JPH01211429A - 組織培養方法及びこれに用いる組織培養器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組織培養菌を、簡易な方法で効率的に大量生産
できる作業性のよい組織培養器具に関する。

〔従来の技術〕

植物体の器官や組織、細胞を植物体から分離して、適切
な培養条件下で無菌的に培養し、植物体として完全な機
能をもつ固体を再生させる、いわゆる組織培養にあって
は、無菌条件が維持されることを要する。同時に植物は
炭酸同化作用を営むため、充分な炭酸ガスの供給が必要
であり、これら気体の通過に伴い微生物を混入させない
ための種々の方法が提案されている。

培養容器としては、培養面積に比して空気進入路の小さ
い三角フラスコが多用され、その他試験管、広口ビン等
も使用されている。これらの容器口は従来、綿繊維を固
めた綿栓、アルミ箔を被せ、容器口からはみ出した部分
を手でひねってしわを作りながら閉じるいわゆるアルミ
キャップが使用されていた。これは容器口周辺部に曲が
りくねった隘路からなる外気と容器内部との通路を形成
し、この隘路を空気が通過するとき細菌が隘路にとどま
って細菌による汚染を防止するものである。

又、ネジ蓋や嵌合蓋も使用されているが、この場合はパ
ツキンを使用せず、必然的に残る蓋と容器間の間隙を外
気が下から上に流通するとき細菌が下から上には移動し
がたいことを利用して無菌に保っている。

組織培養であっても、植物体であるから光合成を行い炭
酸ガスを大量に消費する。従来の方法では炭酸ガスの供
給が不足し、明期になると炭酸ガス濃度が１００ｐｐｎ
＋以下に低下し、このような低濃度では充分な光合成が
行われず、蔗糖、ブドウ糖等の１！類を添加しなければ
ならなかった。しかも、この苗は非常に虚弱で順化の際
の生存率が非常に低いものであった。

本発明者は特公昭５Ｂ−１１７１７号公報において、多
孔性シートを貼着した通気性キャップシートを開示した
。更に、特願昭６１−２４３０５８号及び特願昭６１−
２４３０５９号において微多孔性フィルムを有する密封
蓋を有する広口びんを用いてクリーンルームを使用せず
に培養を行っても微生物が侵入せず、しかも充分な炭酸
ガスが供給されて丈夫な苗を速やかに成長させる技術を
提案した。

植物の組織培養苗は多分に手工業的であり、生産コスト
の大半を人件費が占めるため、機械化、手間の省略、成
長の早さが求められていた。

微多孔性フィルム、好ましくは単層の微多孔性フィルム
を使用することにより微生物による汚染を防止して充分
な炭酸ガスを供給し苗の成長を早める方法は上記技術に
より一応達成された。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、空気の流通を盛んにして炭酸ガスの供給
を充分にすると、必然的に水蒸気の流通もよくなり、培
地中の水蒸気が蒸発して培地が乾燥しがちである。培地
の乾燥は植物の成長に悪影響を与える。組織培養苗は通
常２〜３月間密封して育成するものであるから、その間
植物の成長に悪影響を与えない程度に培地の乾燥を防止
する簡易な手段が必要であった。

そこで、生産性の向上、ひいてはＭｉ織培養苗を利用で
きる植物の種類を拡大するために、育成に充分な通気性
を付与ししかも培地の乾燥及び微生物混入のおそれがな
く、クリーンルームの使用を排除できる組織培養器具が
求められていた。

〔課題解決の手段〕

本発明は上記問題を解決することを目的とし、その構成
は、カルス又は小植物を成長させる培地を装入する入口
の広い容器と、水を供給できる水源とを同一の密封室内
に収納し、該密封室に微多孔性フィルムによる通気孔を
設けて微生物による汚染を排除して充分な炭酸ガスを供
給すると共に、微多孔性フィルムから揮散する水蒸気を
密封室内の水源から補給し、培地の極度の乾燥を防ぐこ
とを特徴とする。

本発明に使用する容器は光合成に必要な光を効率的に通
過させ、繰返し使用に耐えるため、加熱滅菌に耐える耐
熱ガラス、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリス
チレン、高密度ポリエチレン、ナイロンなどの透明容器
が好ましい。特に幹及び葉が発育する培地より上の部分
が透明であることが好ましい。

