JPH01212360A

JPH01212360A - 電解質試験用均一水溶液及びその製造方法

Info

Publication number: JPH01212360A
Application number: JP63310253A
Authority: JP
Inventors: Steven C Charlton; スチーブン・シー・チャールトン; B Denton James; ジェームス・ビー・デントン; Makowski Eugenia; ユーゲニア・マコウスキー
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-12-09
Publication date: 1989-08-25
Also published as: DK689088D0; DK689088A; AU604177B2; IL88278A; IL88278A0; EP0319863A2; ZA888420B; EP0319863A3; NO885315D0; AU2647688A; NO885315L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１旦本発明は、概して、水性試料中のイオンの濃度の測定法
に関し、特に、血清中のカリウムのような、体液試料中
の電解質の測定法に関する。

血清カリウムの測定は、広く用いられている重要な診断
試験である。全臨床範囲は僅かに約２〜１０ｍＭ、通常
は約３．５〜５．５ｍＭでしかないので、測定には高い
選択性及び正確性が必要とされる。これらの考慮点は、
全範囲が１２０〜１７０ｍＭ、通常は１３５〜１５５ｍ
Ｍである血清ナトリウム測定においてもあてはまる。リ
チウムの中毒投与量は精神病の処置において用いられて
いる治療量よりも僅かに高いだけであるので、血清中の
リチウム値の測定もまた重要である。カルシウム、ナト
リウム及びマグネシウムのような他の陽イオンもまた医
学的に重要であると考えられる。本発明は、体液電解質
中においてみられるアルカリ金属陽イオンの測定に特に
重要であるが、他のイオン、特に他の陽イオンを測定す
ることもできる。

！更二亘旦現在のところ、ナトリウム、カリウム及びリチウムのよ
うな電解質の測定のための診断試験は、次光光度測定及
びイオン選択性電極によって定型的に測定されている。

最近になって、他の２種類の方法が利用しうるようにな
った。乾燥相試薬片を、５ＥＲＡＬＹＺＥＲ■反射光度
計上での血清カリウムの比色測定に適用しうる。ここで
、この試薬片及び装置のいずれも、Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ
、、　Ｅｌｋｈａｒｔ。

ＩｎｄｉａｎａのＭｉｌｅｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
　Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって市販されている。乾燥相試
薬片法は、米国特許第４，５４０，５２０号、同第４，
５５２゜６９７号、同第４．６４９．１２３号、同第４
゜６４５．７４４号及び同第４．６７０．２１８号にお
いて記載されている。

Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、色原性
対イオンを液状有機相と水相との間に分配することによ
って血清カリウムを測定する特殊な装置及び試薬片のセ
ットが市販されている。有機相はカリウムイオンに特異
なイオノホアを含んでおり、有機相中に分配する色原性
対イオンの量はカリウムイオン濃度の関数である。該装
置によって相分離を起こすのに必要な試薬パックの遠心
分離が行なわれ、吸光度によって、有機相中の色原性対
イオンの濃度が測定される（ヨーロッパ特許出願筒８５
１０５１０６．０号、８５１０５１０８．６号及び米国
特許第４．６３９．４２４号を参照）。

次発光分光光度法を除いて、イオノホアを用いてアルカ
リ金属陽イオンを測定する方法のほとんどにおいては、
イオンの、イオノホアによる有機液相中への移動（相転
位測定）か又はイオノホアを含むイオン選択膜を通る移
動［電極又はオブトード（ｏｐｔｏｄｅｌ法］が必要で
ある。乾燥試薬片測定法においては、通常はポリマー成
分によって与えられる疎水性雰囲気中においてイオノホ
アを単離し、２種の分子種即ちイオノホア及びレポータ
ー（ｒｅｐｏｒｔｅｒｌを含む疎水性マトリックス中に
イオンを移動させることによって検出可能な比色応答を
生起せしめる。

疎水性又は有機相中におけるイオノホアの単離を必要と
しない例外は、Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎらの業績である［Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、
　６８（９）：　２０３７−２０４１、　　（Ｓｅｐ、
　１９７１）］、　Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎらによって、２
種の蛍光染料即ち１−アニリノ−８−ナフタレンスルホ
ネート（ＡＮＳ）及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフ
クレンスルホネート（ＴＮＳ）の陰イオン形態との、水
中における。陽イオンイオノホアコンプレックスの形成
の研究が開示されている。この研究の内容としては、パ
リノマイシンのようなイオノホア性抗生物質及びマクロ
テトラリド（ｍａｃｒｏｔｅｔｒａｌｉｄｅ）作用が挙
げられる。試験される水溶液を得るために著者らによっ
て用いられている方法は明確には記載されていない、第
２０３７頁第２欄９〜１０行目のｒＭｅｔｈｏｄｓ　ａ
ｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓＪにおいて、水溶液を２．０−
以下に調製し、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、　ＨＣｌ２によっ
てｐＨ７，４に緩衝したと記載されている。その後の第
２０３８頁においては、抗生物質原料溶液はアセトン又
はエタノールを用いて調製し、蛍光試験における有機溶
媒の濃度は２．５％を超えないと記載されている。著者
らは、蛍光復極の観察される増加は陽イオン−イオノホ
アコンプレックスの結合部位が飽和するようになること
が原因である可能性があると考察しているが、また、こ
の復極は、ミセル内の蛍光分子間のエネルギー移動によ
る可能性もあり、また、陽イオン−イオノホアコンプレ
ックスの凝集との色素相互作用に起因する可能性も有す
ると考察している。

Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎの目的は、陽イオン−イオノホアコ
ンプレックスを水性雰囲気中で検出しうることを示すこ
とであった。これは、かかるコンプレックスの安定性が
、コンプレックスを含む有機溶液に水を加えることによ
って著しく減少するという通常の常識に反するものであ
った（第２０３７頁、第２欄、９〜１３行目）。

Ｖｏｇｔｌｅらの米国特許筒４．３６７．０７２号にお
いては、ヒドラジニウム塩酸塩をメタノール／水中に溶
解し、１モルのクラウンエーテルと混合すると、イオン
試験試料の添加によって色が変化することが開示されて
いる６色素を、その包接コンプレックスからカリウム又
はナトリウムのような陽イオンによって除去すると、吸
収の変化（明色化）が観察される。

イオノホアの表面活性特性が、Ｐｉｎｇ−Ｌｉｎ　Ｋａ
ｕらのＴｅｎ５ｉｄｅ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、　１９
（４）：　２０４−２０６　（１９８２）において、及
び、Ｊ、１６　ＭｏｉｇｎｅらのＪ、　Ｐｈｙｓ、　Ｃ
ｈｅｍ。

８４：　１７０−１７７（１９８０）において研究され
ている。

上記記載の試験のいずれにおいても、血清カリウムのよ
うな臨床的に重要な電解質のための診断試験として用い
ることのできる均一な水溶液は得られていない。

及豆五亘ヱ本発明は、体液試料のような水溶液中の、カリウム、ナ
トリウム、カルシウム及びリチウムのような周期律表Ｉ
ａ及びＩＩａ族のイオンを測定しうる均一な試験溶液を
提供する。試験溶液は、対象とするイオンとコンプレッ
クスを形成しうるイオノホア：解離によって検出可能な
応答を与える解離性プロトンを有する中性レポーター（
ｒｅｐｏｒｔｅｒ）　：及び、イオノホア−イオンコン
プレックスの生成に応答してレポーターの脱プロトン化
が起こるｐＨ範囲のｐＨを与えうるバッファーを含む。

好ましい溶液配合物としては、水溶性ポリマー又は水に
可溶化させることのできるポリマーのような安定剤ある
いは洗浄剤が挙げられる。

本発明は、ま−た、試験水溶液を調製するための種々の
方法を提供する。一つの実施態様においては、プロトン
が解離して溶液を生成し、該溶液のｐＨを調節して所望
のｐＨ範囲の試験溶液を得ることができるｐＨを有する
水溶液中に、イオノホア及び中性レポーターを溶解する
ことができる。

他の実施態様においては、イオノホア及びレポーターを
水混和性有機溶媒中に溶解することができ、ｐＨを上昇
させ、ｐＨを再調節して最終的な所望の作用ｐＨを得る
工程を行なう、好ましい実施態様においては、−の調製
工程の間に、組成物に安定剤を加える。安定剤を組成物
に加える場合には、イオノホア、レポーター及び安定剤
を、作用ｐＨにおけるバッファー溶液中に直接溶解する
ことができる。最終的な所望の作用ｐＨに調節する際に
安定剤を加えることが特に好ましい、試験溶液を、イオ
ノホア及びレポーターを含む、水に可溶化させることの
できるポリマーフィルムから調製することも、又は、凍
結乾燥成分を再構成することによって調製することもで
きる。

