JPH01223352A - 固相酵素免疫検定システムおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 〔発明の分野〕 本発明は、臨床試料中の抗体または抗原の存在を判定す
るための免疫化学システムおよび方法に関し、酵素結合
免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ　）として知られている処
理法に最も密接に関連する。

〔従来の技術〕

免疫学の科学においては、これまで疾病発見のために多
数の方法が開発されてきており、これらの方法の多くは
、抗原は動物の中に導入されたとき検出可能な免疫反応
を生ぜしめる物質であるという知１に基いている。その
抗原の導入に反応して体は抗体を産生ずる。この抗体は
該抗体の産生を刺激した抗原と結合する能力を有するよ
うな蛋白質である。したがって、このような抗原または
抗体に対する体の反応は、動物が特定の疾病ないしは疾
患に罹っているかまたは罹ったことがあるかを決定する
ことができる。人の血清中に抗体が存在すると確認され
れば、その人は特定のタイプの抗原にさらされたことが
あると結論できる。本発明者のうちの３人による先行特
許出願、特願昭６２−２０３６１４号、「固相酵素免疫
検定法システムおよび処理方法」は、この医学的事実を
認識し、疾病検出のための装置および方法を提供してい
る。

上に引用した本発明者の特許出願は、次の１１個のカテ
ゴリーにおける臨床実務の抗原および抗体の検出のため
の試験を明らかにしている。

１）免疫拡散法、　２）電気泳動および免疫電気泳動法
、　３）免疫化学および物理化学方法、４）放射性免疫
検定法、　５）免疫組織化学的技術、　６）凝集、　７
）袖体結合、　８）免疫蛍光法、　９）沈降、　１０）
ウィルス中和法、および　１１　）　ＥＬＩＳＡ、この
先行特許出願は、抗体または抗原の検出に関するこれま
で多数の方法および装置について議論しており、これら
はそれぞれ解析のための視覚的記録を生じさせる。これ
らの引用のうちのあるもののと同様に、前記先行特許出
願および本出願は好ましい支持体としてニトロセルロー
ス（ｎｉｔｒｏｅｅｌ　１ｕｌｏｓｅ）を使用する。

ニトロセルロースの膜は、比較的に安く、使用が簡単で
、４℃で約１２箇月という長い貯蔵寿命を有するという
点で、現在量も広く使用されている蛋白質プロッティン
グのための転移媒体であるが、支持体に対するニトロセ
ルロース保持体の固定が実際には問題を生じさせること
が分った。前記先行特許出願においては、両面テープが
好ましいアタッチメント構成として認められた。実際に
は、このような使用から汚染が生じ得ることが分つた。

本発明は、選択されたニトロセルロース保持体をプラス
チックの支持体へ熱ボンディングすることによりこの問
題を解決する。前記熱ボンディング・プロセスにおいて
、ＤＮＡのニトロセルロースへの結合に影響を与えるこ
ととなるようにニトロセルロースの物理特性に影響を与
えないように、制御された圧力および温度条件下で材料
のボンディングないしは溶接が行われる。蛋白質ニトロ
セルロース結合の正確な性質は未だ充分に分っていない
が、疎水性およびイオン相互作用や水素結合を含む幾つ
かの異なった要因の結果のように思われる。そして、そ
れ故、前記熱ボンディング・プロセスはニトロセルロー
スへの蛋白質の結合を受け入れる該ニトロセルロースの
能力の崩壊なしに前記ニトロセルロース保持体および支
持体の溶解および流動を生じさせるものでなければなら
ない。この熱ボンディングφプロセスは、本発明におい
て、プラスチック支持体で支持されたニトロセルロース
を「スティック保持体」として構成するために選択され
、前記ニトロセルロース保持体はある抗原および対照の
点を受け入れてそこで乾燥させる。

上述のように、前記引用された先行発明および本発明の
両方は、それぞれ免疫化学技術に分類される蛋白質ドツ
トΦブロッティング争システムに関し、さらに詳しくは
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ　）に関する。過
去数年に渡って、固体保持体への蛋白質プロッティング
は、広範囲な問題を解決するための試験を提供するため
にますます使用されて来ている。このような問題は、種
々の抗原および抗血清のスクリーニングに加えて、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡ結合蛋白質、糖蛋白質の識別を含む。加
うるに、ゲル−マトリックスから取られた分画された蛋
白質から蛋白質プロッティングをするためにニトロセル
ロース膜を使用することは一般的であった。そして、最
近は、ニトロセルロースは蛋白質試料を直接波ニトロセ
ルロースに点付け（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）するために使用
されて来た。この手順は、一般に、蛋白質スポツティン
グまたは、本発明におけるように、ドツト免疫結合と呼
ばれており、この手順は、前述のようなスポツティング
手順において蛋白質懸濁液の測定されたアリクウォット
が膜の表面に直接付けられ、護膜に吸収されるという点
で、従来のゲル・マトリックスからの蛋白質プロッティ
ングとは異なる。対照的に、ゲル・マトリックスからの
蛋白質プロッティングは、固定化蛋白質を含む分画ゲル
・マトリックスをニトロセルロース膜に直接接触して置
き、毛管作用によりゲル・マトリックスから蛋白質を転
移させることを含み、しばしば数時間から数日という長
時間を必要とする。