更に培地と水とが分離されていることを要する。

分離する手段としては水槽となる下箱の上に培地となる
上箱を設ける２段構造とし、第２図に示すように下箱上
端に切欠きを設けたり、第１図に示すように下箱の水面
より上に貫通孔を穿設したり、第３図に示すように上箱
の底面から培地上に突出するパイプ状の貫通孔を設ける
方法等がある。更に、直接下箱の水分を上箱の培地に糸
や紐のような毛細管の集合体により吸引する方法、或い
は上箱の底面に、培地や水分が落下せず下箱の水蒸気が
直接培地に吸収されるような多孔質の支持板を設けるこ
ともできる。また、培地と水槽を横に並べても差し支え
ない。要するに培地表面の他に、これと分離された水面
を有していればよい。

培地に植物組織を植込むには可及的に口の広い容器が手
作業であっても、また機械化する場合にも好ましい。更
に培地上の容器の側面が培地が溢れない程度に浅いこと
が好ましい。しかし浅い容器であれば植込み後、植物が
袋に接触して真直ぐに成長しがたい欠点がある。そこで
、培地を入れた上箱を浅くする場合には植物が袋と接触
しないように袋を持ち上げる機能を有する各種の突出体
を用いることが好ましい。突出体としては、上箱と嵌合
できる枠を用いたり、仕切り板や棒や管を用いることが
できる。例えば、上箱の底の中央部から仕切り板を突出
させたり、上箱の両端部の底から衝立状の仕切り板を突
出させたり、１本の棒を上箱の中央部に突出させるか、
上箱の四隅から４本の棒を突出させる方法などがある。

水の量は培養期間中培地から蒸発する水分を補給するに
足る量と蒸発水面を有すればよい。

培地容器と水槽とは同時に袋内に気密に収納密封する。

この袋は一部が後述する微多孔性フィルムからなること
を要する。更に袋は透明であることが好ましく全体に透
明でなくとも、上述の容器を収納した場合に、培地から
上の小植物が成長する部分が透明であればよい。

このように、容器を袋内に収納すると容器の汚れが少な
く、容器の耐久性が向上し繰返し使用に耐える。

プラスチック袋を密封する方法は、培養期間を通じて完
全に気密に保持されるものであればいかなる方法でもよ
いが、熱融着する方法が確実かつ簡易である。この他第
４図に示すようにクリップを用いて密封することもでき
る。クリップを用いた場合には袋の再使用が可能である
。

本発明に使用する微多孔性フィルムは、０．０２μ以上
、好ましくは０．０１μ以上の微生物が通過できない大
きさの孔を有し、長径と短径の差が小さい場合には孔の
短径が０．１μ以下、好ましくは０．０５μ以下である
。また、すのこ状の細長の孔の場合には最大の短径が０
．１　μ以下、好ましくは０．０５μ以下、より好まし
くは０．０２μ以下であれば長径が大きくとも微生物の
通過を防止できる。空孔率は５０％以下、好ましくは４
０％以下である。要するに、酸素及び炭酸ガスの流通が
抵抗なく行える範囲で可及的に小さい孔を有するフィル
ムであればよい。

気体の流通抵抗を減少して炭酸ガスの供給をより円滑に
行うためには単層のフィルムが好ましい。

一般に微多孔性フィルムは大きい孔を有する層が何層に
も重なり、隘路を形成しているものが多い。

このような多層構造の微多孔性フィルムにあっては、必
然的に通気抵抗が大きくなり、炭酸ガスの円滑な供給に
支障を生じがちである。しかも、自己移動性のない微生
物は隘路を通過することができずに遮断されるが、微細
なダニなど自己移動性を有する微生物の侵入を完全に防
止することはできない。

微多孔性フィルム素材はポリプロピレン、ポリエチレン
、ナイロン、フッソ樹脂等の撥水性フィルムが好ましい
。微生物は主として水分と共に移動するため、同一の大
きさの孔であっても微多孔性フィルム素材がｔａ水性で
あると微生物が通過しがたい。また、培地の乾燥は培地
に含まれる水分の蒸発によるものであるが、撥水性微多
孔性フィルムの場合は疎水性の二酸化炭素や酸素はよく
通過させるが水蒸気は通過させがたく、しだ力（゛って
、充分な通気性がありながら多少の培地乾燥防止効果を
有する。