日の　ましし）　　、菖本発明以前には、均一な水溶液中のイオノホアを用いる
、感度の高い正確なイオン試験を提供することができる
とは考えられていなかった。

Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎらの趣旨は、水溶液中のイオノホア
コンプレックスの生成を開示することであるが、開示さ
れている溶液は、穏やかな遠心分離を用いて溶液から容
易に分離する、結晶状の、高濃度のイオノホア性抗生物
質を含んでいる１分析対象物の濃度が極めて高いことは
明らかであるが、Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎらの開示において
、対象とする第１のイオンであるカリウムに関する重要
な臨床範囲における蛍光変化が非常に少ないことが示さ
れるので、この技術は研究において利用しうる手段では
ないと当業者は考えるであろう、実際、Ｆｅ１ｎｓｔｅ
ｉｎらは、合成「クラウン」エーテルによっては蛍光変
化は観察されなかったと記載している。

したがって、はとんどの研究は、イオンを、イオン選択
膜を通って有機液相中に、又は、疎水性固体雰囲気中に
移動させるイオノホアの能力を用いるという意図で継続
されてきた。固体相イ才ン試験片を用いる研究において
、非孔性フィルムの反応性を向上させることが研究者ら
によって試みられた。

本発明に到達する鍵となった発見は、乾燥相試薬片にお
いて用いられる解離性プロトンを有する好ましいレポー
ターを脱プロトン化して水性媒体中に溶解するのを容易
にし、次にこれを水溶液中でプロトン付加（ｐｒｏｔｏ
ｎａｔｅ）　してイオン試験に所望の反応性種を与える
ことができることを見出したことである。

好結果のイオン−イオノホア試験のための有機又は疎水
性相についての必要事項に関する従来の推測が誤りであ
ったことを示す発見の後、イオンのための均一な試験水
溶液を提供する広範囲の成分及び方法が見出された。こ
れらの試験溶液は、体液試料を加えた試験水溶液の吸光
度の測定に基く広範囲のスケールの診断分析手段をはじ
めとする通常の分析手段に適合しうる。

人、藍並威透１、イオノホアイオノホアは当該技術において周知であるが、−船釣に
、極微又は低い水溶性を有すると考えられていた。この
用語に含まれるものは、電子過剰で陽イオンをコンプレ
ックス化しうる中性の化合物である。考えられるイオノ
ホアとしては、ポダンド（ｐｏｄａｎｄｓ）　、クリプ
タンド（ｃｒｙｐｔａｎｄｓ）及びコロナンド（ｃｏｒ
ｏｎａｎｄｓｌ並びにパリノマイシンのようなイオノホ
ア性抗生物質といった種類のものが挙げられる。クラウ
ンエーテルと称されるコロナンド類が特に好適である。

特に好ましいイオノホアは、後述の、実施例の直前に記
載されているものである。

しかしながら、本発明は、概して、通常イオノホアとし
て公知である化合物類の全ての群に適用することができ
る。イオノホア／イオン対の多数の例が文献中に見られ
る。特にＳｉｍｏｎ　ａｎｄＰｒｅｓｓｍａｎの文献を
参照のこと、イオノホアは、イオンをコンプレックス化
し、それらを脂質膜を通して、又は有機相中に移動させ
ることができる。

後者の特性を用いて、群を「キレート」として知られる
、より広範囲の群から識別することができる。キレート
は、技術的により広い分類であるが、通常、荷電された
、イオンをコンプレックス化しうる水溶性分子であると
考えられている。

２、レポーターレポーターは、イオノホア−イオンコンプレックスの生
成によって検出可能な応答を与える、イオノホアと異な
る分子種である。好適な測定装置と共に蛍光応答を用い
ることができるが、比色応答が好ましい。本発明におい
て有用なレポーターは解離性プロトンを有する中性化合
物である。以下に説明する好適なｐＨ条件を用いると、
イオノホア−イオンコンプレックスの生成によってプロ
トンが解離して検出可能な応答が生成する。

レポーターは、酸性プロトンを有するということができ
る。好ましいレポーターは、芳香族ヒドロキシル、解離
して検出可能な応答を生成しうるプロトンを含む。２種
類のインドフェノールレポーターが、ここで参照として
記載する米国特許第４，５４０．５２０号及び同第４゜
５５２．６９７号に記載されている。しかしながら、テ
トラブロモフェノールフタレインデシルエステル（ＴＢ
ＤＥ）のようなトリフェニルメタン類及びメチルエオシ
ンのようなフルオレセイン類をはじめとする他の種のレ
ポーターもまた好適である。

親水性プロトン及び疎水性プロトンを有するレポーター
が好ましい、ここで７−デシルＭＥＤＰＩＮと称するイ
ンドフェノール類、７−（ｎ−デシル）−２−メチル−
４−（３°、５−ジクロロフェン−４−オン）インドフ
ェノールが特に好ましい、向上する安定性と、これらの
化合物を用いて所望の試験水溶液を製造する容易さとを
試験溶液の可能なミセル構造にリンクさせることができ
る。

３、緩衝物質レポーターによって、イオノホア−イオンコンプレック
スの生成に基く、プロトンの損失による検出可能な応答
が得られる。緩衝物質は、この機構を生起させ、純粋な
ｐＨ又は雰囲気効果がらのプロトン損失を抑止するｐＨ
を有するものでなければならない０通常は、所望の作用
ｐＨ範囲は約５〜約１０であるが、その選択は、試験成
分、試験試料、更に試験の所望の感度に依存するもので
ある。高いｐＨにおいては、プロトン損失がより容易に
発生し、反応性が明らかに向上する。低いｐＨにおいて
は、その逆が起こる０作用ｐＨ範囲によって、対象とす
るイオンと接触する前に、中性で実質的にプロトン付加
されているレポーター種が与えられる。好ましい比色レ
ポーターにおいては、試験溶液の色が急激に変化するこ
とが多いので、レポーターの状態が極めて明確となるこ
とが多い、好適なｐＨ範囲は、実施例の記載において与
えられている定型的な実験によって決定される。

４、安定剤安定剤は、レポーター及びイオノホアを水溶液中に保持
するか、又は、これらの成分を可溶化するのを実質的に
補助するものと考えられる。有用な安定剤は界面活性特
性を有するものであると考えられ、その例としては、水
溶性又は水に可溶化させることができるポリマー及び、
通常、洗浄剤と称されている化合物が挙げられる。水に
可溶化させることのできるポリマーとは、水に不溶性で
あるが、いくつかの簡単な反応によって水溶性になるも
のである。広範囲にわたる成分が好適であることが分か
っている。有用なポリマーとしては、ポリ（ビニルアル
コール）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシ
ド／ボリプロビレンオキシドボリマーのようなＰｌｕｒ
ｏｎｉｃ■ブロックポリマー、並びに、ＧＡＮＴＲＥＺ
■として公知であり、ＧＡＦ　Ｃａｒｐ、から供給され
ている、エチレン／無水マレイン酸、ブチレン／無水マ
レイン酸及びメチルビニルエーテル／無水マレイン酸の
ようなコポリマー無水物が挙げられるが、これらに限定
されるものではない、プルロニック類（Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃｓｌ及び無水物が好ましい、他の有用な化合物として
は、ホスファチジルコリン、並びに、非イオン界面活性
剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ■Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎｓ
。

Ｂｒ１ｊ　３５及びポリオキシエチレン−９−ラウリル
エーテル（ポリドカノール）のような洗浄剤が挙げられ
る。必須のものではないが、安定剤を用いることが好ま
しい。

ｌ。１」魁Ｋｌ液実施例及び試験溶液の製造方法の記載から明らかなよう
に、試験水溶液は、上記成分を含む純粋な水であっても
、又は、少量の水混和性有機溶媒を含んでいてもよい。

水混和性有機溶媒は、エタノール、メタノール、テトラ
ヒドロフラン、アセトンなどであってよい、濃度は通常
４％未満である・、高濃度の有機溶媒は、それが速やか
に蒸発するために、試験溶液の濃度が放置によって相当
に変化する可能性があるので好ましくない、更に、臨床
分析手段と共に有機溶媒を用いると、管材料の劣化を起
こし、使用者に対する問題を生起させることになる可能
性がある。