本発明のドツト免疫結合技術は、ある測定された量の蛋
白質溶液を点としてニトロセルロース膜の表面に付ける
ことからなる。その後、このような膜は、好ましくは遮
断反応を受ける。この遮断反応においては、試験されて
いる蛋白質以外の蛋白質に対する蛋白質結合を阻止する
ために作用物質が膜に付けられる。遮断後、点付けされ
た膜は、護膜を抗原−抗体反応状態に置くことによって
特異抗体の検出に使用される。従来の抗体検出手順につ
いての論議は前記先行特許出願、特願昭６２−２０３６
１４号に述べられている。

本発明および前記先行出願は、蛋白質ドツト免疫結合技
術に向けられている。これらはそれぞれ固定化ニトロセ
ルロース膜を浸漬スティックないしはスティック保持体
の形でユニークに使用する。

本発明および前記先行出願は、陽性反応を識別する色度
物は可溶性でなくて不溶性であるという点で他のＥＬＩ
ＳＡ法と異なり、かつそれぞれ全血を試験することがで
きる。加えるに、本発明がユニークなことには、本発明
のスティック保持体構成は、膜の取り扱いを含めて免疫
化学反応がより容易に遂行されるようにする。選択され
たニトロセルロース膜を支持体に厳密に制御して熱ボン
ディングすることにより、完成されたスティック保持体
は以前に行われていた粘着ボンディング方法において起
こり得た汚染を生じない。さらにユニークなことには、
本発明は前記先行発明と同様に、試薬中でのスティック
保持体のインキュベーション期間を、従来の標準的な３
０分に比較して非常に短くするシステムを提供する。ま
たユニークなことには、本発明は、錠剤化されていて、
使用準備のとき再構成されるようになっており、したが
って液体試薬よりずっと長い貯蔵寿命を有する試薬の使
用を含む。本発明はまた、ユニークな改良された「ステ
ィック」ホルダーおよび該ホルダーとともに使用する容
器構造を使用する。最後に、本発明のシステムはインキ
ュベーション間において改良された洗浄段階を採用する
。

したがって、本発明は、試験を行う医者のオフィスの設
備環境において多数の異なる抗原に対する抗体の存在を
単一の処理で試験するために使用するための、より有効
で信頼できる血清試験システムを提供する。

発明の要約 抗体を検出するための改良された固相酵素免疫検定試験
装置および方法における本発明の主な目的は、比較的短
い時間のうちに臨床試料中の種々様々な特異抗体の存在
を正確にかつ信頼できるように検出するための装置およ
び方法を提供することである。

本発明の他の目的は、試験装置として、堅い支持体に熱
ボンディングによって装着され、複数の特異抗原の点が
そこに別々に固定される多孔性膜を提供することであり
、前記特異抗原の点は順次行われる異なった免疫化学試
薬中におけるインキュベーションおよびこれらのインキ
ュベーション間の洗浄の後、色を変化することにより特
異抗体の存在にそれぞれ反応し、それによって特異抗体
の存在を視覚的に指示する。

本発明の他の目的は、好ましくは薄いＮａＣ１溶液の添
加によって活性化され、インキュベーション段階がその
中で順次行われるところの再構成された試薬を構成する
こととなる長寿命な錠剤化された試薬を提供することで
ある。

本発明のさらに他の目的は、インキュベーション間の洗
浄段階において使用するための渦洗浄（ｖｏｒｔｅｘ　
ｗａｓｈ　）装置を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、医者のオフィスの設備環境
において臨床試料中の複数の特異抗体の存在を短時間で
同時に検出するための改良された装置および方法を提供
することである。

