JPH01215283A - 水溶性酵素の分離方法 - Google Patents
水溶性酵素の分離方法Info
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- JPH01215283A JPH01215283A JP1011763A JP1176389A JPH01215283A JP H01215283 A JPH01215283 A JP H01215283A JP 1011763 A JP1011763 A JP 1011763A JP 1176389 A JP1176389 A JP 1176389A JP H01215283 A JPH01215283 A JP H01215283A
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- JP
- Japan
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- clay
- water
- aqueous medium
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- soluble enzyme
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野：
本発明は水溶性酵素を溶液状態で含む水性媒質中に存在
する不溶解物質及び／または非酵素蛋白からその水溶性
酵素を分離する方法に関する。
する不溶解物質及び／または非酵素蛋白からその水溶性
酵素を分離する方法に関する。
従来の技術：
菌体内酵素を含む菌体（細胞）から菌体内酵素を得るに
は、細胞を機械的手段により、またはその他の処理によ
り（例えば加熱により、あるいは酸もしくは塩基性剤、
界面活性剤、あるいはリゾチームのような酵素で処理す
ることにより）、破砕する。かかる細胞破砕によって最
初に得られるものは、破砕細胞、細胞砕片及び、水溶性
酵素を伴なうその他の細胞砕片及び多くの場合に溶液状
のその他の蛋白質物質を含む水性懸濁液である。
は、細胞を機械的手段により、またはその他の処理によ
り（例えば加熱により、あるいは酸もしくは塩基性剤、
界面活性剤、あるいはリゾチームのような酵素で処理す
ることにより）、破砕する。かかる細胞破砕によって最
初に得られるものは、破砕細胞、細胞砕片及び、水溶性
酵素を伴なうその他の細胞砕片及び多くの場合に溶液状
のその他の蛋白質物質を含む水性懸濁液である。
破砕細胞及びその他の砕片からの、可溶性酵素含有溶液
の分離は、遠心分離方法によって実施できる。しかし、
この分離操作は、分離の際に高遠心加速（Ｇ）力を得ら
れる強力遠心分離機を使用しない限り、なお可成りの置
の砕片を含む溶液を与える。そのような可成りの量の砕
片の存在は、可溶性酵素の精製及び／または使用を妨害
することがある。別法として、可溶性酵素を含む溶液は
、破砕細胞及びその他の不溶解砕片を含む懸濁液を高分
子凝集剤で処理することにより、それらの懸濁物から分
離することができる。しかしかかる処理法も、酵素含有
溶液に伴なって残存する可成りの量の凝集剤による問題
を与え、これも望ましくない。
の分離は、遠心分離方法によって実施できる。しかし、
この分離操作は、分離の際に高遠心加速（Ｇ）力を得ら
れる強力遠心分離機を使用しない限り、なお可成りの置
の砕片を含む溶液を与える。そのような可成りの量の砕
片の存在は、可溶性酵素の精製及び／または使用を妨害
することがある。別法として、可溶性酵素を含む溶液は
、破砕細胞及びその他の不溶解砕片を含む懸濁液を高分
子凝集剤で処理することにより、それらの懸濁物から分
離することができる。しかしかかる処理法も、酵素含有
溶液に伴なって残存する可成りの量の凝集剤による問題
を与え、これも望ましくない。
本発明の構成：
本発明によれば、水溶性酵素を溶解して含む水性媒質中
に存在する不溶解物質及び／または非酵素蛋白から水溶
性酵素を分離するに際して、その水性媒質を粘土と接触
させ、しかる後にその水性媒質から不溶解物質及び／ま
たは非酵素蛋白を分離するための処理に付すことを特徴
とする水溶性酵素の分離方法が提供される。
に存在する不溶解物質及び／または非酵素蛋白から水溶
性酵素を分離するに際して、その水性媒質を粘土と接触
させ、しかる後にその水性媒質から不溶解物質及び／ま
たは非酵素蛋白を分離するための処理に付すことを特徴
とする水溶性酵素の分離方法が提供される。
殊に本発明の方法は、水溶性酵素を含む細胞を破砕する
ときに得られる細胞砕片及びその他の不溶解（未溶解）
物質から水溶性酵素を分離するのに使用できる。この方
法の実施には、多様な粘土及び広範囲の条件を使用でき
る。しかし、最適の粘土及び最適の条件は、分離される
べき酵素によって非常に左右され易い、多くの可溶性酵
素についてスメクタイト粘土（モンモリロン石群鉱物）
例えばベントナイトｌは非常に適当である。ベントナイ
ト類に水を添加すると膨潤し、本発明方法で使用する場