Ｃ１−の゛庁− イオノホア、レポーター及びバッファーの濃度が所望の
検出可能な応答を与えるのに十分なものであるならば、
試験成分の濃度は本発明には重要ではない、定量結果を
得るためには、イオノホアの濃度及びレポーターの濃度
のいずれも測定するイオンの濃度範囲と同一のものでは
ない。

成分の最適濃度の決定は、本開示が与えられることによ
って当業者の能力の範囲内となる。しかしながら、以下
の指針を与える。有機溶媒の濃度は、最小、通常は４％
未満に保持される。ポリマー安定剤の濃度は広範囲に変
化させることができるが、洗浄剤安定剤の濃度は通常０
．５％未満である。このレベルを超える洗浄剤安定剤濃
度は、おそらくは混合ミセルの生成による異常な結果を
発生させることが明らかである。

Ｄ、・　当゛の“ゝイオンに対して反応性を示すイオノホアを有する試験水
溶液を得ることができるという発見の後、かかる溶液を
調製することのできる多くの方法が見出された。しかし
ながら、Ｆｅ１ｎｓｔｅｉｎらによって用いられたもの
のようなほとんどの直接進行法によっては均一な試験溶
液は得られない０反応性試薬、イオノホア及びレポータ
ーを、好適な作用ｐＨを有するバッファー中に直接溶解
することによっても、また、反応性試薬を水混和性有機
溶媒中に溶解した後、所望の作用ｐＨを有するバッファ
ーを用いてｐＨを調節し、また、これによって有機溶媒
を希釈することによって４容量％未滴の有機溶媒を含む
試験溶液を生成させることによっても、臨床的に重要な
レベルのイオン濃度を測定しうる、反応性を有する均一
な試験溶液を得ることはできない、しかしながら、いく
つかの利用可能な方法を以下に概説する。「反応性試薬
」という用語は、ここでは、イオノホア及び中性レポー
タ一種を意味するように用いられる。

１、　　″　　の溶　を八　とする　法イオノホア及び
レポーターを水混和性有機溶媒中に溶解することが均一
な水溶液を調製する第１段階である種々の好適な方法が
ある０反応性試薬を水混和性有機溶媒中に溶解すること
ができる。次に、かくして得られた有機溶液を、撹拌し
ながら、レポーターの解離を起こすのに十分に高いｐＨ
を有する塩基性水溶液に加える。この解離種は、解離形
態の色が中性形態の色とは通常大きく異なるので、比色
レポーターと区別される０次に、レポーターが中性形態
にあり、レポーターの解離が単純に試料のｐＨによらず
、イオノホア−イオンコンプレックスの生成と共に生じ
る範囲のｐＨを有するバッファー溶液に、解離レポータ
ーを含む溶液のアリコートを加えることによって高ｐＨ
溶液のｐＨを調節する。レポーターの解離がイオノホア
−イオンコンプレックスの生成に応答して発生するｐＨ
範囲を、ここで「作用ｐＨ範囲」と称する。

第２の好ましい方法は安定剤を加える方法である。安定
剤は、塩基性水溶液中において、反応性試薬と共に有機
溶媒中に加えることも、又は、最後のｐＨ調節工程にお
いて用いる溶液と共に加えることもできる。これらの方
法の中では、最後のｐＨ調節段階においてバッファー溶
液中に溶解している安定剤を用いることが好ましい。

安定剤を用いる場合には、有機溶液又はそのアリコート
を、所望の最終ｐＨを有するバッファー溶液に、撹拌し
ながら速やかに加えることによって試験水溶液を生成さ
せることもできる。かかる方法においては、安定剤を有
機溶液中で用いることが好ましい、所望の濃度で反応性
試薬を溶解する任意の溶媒から、水混和性有機溶媒を選
択することができる。単に溶解性の理由からはテトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）が好ましいが、ＴＨＦ、アセトン
、メタノール及びエタノールが有利に用いられる。

反応性試薬はそれほど水溶性ではないので、撹拌の程度
が重要である場合がある。場合によっては、ここで記載
されているいかなる方法を用いても、特に調製した試験
溶液を用いた試験溶液中に粒子状の物質が残留すること
がある。これは無視できる程度に少量であることが多い
、しかしながら、イオノホア及びレポーターであること
が分かっており完全には溶解していない全ての粒子状物
質を、穏やかな遠心分離（０，ｌＸｌ０’ｇ−分）によ
って除去することができ、残留する均一な試験溶液は所
望の濃度レベルのイオンに対して反応性を示す、より長
い遠心分離（ｌＸ１０’ｇ−分）を行なった後でも反応
性試薬のバルクは溶液中に残留する。同様の実験をＦｅ
１ｎｓｔｅｉｎらの方法によって調製された水溶液を用
いて行なうと、極めて温和な遠心分離（０，０１ｘｌＯ
’ｇ−分）の後に非反応性溶液が得られ、イオノホアが
粒子状形態で存在していることが示唆される。

２、　　汐　をパ・　としない　ゝ他の方法は、反応性試薬を水混和性有機溶媒中に溶解す
ることを必要としないものである０反応性試薬を、レポ
ーターのプロトンが解離しうるｐ）ｌを有する高ｐＨ溶
液中に直接溶解し、次に、バッファー水溶液を用いて、
この高ｐＨ溶液のｐＨを所望の作用ｐＨ範囲に調節する
ことができる。もちろん、生成する各溶液は、減少した
量の反応性試薬を含んでいる。したがって、最初に用い
る濃度は、バッファーを用いて最終的な作用ｐＨに希釈
することによって所望の濃度に到達するのに十分に高い
もゐでなければならない。

生成する試験溶液の改良された安定性は、安定剤、好ま
しくはポリマー安定剤を、試験溶液の製造におけるいく
つかの時点において試薬に加えた場合に得られる。最初
の溶解工程と共に添加することが好ましい、ここでは確
実ではないが、安定剤は、ミセル形成に関与することに
よって反応性試薬の可溶化を促進するか、又は、生成し
た反応性試薬のミセルを安定化させると考えられる。

また、反応性試薬を含むポリマーフィルムを直接溶解し
て、所望の作用ｐＨを有する均一試験溶液を生成させる
こともできる。ポリマーフィルムは、上記のように調製
される、ポリマー安定剤を含む任意の試験溶液を、凍結
乾燥するか又はかかるフィルムを生成する他の任意の方
法によって乾燥させることによって製造することができ
る。また、用いる疎水性ビヒクルが水溶性又は水に可溶
化させることができる限りにおいては、フィルムを米国
特許第４，６４５，７４４号において開示されているよ
うに製造することもできる。エチレン／無水マレイン酸
コポリマーのような無水物ポリマー成分を用いて後者の
方法によって製造されるフィルムが好ましい、イオノホ
ア、中性レポーター及び安定剤として作用することが明
らかな無水物ポリマーから製造されたフィルムを、フィ
ルムを加水分解することによって溶解させる０通常は、
フィルムを、所望の最終的なｐＨを有するバッファー溶
液と接触させて加熱し、フィルムを加水分解及び／又は
溶解させる。溶液を生成させるには、かかるフィルムを
バッファーと共に約５０℃に１０分間加熱することで十
分である。

これらの方法のそれぞれによって、イオノホアがそれに
対して特異なイオンの濃度を測定しうる均一な試験水溶
液が得られる。用いる方法によって、最初に存在してい
る反応性試薬の濃度が固有に減少する。したがって、反
応性試薬の最初の濃度を算出する場合には、この希釈効
果を斜酌しなければならない、臨床対象の陽イオンを試
験するのに有用な濃度を有する試験溶液の製造の指針は
、実施例において見られる。

旦エコ１１法均−試験水溶液は、多くのイオンの測定に有用である。

これらは、臨床的に重要な陽イオン、特に周期律表Ｉａ
及びＩＩ　ａ族の陽イオンの測定に特に好ましい、試験
溶液を、最終的な試験溶液又は希釈すべき溶液として提
供することができ、また、試験成分をフィルムとして又
は溶解すべき乾燥状態で提供することもできる。

これらの試験溶液は、通常用いられる液体臨床分析手段
を用いる体液のイオン測定に特に有用性を有する。血清
試料のような大量の蛋白質を含む試料と共に試験水溶液
を用いるためには、蛋白質が沈殿する可能性があるので
、有機溶媒の濃度を低く保持することが好ましい、更に
、血清試料に関しては、安定剤を反応性試薬と共に用い
ることが好ましい、大量の血清蛋白が存在すると、試験
溶液を「不安定にし」、安定剤が存在していない場合に
は反応性試薬が沈殿することが明らかである。