プラスチック袋の一部に微多孔性フィルムを用いるには
、例えば袋の一部、好ましくは容器を収納した場合の上
部を１箇所以上切断して貫通孔を設け、この貫通孔に不
織布などで補強した微多孔性フィルムを熱融着すればよ
い。或いは第５図に示すように袋に間歇的に孔を穿設し
、この孔を覆って補強された微多孔性フィルムを熱融着
或いは接着してもよい。

培地容器と水槽とを袋内に密封収納しない場合には、第
３図に示すように培地容器と水槽とを蓋を用いて気密に
密封し、この蓋に上記微多孔性フィルムを装着する。更
に培地容器上部空間と水槽の上部空間とが連通している
ことを要する。培地容器と水槽とが上下２段に積重ねら
れている場合には下箱の水槽の上部空間と培地とが連通
していればよい。

この場合には、容器が上箱と下箱に分離していると上箱
と下箱、上箱と蓋とを確実に密封する必要があり、例え
ば各々フランジを設け、このフランジをパツキンを介し
て確実に閉じる方法などが採用される。

微多孔性フィルムは蓋又は上箱の上部側面に設ける。微
多孔性フィルムを設けるためには穿孔を設け、ｑの穿孔
に直接微多孔性フィルムを融着又は接着しても差支えな
いが、第３図に示すように、蓋に開口部を穿設し、この
開口部に気密に脱着自在な剛性板からなる平板状のリン
グを設け、この平板状のリングの中央部の広（開口した
部分に補強した微多孔性フィルムを貼着或いは融着する
。

このようにすれば、平板状のリングはパツキンを介して
気密に脱着可能であり、平板状のリングを交換するのみ
で容器自体は繰返し使用できる。

〔作用〕

本発明は、組織培養容器自体を一部に微多孔性フィルム
を設けたプラスチック袋で密封し、或いは容器自体の一
部を微多孔性フィルムとしたため、袋内或いは容器内自
体が小型のクリーンルームを形成し、空気の流通が自由
でありながら微生物を侵入させない。そのため、通常の
明るい部屋に置くだけて培地にｔｉｎを添加する必要も
なく、丈夫な苗が短期間に育ち、順化の必要なくそのま
ま立植えすることができる。

炭酸ガスの充分な供給はこれに伴う培地の乾燥をもたら
すが、培地の乾燥は密封室内に水源を設けたため、この
水源から蒸発する水分で上述の小型のクリーンルーム内
の湿度が高まり、培地の乾燥を防止することができる。

また、上箱が扁平で入口が広く、側面を短くすることに
より苗の植込みや採取作業が容易になり、機械化も可能
になった。

〔実施例〕

第１図は本発明の断面図である。１は水２を入れた下箱
で、水面より上に複数箇の水蒸気排出孔３を設けた。こ
の下箱１の上に深さ約１．５ｃｍの上相４を重ねた。上
箱４には寒天培地を培地１０が溢れない程度に約１ｃｍ
厚さに流して固めた。この浅い上箱中の培地に植物カル
スを植込み、透明なポリプロピレン類の枠５を重ねた。

このようにして３Ｎに重ねた容器を厚さ５５μの透明な
ポリプロピレン類の袋６に挿入し、入口を熱融着した。

９は袋の熱融着部である。袋６は２箇所に開口部７を設
け、この開口部７に微多孔性フィルム８を熱融着した。

本実施例においては微多孔性フィルムとして米国セラニ
ーズ社のジュラガード（商標名）を用いた。１１は生育
している小植物である。

本発明においては上箱４を浅くし、突出体として透明な
枠５を用いたため、作業が容易になり作業効率が向上し
た。突出体としてはこの他１枚又は２枚以上の仕切り板
を設けても、棒や管を突出させてもよい。本実施例にお
いては下箱を黒色とし、光を吸収して水温を上昇させ水
蒸気の蒸発を促進させる効果を図った。

第２図は他の実施例の斜視図である。本実施例において
は上箱を深くして突出体を省略した。また、水蒸気排出
孔として下箱１の上端に複数箇の切欠き１２を刻設した
。この切欠き１２から蒸発した水蒸気が排出し、容器が
袋で密封されているため、袋内の湿度が高まり、炭酸ガ
スの供給が充分であったにもかかわらず必要な育成期間
中培地が乾燥しなかった。