合には、水性媒質に対して添加し、その媒質から水溶性
酵素が水膨潤形態で分離されるようにするのが好ましい
。特に適当なベントナイトは、米国ワイオミング州の周
知の鉱床から得られるベントナイト、例えば「オーガノ
ソープ（ＯＲＧＡＮＯ３ＯＲＢ） Ｊ （商は）ワイ
オミングベントナイトである。
ときに得られる細胞砕片及びその他の不溶解（未溶解）
物質から水溶性酵素を分離するのに使用できる。この方
法の実施には、多様な粘土及び広範囲の条件を使用でき
る。しかし、最適の粘土及び最適の条件は、分離される
べき酵素によって非常に左右され易い、多くの可溶性酵
素についてスメクタイト粘土（モンモリロン石群鉱物）
例えばベントナイトｌは非常に適当である。ベントナイ
ト類に水を添加すると膨潤し、本発明方法で使用する場
合には、水性媒質に対して添加し、その媒質から水溶性
酵素が水膨潤形態で分離されるようにするのが好ましい
。特に適当なベントナイトは、米国ワイオミング州の周
知の鉱床から得られるベントナイト、例えば「オーガノ
ソープ（ＯＲＧＡＮＯ３ＯＲＢ） Ｊ （商は）ワイ
オミングベントナイトである。
使用されるべき最適の粘土及び条件はそれぞれの酵素に
より変動するけれども、本発明方法を用いることにより
、いずれの水溶性酵素も、水性媒質中に懸濁されている
固型分から分離できる。アミダーゼは、本発明方法によ
り極めて良好に分離されうる水溶性酵素である。我々の
欧州公告特許出願第２７２０２５号明細書において、メ
チロフイルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＋５ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）＾５−１（
このものの培養体は、英国連邦スコツトランド八８９
ＢＤＣ，アバーディーン、１３５アビイロード、矛０
ボックス３１のザ・ナシヨナル・コレクションズ・オブ
・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア Ｎ
ＣＩＭＢに寄託されており、菌株ＮＣＩＢ １０５１５
としてそこから入手できる。このものは微工研寄託第１
２２２号と同じである。）の細胞中で産生されるアミダ
ーゼが記載されている。このアミダーゼは本発明方法を
用いると菌株ＭＳ−１の破砕細胞から非常に容易に分離
される。
より変動するけれども、本発明方法を用いることにより
、いずれの水溶性酵素も、水性媒質中に懸濁されている
固型分から分離できる。アミダーゼは、本発明方法によ
り極めて良好に分離されうる水溶性酵素である。我々の
欧州公告特許出願第２７２０２５号明細書において、メ
チロフイルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＋５ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）＾５−１（
このものの培養体は、英国連邦スコツトランド八８９
ＢＤＣ，アバーディーン、１３５アビイロード、矛０
ボックス３１のザ・ナシヨナル・コレクションズ・オブ
・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア Ｎ
ＣＩＭＢに寄託されており、菌株ＮＣＩＢ １０５１５
としてそこから入手できる。このものは微工研寄託第１
２２２号と同じである。）の細胞中で産生されるアミダ
ーゼが記載されている。このアミダーゼは本発明方法を
用いると菌株ＭＳ−１の破砕細胞から非常に容易に分離
される。
本発明方法では、粘土を、分離されるべき酵素を含む水
性媒質（例えば水性信地）に対して添加するのが適当で
ある０分離されるべき酵素を著しくは吸収せずに細胞砕
片及びその他の不溶解（未溶Ｓ）物質を吸収するのに充
分な粘土を添加するのが適当である。ある特定例におい
ては、最適粘土が最適量で添加されるならば、溶解され
た不要蛋白ならびに不溶解物質は粘土へ吸収され、かく
して所要の水溶性酵素から分離されうる。多くの例にお
いて、水性媒質へ添加される粘土の量は、媒質中の懸濁
固型分１０部に対して０．１〜２部の範囲の粘土である
のが適当である。特に有用な使用量比は、１０部の懸濁
固型分に対し１部の粘土である。水で膨潤されたチキソ
トロピー性粘土が使用される場合、これらについての量
比は、その粘土の固型分に関するものである（水分は差
引かれる）。
性媒質（例えば水性信地）に対して添加するのが適当で
ある０分離されるべき酵素を著しくは吸収せずに細胞砕
片及びその他の不溶解（未溶Ｓ）物質を吸収するのに充
分な粘土を添加するのが適当である。ある特定例におい
ては、最適粘土が最適量で添加されるならば、溶解され
た不要蛋白ならびに不溶解物質は粘土へ吸収され、かく
して所要の水溶性酵素から分離されうる。多くの例にお
いて、水性媒質へ添加される粘土の量は、媒質中の懸濁
固型分１０部に対して０．１〜２部の範囲の粘土である
のが適当である。特に有用な使用量比は、１０部の懸濁