証肌及ｆｌ滅以下の実施例においては、以下の略号を用いる。

大括弧［］によって、イオン濃度をミリモル／Ｉ２で表
わすことがある９％濃度は、ほかに示されていない限り
、全てａあたりの容量（ｖ／ｖ％）で与えられる。用い
られるレポーターは全て、最初は、及び調製される最終
的な試験溶液においては中性形態である。

ｇ−分　　　　　１分間加える力（ｇ）ＯＤ　　　　　
　光学濃度（吸光度）濃度：ｗ／ｖ％　　　ａあたりの重量の％ｖ／ｖ％　　　ａあたりの容量の％化学成分に関する略号を以下に示す、イオノホアの選択
は、本発明においては便宜性のみについて決定される０
名称は、通常、イオノホアを用いて測定する主要なイオ
ンに基＜、シかしながら、イオノホアは、通常、種々の
程度で他のイオンに感応する（好ましいイオノホアの構
造は米国特許第４．６７０．２１８号においてみられる
）。

イオノホアナトリウムイオノホア　ビス［１２−クラウン−４−メ
チル］メチルドデシルマロネートカリウムイオノホア　　２．３−ナフト−１，４，７，
１０゜１３−ペンタオキサシクロペンタデカ−２−エンリチウムイオノホアＩＮ、Ｎ’−ジヘプチルーＮ、　Ｎ
’−５，５−テトラメチル−３，７−シオキサノナンジアミドリチウムイオノホアＩＩＮ、Ｎ’−ジヘプチル−５，５
−ジメチル−Ｎ、　Ｎ’−ジー（３−才キサペンチルｌ
−３，７−シオキサノナンジアミドＣＤＡ　（リチウム
用）　シス−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、Ｎ’−テトライソブチ
ル−１，２−シクロヘキサンジ力ルポキサミドカルシウムイオノホア　ジエチル−Ｎ、Ｎ’−［（４Ｒ
，５Ｒ）−４，５−ジメチル−１，８−ジオキソ−３，６−シオキサオクタメチレン］ビス（１２−メチルアミノドデカノエート）安定剤ＨＭＡ　　　　　　　　　　エチレン／無水マレイン酸
コポリマー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ。

１８、８０５−０）Ｇａｎｔｒｅｚ■　　　　　　メチルビニルエーテル／
無水マレイン酸コポリマー（ＧＡＦ　Ｃａｒｐ、）ＢＭＡ　　　　　　　　　ブチレン／無水マレイン酸Ｐ
ＶＡ　　　　　　　　ポリ（ビニルアルコール）　（Ａ
ｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｃａｔａｌｏ
ｇ　Ｎｏ、　１８．４６３−２）ｐｖｐ　　　　　　　
　　　ポリビニルピロリドン（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ
ｍｉ−ｃａｌ　Ｇｏ、　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、８５，
６５６−８）Ｔｒｉｔｏｎ＠Ｘ−１００ポリエチレング
リコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｓｉｇ
ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎ
ｏ、　Ｔ−６８７８１Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠Ｆ６８　　　
　　エチレンオキシド／ポリプロピレングリコール縮合
生成物（ＢＡＳＦ　ＷｙａｎｄｏｔｔｅＣｏｒｐ、　）Ｂｒｉｊ＠３５　　　　　　　　［ポリオキシエチレン
（２３）ラウリルエーテル］　（ＩＣＩ　Ｕｎｉｔｅｄ
　５ｔａｔｅｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｗｉｌｍｉｎｇ−ｔｏｎ、　ＤＥＩポリド
カノール　　　ポリオキシエチレン−９−ラウリルエー
テル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈａｎｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｃａｔ
ａｌｏｇＮｏ、　Ｐ９６４１１に菱≦ヒ土質７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　　　７−　（ｎ−デシル）
−２−メチル−４−（３°、５°、−ジクロロフェン−
４°−オン）インドナフトールＴＢＤＥ　　　　　　　　テトラブロモフェノールフタ
レインデシルエステルメチルエオシン　　　　メチル（テトラブロモフルオレ
セイン）　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、　ＣａｔａｌｏｇＮｏ、　１９．９５５−９）緩衝物質Ｂ１５−Ｔｒｉｓ　　　　　　　　ビス［２−ヒドロキ
シエチル］−イミノートリス（ヒドロキシメチル）メタンＢ１５−Ｔｒｉｓプロパン　　　１．３−ビス［トリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミノコ−プロパンＴｒｉｓ　　　　　　　　　　トリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタンＰＩＰＥＳ　　　　　　　　　　ピペラジン−Ｎ、Ｎ’
−ビス［２−！タンスルホン酸］ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　（Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ゛、２−エタンスルホン酸）ビシン　　　　　、Ｎ、Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチ
ルコグリシン ■３水和物　　　　　　　（４−モルホリンエタンスル
ホン酸）土Ω他ＴＩ（Ｆ　　　　　　　　　テトラヒドロフランＫｏｄ
ａｒ　Ａ−１５０（ポリシクロヘキシレンジメチレンテ
レフタレート、酸変性）塞ＪＬ圀均−試験溶液を調製する一般的な方法は以下の通りであ
る。

（ａ）　　イオノホア及び中性レポーターを水混和性有
機溶媒中に溶解して有機試薬溶液を調製する。

（ｂｌ　　有機試薬溶液を、渦流塩基溶液に滴加して、
レポーターが脱プロトン形態となる高ｐＨ試薬溶液を調
製する。

（ｃ１高ｐＨ試薬溶液を作用ｐＨのバッファー溶液に加
えて、レポーターが実質的に非イオン化形態となる均一
試験水溶液を調製する。

他に示さない限り、用いる有機溶媒はＴＨＦであり、レ
ポーターは７−ゾシルーＭＥ叶ＩＮであった。他に示さ
ない限り、量応答は６４０ｎｍにおけるものであり、示
されたイオン濃度はキュベツト内のものである。

ナトリウムのための均一試験溶液を一般的な方法におい
て記載したようにして調製した６本明細書において「ナ
トリウムイオノホア」と称するイオノホアであるビス［
１２−クラウン−４−メチルコメチルドデシルマロネー
トを用いた。有機試薬組成物は、ナトリウムイオノホア
１７ｍＭ及び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　３３　、６　
ｍＭであった。この溶液は赤色であった。塩基溶液は、
水酸化リチウム（Ｌｉ　ＯＨ）２５ｍＭであり、得られ
た高ｐＨ試薬溶液は青色であり、元の値の１／１０の試
薬濃度を有していた０作用ｐＨバッファー溶液は。

ＬｉＯＨでｐＨ６，５に調節されている２５０ｍＭの旺
ＰＥＳを含んでいた。均一試験溶液は、明澄な橙色であ
り、ＴＨＦ３．３％（Ｖ／Ｖ）　、ナトリウムイオノホ
ア０．５６７ｍＭ、レポーター１．１２ｍＭ及びバッフ
ァー１６７ｍＭを含んでいた。

得られた試験溶液をナトリウム水溶液で試験した。結果
を下表及び図１に示す。

０　　　　　　　　　　　　０、７６０１．９９０．８
４７３．９７　　　　　　　　　　　０．９６３５．９３　
　　　　　　　　　　１．０８３得られた均一な試験水
溶液は、生理学的レベルのナトリウムに対して良好な応
答を示した。

Ａ２：力１ウムー　゛カリウムのための均一な試験溶液を、−船釣な方法にお
いて記載されたようにして、作用バッファー溶液と共に
安定剤を用いて調製した。

（ａｌ　　本明細書においてカリウムイオノホアと称す
るイオノホアである、２．３−ナフト−１，４，７，１
０，１３−ペンタオキサシクロペンタデカ−２−エンを
用いた。有機試薬組成物は、カリウムイオノホア４３ｍ
Ｍ及び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　３３．６ｍＭであっ
た。有機試薬溶液は赤色であった。塩畢溶液は５０ｍＭ
−ＮａＯＨであり、得られた高ｐＨ試薬溶液は青色であ
り、元の値の１／ｌＯの試薬濃度を有していた。作用ｐ
Ｈバッファー溶液は、安定剤：エチレン／無水マレイン
酸コポリマー１％（Ｗ／Ｖ）を含むＩＭ−ＨＥＰＥＳ　
、　ｐＨ６，５であった。得られた明澄な橙色の均一試
験水溶液は、ＴＨＦ３．３％（Ｖ／Ｖ）、カリウムイオ
ノホア１．４３ｍＭ、レポーター１．１２ｍＭ、安定剤
０．６７％ＦＷ／Ｖｌ　、バッファー６７０ｍＭを含ん
でいた。この試験溶液による量応答曲線を、カリウムを
加えた標準ヒト血清試料な繭いて作成した。試験溶液０
．８１１ｄｌを試料０．２−に加えた。得られた結果を
下表及び図２のａ線で示す。

