付加さ
れていることが必要である。従って、この発明の好まし
い具体例においては、親水性ＴＧＦ−α誘導体のＮ末端
側にシグナルペプチドが付加されている。後述の実施例
では、大１１１菌アルカリホスフアターゼのシグナルペ
プチドｐｈｏＡが付加されている。もっとも、シグナル
ペプチドはｐｈｏＡに限定されるものではなく、他のい
ずれのシグナルペプチドをも採用することができる。シ
グナルペプチドは細胞膜を通過する際に切断される。

この発１１の組換えベクターは、ｌ：記ＴＧＦ−α誘導
体及び所望によりそのＮ末端にシグナルペプチドか付加
されたものをコードするＤＮＡを調製し、これを、制限
酵素による開裂、アニーリング及びライゲーションから
なる常法によって適当な発現ベクター中に組込み、これ
を用いてそのベクターの宿主を形質転換し、宿主を培養
し、ベクター中の選択マーカーによって該組換えベクタ
ーを含む宿主を選択し、該宿主から組換えベクターを抽
出することによって製造することができる。

ＴＧＦ−α誘導体及び所望によりそのＮ末端にシグナル
ペプチドか付加されたものをコードするＤＮＡは、　Ｔ
ＧＦ−αの塩基配列か決定されているので、ホスホアミ
ダイト法等の常法により化学合成することかできるのて
便利である。また、後述の実施例において示されるよう
に、先ず成熟ＴＧＦ−αをコードするＤＮＡ配列をクロ
ーニングし１次いでこれにＮ末端側にシグナルペプチド
を付加するためのオリゴヌクレオチドを付加したものを
クローニングすることもてきる。このように、成熟ＴＧ
Ｆ−α、シグナルペプチドと順次付加していく方法を採
用すると、後に種々の構造遺伝子、シグナルペプチドの
組合せか可能であるという利点がある。

［発明の実施例］ 以下、この発明を実施例に基づいて説明するが、この発
明は下記実施例に限定されるものてはない。

実施例１（融合蛋白質を用いた方法） 大腸菌トリプトファンオペロンのＴｒｐＥタンパク質の
Ｎ末端を含む、第３図に示す塩ノ＾配列を有するＴＧＦ
−α誘導体遺伝子を化学合成した。すなわち、第３図に
示す全２４（Ｎｉｌ基対を同図に示すように１４個のフ
ラグメントに分割し、ホスホアミタイト法（文献：　Ｃ
ａｒｕｔｂｅｒｓ、　Ｍ、Ｉｌ、：　Ｊ、　Ａｍ。

ＣＩｕｅｓ、　Ｓｏｃ、　１０３，３１８５　（１９１
１１）により合成した。

精製したフラグメントをライゲーション反応により結合
しく文献：　Ｉｔａｋｕｒａ、に、：　５ｃｉｅｎｃｅ
　１９８゜１０５６　（１９７７）　）　、　２４０塩
基対のＴｒｐＥ融合ＴＧＦ−ａ遺伝子誘導体を得た。得
られた遺伝子は第３１７Ｉに示すように末端にＣ１ａｌ
、５ａｌｌｌ、ＩＪ断部位をそれぞれ有し、図示の部分
にＥｃｏ８１部位を有する。

ベクターｐＡＴ−Ｐｔｒｐ　（文献：　１ｋｅｈａｒａ
、　Ｍ、：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　８１．５９５６　（１９８４））をＣ１
ａｌ及び５ａｌｌて消化し、上記合成遺伝子を直接、該
ベクターのトリプトファンプロモーターの下流のＣ１ａ
１．５ａ１１部位に組込み、ＴＧＦ−α誘導体遺伝子を
有する組換えベクター１）ＡＴ−ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α
■を得た（第１図Ａ）。この組換えベクターを用い、大
１［１１１Ｒ＋旧株を形質転換し、４０　ＩＬｇ／ｍｌ
のアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補株
を得た。この候補株を培養し、集菌した後、アルカリ法
（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ。

ｐ３６：ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により、プラスミドを大量
調製した。得られたプラスミドを制限酵素及び塩基配列
の決定により、目的遺伝子の挿入を確認し、このプラス
ミドを持つ菌をＴｒｐＥ−ＴＧＦ−ａ　Ｕ　／ＩＩＢＩ
ＯＩ株と命名した。

このＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α■／ＩＩＢＩＯＩ株を４０ｕ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００　ｍｌのし培地中
で一夜培養し、５文の０．５ｚカザミノ酸を含むＭ９培
地（組成：　０．７＄　　Ｎａ２１１Ｐ０４”１２１１
２０．０．３＄　　ＫＩ１２ＰＯ，，０，０５ＸＮａＣ
ｌ、０．１　％　ＮＩｌ、ＣＩ、１　ｍＭ　ＣａＣ１ｚ
、０．５％グルコース）に接種し、３７°Ｃで培養し、
５１１０　ｎｍにおける吸光度が０．５になるまて培養
したところでインドールアクリル酸を最終濃度２０＃Ｌ
ｇ／ｍｌになるように加え、さらに２０時間培養を粛続
した後、遠心分離により５．６ｇの菌体を集めた。

集めた菌体な２　Ｂｌ■ｌのリゾチーム、２１１ＭＥ　
ＤＴＡ及び１００園屓トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）を含む溶液中に懸渇し、０℃、３０分間放置した。ざ
らにβ−メルカプトエタノールを３５１Ｌ＋加え。

超音波処理を行ない、菌体を粉砕した。−晩攪拌した後
、遠心分離により、可溶性画分であるＥ清と、不溶性画
分である沈殿に分離し、それぞれＳ　ｗ　ａ　ｎ　ｋと
Ｍｕｒｅｓの方法（文献：　５Ｗａｎｋ、　Ｉｌ、Ｔ：
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　３９　（１９７１））
に従い、８Ｍ尿素存在下Ｉｓ！　ＳＯ３−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行なったところ、不溶性画分に目
的とするＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α誘導体の発現が確認され
た。さらに具体的に述べると、ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α誘
導体の発現はベクター、ｐＡＴｐｈｏＡ−ＴＧＦ−αＩ
Ｉを含まない１１８１０１株を培養したもの及びｐＡＴ
−ｐｈｏＡ−ＴＧＦ−（Ｘ　Ｈを含むか、インドールア
クリル酸を加えず蛋白質の発現を誘導しなかったものと
比較し、明らかに新しい蛋白質か目的とする分子量的７
０００の位置に出現したことにより確認された。

得られた不溶性画分を、８Ｍグアニジン及び１０ｍＭメ
ルカプトエタノールを含む溶液に溶解した後、セファデ
ックスＧ−７５（ファルマシア社製）を用いてゲルろ過
を行なった。ゲルろ過の具体的な条件は、溶出液：　２
０　＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、４Ｍ
グアニジン、１０ｍＭメルカプトエタノール、カラム：
φ２．６　ｘ　１００　ｃｍ、流速：　２．４　ｍｌ／
１５分てあった。第４図に示す９８−１１２画分を集め
、ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α誘導体タンパク質３７　ｇを得
た。これを臭化シアンによりＴｒｐＥ部分を切断し、さ
らにセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）を用
いゲルろ過を行なった。このゲルろ過の具体的条件は、
溶出液：　ｌＩｃ０ＯＨパＩＩ　３　ＣＯＯｔｌ　／　
Ｉｆ□Ｏ−２５／８８／８８８、カラム：φ２．５　ｘ
　１００　ｃｍ、　１＆速２．２　ｍｌ／１５分であつ
た。第５ｒ？ｌに示す溶離曲線か得られ■の両分を集め
ＴＧＦ−α誘導体タンパク賀４．Ｏｍｇを得た。

実施例２（シグナルベプチトを用いた方法）ｈ記Ｔｒｐ
Ｅ及びＴＧＦ−α誘導体の遺伝子を含むベクター、ｐＡ
Ｔ−ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−αＨをＥｃｏＲｌ及び５ａｌｌ
て処理してＥｃｏ旧−３ａｌｌｌｔｌｉ片を切り出した
。一方、大１賜菌アルカリホスフアターゼのシグナルベ
プチトを含むＭｅＬ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−ｌｌｅ−八Ｉ　ａ　−１，ｃ　ｏ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−
Ｖａ　ｌ　−Ｔｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ａ　１ａ−Ａ　ｒｇ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅのアミノ酸配列をコードし、かつその５
゛末端及び３°末端かそれぞれＣ１ａｌ及びＥｃｏＲ１
部位を有する、 ＣＧＡＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣＡＣＴ　Ａ
ＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＣＴＴ八　ＣＣＧ
　　ＴＴＡ　　ＣＴＧ　　ＴＴＴ　　ＡＣＣＣＣＴ　　
ＧＴＧ　　ＡＣＡ　　ＡＡＡ　　ＧＣＣＡＣＣＴＣＴ　
　ＧＡＣＧＴＡ　　ＴへＣＴＴＴ　　Ｃ７丁　ＴＣＧ　
　ＴＧＡ　　ＴＡＡ　　ＣＧＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＡＧ　
ＡＡＴ　ＧＧＣＡＡＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＧＧ　ＧＧＡ
　ＣＡＣＴＧＴ　　ＴＴＴ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　へ
Ｇへ　ＣＴＧ　　ＣＴＴ　　ＡＡて示される塩基配列を
有するｐｈｏＡオリコヌクレオチトを化学合成し、これ
を上記ＥｃｏＲ１−９ａｔ　ＩＦｆｉ片とＴ、ＤＮＡリ
ガーゼにより結合した。この結合断片を先に得られた組
換えベクター、ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＴＧＦ−ａＨのＣ１
ａｌ、　５ａｌ１部位に組込み（第１図Ｂ）、シグナル
ペプチドｐｈｏＡ、成熟ＴＧＦ−α及び親水性付与アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを用
い、大腸菌１１８１０１株を形質転換し。