固型分に対し１部の粘土である。水で膨潤されたチキソ
トロピー性粘土が使用される場合、これらについての量
比は、その粘土の固型分に関するものである（水分は差
引かれる）。
粘土添加中のその他の条件についての最適値は、分離さ
れるべきそれぞれの酵素により及び使用されるそれぞれ
の粘土により変動する。大抵の場合、中性付近のｐＨ１
例えば６〜８のｐＨ値が適当であり、殊に６〜７のｐｉ
値が適当である。適当な温度は多くの場合１０〜６０″
Ｃの範囲内である。
れるべきそれぞれの酵素により及び使用されるそれぞれ
の粘土により変動する。大抵の場合、中性付近のｐＨ１
例えば６〜８のｐＨ値が適当であり、殊に６〜７のｐｉ
値が適当である。適当な温度は多くの場合１０〜６０″
Ｃの範囲内である。
粘土での水性媒質の処理後に固型分は、適宜な手段によ
り、例えば遠心分離法により、所要の水溶性酵素を含む
水性媒質から分離されうる。
り、例えば遠心分離法により、所要の水溶性酵素を含む
水性媒質から分離されうる。
本発明を以下の実施例により説明する。
尖施班
１０％の乾燥基準固型分を含むメチロフイルス・メチロ
トロフス菌株ＮＣＩＢ第１０５１５号の細胞スラリーを
ＤＮＡアーゼ（ａｓｅ）の存在下にフレンチ・プレスに
より破砕した。得られたものを３つの部分に分割した。
トロフス菌株ＮＣＩＢ第１０５１５号の細胞スラリーを
ＤＮＡアーゼ（ａｓｅ）の存在下にフレンチ・プレスに
より破砕した。得られたものを３つの部分に分割した。
一つの部分を対照試料とし、粘土スラリーで処理しなか
った。他の二つの分割部分に「オーガノソープ」ベント
ナイト粘土を、それぞれ１０％及び２０％”への量で添
加した（この量は乾燥細胞固型分の重量に対する乾燥粘
土の重量を基準としている）、記録されたパラメータは
、粘土スラリーによる希釈について修正された。三つの
部分すべても、ｒ ’；／−ハル（ＳＯＲＶＡＬ ：商
標）」１２ｃ５Ｂ遠心分離機で３００００で１分間遠心
分離し、標準的な方法で乾燥基準固型分含量、蛋白濃度
、アミダーゼ活性、グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）及び可溶性シトクロームＣ含
量について検定した。
った。他の二つの分割部分に「オーガノソープ」ベント
ナイト粘土を、それぞれ１０％及び２０％”への量で添
加した（この量は乾燥細胞固型分の重量に対する乾燥粘
土の重量を基準としている）、記録されたパラメータは
、粘土スラリーによる希釈について修正された。三つの
部分すべても、ｒ ’；／−ハル（ＳＯＲＶＡＬ ：商
標）」１２ｃ５Ｂ遠心分離機で３００００で１分間遠心
分離し、標準的な方法で乾燥基準固型分含量、蛋白濃度
、アミダーゼ活性、グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）及び可溶性シトクロームＣ含
量について検定した。
結果を表に示す、これらの結果は、粘土処理された分割
試料部分中の固型分含量及び全蛋白濃度が、対照試験試
料におけるよりも著しく低いことを示している。粘土処
理試料のいずれにおいてもアミダーゼ活性は著しくは低
減しておらず、このことはこの処理が該酵素について最
適処理であったことを示している。しかし、シトクロー
ムＣ活性は両方の粘土処理試料において著しく低減し、
またグルコース−６−ホスフォートデヒドロゲナーゼ活
性は、２０％粘土処理の使用時に著しく低減した。この
ことは、これらの酵素について、固型分及びその他の蛋
白質の分離は良好であったが、これは酵素活性の若干の
損失の犠牲によって達成された。
試料部分中の固型分含量及び全蛋白濃度が、対照試験試
料におけるよりも著しく低いことを示している。粘土処
理試料のいずれにおいてもアミダーゼ活性は著しくは低
減しておらず、このことはこの処理が該酵素について最
適処理であったことを示している。しかし、シトクロー
ムＣ活性は両方の粘土処理試料において著しく低減し、
またグルコース−６−ホスフォートデヒドロゲナーゼ活
性は、２０％粘土処理の使用時に著しく低減した。この
ことは、これらの酵素について、固型分及びその他の蛋
白質の分離は良好であったが、これは酵素活性の若干の
損失の犠牲によって達成された。
従ってこれらの場合にはさらに若干の最適化をするのが
望ましいであろう。
望ましいであろう。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、水溶性酵素を溶解して含む水性媒質中に存在する不
溶解物質及び／または非酵素蛋白から水溶性酵素を分離
するに際して、その水性媒質を粘土と接触させ、しかる
後にその水性媒質から不溶解物質及び／または非酵素蛋
白を分離するための処理に付すことを特徴とする水溶性
酵素の分離方法。 ２、粘土はスメクタイト粘土である請求項１記載の方法
。 ３、粘土はベントナイトである請求項２記載の方法。 ４、酵素含有水性媒質に対して、粘土を水膨潤形態で添
加する請求項３記載の方法。 ５、水溶性酵素はアミダーゼである請求項１〜４のいず