（ｂ）　　実施例Ａ２ａで得られた試験溶液のアリコー
トを凍結乾燥した。数日後、水を用いて撹拌しながら元
の容量に再構成した。残留する少量の固体物質を遠心分
離（０，３Ｘ１０・ｇ−分）によって除去し、上澄み液
を、カリウムを加えた標準ヒト血清を用いて上記記載の
ようにして試験した。結果を以下に示す、存在してもご
く僅かであった反応性が、凍結乾燥及び再構成によって
消失したことが明らかである。得られた結果を下表及び
図２のｂ線で示す。

［Ｋ　”］　　（ｍＭ）　　　　０Ｄ（ａｌ　　　　０
Ｄ（ｂ）１．０８　　　　　　０．８３ｇ　　　　　０
．８１６１．１０　　　　　　０．８４２　　　　０゜
８２４１．１４　　　　　　０．８４８　　　　０．８
２９１、１８　　　　　　０．８７１　　　　０．８５
６１、２２　　　　　　０．８８４　　　　０．８５８
１、２６　　　　　　　［１，８９８０，８８７施例Ａ
３：カリウム試　２５゛有機溶媒中に反応性試薬を溶解しないでカリウム試験溶
液を調製した。７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ（７，４７ｍ
Ｍ）を塩基溶液（Ｎ　ａ　ＯＨ１５０ｍＭ）中に溶解し
た１次に、カリウムイオノホア（１５ｍＭ）を塩基溶液
中に溶解して、高ｐＨ溶液を生成させた（音波処理を用
いて反応を加速させた）０作用ｐＨバッファー溶液は、
安定剤、エチレン／無水マレイン酸コポリマー１％（Ｗ
／Ｖｌ　を含む旺ＰＥＳ　　（ＬＭ、ｐＨ６，５）であ
った。カリウムイオノホア５ｍＭ、レポーター２．４９
ｍＭ、バッファ　−６６７ｍ　Ｍ及び安定剤０．６７％
（Ｗ／Ｖ）を含む幾分濁った褐色の溶液が得られた。０
．４５μのフィルターを用いて液を透明にして明澄な橙
色の液体を得、これを、カリウム水溶液試料を用いて試
験した。結果を下表及び図３に示す。

［Ｋ”］　　（ｍＭ）　　　、　　　　　　　　　　Ｏ
Ｄｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
２５１０．２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１．３４４０・５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１．４３７０．７５　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１．５６６１．０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１．７７６有機溶媒を含まない均一な試
験水溶液は、臨床的に重要な濃度範囲のカリウムイオン
に対して良好な応答を示した。

施　Ａ４：ナトリウム試　ンナトリウムのための均一な試験溶液を、有機試薬溶液中
に安定剤を加えて調製した。

（ａ）　　有機試薬溶液は、ナトリウムイオノホア３７
．７ｍＭ、７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　３３．６ｍＭ及
び安定剤：エチレン／マレイン酸コポリマーｌＯ％（Ｗ
／Ｖｌ　を含んでいた。この溶液は赤色であり、これを
、渦流の作用ｐＨバッファー溶液に直接滴加した。バッ
ファー溶液は、ＬｉＯＨでｐＨ６，５に調節したＩ　Ｍ
　−ＨＥＰＥＳから成る。得られた均一な試験溶液は、
明澄な橙色であり、ＴＨＦ３．３％（Ｖ／Ｖ）　、イオ
ノホア１．２６ｍＭ、レポーター１．１２ｍＭ、バッフ
ｙ−９７０ｍＭ及び安定剤０．３３％（Ｗ／Ｖｌ　を含
んでいた。ナトリウムイオンアリコートを含む水溶液を
加えた後に試験溶液の量応答を測定し、結果を図４に示
した。

１０　　　　　　　　　　　　　０．４５５７１２、５
　　　　　　　　　　　　０．５０８６１５　　　　　
　　　　　　　　０、５３００１７、５　　　　　　　
　　　　　０．５５３９２０　　　　　　　　　　　　
　０．６４４３（ｂｌ　　有機溶媒としてアセトンを用
いた外は実施例Ａ４ａに記載のようにして試験溶液を調
製した。ヒト血清のアリコートにナトリウムを加えて、
１３０〜２００ｍＭの範囲のナトリウムイオン濃度を有
する試料を調製した。試験溶液（０，８１ｄｌ）を加血
清試料（０，２ＭＩ）と混合して、図５に示す量応答を
得た。

［Ｎａ”］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　０Ｄ２６　
　　　　　　　　　　　　０、６９４２８　　　　　　
　　　　　　　０、７２４３０　　　　　　　　　　　
　　０、７４２３２　　　　　　　　　　　　　０、７
７６３４　　　　　　　　　　　　　０．７９６３６　
　　　　　　　　　　　　０．８２９３８　　　　　　
　　　　　　　０、８５１４０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．９０４これらの実験から
、安定剤を有機試薬溶液中に加えることができ、ＴＨＦ
と同様にアセトンを有機溶媒として用いることができる
ことが示された。安定化された均一な試験水溶液は、生
理学的液体である血清中のナトリウムイオンの濃度に応
答性を示した。

カリウム試験溶液をフィルムから調製した。

フィルムは、ＴＨＦ中に、カリウムイオノホア１４３．
１ｍＭ、７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　３３　、６ｍＭ及
びエチレン／無水マレイン酸コポリマー１０％（Ｗ／Ｖ
ｌ　を含む、実施例Ａと同様の有機試薬溶液から製造し
た。この溶液を、Ｋｏｄａｒ　Ａ−１５０上にｌ０ＸＩ
Ｏ−”インチ（約２５０μ）の厚に展開した。ＴＨＦを
蒸発させると、非孔質で橙色のポリマーフィルムが得ら
れた。

該材料の２．５ｃｍ（１インチ）平方の試験片をＨＥＰ
ＥＳバッファー（ＬＭ、ｐＨ７，５，５−）中に浸漬し
、撹拌しながら５０℃で１０分間浸透させた。得られた
、濁った橙色の溶液（０，７５Ｍ！りを、カリウムを加
えた標準血清試料（０，７５ｍ＆’）で試験すると、３
分間混合した後に応答が示され、これを吸光度によって
測定した。得られた結果を下表及び図６に示す。

［Ｋ″″］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　Ｏ
Ｄｌ、０２　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
４９４・８２　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
６２６７．０２　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．６８０１０．０２　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．７１７１３、０２　　　　　　　　　　　　　　
　　０．７４５綾鎗（ｉ）　　イオノホア、中性レポーター及びバッファー
のみを含む均一な試験溶液（実施例Ａｌ）を調製するこ
とができ、これは、生理学的レベルのナトリウムに対し
て良好な応答を有する。

（ｉｉ）　　安定化された均一な試験溶液が調製され、
これは、生理学的液体中のナトリウム（実施例Ａ４）及
びカリウム（実施例Ａ２）に対して応答性を有していた
。

（ｉｉｉ）安定剤が所望の場合には、任意の溶液中に含
ませることができる（実施例Ａ２ａ、Ａ４）。

（ｉｖ）　　均一な溶液は、乾燥材料（実施例Ａ２ｂｌ
又は安定化フィルム（実施例Ａ５）のいずれからも再構
成することができる。

（Ｖ）　　有機溶媒は重要ではないが（実施例Ａ３）、
用いる場合は、Ｔ）（Ｆ　（実施例Ａｔ）又は他の水混
和性溶媒、例えばアセトン（実施例Ａ４ｂ）であってよ
い。

−Ｍ的な方法において記載したようにして、作用バッフ
ァー溶液中に安定剤を加えて、ナトリウム試験溶液を調
製した。有機試薬溶液は、ナトリウムイオノホア３７．
７ｍＭ及び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　３３．６ｍＭを
含んでいた。溶液は赤色であった。塩基溶液はＬｉＯＨ
１５０ｍＭであり、高ｐＨ溶液は青色であり、元の値の
１／１０の試薬濃度を有していた０作用ｐＨ溶液は、ポ
リ（ビニルアルコール）１％（Ｗ／Ｖｌ　（８８％加水
分解、平均分子量１０．０００）を含む、旺ＰＥ５２０
０ｍＭ、　ｐＨ６，５であった。明澄な赤色の均一試験
溶液が調製され、これは、ＴＨＦ３．３％（ｖ／ｖｌ　
、ナトリウムイオノホア１．２６ｍＭ、７−ゾシルーＭ
ＥＤＰＩＮＩ　、　　１２　ｍＭ、安定剤０．６７％（
ｗ／ｖ）及びバッファー１３３ｍＭを含んでいた。