４０μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一晩
培養し、候補株を得た。この候補株を培養し、集菌した
後、アルカリ法により、プラスミドを大量調製し、制限
酵素による分析を行ない、目的遺伝子の挿入を確認し、
このプラスミドを持つ菌を１）ＩＩＯＡＴＧＦ−Ｑ　Ｉ
Ｉ　／ＩＩＢＩＯＩ株と命名した。

得られたＰｈｏＡ−ＴＧＦ−（Ｘ　ＩＩ　／ｌｌＢ１０
’１株を４０ｐｇ／ｍｌアンピシリンを含むし培地中で
一晩培養し、この培養液１ｍｌを４０１のＭ９ＣＡ培地
に加え、３７℃でＯＤ＋％ｏｏ−０，９まで培養した。

この培養液を集菌し、４０％シュクロース及び２　ｍＭ
　ＥＤＴＡを含む溶液に懸渇し、２４℃、１０分間放置
した。遠心分離により、上積を除いた菌体に水（０”Ｃ
）を加え、浸透圧ショックにより外膜を破壊し、ペリプ
ラズム画分を水溶液中に得た。遠心分離により菌体を除
き、ペリプラズム画分を８Ｍ尿素存在下ｔｓｘ　ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、目的とする
ＴＧＦ−α誘導体タンパク質の分泌発現を確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の組換えベクターの製造工程の実施
例を説明するための図、 第２図は成熟ＴＧＦ−αを含むＴＧＦ−α萌駆体のアミ
ノ酸配列その遺伝子のｋＪ１基配列配列す図。 第３図は第１図に示す製造工程において化学合成された
ＴｒｐＥ融合ＴＧＦ−αのアミノ酸配列及びその遺伝子
の塩基配列を示す図。 第４図は実施例において得られたこの発明の組換えベク
ターを発現させて得られたＴｒｐＥ−ＴＧＦ−α誘導体
をゲルろ過によって精製した際に得られた溶離曲線、及
び 第５図は第４図に示すゲルろ過により精製されたＴｒｐ
Ｅ−ＴＧＦ−α誘導体のＴｒｐＥを切断除去して得られ
るＴＧＦ−α誘導体をゲルろ過により精製した際に得ら
れた溶離曲線を示す。 第５図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＴＧＦ−αのＣ末端に、ＴＧＦ−αに親水性を付
   与するアミノ酸配列が付加されたＴＧＦ−α誘導体をコ
   ードするＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
2. （２）親水性を付与するアミノ酸配列はＶａｌ−Ｖａｌ
   −Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓで
   ある特許請求の範囲第１項記載の組換えベクター。
3. （３）前記ＤＮＡ配列は、ＴＧＦ−αのＮ末端に大腸菌
   の蛋白質の全部又は一部を含むアミノ酸配列をコードす
   る領域を含む特許請求の範囲第１項又は第２項記載の組
   換えベクター。
4. （４）前記大腸菌の蛋白質の全部又は一部は、トリプト
   ファンオペレーターのＴｒｐＥ蛋白質又はアルカリフォ
   スファターゼのシグナルペプチドである特許請求の範囲
   第３項記載の組換えベクター。
5. （５）前記ＴｒｐＥのアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−
   Ａｌａ−ｌｌｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
   ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒ
   ｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅであり、前記シグナルペプチドのア
   ミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
   −ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
   Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖ
   ａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｈ
   ｅである特許請求の範囲第４項記載の組換えベクター。
6. （６）前記ＤＮＡ配列は 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列又は 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列を含む特許請求の範囲第５項記載
   の組換えベクター。