JPH01221394A - 血小板膜糖蛋白質Ｉｂへのフォン・ヴィレブラント因子の結合を阻子する蛋白質分解切片および合成ペプチド - Google Patents
血小板膜糖蛋白質Ｉｂへのフォン・ヴィレブラント因子の結合を阻子する蛋白質分解切片および合成ペプチドInfo
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- JPH01221394A JPH01221394A JP63291065A JP29106588A JPH01221394A JP H01221394 A JPH01221394 A JP H01221394A JP 63291065 A JP63291065 A JP 63291065A JP 29106588 A JP29106588 A JP 29106588A JP H01221394 A JPH01221394 A JP H01221394A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、血小板膜糖蛋白質Ｔｂ（ＧＰＩｂ）および血
小板膜ＧＰＩｂに関連した分子または他の細胞および細
胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子（ｖ
Ｗ Ｆ ）の結合を阻止するペプチドに関するものであ
る。
小板膜ＧＰＩｂに関連した分子または他の細胞および細
胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子（ｖ
Ｗ Ｆ ）の結合を阻止するペプチドに関するものであ
る。
また、本発明は血小板凝固の防止及び血栓症の防止にも
関するものである。
関するものである。
発明の背景
ｖ Ｗ Ｆは、血小板ＧＰＩｂ受容体に結合することに
よって欝血の初期の段階に関与する。ｖ Ｗ ＦとＣＰ
ＩｂＯ間の相互作用の重要性は、ＣＰＩｂの減量または
異常機能で特徴づけられる障害であるベルナールースー
リエ症候群の出血性素質によって示唆される。ＣＰｌｂ
は、一般に特に高い壁剪断応力（小さい脈管内での高流
速）の条件化において露出した内皮下マトリックス、変
化した内皮細胞およびプロトロンビン表面への血小板の
付着を仲介してｖ Ｗ Ｆの受容体として働く、すなわ
ち、ｖＷＦ−ＧＰＩｂの相互作用は一次欝血の防止およ
び血管の閉塞が重要な役割を演じる疾病の予防に有用な
抗血栓状態の導入をもたらすと期待される。
よって欝血の初期の段階に関与する。ｖ Ｗ ＦとＣＰ
ＩｂＯ間の相互作用の重要性は、ＣＰＩｂの減量または
異常機能で特徴づけられる障害であるベルナールースー
リエ症候群の出血性素質によって示唆される。ＣＰｌｂ
は、一般に特に高い壁剪断応力（小さい脈管内での高流
速）の条件化において露出した内皮下マトリックス、変
化した内皮細胞およびプロトロンビン表面への血小板の
付着を仲介してｖ Ｗ Ｆの受容体として働く、すなわ
ち、ｖＷＦ−ＧＰＩｂの相互作用は一次欝血の防止およ
び血管の閉塞が重要な役割を演じる疾病の予防に有用な
抗血栓状態の導入をもたらすと期待される。
発明の解決しようとする課題
本発明は、ｖ Ｗ ＦのＣＰＩｂへの結合を阻止するこ
とによって抗血栓剤として作用する能力を有する、ＧＰ
Ｉｂの蛋白質分解切片およびペプチドを提供することを
課題とする。
とによって抗血栓剤として作用する能力を有する、ＧＰ
Ｉｂの蛋白質分解切片およびペプチドを提供することを
課題とする。
課題を解決するための手段
本発明は、血小ｖｉ膜糖蛋白質Ｉｂおよび血小板膜糖蛋
白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞マト
リックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を阻止
する下記のアミノ酸配列：ＨＰ ＴＣＥＶＳＫＶＡＳＨ
ＬＢＶＮＣＤＫＲＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ｒ
ＬＨＬＳＥＮＬＬＹＴＦＳＬＡＴＬＭＰＹＴＲＬＴＱＬ
ＮＬＤＲＣＥＬＴＫＬＱＶＤＧＴＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳ
ＨＮＱＬＱＳＬＰＬＬＧＱＴＬＰｌｌｏ
１２０ＡＬＴＶＬＤＶＳＦＮＲＬＴＳＬ
ＰＬＧＡＬＲＧＬＧＥＬＱＥＬＹＬＫＧＮＥＬＫＴＬＰ
（Ｉ Ｐ Ｇ Ｌ Ｌ、Ｔ Ｐ Ｔ Ｐ Ｋ
Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｌ Ａ Ｎ
Ｎ Ｎ Ｌｉ２Ｏ１８０ 置ＰＡＧＬＬＮＧＬＥＮＬＤＴＬＬＬＱＥＮＳＬＹＴＩ
ＰＫＧＦＦＧＳＨＬＬＰＦＡＦＬＨＧＮＰＷＬＣＮ
ＣＥＩ ＬＹＦＲＲＷＬＱＤＮＡＥＮＶＹＶＷＫＱＧ
ＶＤＶＫＡＭＴＳ Ｎ Ｖ Ａ Ｓ Ｖ
Ｑ ＣＤ Ｎ Ｓ Ｄ Ｋ Ｆ Ｐ
Ｖ’Ｙ Ｋ Ｙ ＰＧＫＧＣＰＴＬＧＤＥＧＤＴ
ＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲ から選ばれたグリコカリシンの４５ ｋＤａアミノ末端
トリプシン切片（ｔｒｙｐｔｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
のペプチドを含む。
白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞マト
リックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を阻止
する下記のアミノ酸配列：ＨＰ ＴＣＥＶＳＫＶＡＳＨ
ＬＢＶＮＣＤＫＲＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ｒ
ＬＨＬＳＥＮＬＬＹＴＦＳＬＡＴＬＭＰＹＴＲＬＴＱＬ
ＮＬＤＲＣＥＬＴＫＬＱＶＤＧＴＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳ
ＨＮＱＬＱＳＬＰＬＬＧＱＴＬＰｌｌｏ
１２０ＡＬＴＶＬＤＶＳＦＮＲＬＴＳＬ
ＰＬＧＡＬＲＧＬＧＥＬＱＥＬＹＬＫＧＮＥＬＫＴＬＰ
（Ｉ Ｐ Ｇ Ｌ Ｌ、Ｔ Ｐ Ｔ Ｐ Ｋ
Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ Ｌ Ａ Ｎ
Ｎ Ｎ Ｌｉ２Ｏ１８０ 置ＰＡＧＬＬＮＧＬＥＮＬＤＴＬＬＬＱＥＮＳＬＹＴＩ
ＰＫＧＦＦＧＳＨＬＬＰＦＡＦＬＨＧＮＰＷＬＣＮ
ＣＥＩ ＬＹＦＲＲＷＬＱＤＮＡＥＮＶＹＶＷＫＱＧ
ＶＤＶＫＡＭＴＳ Ｎ Ｖ Ａ Ｓ Ｖ
Ｑ ＣＤ Ｎ Ｓ Ｄ Ｋ Ｆ Ｐ
Ｖ’Ｙ Ｋ Ｙ ＰＧＫＧＣＰＴＬＧＤＥＧＤＴ
ＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲ から選ばれたグリコカリシンの４５ ｋＤａアミノ末端
トリプシン切片（ｔｒｙｐｔｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
のペプチドを含む。
本発明はさらに血小板膜糖蛋白￥ｔＩｂおよび血小板膜
糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞
マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を
阻止する下記のアミノ酸配列： ＨＰＩＣＥＶＳＫＶＡＳＨＬＥＶＮＣＤＫＲＮＬＴＡＬ
ＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩＬＨＬＳＥＮＬＬＹＴＦＳＬＡＴ
ＬＭＰＹＴＲＬＴＱＬＮＬＤＲＣＥＬＴＫＬＱＶＤＧＴ
ＬＰＶＬＧＴＬＤＬＳＨＮＱＬＱＳＬＰＬＬＧＱＴＬＰ
ｌｌｏ １２０ＡＬＴＶ
ＬＤＶＳＦＮｒ？ＬＴＳＬＰＬＧＡＬＲＧＬＧＥＬＱＥ
ＬＹＬＫＧＮＥＬＫＴＬＰＰ ＣＬ Ｌ、Ｔ Ｐ
Ｔ Ｐ Ｋ Ｌ Ｅ Ｋ Ｌ Ｓ
Ｌ Ａ Ｎ Ｎ Ｎ Ｌｉ２Ｏ１８０ Ｉ 置ＰＡＧＬＬＮＧＬＥＮＬＤＴＬＬＬＱＥＮＳＬＹＴＩ
ＰＫＧＦＦＧＳＨＬＬＰＦＡＦＬＨＧＮＰＷＬＣＮＣＥ
Ｉ ＬＹＦＲＲＷＬＱＤＮＡＥＮＶＹＶＷＫＱＧ
ＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡＳＶＱＣＤＮＳＤＫＦＰＶＹＫ
ＹＰＧＫＧＣＰＴＬＧＤＥＣ；ＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥ
ＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲ から選ばれたグリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末端ト
リプシン切片の逐次サブセット （ｓｅｑｕｅｎｔｉ（
１３） ５ｕｂｓｅｔ）を含む。
糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞
マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を
阻止する下記のアミノ酸配列： ＨＰＩＣＥＶＳＫＶＡＳＨＬＥＶＮＣＤＫＲＮＬＴＡＬ
ＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩＬＨＬＳＥＮＬＬＹＴＦＳＬＡＴ
ＬＭＰＹＴＲＬＴＱＬＮＬＤＲＣＥＬＴＫＬＱＶＤＧＴ
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ＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲ から選ばれたグリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末端ト
リプシン切片の逐次サブセット （ｓｅｑｕｅｎｔｉ（
１３） ５ｕｂｓｅｔ）を含む。
本発明はさらに、
ＤＫＲＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ。
ＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴＴ、
ＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩＬＨＬＳＥ。
ＰＧＬＬＴＰＴＰＫＬＥＫＬＳＬ。
ＫＱＧＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡＳ。
ＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥＤＴＥ。
ＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲＴＶ。
ＰＰＤＬＰＫＤＴＴ、およびＥＥＤＴＥから成るペプチ
ドの群から選ばれた血小板ＭｔＪＡ蛋白質Ｉｂおよび血
小板膜糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞およ
び細胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の
結合を阻止するペプチドを含む。
ドの群から選ばれた血小板ＭｔＪＡ蛋白質Ｉｂおよび血
小板膜糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞およ
び細胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の
結合を阻止するペプチドを含む。
その他好ましいのは、血小板膜糖蛋白質Ｉｂおよび血小
板ｎり糖蛋白質！ｂに関連した分子または他の細胞およ
び細胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の
結合を阻止するペプチドおよびその誘導体ノアミノ酸の
逐次サブセットのペプチドである。
板ｎり糖蛋白質！ｂに関連した分子または他の細胞およ
び細胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の
結合を阻止するペプチドおよびその誘導体ノアミノ酸の
逐次サブセットのペプチドである。
本発明はさらに、血小板膜糖蛋白質ｉｂおよび血小板膜
糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞
マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を
阻止する一般式（ＫＲ）ａ〔ただしｎ＝２−１０３およ
びＲｎ 〔ただしｎ−２−２０）を存するペプチドおよ
びその誘導体を含む。
糖蛋白質Ｉｂに関連した分子または他の細胞および細胞
マトリックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を
阻止する一般式（ＫＲ）ａ〔ただしｎ＝２−１０３およ
びＲｎ 〔ただしｎ−２−２０）を存するペプチドおよ
びその誘導体を含む。
本発明はさらに、これらのペプチドの有効量で血小板同
士の凝集を阻止する方法を含む。
士の凝集を阻止する方法を含む。
本発明はさらに、これらのペプチドの有効量をその患者
に投与することを特徴とする色者の血栓症を阻止する方
法を含む。
に投与することを特徴とする色者の血栓症を阻止する方
法を含む。
ＧＰＩｂは、分子質量約２２ｋＤａのＬ（β）鎖にジス
ルフィド結合で結合した分子Ｘ！約１４０ｋＤａの＋（
（α）鎖から成る二鎖分子である。
ルフィド結合で結合した分子Ｘ！約１４０ｋＤａの＋（
（α）鎖から成る二鎖分子である。
ＣＰＩｂは、膜内在性蛋白質であり、αおよびβの両方
の鎖がトランスメンプランドメインを有する。内在性の
カルシウム依存性の血小板プロテアーゼによる蛋白質分
解は、グリコカリシンとして知られるα鎖の蛋白分解切
片を生成する。この切片は、α鎖の細胞外ドメインに由
来し、水溶性である。すなわち、親分子から分裂したあ
と放出される。′ 本発明の具体例が行われ使用される方法の詳細を下記に
説明する。この説明は、本発明を例示するものであって
、本発明を特に限定することを意図するものではな（、
当業者の認識の範囲内にあるような改変は本発明の範囲
に入ると考えられるべきである。
の鎖がトランスメンプランドメインを有する。内在性の
カルシウム依存性の血小板プロテアーゼによる蛋白質分
解は、グリコカリシンとして知られるα鎖の蛋白分解切
片を生成する。この切片は、α鎖の細胞外ドメインに由
来し、水溶性である。すなわち、親分子から分裂したあ
と放出される。′ 本発明の具体例が行われ使用される方法の詳細を下記に
説明する。この説明は、本発明を例示するものであって
、本発明を特に限定することを意図するものではな（、
当業者の認識の範囲内にあるような改変は本発明の範囲
に入ると考えられるべきである。
発明者らは、１）セファロースビーズ上に不溶化した小
麦胚芽凝集素を使ったアフィニティー・クロマトグラフ
ィーおよび２）グリコカリシンに対して向けられセファ
ロースビーズ上に不溶化したモノクローナル抗体（ＬＪ
−Ｐ３）を使った免疫アフィニティー・クロマトグラフ
ィーに基づく二段法でグリコカリシンを精製した。
麦胚芽凝集素を使ったアフィニティー・クロマトグラフ
ィーおよび２）グリコカリシンに対して向けられセファ
ロースビーズ上に不溶化したモノクローナル抗体（ＬＪ
−Ｐ３）を使った免疫アフィニティー・クロマトグラフ
ィーに基づく二段法でグリコカリシンを精製した。
古い血小板濃厚液をグリコカリシンの精製用の出発原料
として使用した。血小板を２３００ｇで室温（２２−２
５℃）で２５分間沈降させ、上澄液を除き、１０ｍＭト
リス塩基および１５０ｍＭＮａＣｌを含む、ＨＣＩでｐ
Ｈを７．４にした緩衝液（トリス緩衝塩水、ＴＢＳ）に
血小板ペレットを再懸濁させ、２ ｍ ＭのＥＤＴＡを
加えることによって血漿成分を除去した。この方法を゛
二回繰り返した。最初の洗浄の後、懸濁液を６００ｇで
１分間遠心分離し、不純物の赤血球の大部分を含むペレ
ットを次の洗浄工程の前に廃棄した。最後の遠心分離の
あと、血小板を、２ｍＭのＣａＣ１ｇおよび０．１ ｍ
Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）を含むＴＢＳに再懸濁させた。その後、これを音波
処理（血小板懸濁液を氷で冷やし約１００ワツトで各１
５秒のパルス３回）で破壊した。つぎに、懸濁液を室温
に３時間、４℃に１６−１８時間常に撹拌を続けながら
放置した後、ｘｏｏｏｏｏｇで１２℃で２０分間遠心分
離して懸濁液中の粒軟化した物質を除いた。透明な上澄
液を、臭化シアンで活性化し１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１
ｍ ＭのＰＭＳ Ｆおよび０．０２％のアジ化ナトリ
ウムを含むＴＢＳで平衡化したセファロースビーズに結