本発明は臨床試料から幾つかの異なった抗原に対する抗
体の存在を同時に検出するための改良された酵素結合ド
ツト・プロット免疫検定法技術である。本発明の改良さ
れた装置は、熱ボンディングによってプラスチック支持
体に固定される多孔性膜、好ましくはニトロセルロース
を含む。このような熱ボンディングにおいては、ある時
間に渡るニトロセルロースおよびプラスチックの接触圧
力および温度は、ニトロセルロースおよびプラスチック
の間に丁度流動を生じさせ、ニトロセルロースの物理特
性の変化を生じさせることなく該ニトロセルロースおよ
びプラスチックの層を溶接するように厳密に制御される
。熱ボンディングの前に、前記支持体は、窓として役立
ち、それらを通して前記多孔性膜を露出する穴を間隔を
おいて形成される。ボンディングの後、精製された抗原
の列が多孔性ニトロセルロース膜上にドツト・ブロツト
されて乾燥され、各点（ドツト）は前記分離、された窓
ないしは区画の１つのほぼ中心に位置される。免疫ドツ
トされた固定化膜を装着したスティック保持体は、それ
故、浸漬スティックのやり方で使用されるために、一端
部において保持されるように形成される。このように構
成されて、前記スティック保持体は、臨床試料から前記
精製された抗原の点の色変化として抗体を検出するため
に、薄いＮａＣ１による洗浄を挾んで、所定の試薬に次
々と浸される。この検出を行うために、３回の５分間の
インキュベーション段階が必要とされる。これらのイン
キュベーション段階のすべては周囲温度で行われる。前
記順次行われるインキュベーションは、錠剤化された試
薬をそれぞれ受け入れる３つの別々の容器で行われる。

前記試薬は、それぞれ好ましくはＮａＣ１溶液の導入に
よって活性化される。各容器は次にスティック保持体の
ニトロセルロース膜端部を挿入され、その後、スティッ
ク保持体の膜端部は渦洗浄を受ける。

本発明の方法の実施において、第一の容器は、ＮａＣ１
溶液および臨床試料からの血漿、血清、または全血のう
ちのいずれかの１滴と混合することによって活性化ない
しは再構成される錠剤形状の標本試料希釈剤を収容する
。前記スティック保持体は５分間のインキュベーション
期間の間この希釈剤および試料の中に挿入され、この期
間の間に、臨床試料に存在するある抗体が前記抗原の点
のうちのあるものに結合する。薄いＮａＣ１溶液を収容
したシールされる渦管（ｖｏｒｔｅｘ　ｔｕｂｅ　）に
スティック保持体を挿入し、そこで渦形式の洗浄を行っ
た後、スティック保持体は第二の容器に挿入される。こ
の第二の容器は、好ましくは、錠剤化された形で、アル
カリホスファターゼを接合された抗ヒト免疫グロブリン
Ｇを収容する。スティック保持体の挿入の前に、この錠
剤はＮａＣ１溶液を導入し混合することによって再構成
される。

このインキュベーション段階の間、酵素接合体は前記第
一段階の間に臨床試料から吸収された抗体に結合する。

同一または新しいＮａＣ１溶液を収容した渦管を使用し
てもう１同局洗浄した後、スティック保持体の膜端部は
、好ましくはアルカリホスファターゼに対する色素産生
性基質を、好ましい量および濃度のＮａＣ１溶液を混合
することによって再構成される錠剤化形状で収容する最
後の第三の容器に浸される。スティック支持体の膜端部
をそこに浸されて、前記アルカリホスファターゼ酵素は
、結合酵素接合体の部位において、可溶性の色素産生の
基質を多孔性ニトロセルロース膜に結合する色のついた
不溶解性の産物に変える。

それによって、前記結合産物はそれぞれニトロセルロー
ス膜表面上に色点として現われる。色点かないことは、
臨床試料中に特異抗体がないことを示す。

実際、本発明の改良された酵素結合ドツト・プロット検
定法の適用は、短時間のうちに実施できる単一の処理で
、様々な抗原に対する抗体の存在を堅実に、正確に、か
つ同時に識別することが分った。

臨床試料において特異抗原に対する抗体を検出するため
の改良された固相酵素免疫検定試験装置およびその使用
方法における本発明の前記目的および特徴並びに他の目
的および特徴は、添附図面と関連して本発明が詳細に述
べられる以下の記述によってさらに充分に明らかになる
であろう。

発明の詳細な明 本発明においては、幾つかの異なる抗原に対する特異抗
体を単一の臨床試料から単一の試験方法において同時に
検出できる。第２図に示されるようにこの試験方法は、
好ましくは、ドツト免疫結合された精製された抗原の列
を配列されるスティック保持体１０を採用する。前記ス
ティック保持体１０は第１図に示されるように支持体１
１を含み、この支持体１１は、好ましくは、間隔を置い
て形成された丸いかまたは楕円形の窓１２の列を有する
約４０ミル厚の堅いプラスチックからなる長い長方形の
薄い小片である。前記窓１２は好ましくは１３において
直角から内方に約１５度に斜面を付けられ、下端部１１
ａから間隔を置いて配列される。個々の窓は、護憲に付
けられた特定の抗原の点を１別するに好適なようにそれ
ぞれ該窓の下に文字を付けられて示されている。