第３図は袋を使用しない場合の実施例の断面図である。

下箱１内の水蒸気の通路として上箱４の底下端から培地
１０上面に突出する管状の通気孔１３を設けた。この通
気孔１３は水蒸気を容器外へ出ることなく直接上箱内に
導入できるため、既述の実施例に使用できることは勿論
、本実施例のような袋を用いず、下箱１と上箱４とをフ
ランジを設け、パツキン１５を介してクリップ１６で気
密に押さえる形式の培養容器にも使用できる。

１７は蓋であり、同様に上箱とフランジとパツキン及び
クリップにより密封されている。７゛　は蓋に設けた開
口部であり、この開口部７°の周囲には薄い溝１８を刻
設した。１９は溝１８に気密に嵌合する剛性あるリング
であり、中央部に微多孔性フィルム８を貼着した。この
リング１９は蓋の開口部７゛に気密に脱着自在であり、
再度容器を使用する場合に交換することが可能であった
。

第４図には袋の他の融着方法を示した。袋を培養期間中
気密に維持できる方法であれば、融着に限らず各種の方
法が採用できる。２０は止め具であり、メス体２１とオ
ス体２２とからなる。オス体２２がメス体２１に袋６の
端部を介して嵌合するとき袋素材のパツキン効果により
袋内を気密に保つことができる。２３は不織布で補強し
た微多孔性フィルムである。第４図に示した袋は第５図
に示すように袋を構成するフィルムに間歇的に穿孔２４
を設け、この上から帯状の微多孔性フィルムを重ね、両
端部を熱融着した。２５は融着部である。

第６図には他の実施例の断面図である。不透明な下箱１
と浅い上箱４とを一体に形成し、内側面から内方に向か
って係合部２６を延出した。上箱の上端に枠５を載置し
た。両者の嵌合を確実にするため、上箱の上端を外部が
尖った斜めに切断し、枠５の下端を内部が尖った斜めに
切断した。

係合部２６の上に剛性を有するプラスチック製の網から
なる上箱の内径と同寸の支持板２７を載せ、この支持板
２７上に支持板よりわずかに大きい多孔質フィルム２８
を敷設した。この上に培地１０を強いた。多孔質フィル
ムは水蒸気を通過するが、水分や培地を通過させない。