合させた小麦胚芽凝集素のカラム（径２．６ ｃ ｍ
％高さＩｔｃｍ）に加えた。同じ緩衝液に加えた１００
ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンで結合蛋白質を溶出さ
せる前にビーズの体積の二倍に相当する体積の緩衝液で
カラムを洗浄した。すべての方法は室温で行った。溶出
物質を直ぐに、臭化シアンで活性化したセファロースビ
ーズに結合した精製ＩｇＧから成るモノクローナル抗体
カラム（径５ｃｍ、高さ２．５ｃｍ）に加えた。使用し
た抗体、ＬＪ−Ｐ３、はＧＰＩｂのグリコカリシン部分
に特異的であり、その調製法、特徴および精製法は、ハ
ンダら、ジャーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２６１巻、１２５７９−１２５８５頁（１
９８６年）に記載されている。カラムは、１００ｍＭの
トリス塩基、５００ｍＭのＬｉＣ１，，１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、０．０２％のアジ化ナトリ
ウムから成り、ＭＣＩでｐＨを７．４に調節した緩衝液
で平衡化した。カラムは、ビーズの体積の二倍に当たる
体積の緩衝液で洗浄した。結合グリコカリシンは、１ｍ
ＭのＥＤＴＡおよび０．１ｍＭのＰＭＳ Ｆを含む５０
ｍＭのジエチルアミン７０７０−８Ｏで溶出した。この
工程の間、溶出が２０−２５分で終わるようにカラム流
速を調節した。全工程は室温で行った。溶出したグリコ
カリシンは、６ｇのグリシン中に集めてジエチルアミン
の高いｐＨを中和した。精製した物質を強力にＴＢＳに
対して透析し、アクアサイド（＾ｑｕａｃｉｄｅ）で濃
縮し、もう−度ＴＢＳで透析した。精製したグリコカリ
シンは、小分けして一７０℃で保存した。
として使用した。血小板を２３００ｇで室温（２２−２
５℃）で２５分間沈降させ、上澄液を除き、１０ｍＭト
リス塩基および１５０ｍＭＮａＣｌを含む、ＨＣＩでｐ
Ｈを７．４にした緩衝液（トリス緩衝塩水、ＴＢＳ）に
血小板ペレットを再懸濁させ、２ ｍ ＭのＥＤＴＡを
加えることによって血漿成分を除去した。この方法を゛
二回繰り返した。最初の洗浄の後、懸濁液を６００ｇで
１分間遠心分離し、不純物の赤血球の大部分を含むペレ
ットを次の洗浄工程の前に廃棄した。最後の遠心分離の
あと、血小板を、２ｍＭのＣａＣ１ｇおよび０．１ ｍ
Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）を含むＴＢＳに再懸濁させた。その後、これを音波
処理（血小板懸濁液を氷で冷やし約１００ワツトで各１
５秒のパルス３回）で破壊した。つぎに、懸濁液を室温
に３時間、４℃に１６−１８時間常に撹拌を続けながら
放置した後、ｘｏｏｏｏｏｇで１２℃で２０分間遠心分
離して懸濁液中の粒軟化した物質を除いた。透明な上澄
液を、臭化シアンで活性化し１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１
ｍ ＭのＰＭＳ Ｆおよび０．０２％のアジ化ナトリ
ウムを含むＴＢＳで平衡化したセファロースビーズに結
合させた小麦胚芽凝集素のカラム（径２．６ ｃ ｍ
％高さＩｔｃｍ）に加えた。同じ緩衝液に加えた１００
ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンで結合蛋白質を溶出さ
せる前にビーズの体積の二倍に相当する体積の緩衝液で
カラムを洗浄した。すべての方法は室温で行った。溶出
物質を直ぐに、臭化シアンで活性化したセファロースビ
ーズに結合した精製ＩｇＧから成るモノクローナル抗体
カラム（径５ｃｍ、高さ２．５ｃｍ）に加えた。使用し
た抗体、ＬＪ−Ｐ３、はＧＰＩｂのグリコカリシン部分
に特異的であり、その調製法、特徴および精製法は、ハ
ンダら、ジャーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２６１巻、１２５７９−１２５８５頁（１
９８６年）に記載されている。カラムは、１００ｍＭの
トリス塩基、５００ｍＭのＬｉＣ１，，１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、０．０２％のアジ化ナトリ
ウムから成り、ＭＣＩでｐＨを７．４に調節した緩衝液
で平衡化した。カラムは、ビーズの体積の二倍に当たる
体積の緩衝液で洗浄した。結合グリコカリシンは、１ｍ
ＭのＥＤＴＡおよび０．１ｍＭのＰＭＳ Ｆを含む５０
ｍＭのジエチルアミン７０７０−８Ｏで溶出した。この
工程の間、溶出が２０−２５分で終わるようにカラム流
速を調節した。全工程は室温で行った。溶出したグリコ
カリシンは、６ｇのグリシン中に集めてジエチルアミン
の高いｐＨを中和した。精製した物質を強力にＴＢＳに
対して透析し、アクアサイド（＾ｑｕａｃｉｄｅ）で濃
縮し、もう−度ＴＢＳで透析した。精製したグリコカリ
シンは、小分けして一７０℃で保存した。
精製したグリコカリシンは、Ｎ−）シル−し一フェニル
アラニン・クロルメチルケトンで予め処理したトリプシ
ンで消化した。酵素基体比は１：２００であり、反応は
３７℃で１６−１８時間進むに任せた。培養の終わりに
、二倍モル過剰の（ｐ−アミジノフェニル）メタンスル
ホニルフルオライドでトリプシン活性を阻止した。トリ
プシン消化で生成したグリコカリシンの４５ｋＤａ切片
は、直列につないだ一本のＧＦ４５０および二本（７）
ＧＦ ２５０デユポン・ゾルパックスカラム（径９、４
ｍ ｍ、長さ２５ｃｍ）を使って高圧液体ゲル浸透ク
ロマトグラフィーで精製した。カラムは２００ｍＭの（
ＮＨ４）！ ＨＰＯ４（り）［７）で平衡化し、流速は
１ｍ１／分であった。方法は室温で行った。４５ｋＤａ
の切片は、鋭いピークとして溶出し、これを捕集し、ア
クアサイドでｆｍ’ｍＬ、ＴＢＳで強力に透析し、使用
までは小分けして、−７０℃で保存した。
アラニン・クロルメチルケトンで予め処理したトリプシ
ンで消化した。酵素基体比は１：２００であり、反応は
３７℃で１６−１８時間進むに任せた。培養の終わりに
、二倍モル過剰の（ｐ−アミジノフェニル）メタンスル
ホニルフルオライドでトリプシン活性を阻止した。トリ
プシン消化で生成したグリコカリシンの４５ｋＤａ切片
は、直列につないだ一本のＧＦ４５０および二本（７）
ＧＦ ２５０デユポン・ゾルパックスカラム（径９、４
ｍ ｍ、長さ２５ｃｍ）を使って高圧液体ゲル浸透ク
ロマトグラフィーで精製した。カラムは２００ｍＭの（
ＮＨ４）！ ＨＰＯ４（り）［７）で平衡化し、流速は
１ｍ１／分であった。方法は室温で行った。４５ｋＤａ
の切片は、鋭いピークとして溶出し、これを捕集し、ア
クアサイドでｆｍ’ｍＬ、ＴＢＳで強力に透析し、使用
までは小分けして、−７０℃で保存した。
ＧＰＴｂのα頷のこの蛋白質分解切片がｖ Ｗ Ｆのも
とのままの血小板への結合を阻害できることを示すのに
この精製グリコカリシンを使用した。
とのままの血小板への結合を阻害できることを示すのに
この精製グリコカリシンを使用した。
試験法は、＋１％ １−標識のｖＷＦおよび新鮮な又
はホルマリンで固定した血小板の使用に基づくものであ
る。ＶＷＦのｃｐＩｂへの結合を誘導するにはりストセ
チンを使用した。３７℃で３０分間撹拌なしに培養した
あと、タイロード１１ ？Ｊｉ ／＆中２０％の蔗糖を
通して遠心分離して遊離のりガントから血小板に結合し
たりガントを分離し、ルソゲリら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション、第７２巻、■−
１２頁（１９８３年）に記載された方法で結合放射能を
測定した。
はホルマリンで固定した血小板の使用に基づくものであ
る。ＶＷＦのｃｐＩｂへの結合を誘導するにはりストセ
チンを使用した。３７℃で３０分間撹拌なしに培養した
あと、タイロード１１ ？Ｊｉ ／＆中２０％の蔗糖を
通して遠心分離して遊離のりガントから血小板に結合し
たりガントを分離し、ルソゲリら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション、第７２巻、■−
１２頁（１９８３年）に記載された方法で結合放射能を
測定した。
４０倍過剰の未ｔ！！識のＶＷＦの存在で結合を測定す
ることによって選択点についての化性異的結合を評価し
た。結合等混線は、マンソンらメソード・エンザイモロ