塩化ナトリウム（ｌｏｏｍＭ）を加えると溶液は青色に
変化した。

Ｂ２：　　　としてのボ曹ビニルピロリド安定剤として
ポリビニルピロリドン（平均分子量１０．０００）を用
いた外は実施例Ｂ１に記載のようにナトリウム試験溶液
を調製した．同様な結果が得られた。

Ｂ３：　　　ｉとしてのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００実施
例Ａ４ａのように、有機試薬中に安定剤を用いてカリウ
ム試験溶液を調製した．有機試薬溶液の組成は、カリウ
ムイオノホア７　１　ｍＭ。

７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　１　６．　９ｍＭ及びＴｒ
ｉｒｏｎＸ−１００　２．　７％（Ｖ／Ｖ）であった、
　Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓｌ　Ｏ　ＯｍＭ．ｐＨ６．５である
作用ｐＨバッファー溶液にこの溶液を直接加えた。極め
て明澄な橙色の溶液が得られ、これは、ＴＨＦ　　４％
（Ｖ／Ｖｌ　、イオノホア２．８６ｍＭ、レポーター０
．６７６ｍＭ、バッファー９６ｍＭ及び安定剤０．１０
８％（Ｖ／Ｖ）を含んでいた。

［Ｋ”ｌ　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　ＯＤｏ　　
　　　　　　　　　　　　０、５７７０、１０　　　　
　　　　　　　　０．５９００．３０　　　　　　　　
　　　　　Ｇ、６１００．９９　　　　　　　　　　　
　０．６７１３゜９４　　　　　　　　　　　　０．９
０６６．８７　　　　　　　　　　　　１．０８９図７
において示されるように、試験溶液はカリウムに対する
良好な直線応答を示した。

−船釣な方法において記載されたようにして、作用バッ
ファー溶液中に安定剤を加えてカリウム試験溶液を調製
した。有機試薬溶液は、カワラムイオノホア４２ｍＭ及
び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ３３．８ｍＭを含んでいた
。塩基溶液はＮａＯＨ５０ｍＭであり、得られた高ｐＨ
溶液は青色であり、元の値の１／３の試薬濃度を有して
いた。

作用ｐＨバッファー溶液は、ポリオキシエチレン−９−
ラウリルエーテル０．１％（Ｗ／Ｖｌを含むＰＩＰＥＳ
　１００ｍＭ、　ｐＨ６，５であった。ＴＨＦ２．８％
（Ｖ／Ｖ）　、イオノホア１．１７ｍＭ、レポーター０
．９３６ｍＭ、バッファー８９ｍＭ及び安定剤０．０８
９％（Ｗ／Ｖｌを含む明澄な紫色の均一な試験溶液が得
られた。カリウムイオンに対する量応答を６００ｎｍに
右いて測定した。

［Ｋ”ｌ　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　ＯＤ
ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
８５６０、１９　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．９１８０．３８　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．９８２０．５７　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１．０３６０、７６　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１．１０２０、９５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１．１６１１．１４１．２１２１．３３　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２
６６１．５２　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．３１６図８に得られた量応答を示す。

Ｂ５：　゛　　イオンボ３ウレタン　　　゛一般的な方
法に記載のようにして、バッファー溶液中に安定剤を加
えてナトリウム試験溶液を調製した。有機試薬組成物は
、ナトリウムイオノホア２２６ｍＭ及び７−ゾシルーＭ
ＥＤＰＩＮ　２００　ｍ　Ｍであった。塩基溶液は５０
ｍＭ−ＬｉＯＨであり、高ｐ）Ｉ試薬溶液における試薬
濃度は元の値の１／１１であった。Ｌｉ０Ｈ１’ｐＨ６
，５に調節したＨＥＰＥＳ　５００　ｍＭを用い、可溶
性ポリウレタン安定剤１％を加えて作用ｐＨバッファー
溶液を調製した。得られた溶液の組成は、ＴＨＦｏ、７
％（Ｖ／Ｖ）　、ナトリウムイオノホア１．６ｍＭ、レ
ポーター１．４ｍＭ、バッファー４６２ｍＭ、安定剤０
．９２％（ｗ／ｖ）であった、この溶液を遠心分離した
（０．ｌＸ１０”ｇ−分）、小さなベレットが得られた
。上澄み液は檀赤色であり、これを試験に用いた。ナト
リウム水溶液試料及び加血清試料を用いて調製物を評価
した。

［Ｎａ”ｌ　　（ｍＭ）　　　　　　　　　ＯＤｏ　　
　　　　　　　　　　　０、３１６５　　　　　　　　
　　　　０、４４０９．９　　　　　　　　　　　　Ｇ
、　５６８１１．９　　　　　　　　　　　０．６１５
１３、８　　　　　　　　　　　０．６Ｂ３１５、８　
　　　　　　　　　　０．７０５１？、　７　　　　　
　　　　　　０．７４３１９、６　　　　　　　　　　
　０．７８７２３．９　　　　　　　　　　　０．９１
９　”＊血清を加えた図９に得られた量応答を示す。

ケＢ６：　　　とじてのＰｌｕｒｏｎｉｃ　ＲＦ１ａ−
ＩｉｌＱ的な方法において記載されたようにして、安定
剤を加えてナトリウム試験溶液を調製した。

（ａ）　　有機試薬溶液は、ナトリウムイオノホア４５
ｍＭ及び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　４５　ｍＭを含ん
でいた。塩基溶液はＬｉＯＨ２５ｍＭであった。高ｐＨ
試薬溶液の試薬濃度は、元の値の１／１０であった。　
ＨＥＰＥＳ　、　５００ｍＭ、　ｐＨ７，５を用いて、
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ■Ｆ６８１％を含む作用バッファー溶
液を調製した。ＴＨＦ　　３．３％（Ｖ／Ｖｌ　、ナト
リウムイオノホア１．５ｍＭ、レポーター１．５ｍＭ、
バッファー３３３ｍＭ、安定剤０．６７％（ｗ／ｖ）を
含む明澄な褐色の溶液が得られた。

ｆｂｌ　　アリコートを遠心分離した（ｌ　ｘ　１０ｓ
ｇ−分）。遠心分離後及び遠心分離していない調製物の
量応答を、血清試料を用いて、試料０．０５−を試薬０
．９５−に加えて測定した。

６．２１　　　　　　　１．２６３　　　１．２４４８
．０８　　　　　　１．３３４　　　１．３４８９．９
７　　　　　　１．４３８　　　１．４７６図１０から
、遠心分離後及び遠心分離していない試験溶液の両方に
ついて良好な直線関係が示された。

濃縮し一α−ホスファチジルクロリン（ｌｄ、Ｓｉｇｍ
ａ　、クロロホルム中１００ｍｇ／１１ｄｌ）を減圧下
で乾燥してクロロホルムを除去した。　ＰＩＰＥＳバッ
ファー（４１ｄｌ、Ｏ，ＬＭ、ｐＨ６，５）を乾燥脂質
フィルムに加え、乳白色の懸濁液が生成するまで混合物
を撹拌した。懸濁液が明澄になるまで、１０％コール酸
ナトリウムで滴定した。この明澄な脂質／洗浄剤ミセル
溶液の全量は約５ＭＩ！であった。溶液をＯ，ＬＭ−Ｐ
ＩＰＥＳに対してｐＨ６，５で１５時間透析し、コール
酸ナトリウムを除去した。透析中にバッファーを２回交
換した。透析溝から明澄、なホスファチジルコリンリポ
ソーム溶液（淡黄色）が除去された。