れかに記載の方法。 ６、アミダーゼはメチロフイルス・メチロトロフスの菌
株から得られたものである請求項５記載の方法。 ７、分離されるべき水溶性酵素を含む水性媒質に対して
粘土を添加する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８、分離されるべき水溶性酵素を著しくは吸収せずに存
在不溶解物質を吸収するのに充分な粘土と、水性媒質を
接触させる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９、水性媒質と粘土とを、水性媒質中の１０部に対して
０．１〜２部の粘土（水膨潤粘土を使用する場合はその
粘土固型分）の量で接触させる請求項１〜８のいずれか
の方法。 １０、水性媒質を粘土で処理した後に、不溶解物質及び
／または非酵素蛋白を、遠心分離法により媒質から分離
する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8801303 | 1988-01-21 | ||
| GB888801303A GB8801303D0 (en) | 1988-01-21 | 1988-01-21 | Improved method of separating soluble enzymes from cell debris |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01215283A true JPH01215283A (ja) | 1989-08-29 |
Family
ID=10630291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1011763A Pending JPH01215283A (ja) | 1988-01-21 | 1989-01-20 | 水溶性酵素の分離方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0325348A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01215283A (ja) |
| GB (1) | GB8801303D0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4037530A1 (de) * | 1990-11-26 | 1992-05-27 | Henkel Kgaa | Faellungsverfahren fuer exocellulaere proteine |
| WO1998058072A1 (en) * | 1997-06-19 | 1998-12-23 | Ciba Speciality Chemicals Water Treatments Limited | Flocculation of biological material from organic acid-containing systems |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3711462A (en) * | 1970-04-01 | 1973-01-16 | Mobil Oil | Method of clarifying polysaccharide solutions |
| BE790075A (fr) * | 1971-10-14 | 1973-04-13 | Bayer Ag | Procede de preparation de penicillinacylase cristalline pure etproduit obtenu |
| US4931397A (en) * | 1985-09-24 | 1990-06-05 | Miles Inc. | Method for removing antifoaming agents during processing of microbial fermentations |
-
1988
- 1988-01-21 GB GB888801303A patent/GB8801303D0/en active Pending
-
1989
- 1989-01-09 EP EP89300140A patent/EP0325348A3/en not_active Withdrawn
- 1989-01-20 JP JP1011763A patent/JPH01215283A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8801303D0 (en) | 1988-02-17 |
| EP0325348A2 (en) | 1989-07-26 |
| EP0325348A3 (en) | 1990-07-04 |
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