ジー、第９２巻、５４１−５７６ｇ（１９８３年）に記
載されているコンピューター支援プログラム・リガンド
を使って結合パラメーター（非特異結合の評価を含む）
を測定するスカノチャード弐の分析法で評価した。
ることによって選択点についての化性異的結合を評価し
た。結合等混線は、マンソンらメソード・エンザイモロ
ジー、第９２巻、５４１−５７６ｇ（１９８３年）に記
載されているコンピューター支援プログラム・リガンド
を使って結合パラメーター（非特異結合の評価を含む）
を測定するスカノチャード弐の分析法で評価した。
グリコカリシンは、ｌ ｍ ｇ ／ ｍ ｌを超える最
終濃度でＩｔｓ ■−標識のｖＷＦのもとのままのＧ
ＰＩｂへの結合を完全に阻止することができる。結合の
５０％を阻止するのに必要な濃度１ｃｓ。値として示す
）は、７種の異なったグリコカリシンｙ４製品を使って
平均１５０μｇ ／ ｍ ｌであることがわかった。つ
ぎに、モル過剰のジチオトレイ１−ルで処理することに
よってグリコカリシン中に存在するすべての鎖内ジスル
フィド結合を還元し、できたスルフヒドリル基をＳ−カ
ルボキシイミドメチル化で保護した。できた還元および
アルキル化されたグリコカリシンは、リストセチンの存
在でｖ Ｗ Ｆが血小板上のもとのままのＧＰＩｂに結
合するのを阻止する性質を保持していることがわかった
。還元およびアルキル化されたグリコカリシンは、鎖内
ジスルフィド結合による二級構造を失っているので、こ
の実験はｖ Ｗ Ｆとの相互作用の機能はグリコカリシ
ンの一級構造内の特定の区域によるものと思われること
を示している。
終濃度でＩｔｓ ■−標識のｖＷＦのもとのままのＧ
ＰＩｂへの結合を完全に阻止することができる。結合の
５０％を阻止するのに必要な濃度１ｃｓ。値として示す
）は、７種の異なったグリコカリシンｙ４製品を使って
平均１５０μｇ ／ ｍ ｌであることがわかった。つ
ぎに、モル過剰のジチオトレイ１−ルで処理することに
よってグリコカリシン中に存在するすべての鎖内ジスル
フィド結合を還元し、できたスルフヒドリル基をＳ−カ
ルボキシイミドメチル化で保護した。できた還元および
アルキル化されたグリコカリシンは、リストセチンの存
在でｖ Ｗ Ｆが血小板上のもとのままのＧＰＩｂに結
合するのを阻止する性質を保持していることがわかった
。還元およびアルキル化されたグリコカリシンは、鎖内
ジスルフィド結合による二級構造を失っているので、こ
の実験はｖ Ｗ Ｆとの相互作用の機能はグリコカリシ
ンの一級構造内の特定の区域によるものと思われること
を示している。
もとの分子をトリプシンで処理することによって二つの
グリコカリシンの蛋白質分解切片が得られた。トリプシ
ンは、前もって残基Ａｒｇ−２９０とＡｌａ−２９１の
間またはＡｒｇ−２９３とＴｈｒ−２９４の間でグリコ
カリシンを分解し、二つの切片を生成することがわかっ
た。その一つは４５ｋＤａの見掛けの分子’Ｊ［をもち
、アミン酸残基Ｈｉ ｓ −１からＡｒｇ−２９０また
はＡｒｇ−２９３に達するものである。もう一つは、８
４ｋＤａの見掛けの分子質量で極めて炭水化物に富むＡ
ｌａ−２９１またはＴｈｒ−２９４に始まる分子の中程
のカルボキシル末端を示す。４５ｋＤａの切片は、単鎖
の種および二鎖の種から成る。
グリコカリシンの蛋白質分解切片が得られた。トリプシ
ンは、前もって残基Ａｒｇ−２９０とＡｌａ−２９１の
間またはＡｒｇ−２９３とＴｈｒ−２９４の間でグリコ
カリシンを分解し、二つの切片を生成することがわかっ
た。その一つは４５ｋＤａの見掛けの分子’Ｊ［をもち
、アミン酸残基Ｈｉ ｓ −１からＡｒｇ−２９０また
はＡｒｇ−２９３に達するものである。もう一つは、８
４ｋＤａの見掛けの分子質量で極めて炭水化物に富むＡ
ｌａ−２９１またはＴｈｒ−２９４に始まる分子の中程
のカルボキシル末端を示す。４５ｋＤａの切片は、単鎖
の種および二鎖の種から成る。
後者は、残基Ｌｙｓ−２３７およびＡｌａ−２３８の間
での追加のトリプシン分解によって生成し、ジスルフィ
ド結合に保持されたそれぞれ３５ｋＤａおよび７ ｋＤ
ａの見掛けの分子’ｆｆｌを有する二つのポリペプチド
を得る。単鎖および二鎖の種の相対的な比率は、グリコ
カリシンのトリプシン分解の程度に依存する。１：２０
０ （重量比）の酵素／基体比で１８時間消化したあと
、二鎖の種の方が圧倒的に多かった。
での追加のトリプシン分解によって生成し、ジスルフィ
ド結合に保持されたそれぞれ３５ｋＤａおよび７ ｋＤ
ａの見掛けの分子’ｆｆｌを有する二つのポリペプチド
を得る。単鎖および二鎖の種の相対的な比率は、グリコ
カリシンのトリプシン分解の程度に依存する。１：２０
０ （重量比）の酵素／基体比で１８時間消化したあと
、二鎖の種の方が圧倒的に多かった。
グリコカリシンの４５ｋＤａのトリプシン切片は、分子
質量にもとすいて蛋白質を分離する高圧液体クロマトグ
ラフィー（Ｉｆ Ｐ Ｌ Ｃと略す）およびゲル浸透カ
ラムを使って、自然な条件で精製した。トリプシン消化
に使用した条件のため、４５ｋＤａの切片は主に二鎖の
種から成っていた。この精製されたグリコカリシンの蛋
白質分解切片がｖ Ｗ Ｆの血小板ＧＰＩｂへの結合の
阻止能力の試験に使用された。４５ｋＤａ切片は、約３
．５μＭのＩＣ，。でｖ Ｗ Ｆの血小板へのすなわち
ＧＰＩｂへのりストセチンの仲介による結合を完全に阻
止した。
質量にもとすいて蛋白質を分離する高圧液体クロマトグ
ラフィー（Ｉｆ Ｐ Ｌ Ｃと略す）およびゲル浸透カ
ラムを使って、自然な条件で精製した。トリプシン消化
に使用した条件のため、４５ｋＤａの切片は主に二鎖の
種から成っていた。この精製されたグリコカリシンの蛋
白質分解切片がｖ Ｗ Ｆの血小板ＧＰＩｂへの結合の
阻止能力の試験に使用された。４５ｋＤａ切片は、約３
．５μＭのＩＣ，。でｖ Ｗ Ｆの血小板へのすなわち
ＧＰＩｂへのりストセチンの仲介による結合を完全に阻
止した。
同様の実験において、グリコカリシンをトリプシンで消
化し、つぎにジスルフィド結合をジチオトレイトールで
還元し、できたスルフヒドリル基をヨードアセトアミド
でＳ−カルボキシイミドメチル化した。つぎに、３５ｋ
Ｄａのアミノ末端の切片をゲル浸透ＨＰＬＣで精製し、
ｖ Ｗ Ｆの血小板のＧＰＩｂへの結合に対する阻止効
果を試験した。そのＩＣｓ。は、もとの未還元の４５ｋ
Ｄａの切片のそれと類似の値であることがわかった。全
グリコカリシンで得られた結果によって、この結果はグ
リコカリシンのアミノ末端区域の一級構造がｖＷＦ結合
ドメインを含み、その機能は分子のもとの三次元構造の
保持には依存しないことを確証している。
化し、つぎにジスルフィド結合をジチオトレイトールで
還元し、できたスルフヒドリル基をヨードアセトアミド
でＳ−カルボキシイミドメチル化した。つぎに、３５ｋ
Ｄａのアミノ末端の切片をゲル浸透ＨＰＬＣで精製し、
ｖ Ｗ Ｆの血小板のＧＰＩｂへの結合に対する阻止効
果を試験した。そのＩＣｓ。は、もとの未還元の４５ｋ
Ｄａの切片のそれと類似の値であることがわかった。全
グリコカリシンで得られた結果によって、この結果はグ
リコカリシンのアミノ末端区域の一級構造がｖＷＦ結合
ドメインを含み、その機能は分子のもとの三次元構造の
保持には依存しないことを確証している。
これらの知見にもとすき、１５個のアミノ酸残基を含む
、グリコカリシンの全４５ ｋＤａアミノ末端切片の配
列を示す重複ペプチドが合成された。
、グリコカリシンの全４５ ｋＤａアミノ末端切片の配
列を示す重複ペプチドが合成された。
下記のペプチドが０．５ ｍ Ｍ以上のＩＣ６゜値でｖ
ＷＦの血小板のＧＰＩｂへの結合を阻止することがわか
った（−文字の記号がアミノ酸残基の同定に使用される
）：ＤＫＲＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ｉ ＮＬＴ
ＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ［。
ＷＦの血小板のＧＰＩｂへの結合を阻止することがわか
った（−文字の記号がアミノ酸残基の同定に使用される
）：ＤＫＲＮＬＴＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ｉ ＮＬＴ
ＡＬＰＰＤＬＰＫＤＴＴ ［。
ＰＰＤＬＰＫＤＴＴＩＬＨＬＳＥ（この三つのペプチド
はグリコカリシンの残基Ａｓｐ−１３とＧＩｕ−４０の
間の配列をカバーする）；ＰＯＬＬＴＰＴＰＫＬＥＫＬ