（ｂｌ　　−船釣な方法において記載されているように
して、ｐＨ溶液中に安定剤を加えてカリウム試験溶液を
調製した。有機試薬溶液は、カリウムイオノホア１４２
ｍＭ及び７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ３３．８ｍＭを含ん
でいた。塩基溶液はＮａＯＨであった（５０ｍＭ）、高
ｐＨ試薬溶液においては、試薬濃度は元の値の１／３で
あった０作用ｐＨバッファー溶液は、上記で調製された
リポソーム溶液であった。試験溶液は、ＴＨＦ６．６％
、イオノホア９．４７ｍＭ、レポーター２．２５ｍＭ、
バッファー８０ｍＭ、ホスファチジルクロリン２％（Ｗ
／Ｖｌ　を含んでいた。これをカリウム水溶液で試験し
た。結果を下表及び図１１に示した。

［Ｋ”］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　ＯＤ
ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
１８１０．１９１．２１８０．３８　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２
５７０．５７　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．２９３０．７６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．３３７１．１４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．４００１．３３　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１．４３６１．５２１．４７５稙１（ｉ）　　安定剤は、広範囲にわたる界面活性化合物、
即ち、ポリマー（エチレン／無水マレイン酸コポリマー
、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルピロリドン、
Ｔｒｉｒｏｎ　Ｘ−１００、ポリオキシエチレン−９−
ラウリルエーテル、水溶性陽イオンポリウレタン、Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ■Ｆ６８）：陰電荷物（エチレン／無水マ
レイン酸、水溶性陽イオンポリウレタン）：両性イオン
（ホスファチジルコリン）又は中性ポリ（ビニルアルコ
ール）、ポリビニルピロリドン、Ｔｒｉｒｏｎ　Ｘ−１
００、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル又は
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ■Ｆ６８のいずれであってもよい。

（ｉｉ）　　調製物は遠心分離に対して完全な耐性を有
する。実施例Ｂ６　（１ｘｌＯ’ｇ−分）によって、試
薬が均一溶液として定量的に存在することが示される。

本明細書においてカルシウムリガンド■と称するポダン
ド（完全な化学式に関しては略号の欄を参照）を用いて
、カルシウムのための均一な試験水溶液を調製した。試
験溶液を実施例Ａ４の手順にしたがって調製した。有機
試薬溶液は、カルシウムリガンドＨ３３，８ｍＭ、７−
ゾシルーＭＥＤＰＩＮ２５　、４　ｍ　Ｍ及びエチレン
無水マレイン酸コポリマー７．５％（Ｗ／Ｖｌを含んで
いた。この溶液を９倍容量のＨＥＰＥＳバッファ　　（
２００ｍＭ。

ｐＨ６，５）に加え、ＭＥＳバッファー（２０ｍＭ。

ｐＨ６）で更に３倍に希釈した。得られた試験溶液は赤
色であり、多少濁っていた。これは、ＴＨＦ３．３％（
Ｖ／Ｖ）　、イオノホア１．１３ｍＭ、レポーター０．
８５ｍＭ、安定剤０．２５％（Ｗ／Ｖｌ　、バッファー
２００ｍＭを含んでいた。

［Ｃａ”］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　ＯＤｏ　
　　　　　　　　　　　　　　０、６１１０、２　　　
　　　　　　　　　　０．７４８０．４　　　　　　　
　　　　　　０．８５１０．６　　　　　　　　　　　
　　０．９５６０．８１．０４５１．２　　　　　　　　　　　　　１．１８４この結果
を図１２に示す１図より、ここで記載した方法によって
得られる試験溶液を用いて、カルシウムイオンに対する
直線応答が得られることが示される。

Ｃ２：イオノホアとしての″バｌノマイシノ一般的な方
法において記載したようにして、作用ｐＨ溶液中に安定
剤を加えて試験溶液を調製した。有機試薬溶液は、パリ
ノマイシン１７．５ｍＭ、７−ゾシルーＭＥＤＰＩＮ　
３５　ｍ　Ｍを含んでおり、赤色であった。塩基溶液は
Ｎａ０−Ｈ５０ｍＭであった。得られた高ｐＨ試薬溶液
は青色であり、元の値の１／１０の試薬濃度を有してい
た。ＨＥＰＥＳ　９００ｍＭ％ｐＨ７，５を用いて作用
ｐＨバッファー溶液を調製し、更に、０．５％（ｗ／ｖ
）のエチレン／無水マレイン酸安定剤を含ませた。得ら
れた明澄な橙褐色の試験溶液は、ＴＨＦ３．３％（Ｖ／
Ｖ）　、イオノホア０．５８ｍＭ、レポーター１．１７
ｍＭ１バツフア一６００ｍＭ及び安定剤０．３３％（Ｗ
／Ｖ）を含んでいた。

カリウムイオン水溶液に対する量応答を下表及び図１３
に示す。

［Ｋ”］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　ｏＩ
）０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
３９００．２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．４３６０、５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．４７８０．７５　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５２５１．０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．５６６稙薯一般的にクリプタンドとして知られる２種類のクラウン
エーテルを用いて均一な試験水溶液を調製することがで
きることが示された。ナトリウムイオノホア（実施例Ａ
ｔ）はビスクラウンエーテルであり、カリウムイオノホ
ア（実施例Ａ２）は１５−クラウン−５−エーテルであ
る。実施例ＣＩによってボダンドを用いることもできる
ことが示され、また、実施例Ｃ２によってイオノホア性
抗生物質を用いることができることが示された。

１Ｄニレポーターのバ一般的な方法において記載したようにして、塩基溶液に
安定剤を加えて試験溶液を調製した。黄色の有機試薬溶
液の組成は、カリウムイオノホア７１．４ｍＭ及びＴＢ
ＤＥ　　１６．８ｍＭであった。塩基溶液はＮａＯＨ２
００ｍＭであり、安定剤としてエチレン／無水マレイン
酸コポリマー１％（Ｗ／Ｖｌ　を含んでいた。高ｐＨ試
薬溶液は明青色であり、元の値のｌ／１０の試薬濃度を
有していた。ＴＨＦ３．３％（Ｖ／Ｖ）　、イオノホア
２．４ｍＭ、レポーター０．５６ｍＭ、安定剤０．３％
（Ｗ／Ｖｌ　、バッフ７−６７０ｍＭを含む明澄な緑色
の試験溶液が得られた。

カリウムイオン水溶液試料に対する応答を６２０ｎｍに
おける吸光度によって測定したが、吸光度が高いので行
程長０．１ｃｍのキュベツト中で行なった。

［Ｋ”］　　（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　ＯＤ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
．４０２３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１、５３６６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１．７５１１０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１．８５３結果を図１４に示す。

絶倒Ｄ２ニレポーターとしてのメチルニオシン実施例Ｄ
Ｉのようにして試験溶液を調製した。

有機試薬溶液の組成は、カリウムイオノホア２８．６ｍ
Ｍ及びメチルエオシン６．７３ｍＭであった。塩基溶液
はＮａＯＨ２００ｍＭであり、安定剤としてエチレン／
無水マレイン酸コポリマー１％（Ｗ／Ｖ）を含んでいた
。　ＨＥＰＥＳ　、　ｐ　Ｈ６，５、ＩＭを用いて作用
バッファー溶液を調製した。試験溶液の組成は、ＴＨＦ
　　３．３％ｆＷ／Ｖ）　、イオノホア０．９５ｍＭ、
レポーター０．２２ｍＭ、安定剤０．３％（Ｗ／Ｖ）及
びバッファー６７０．ｍＭであった。

ここでも行程長０．１ｃｍのキュベツト中で、カリウム
イオン水溶液に対する応答を５６０止における吸光度に
よって測定した。

１　　　　　　　　　　　　　　０．１２３３　　　　
　　　　　　　　　　０、１６９６　　　　　　　　　
　　　　　０、２４６１０　　　　　　　　　　　　　
　０、３５０結果を図１５に示す。