本実施例の容器はこのまま第１図及び第２図の実施例に
おいて説明した袋に密封収納すると、同等の効果が得ら
れた。

〔効果〕

本発明により、空気の流通を自由にして大量の炭酸ガス
を供給しながら、培地の乾燥を防ぎ、作業性を改善し、
組織培養苗の大量供給が可能になった。本発明器具を使
用して得られた組織培養苗は丈夫で順化の必要がなく、
そのまま直値えすることができ、組織培養苗を利用でき
る植物の種類が拡大した。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の実施例を示し、第１図、第３図及び第６
図は断面図、第２図は斜視図、第４図は袋の融着手段を
示す斜視図、第５図は微多孔性フィルムの装着状態を示
す斜視図である。 図面中、符号 １は下箱、２は水、３は水蒸気排出孔、４は上箱、５は
枠、６は袋、７は開口部、 ８．２３は微多孔性フィルム、９は熱融着部、１０は培
地、１１は小植物、１２は切欠き、１３は通気孔、１４
はフランジ、１５はパツキン、１６はクリップ、１７は
蓋、１８は溝、１９はリング、２０は止め具、２４は孔
、２５は融着部、２６は係合部、２７は支持板、２８は
多孔質フィルムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）培地を入れた容器を用いて植物組織を育成するに
   あたり、培地を入れた容器を袋に収納密封し、該袋の一
   部を空気及び水蒸気を通過させ、微生物を通過させない
   微多孔性フィルムとするか、又は容器自体を一部を残し
   て密封し、該一部を空気及び水蒸気を通過させ、微生物
   を通過させない微多孔性フィルムとすることにより炭酸
   ガスを充分に供給する培養方法であって、上記微多孔性
   フィルムにより密封された容器又は袋内に、培地から揮
   散する水蒸気を補給する水を培地とは独立に収納するこ
   とを特徴とする植物の組織培養方法。 （２）培地と水が相互に分離された容器と、水面と培地
   表面との空気の流通が自由な状態でこれら容器を収納密
   封することができるプラスチック製袋とからなり、該袋
   の一部が空気及び水蒸気を通過させ、微生物を通過させ
   ない微多孔性フィルムである組織培養器具。（３）下箱
   と該下箱の上に重ねられ、培地を入れてカルス又は小植
   物を培養する上箱とからなり、上記下箱に上箱を重ねた
   状態で外気と流通できる水蒸気排出孔を設けた容器と、
   該容器を収納密封できるプラスチック袋とからなり、該
   袋の一部が空気及び水蒸気を通過させ、微生物を通過さ
   せない微多孔性フィルムである組織培養器具。 （４）下箱と該下箱の上に載置する上箱とからなり、該
   上箱が底のない枠状であり、該上箱の下端から空間を保
   って配列された剛性体からなる支持板を載置できる係合
   部を内部に向かって延出し、上記支持板上に、水蒸気を
   通過させ、水を通過させない多孔質フィルムを介してカ
   ルス又は小植物を培養する培地を入れた容器と、該容器
   を収納密封することができるプラスチック製袋とからな
   り、該袋の一部が空気及び水蒸気を通過させ、微生物を
   通過させない微多孔性フィルムである組織培養器具。 （５）下箱と該下箱の上に載置する上箱とからなり、該
   上箱が底に空間を保って配列された剛性を有する支持板
   を形成し、該支持板上に、水蒸気を通過させ、水を通過
   させない多孔質フィルムを介してカルス又は小植物を培
   養する培地を入れた容器と、該容器を収納密封すること
   ができるプラスチック製袋とからなり、該袋の一部が空
   気及び水蒸気を通過させ、微生物を通過させない微多孔
   性フィルムである組織培養器具。 （６）箱の内側側面に、剛性体からなる支持板を載置で
   きる係合部を延出し、上記支持板上に水蒸気を通過させ
   、水を通過させない多孔質フィルムを敷設し、該多孔質
   フィルム上にカルス又は小植物を培養する培地を入れた
   容器と、該容器を収納密封することができるプラスチッ
   ク製袋とからなり、該袋の一部が水蒸気を通過させ、微
   生物を通過させない微多孔性フィルムである組織培養器
   具。 （７）水を入れる下箱と、該下箱の上に重ねてカルス又
   は小植物を培養する上箱と、上箱の上に設けた突出体と
   からなる容器と、該容器を収納密封するプラスチック袋
   とからなり、下箱が上箱を重ねた状態で外気と流通でき
   る水蒸気排出孔を有し、上記上箱が培地が溢れない深さ
   の培地容器であり、上記突出体が上箱上の培地に成長す
   る小植物体がプラスチック袋と接触して成長を妨げられ
   ないように設けられていると共に、上記プラスチック袋
   が一部が、水蒸気を通過させ、微生物を通過させない微
   多孔性フィルムである組織培養器具。 （８）突出体が上箱の外枠上に載せる枠体である特許請
   求の範囲第７項記載の組織培養容器。 （９）突出体が１本以上の棒又は管である特許請求の範
   囲第７項記載の組織培養容器。 （１０）突出体が培地容器底に載置する１枚以上の仕切
   り板である特許請求の範囲第７項記載の組織培養容器。 （１１）水蒸気排出孔が下箱の上端に穿設した１箇以上
   の切欠きである特許請求の範囲第７項ないし第１０項の
   いずれかに記載する組織培養容器。 （１２）容器の少なくとも培地より上が透明である特許
   請求の範囲第７項ないし第１１項のいずれかに記載する
   組織培養容器。 （１３）プラスチック袋が、容器を収納密封した状態で
   少なくとも培地表面から上の部分が透明である特許請求
   の範囲第７項ないし第１２項のいずれかに記載する組織
   培養器具。（１４）微多孔性フィルムが微生物を通過さ
   せない微細な孔径を有する単層のフィルムである特許請
   求の範囲第７項ないし第１３項のいずれかに記載する組
   織培養器具。 （１５）下箱と該下箱の上に培地を入れてカルス又は小
   植物を培養する上箱を重ねた容器であって、上箱と下箱
   とを気密に密着するか、上箱と下箱を一体に形成すると
   共に下箱と上箱との間に水蒸気が自由に通過できる装置
   を設け、上箱の底にカルス又は小植物を培養する培地を
   入れた容器を設けると共に、上箱に透明な蓋を気密に密
   着し、該蓋の一部に空気を通過させ、微生物を通過させ
   ない微多孔性フィルムを装着したことを特徴とする組織
   培養器具。