ＳＬ （残基Ｐｒｏ−１４１ないしＬｅｕ−１５５）；
ＫＱＧＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡＳ （残基Ｌｙｓ−２３
１ないし５ｅｒ−２４５）ｉＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥ
ＤＴＥ、ＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲＴＶ （こ（Ｄ二
つのペプチドは残１ｃｌｙ ２７１とＶ（１３） ２
９５（７）ｆｕＩ（Ｄ配列をカバーする）。従って、こ
の結果は、ｖＷＦ結合に機能上の関係を持つグリコカリ
シンのアミノ末端区域内に多重ドメインの存在すること
を明確に示している。
はグリコカリシンの残基Ａｓｐ−１３とＧＩｕ−４０の
間の配列をカバーする）；ＰＯＬＬＴＰＴＰＫＬＥＫＬ
ＳＬ （残基Ｐｒｏ−１４１ないしＬｅｕ−１５５）；
ＫＱＧＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡＳ （残基Ｌｙｓ−２３
１ないし５ｅｒ−２４５）ｉＧＤＴＤＬＹＤＹＹＰＥＥ
ＤＴＥ、ＥＥＤＴＥＧＤＫＶＲＡＴＲＴＶ （こ（Ｄ二
つのペプチドは残１ｃｌｙ ２７１とＶ（１３） ２
９５（７）ｆｕＩ（Ｄ配列をカバーする）。従って、こ
の結果は、ｖＷＦ結合に機能上の関係を持つグリコカリ
シンのアミノ末端区域内に多重ドメインの存在すること
を明確に示している。
阻止作用を示す長いペプチドの重複ｔｉＪＩ域に相当す
る配列を持った短いペプチドも合成された。この短いペ
プチドのうち二つが阻止作用を持つことがわかった。そ
れらの配列は： ＰＰＤＬＰＫＤＴＴ（グリコカリシン
の残基Ｐｒｏ−６ないしＴｈｒ−３４）、およびＥＥＤ
ＴＥ （残基Ｇｌｕ−２８１ないしＧｌｕ−２８５）。
る配列を持った短いペプチドも合成された。この短いペ
プチドのうち二つが阻止作用を持つことがわかった。そ
れらの配列は： ＰＰＤＬＰＫＤＴＴ（グリコカリシン
の残基Ｐｒｏ−６ないしＴｈｒ−３４）、およびＥＥＤ
ＴＥ （残基Ｇｌｕ−２８１ないしＧｌｕ−２８５）。
この２つのペプチドは別々に試験すると０．５ ｍ Ｍ
より大きいＩＣｓ。
より大きいＩＣｓ。
値を持っていた。しかし、０．５ ｍ Ｍの濃度でこれ
らを組み合わせると、ｖＷＦのＧＰＩｂへの結合を完全
に阻止した。この実験は、グリコカリシンの一級配列内
の異なった隣接していないドメインが高い活性をもって
ｖ Ｗ Ｆ結合活性を示すのに共同して関与しているこ
とを示している。それゆえ、グリコカリシンの４５ｋＤ
ａアミノ末端トリプシン切片の配列ならびにそのサブセ
ット（前述の通り）は、ｖ Ｗ ＦのＧＰＩｂへの結合
を阻止することのできる分子を設計するのに有用な情報
を含んでいる。
らを組み合わせると、ｖＷＦのＧＰＩｂへの結合を完全
に阻止した。この実験は、グリコカリシンの一級配列内
の異なった隣接していないドメインが高い活性をもって
ｖ Ｗ Ｆ結合活性を示すのに共同して関与しているこ
とを示している。それゆえ、グリコカリシンの４５ｋＤ
ａアミノ末端トリプシン切片の配列ならびにそのサブセ
ット（前述の通り）は、ｖ Ｗ ＦのＧＰＩｂへの結合
を阻止することのできる分子を設計するのに有用な情報
を含んでいる。
グリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末端トリプシン切片
およびその逐次サブセットのアミノ酸配列に基づ（ペプ
チドは、ホートンら、プロシーディング・オプ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ、第
８２巻、５１３５頁（１９８５年）に記載された方法で
合成した６ペブチドの同相合成の公知の方法では、ベン
ズヒドリルアミンまたはクロルメチル化樹脂（架橋ポリ
スチレンから誘導され、化学品業者から入手できる）の
ような不溶性の支持体から出発して所望のペプチドを組
み立てた。所望のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸
は、α−アミノ窒素および他の反応性部位に保護基を有
しており、公知のペプチド結合法を用いて溶液から樹脂
に結合させる。α−アミノ基の保護基を除去しく他の保
護基はあればそのまま残す）、所望の配列の次のアミノ
酸（適当な保護基をもった）を結合させ、この工程を繰
り返す、所望のペプチドが完全に出来上がったら、樹脂
支持体から解裂させ、すべての保護基を除き、ペプチド
を回収する。適当な保護基の例はα−アミノ基にはα−
ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；システィンのチオ
ール基、アスパラギン酸のβ−カルボン酸基、グルタミ
ン酸のγ−カルボン酸基およびセリン、スレオニンおよ
びチロシンのヒドロキシル基にはベンジル、４−メトキ
シベンジＪしまたは４−メチルベンジルスチジンおよび
トリプトファンの核窒素およびリシンのε−アミノ基に
はベンジルオキシカルボニルまたはその２−クロルまた
は３，４−ジメトキシ誘導体；アスパラギンおよびグル
タミンのアミド窒素にはｐ−ニトロフェニル；そしてア
ルギニンのグアニジン基にはニトロまたはトシルである
。
およびその逐次サブセットのアミノ酸配列に基づ（ペプ
チドは、ホートンら、プロシーディング・オプ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ、第
８２巻、５１３５頁（１９８５年）に記載された方法で
合成した６ペブチドの同相合成の公知の方法では、ベン
ズヒドリルアミンまたはクロルメチル化樹脂（架橋ポリ
スチレンから誘導され、化学品業者から入手できる）の
ような不溶性の支持体から出発して所望のペプチドを組
み立てた。所望のペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸
は、α−アミノ窒素および他の反応性部位に保護基を有
しており、公知のペプチド結合法を用いて溶液から樹脂
に結合させる。α−アミノ基の保護基を除去しく他の保
護基はあればそのまま残す）、所望の配列の次のアミノ
酸（適当な保護基をもった）を結合させ、この工程を繰
り返す、所望のペプチドが完全に出来上がったら、樹脂
支持体から解裂させ、すべての保護基を除き、ペプチド
を回収する。適当な保護基の例はα−アミノ基にはα−
ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；システィンのチオ
ール基、アスパラギン酸のβ−カルボン酸基、グルタミ
ン酸のγ−カルボン酸基およびセリン、スレオニンおよ
びチロシンのヒドロキシル基にはベンジル、４−メトキ
シベンジＪしまたは４−メチルベンジルスチジンおよび
トリプトファンの核窒素およびリシンのε−アミノ基に
はベンジルオキシカルボニルまたはその２−クロルまた
は３，４−ジメトキシ誘導体；アスパラギンおよびグル
タミンのアミド窒素にはｐ−ニトロフェニル；そしてア
ルギニンのグアニジン基にはニトロまたはトシルである
。
ここでは説明のために、容認されているアミノ酸の略記
法を使用する．その完全な一覧表を下記に示す。
法を使用する．その完全な一覧表を下記に示す。
一字及び三字のアミノ酸の略記法
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ システィン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｇ ｃｒｙ グリシン
Ｈ ＩＩ ｉ ｓ ヒスチジン
１ 、 ＩＩｓ イソロイシン
Ｋ Ｌ ｙ ｓ リシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｔ Ｔｈｒ スレオニン
Ｖ Ｖ（１３） バリン
Ｗ Ｔｒｐ ｌ−リブトファン
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｂ Ａｓｘ ＡｓｐまたはＡｓｎ識別不能Ｚ
ＧｌｘＧｌ’ｕまたはＧｌｎ識別不能不能 Ｘ
分析不能または非定形アミノ酸ＧＰＩｂのための完全な
ＣＤＮＡは、ロペッッら、プロシーディング・オプ・ザ
・ナシヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ
，第８４巻、５６１５−５６１９頁（１９８７年）にお
いて測定されている。そのような情報で、４５ｋＤａの
切片からペプチドの表現のために適当なベクトルのなか
へヌクレオチド配列を挿入することができる。
ＧｌｘＧｌ’ｕまたはＧｌｎ識別不能不能 Ｘ
分析不能または非定形アミノ酸ＧＰＩｂのための完全な
ＣＤＮＡは、ロペッッら、プロシーディング・オプ・ザ
・ナシヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ
，第８４巻、５６１５−５６１９頁（１９８７年）にお
いて測定されている。そのような情報で、４５ｋＤａの
切片からペプチドの表現のために適当なベクトルのなか
へヌクレオチド配列を挿入することができる。
一般式（ＫＲ）ｌｌ （ただしｎ＝２−７）のペプチド
およびペプチドＲ．はｖ Ｗ ＦとｃｐＩｂの相互作用
を阻止した。一般式Ｒ．ＲＧＤＶまたは（ＫＲ）ｌＩＲ
ＧＤＶのペプチドは、フィプリノゲンのＧＰＩｌｂ／Ｉ
ｌｌａへの結合をブロックすることが前に示されている
（米国特許第４６８３２９１号「血小板結合阻止剤」）
、後者は、ｖＷＦ−ＧＰ Ｉ ｂ相互作用の阻止にその
（ＫＲ）ｆｉ同族体と同じ効力を持ち、そのため二官能
抗血小板剤の一つの種類を代表する。
およびペプチドＲ．はｖ Ｗ ＦとｃｐＩｂの相互作用
を阻止した。一般式Ｒ．ＲＧＤＶまたは（ＫＲ）ｌＩＲ
ＧＤＶのペプチドは、フィプリノゲンのＧＰＩｌｂ／Ｉ
ｌｌａへの結合をブロックすることが前に示されている
（米国特許第４６８３２９１号「血小板結合阻止剤」）
、後者は、ｖＷＦ−ＧＰ Ｉ ｂ相互作用の阻止にその
（ＫＲ）ｆｉ同族体と同じ効力を持ち、そのため二官能
抗血小板剤の一つの種類を代表する。
ｖ Ｗ Ｆの血小板への、リストセチンで誘導された結
合の、ペプチドによる阻止を試験するために、ホルマリ
ンで固定した血小板を１×１０日／リットルの最終濃度
で使用した。その後、試験するペプチドを種々の濃度で
加えた後、最終量の１７３容量のｖ Ｗ Ｆ不足の血漿
を加え、その後、１２５ Ｉ− ｖ Ｗ Ｆを加えて５
マイクログラム／ ｍ ＋の最終濃度にした。つぎに、
リストセチンを１． ０ ｍ ｇ ／ｍ１の濃度で加え
た．室温で３０分培養した後、５０マイクロリツトルの
その混合物を３００マイクロリツトルの２０％蔗糖を通
して、１２０００×ｇで４分間遠心分離して、結合およ
び遊離のリガンドを分離した．つぎに、血小板ペレット
を混合物の残部から分離し、血小板結合の放射能を測定
した。非特異性結合は、５０倍過剰の未標識ＶＷＦの存
在でただしペプチドの不存在での、Ｉｔｓｒ−ｖ Ｗ
Ｆの残存結合として定義された。
合の、ペプチドによる阻止を試験するために、ホルマリ
ンで固定した血小板を１×１０日／リットルの最終濃度
で使用した。その後、試験するペプチドを種々の濃度で
加えた後、最終量の１７３容量のｖ Ｗ Ｆ不足の血漿
を加え、その後、１２５ Ｉ− ｖ Ｗ Ｆを加えて５
マイクログラム／ ｍ ＋の最終濃度にした。つぎに、
リストセチンを１． ０ ｍ ｇ ／ｍ１の濃度で加え
た．室温で３０分培養した後、５０マイクロリツトルの
その混合物を３００マイクロリツトルの２０％蔗糖を通
して、１２０００×ｇで４分間遠心分離して、結合およ
び遊離のリガンドを分離した．つぎに、血小板ペレット
を混合物の残部から分離し、血小板結合の放射能を測定
した。非特異性結合は、５０倍過剰の未標識ＶＷＦの存
在でただしペプチドの不存在での、Ｉｔｓｒ−ｖ Ｗ
Ｆの残存結合として定義された。
成るペプチドの阻止率は、ペプチドの不在における個々
のｃｐｍを分割して計算した。試験したペプチドのＩＣ
，。（結合を５０％阻止するペプチドの濃度）ば、下記
の通りであった： （ＫＲ）、 ９および１５マイクロモル（２
回の実験） （ＫＲ）、 １３マイクロモル（ＫＲ）ｓ
１２０マイクロモル（ＫＲ）！ ２００マイ
クロモル（ＫＲ）４ＧＤＶ １６マイクロモル（Ｒ）
ｓＧＤＶ ６マイクロモルＹＲＧＤＶ ＞６０
０マイクロモル （阻止は観察されず） 試験した濃度では、どのペプチドでも完全な阻止は見ら
れなかった。
のｃｐｍを分割して計算した。試験したペプチドのＩＣ
，。（結合を５０％阻止するペプチドの濃度）ば、下記
の通りであった： （ＫＲ）、 ９および１５マイクロモル（２
回の実験） （ＫＲ）、 １３マイクロモル（ＫＲ）ｓ
１２０マイクロモル（ＫＲ）！ ２００マイ
クロモル（ＫＲ）４ＧＤＶ １６マイクロモル（Ｒ）
ｓＧＤＶ ６マイクロモルＹＲＧＤＶ ＞６０
０マイクロモル （阻止は観察されず） 試験した濃度では、どのペプチドでも完全な阻止は見ら
れなかった。
アシアロ（ａｓｉ（１３）ｏ） −ｖ Ｗ Ｆの血小板
への結合の阻止を試験するために、新鮮な血小板を使用
した。
への結合の阻止を試験するために、新鮮な血小板を使用
した。
これらは、■１１ミリルのクエン酸三ナトリウムおよび
２ミリモルのＥＤＴＡに血液を入れて調製した。その後
分画遠心で血小板に冨む血漿を調製した０次いで、血小
板のカウントをＩ Ｘ １０”／リットルに調節し、そ
の後、ペプチドを種々の濃度で加え、つぎに”’Ｉ−ｖ
ＷＦを５マイクログラム／ｍｌの最終濃度で加えた。室
温で３０分培養した後、５０マイクロリフ）ルのその混
合物を３００マイクロリツトルの２０％蔗糖を通して、
１２０００ｘｇで４分間遠心分離して、結合および遊離
のリガンドを分離した。つぎに、血小板ペレットを混合
物の残部から分離し、血小板結合の放射能を測定した。
２ミリモルのＥＤＴＡに血液を入れて調製した。その後
分画遠心で血小板に冨む血漿を調製した０次いで、血小
板のカウントをＩ Ｘ １０”／リットルに調節し、そ
の後、ペプチドを種々の濃度で加え、つぎに”’Ｉ−ｖ
ＷＦを５マイクログラム／ｍｌの最終濃度で加えた。室
温で３０分培養した後、５０マイクロリフ）ルのその混
合物を３００マイクロリツトルの２０％蔗糖を通して、
１２０００ｘｇで４分間遠心分離して、結合および遊離
のリガンドを分離した。つぎに、血小板ペレットを混合
物の残部から分離し、血小板結合の放射能を測定した。
非特異性結合は、５０倍過剰の未標識ｖ Ｗ Ｆの存在
でただしペプチドの不存在での ＋ｘｓ■−アシアロー
ｖ Ｗ Ｆの残存結合として定義された。
でただしペプチドの不存在での ＋ｘｓ■−アシアロー
ｖ Ｗ Ｆの残存結合として定義された。
成るペプチドの阻止率は、種々の濃度のペプチドを加え
た時に得られる個々のｃｐｍをペプチド不在のときのｃ
ｐｍで割って計算した。試験したペプチドのＩＣｓ。（
結合を５０％阻止するペプチドの濃度）は、下記の通り
であった： （ＫＲ）、 １．５マイクロモル（ＫＲ）ｓ
１．７マイクロモル（ＫＲ）３ ２
３ マイクロモル（ＫＲ）、ＧＤｖ １５ マイクロ
モル（Ｒ）ｓＧ Ｄ Ｖ ３．５ フィクロモル
（Ｒ）、１ ７ マイクロモル完全な阻止
は下記の濃度で見られた： （ＫＲ）ｆｆ １２及び１５マイクロモル（Ｋ
Ｒ）ｓ ６及び７マイクロモル（ＫＲ）３
６０及び１２０マイクロモル（Ｋ Ｒ）４Ｇ Ｄ
Ｖ ４４ フィクロモル（Ｒ）。ＧＤＶ ２４
マイクロモルリストセチンで誘導される血小板の凝固の
ペプチドによる阻止は、洗浄した血小板を使って評価し
た。血小板は、トラパニーロンバルドら、ジャ二ナル・
オプ・クリニカル・インベスティゲーション、第７６巻
、１９５０−１９５８ （１９８５年）に記載された方
法で調製子、３Ｘ１０”の最終濃度に調整した０種々の
濃度のペプチドと０゜８マイクログラムの最終濃度に調
整した精製ｖＷＦを血小板と一緒に３７℃で５分間培養
した。その後、リストセチンを１． Ｏｍ ｇ ／ ｍ
＋の最終濃度で加えた０反応混合物は、シリコン処理
したガラスキュベツト中で調製した後、１２００ｒｐｍ
で血小板懸濁液を絶えず撹拌しながら３７℃のルミ凝集
計（フロノロラグ社製）中に置いた。ａ集は、撹拌され
ている血小板懸濁液の光透過率の増加を監視して定量し
た。
た時に得られる個々のｃｐｍをペプチド不在のときのｃ
ｐｍで割って計算した。試験したペプチドのＩＣｓ。（
結合を５０％阻止するペプチドの濃度）は、下記の通り
であった： （ＫＲ）、 １．５マイクロモル（ＫＲ）ｓ
１．７マイクロモル（ＫＲ）３ ２
３ マイクロモル（ＫＲ）、ＧＤｖ １５ マイクロ
モル（Ｒ）ｓＧ Ｄ Ｖ ３．５ フィクロモル
（Ｒ）、１ ７ マイクロモル完全な阻止
は下記の濃度で見られた： （ＫＲ）ｆｆ １２及び１５マイクロモル（Ｋ