殖兼レポーターは、インドフェノール類（７−ゾシルーＭＥ
ＤＰＩＮ　）　、フルオレセイン（メチルエオシン）又
は化合物のフタレイン類（ＴＢＤＥ）であってよい。

当業者によって、特許請求の範囲によって定義された本
発明の精神及び範囲から逸脱することなく、これら実施
例の多くの修正又は変更を行なうことができる６本発明
により、どのようにして安定で均一な試薬を調製するか
という問題を解決することによって１分散化電解質試験
を標準的な比色計中で有効に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、イオノホア、レポーター及びバッファーのみを
含むナトリウム試験溶液（実施例Ａｌ）の量応答を示す
グラフであり、図２は、加血清試料に対する、カリウム用の均一な試験
水溶液の量応答を示す図である。ここでは、試験溶液を
、作用バッファー溶液を加えたエチレン／無水マレイン
酸コポリマーで安定化した（実施例Ａ２ａ）。実施例の
（ｂ）においては、試験溶液を凍結乾燥及び再構成する
ことによって、存在していても僅かであった反応性が消
失したことが示される。図３は、有機溶媒を含まないカリウム試験溶液の量応答
を示すグラフである。ここでは、安定剤を作用バッファ
ー溶液と共に加えた（実施例Ａ３）。図４は、ナトリウム試験溶液の量応答を示すグラフであ
る。ここでは、安定剤を有機試薬溶液に加えた（実施例
Ａ４ａ）。・　図５は、図４に示されたものと同様に調製したが、
異なる有機溶媒を用いたナトリウム試験溶液の、ナトリ
ウムイオンを加えた血清試料に対する量応答を示すグラ
フである（実施例Ａ４ｂ）。図６は、フィルムを加水分解することによって調製した
カリウム試験溶液の、カリウムを加えた標準血清に対す
る量応答を示すグラフである（実施例Ａ５）。図７は、カリウム試験溶液の量応答を示すグラフである
。ここでは、安定剤としてＴｒｉｔｏｎ■ｘ−ｔｏｏを
有機試薬溶液に加え、これを直接、作用バッファー溶液
に加えて試験溶液を調製した（実施例Ｂ３）。図８は、安定剤としてポリオキシエチレン−９−ラウリ
ルエーテルを加えた場合のカリウムイオンに対する量応
答を示すグラフである（実施例Ｂ４）。図９は、実施例Ｂ５において示される、可溶性ポリウレ
タン安定剤を用いて調製した均一な試験水溶液による量
応答を示すグラフである。図１０は、実施例Ｂ６において示される、安定剤として
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ■Ｆ−６８を用いて得られた遠心分離
された均一な試験水溶液によって得られる量応答を示す
グラフである。図１１は、安定剤としてホスファチジルコリンを用いて
得られた量応答を示すグラフである（実施例Ｂ７）。図１２は、実施例ＣＩにおいて示されるように調製した
均一な試験水溶液によるカリウムイオンに対する量応答
を示すグラフである。図１３は、実施例Ｃ２において示されるように調製した
、パリノマイシンを含む均一な試験水溶液によるカリウ
ムイオンに対する量応答を示すグラフである。図１４は、レボ−クーとしてＴＢＤＥを用いたカリウム
イオンに対する量応答を示すグラフである（実施例ＤＩ
）。図１５は、レポーターとしてメチルニオシンを用いたカ
リウムイオンに単する量応答を示すグラフである（実施
例Ｄ２）。ＦＩＧ、　１ＦＩＧ、４ＦＩＧ、５ＦＩＧ、８ＦＩＧ、９ＦＩＧ、１２ＦＩＧ、１３

Claims

【特許請求の範囲】

（１）水性試験試料中のイオンの濃度を測定しうる均一
な試験水溶液を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）測定されるイオンとコンプレックスを形成
しうるイオノホア及び（ｉｉ）解離によって検出可能な
応答を生成する解離性プロトンを有する中性レポーター
（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を、プロトンの解離を生起するｐ
Ｈを有する塩基性溶液中に溶解して高ｐＨ溶液を生成さ
せ；（ｂ）該高ｐＨ溶液のｐＨを調節して、レポーターを実
質的にプロトン付加（ｐｒｏｔｏｎａｔｅ）し、イオノ
ホア−イオンコンプレックスの形成に応答してプロトン
脱離が起こるｐＨ範囲の試験溶液を生成させることを特
徴とする方法。
（２）溶解工程において更に安定剤を用いる請求項１記
載の方法。
（３）水性試験試料中のイオンの濃度を測定しうる均一
な試験水溶液を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）元素周期律表の I ａ及びIIａ族から成る
群より選択されるイオンとコンプレックスを形成しうる
イオノホア及び（ｉｉ）解離によって検出可能な応答を
生成する解離性プロトンを有する中性レポーターを、水
混和性有機溶媒中に溶解して有機試薬溶液を生成させ；（ｂ）該有機試薬溶液と、プロトンの解離を生起するｐ
Ｈを有する水溶液とを混合して高ｐＨ溶液を生成させ；（ｃ）該高ｐＨ溶液のｐＨを調節して、レポーターをプ
ロトン付加（ｐｒｏｔｏｎａｔｅ）し、イオノホア−イ
オンコンプレックスの形成に応答してプロトン脱離が起
こるｐＨ範囲の試験水溶液を生成させることを特徴とす
る方法。
（４）水性試験試料中のイオンの濃度を測定しうる均一
な試験水溶液を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）測定されるイオンとコンプレックスを形成
しうるイオノホア、（ｉｉ）解離によってイオノホア−
イオンコンプレックスの形成に基く検出可能な応答を生
成する解離性プロトンを有する中性レポーター及び（ｉ
ｉｉ）安定剤を、水混和性有機溶媒中に溶解して有機試
薬溶液を生成させ；（ｂ）該有機試薬溶液のｐＨを、イオノホア−イオンコ
ンプレックスの生成に応答して脱プロトンが起こるｐＨ
範囲のｐＨを有する水溶液を用いて調節して、５％未満
の水混和性有機溶媒を含む試験水溶液を生成させること
を特徴とする方法。
（５）水性試験試料中のイオンの濃度を測定しうる均一
な試験水溶液を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）イオンとコンプレックスを形成しうるイオ
ノホア、（ｉｉ）解離によってイオノホア−イオンコン
プレックスの形成に基く検出可能な応答を生成する解離
性プロトンを有する中性レポーター及び（ｉｉｉ）安定
剤を含む有機試薬溶液を乾燥することによって乾燥試薬
を調製し；（ｂ）該乾燥試薬を、イオノホア−イオンコンプレック
スの生成に応答してレポーター物質の脱プロトンが起こ
るｐＨ範囲のｐＨを有する水溶液中に溶解することを特
徴とする方法。
（６）水性試験試料中のイオンの濃度を測定しうる均一
な試験水溶液を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）イオンとコンプレックスを形成しうるイオ
ノホア及び（ｉｉ）解離によってイオノホア−イオンコ
ンプレックスの形成に基く検出可能な応答を生成する解
離性プロトンを有する中性レポーターを含む有機試薬溶
液を乾燥することによって乾燥試薬を調製し；（ｂ）該乾燥試薬を、プロトンの解離を生起せしめるｐ
Ｈを有する水溶液中に溶解して高ｐＨ溶液を生成させ；（ｃ）該高ｐＨ溶液のｐＨを調節して、レポーターをプ
ロトン付加し、イオノホア−イオンコンプレックスの形
成に応答してプロトン脱離が起こるｐＨ範囲の試験水溶
液を生成させることを特徴とする方法。
（７）試験水溶液中のイオンの濃度を測定しうる均一な
試験水溶液であって、（ａ）イオンとコンプレックスを形成しうるイオノホア
；（ｂ）解離によって検出可能な応答を与える解離性プロ
トンを有する実質的に中性のレポーター；及び、（ｃ）ｐＨを、イオノホア−イオンコンプレックスの生
成に応答して脱プロトン化が起こるｐＨ範囲のｐＨを与
えうるバッファーを含むことを特徴とする試験水溶液。
（８）血清試料中のイオンの濃度を測定しうる均一な試
験水溶液であって、（ａ）イオンとコンプレックスを形成しうるイオノホア
；（ｂ）解離によって検出可能な応答を与える解離性プロ
トンを有する中性のレポーター；及び、（ｃ）ｐＨを、
イオノホア−イオンコンプレックスの生成に応答して脱
プロトン化が起こるｐＨ範囲のｐＨを与えうるバッファ
ーを含むことを特徴とする試験水溶液。
（９）（ａ）イオンとコンプレックスを形成しうるイオ
ノホア及び（ｂ）解離によって検出可能な応答を与える
解離性プロトンを有する中性のレポーターを含む凍結乾
燥組成物。
（１０）（ａ）イオンとコンプレックスを形成しうるイ
オノホア、（ｂ）解離によって検出可能な応答を与える
解離性プロトンを有する中性のレポーター及び（ｃ）安
定剤を含む凍結乾燥組成物。