Ｒ）ｓ ６及び７マイクロモル（ＫＲ）３
６０及び１２０マイクロモル（Ｋ Ｒ）４Ｇ Ｄ
Ｖ ４４ フィクロモル（Ｒ）。ＧＤＶ ２４
マイクロモルリストセチンで誘導される血小板の凝固の
ペプチドによる阻止は、洗浄した血小板を使って評価し
た。血小板は、トラパニーロンバルドら、ジャ二ナル・
オプ・クリニカル・インベスティゲーション、第７６巻
、１９５０−１９５８ （１９８５年）に記載された方
法で調製子、３Ｘ１０”の最終濃度に調整した０種々の
濃度のペプチドと０゜８マイクログラムの最終濃度に調
整した精製ｖＷＦを血小板と一緒に３７℃で５分間培養
した。その後、リストセチンを１． Ｏｍ ｇ ／ ｍ
＋の最終濃度で加えた０反応混合物は、シリコン処理
したガラスキュベツト中で調製した後、１２００ｒｐｍ
で血小板懸濁液を絶えず撹拌しながら３７℃のルミ凝集
計（フロノロラグ社製）中に置いた。ａ集は、撹拌され
ている血小板懸濁液の光透過率の増加を監視して定量し
た。
ペプチドのＩＣ口（凝集曲線の最初の傾斜の減少率とし
て判断されるａ集を５０％阻止する濃度）は下記のよう
であった： （ＫＲ）ｆｆ ３マイクロモル（ＫＲ）ｓ
５０マイクロモル （ＫＲ）３ ２５０マイクロモル １（１０マイクロモルの濃度では、下記のペプチドが下
記の程度に′ａ集を阻止した： （ＫＲ）、 ８２％阻止 （ＫＲ）ｓ ５０％阻止 （ＫＲ）！ を為な阻止なし くＲ）＠ＧＤＶ ７０％阻止 アシアロ−ｖＷＦで誘導される凝集の阻止は、 ′１１
ミリモルのクエン酸三ナトリウム凝集剤に入れた血液の
分画遠心によって調製した血小板に冨む血漿を使って測
定した。血小板のカウントは、３Ｘ１０”／リットルに
調節した。５５マイクロモルのペプチドを、血小板に富
む血漿と一緒に、３７℃で５分間培養した。つぎに、ア
シアロ−ＶＷＦを１５マイクログラム／ｍ＋の最終濃度
で加えた０反応部合物は、シリコン処理したガラスキュ
ベツト中で調製し、つぎに１２０Ｏｒｐｍで血小板懸濁
液を絶えず撹拌しながら３７℃のルミ凝集計（クロノロ
ソゲ・コーポレーション）中に置いた。凝集は、撹拌さ
れている血小板懸濁液の光透過率の増加を監視して定量
した。
て判断されるａ集を５０％阻止する濃度）は下記のよう
であった： （ＫＲ）ｆｆ ３マイクロモル（ＫＲ）ｓ
５０マイクロモル （ＫＲ）３ ２５０マイクロモル １（１０マイクロモルの濃度では、下記のペプチドが下
記の程度に′ａ集を阻止した： （ＫＲ）、 ８２％阻止 （ＫＲ）ｓ ５０％阻止 （ＫＲ）！ を為な阻止なし くＲ）＠ＧＤＶ ７０％阻止 アシアロ−ｖＷＦで誘導される凝集の阻止は、 ′１１
ミリモルのクエン酸三ナトリウム凝集剤に入れた血液の
分画遠心によって調製した血小板に冨む血漿を使って測
定した。血小板のカウントは、３Ｘ１０”／リットルに
調節した。５５マイクロモルのペプチドを、血小板に富
む血漿と一緒に、３７℃で５分間培養した。つぎに、ア
シアロ−ＶＷＦを１５マイクログラム／ｍ＋の最終濃度
で加えた０反応部合物は、シリコン処理したガラスキュ
ベツト中で調製し、つぎに１２０Ｏｒｐｍで血小板懸濁
液を絶えず撹拌しながら３７℃のルミ凝集計（クロノロ
ソゲ・コーポレーション）中に置いた。凝集は、撹拌さ
れている血小板懸濁液の光透過率の増加を監視して定量
した。
ペプチドによるｉｆｆの阻止は下記のようであった；
（ＫＲ）ｔ １００％阻止
（ＫＲ）５ ８８％阻止
（ＫＲ）ｌ 有為な阻止なし
くＲ）ｓＧＤＶ ９２％阻止
代 理 人 新実健部（外１名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）血小板膜糖蛋白質 I ｂおよび血小板膜糖蛋白質
I ｂに関連した分子または他の細胞および細胞マトリ
ックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を阻止す
る下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 から選ばれたグリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末端ト
リプシン切片のペプチド。 （２）血小板膜糖蛋白質 I ｂおよび血小板膜糖蛋白質
I ｂに関連した分子または他の細胞および細胞マトリ
ックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を阻止す
る下記のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 から選ばれたグリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末端ト
リプシン切片の逐次サブセット。 ３）【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、 【遺伝子配列があります】、およびＥＥＤＴＥから成る
ペプチドの群から選ばれた血小板膜糖蛋白質 I ｂおよ
び血小板膜糖蛋白質 I ｂに関連した分子または他の細
胞および細胞マトリックスへのフォン・ヴィレプラント
因子の結合を阻止するペプチド。 （４）ペプチド内にアミノ酸の逐次サブセットおよびそ
の誘導体を含む請求項３のペプチド。 （５）血小板膜糖蛋白質 I ｂおよび血小板膜糖蛋白質
I ｂに関連した分子または他の細胞および細胞マトリ
ックスへのフォン・ヴィレプラント因子の結合を阻止す
る一般式（ＫＲ）＿ｎ〔但し、ｎ＝２−１０〕およびＲ
＿ｎ〔但し、ｎ＝２−２０〕を有するペプチド。 （６）血小板同士の凝集を阻止するのに有効な量の請求
項１のペプチドと血小板を接触させることを特徴とする
血小板同士の凝集を阻止する方法。 （７）血栓症を阻止するのに有効な量の請求項１のペプ
チドを患者に投与することを特徴とする患者の血栓症を
阻止する方法。 （８）血小板を、請求項２のグリコカリシンの４５ｋＤ
ａアミノ末端トリプシン切片の逐次サブセットと接触さ
せるものであって、上記トリプシン切片の逐次サブセッ
トの量が血小板同士の凝集を阻止するのに有効な量であ
ることを特徴とする血小板同士の凝集を阻止する方法。 （９）請求項２のグリコカリシンの４５ｋＤａアミノ末
端トリプシン切片の逐次サブセットを患者に投与するも
のであって、上記トリプシン切片の逐次サブセットの量
が血栓症を阻止するのに有効な量であることを特徴とす
る患者の血栓症を阻止する方法。 （１０）血小板を、血小板同士の凝集を阻止するのに有
効な量の、請求項３のペプチドと接触させることを特徴
とする血小板同士の凝集を阻止する方法。 （１１）血栓症を阻止するのに有効な量の請求項３のペ
プチドを患者に投与することを特徴とする患者の血栓症
を阻止する方法。 （１２）血小板を、血小板同士の凝集を阻止するのに有
効な量の、請求項４のペプチドと接触させることを特徴
とする血小板同士の凝集を阻止する方法。 （１３）血栓症を阻止するのに有効な量の請求項４のペ
プチドを患者に投与することを特徴とする患者の血栓症
を阻止する方法。 （１４）血栓症を阻止するのに有効な量の請求項５のペ
プチドを患者に投与することを特徴とする患者の血栓症
を阻止する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12145487A | 1987-11-17 | 1987-11-17 | |
| US121454 | 1987-11-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01221394A true JPH01221394A (ja) | 1989-09-04 |
Family
ID=22396842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63291065A Pending JPH01221394A (ja) | 1987-11-17 | 1988-11-15 | 血小板膜糖蛋白質Ｉｂへのフォン・ヴィレブラント因子の結合を阻子する蛋白質分解切片および合成ペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0317278A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01221394A (ja) |
| KR (1) | KR890008169A (ja) |
| AU (1) | AU626813B2 (ja) |
| DK (1) | DK639988A (ja) |
| FI (1) | FI885303L (ja) |
| IL (1) | IL88308A0 (ja) |
| NO (1) | NO885108L (ja) |
| NZ (1) | NZ226964A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077990A1 (ja) | 2006-01-06 | 2007-07-12 | Keio University | 薬物運搬体 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340727A (en) * | 1987-11-17 | 1994-08-23 | The Scripps Research Institute | GPIbα fragments and recombinant DNA expression vectors |
| US5332726A (en) * | 1989-09-29 | 1994-07-26 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Antithrombotic peptides and pseudopeptides |
| JPH05504470A (ja) * | 1989-10-20 | 1993-07-15 | ニューイングランド・メディカル・センター・ホスピタルズ・インコーポレーテッド | Ｐａｄｇｅｍを介した細胞結合の阻害 |
| US6008193A (en) * | 1990-03-02 | 1999-12-28 | Bio-Technology General Corp. | Methods of using human von Willebrand factor GPIb binding domain polypeptides |
| US5849536A (en) * | 1990-03-02 | 1998-12-15 | Bio-Technology General Corp. | Cloning and production of human von willebrand factor GPIb binding domain polypeptides and methods of using same |
| US5064814A (en) * | 1990-04-05 | 1991-11-12 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Anti-thrombotic peptide and pseudopeptide derivatives |
| US5342830A (en) * | 1990-11-16 | 1994-08-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
| US5317097A (en) * | 1991-10-07 | 1994-05-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Mutations in the gene encoding the α chain on platelet glycoprotein IB |
| US5298239A (en) * | 1991-10-07 | 1994-03-29 | The Research Foundation Of State University Of New York | Mutations rendering platelet glycoprotein IB α less reactive |
| US5427939A (en) * | 1992-01-06 | 1995-06-27 | The Scripps Research Institute | Expression vectors encoding alloantigens of glycoprotein Ibα |
| WO1993016712A1 (en) * | 1992-02-26 | 1993-09-02 | The Scripps Research Institute | MUTANT GPIbα FRAGMENTS AND RECOMBINANT EXPRESSION THEREOF |
| AR035779A1 (es) | 2001-02-06 | 2004-07-14 | Genetics Inst Llc | Polipeptidos de fusion derivados de glicoproteina ib alfa de plaqueta y metodos de uso de los mismos |
| AU2004247737B2 (en) | 2003-06-11 | 2009-04-23 | Wyeth | Platelet glycoprotein IB alpha variant fusion polypeptides and methods of use thereof |
| DE102007031708A1 (de) | 2007-07-06 | 2009-01-08 | Dade Behring Marburg Gmbh | Bestimmung der von Willebrand Faktor-Aktivität in Abwesenheit von Ristocetin |
-
1988
- 1988-11-07 IL IL88308A patent/IL88308A0/xx unknown
- 1988-11-14 NZ NZ226964A patent/NZ226964A/en unknown
- 1988-11-15 JP JP63291065A patent/JPH01221394A/ja active Pending
- 1988-11-16 AU AU25605/88A patent/AU626813B2/en not_active Ceased
- 1988-11-16 NO NO88885108A patent/NO885108L/no unknown
- 1988-11-16 KR KR1019880015143A patent/KR890008169A/ko not_active Withdrawn
- 1988-11-16 EP EP88310799A patent/EP0317278A3/en not_active Withdrawn
- 1988-11-16 DK DK639988A patent/DK639988A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-16 FI FI885303A patent/FI885303L/fi not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077990A1 (ja) | 2006-01-06 | 2007-07-12 | Keio University | 薬物運搬体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL88308A0 (en) | 1989-06-30 |
| FI885303A0 (fi) | 1988-11-16 |
| NO885108L (no) | 1989-05-18 |
| AU2560588A (en) | 1989-05-18 |
| DK639988A (da) | 1989-05-18 |
| NO885108D0 (no) | 1988-11-16 |
| FI885303A7 (fi) | 1989-05-18 |
| DK639988D0 (da) | 1988-11-16 |
| KR890008169A (ko) | 1989-07-10 |
| NZ226964A (en) | 1991-08-27 |
| FI885303L (fi) | 1989-05-18 |
| AU626813B2 (en) | 1992-08-13 |
| EP0317278A2 (en) | 1989-05-24 |
| EP0317278A3 (en) | 1989-11-23 |
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