多孔性膜１４、好ましくはニトロセルロースは、第１図
に示されるように熱ボンディングにより支持体１１に取
り付けられて、スティック保持体１０を形成する。この
熱ボンディングψプロセスにおいて、支持体１１および
膜１４は、該支持体１１および膜１４の表面の接合部に
僅かな溶解を生じさせるように厳密に制御された圧力お
よび温度において短い時間の間圧若される。前記溶解は
、転移膜として役立つニトロセルロースの能力に影響を
与えることとなるようにニトロセルロース膜の物理特性
を崩壊させることなく、該ニトロセルロースおよびプラ
スチックの層を溶接するに丁度充分である。実際には、
好ましい熱ボンディングを提供するために、ニトロセル
ロース膜およびポリ塩化ビニルの支持体に対して、前記
層は、約華氏２２０度±２０度の温度および約３０ポン
ド／ｌｎ　　±３ポンド／ｉｎ２の圧力を約１秒±０゜
・　　２ ２秒の間受ける。しかしながら、他の膜材料または異な
るプラスチック支持体が使用されるならば、好ましい熱
ボンディング温度および圧力は該特定の材料に対し、１
１整されなければならないであろう。

第１図および２図においてＰ、　Ｎ、　Ｗ、　Ｘ、　Ｙ
および２として示される文字１５が、好ましくは、特定
の窓１２ないしは該窓内の点を識別するために各窓１２
の下に位置されて支持体１１に形成される。スティック
保持体の把持端部１１ｂには、第２図に最もよく示され
るように、好ましくは荒い面が備えられて、書き込みま
たは同様のものを受け入れるための表面を提供し、臨床
試料の識別のために操作者が特定のスティック保持体１
０にマークするのを可能にする。

多孔性膜１４を支持体１１に熱ボンディングすることに
よって一旦スティック保持体１０が組み立てられると、
多孔性膜のうちの各窓１２を通してあられれる部分は、
点１６として示されるそれぞれ約１マイクロリツトルの
抗原標本を点付け（免疫ドツト）される。勿論、この開
示の範囲内において１マイクロリツトル／ドツト以外の
量も採用され得ることが理解されなければならない。

異なる標本がｗ、　ｘ、　ｙおよび２で識別される下側
の窓１２のそれぞれの中心に点１６として与えられる。

その上方、すなわち一番上か゛ら二番目の窓はＮとラベ
ルされて示されている。この窓は、好ましくは陰性対照
を収容する。前記窓１２に点付けされるこのような対照
は、文字を付けられた窓に点付けされる他のすべての標
本の可溶化／希釈のために使用される緩衝溶液からなる
か、またはウィルス性の抗原産生に使用される感染して
ない細胞の細胞抽出物のような陰性対照抗原であり得る
。最後に、スティック保持体の端部１１ｂ付近のＰと識
別された一番上の窓は陽性対照を受け入れるために割り
当てられることができる。前記陽性対照は、全ての試薬
が適正に機能しており、かつ試験手順が適正に行われた
ことを証明するためのものである。このような対照はま
た、第３図に示される３つの反応容器が、試験手順を首
尾よく遂行するために望まれる量まで充分に再構成され
ていることを証明する。実際には、この窓は精製された
ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の溶液を点付けされて
いる。勿論、この開示の範囲内において、前述以外の溶
液を陽性および陰性対照として使用することもできるし
、これらの対照を完全に省略し、ＰおよびＮで示される
窓を除去するか、または他の目的のために使用すること
もできる。実際には、ｗ、ｘ、ｙおよび２と識別された
窓１２は、好ましくは試験されるべき抗体の型に対して
それぞれ特異的な種々の精製抗原をそれぞれ点付けされ
る。勿論、試験されるべき抗体の型の総数が必要な窓１
２の数を決定する。実際には、下記の例に示されるよう
に、６個の窓（２個は陽性および陰性対照用、他の４個
の窓は種々の精製抗原を点付けされる）を有するスティ
ック保持体１０が具合よく使用されてきた。

窓１２を通してあられれている多孔性膜１４の表面が一
旦適切な溶液を点付けされてしまうと、これらの点１６
は周囲温度において空気乾燥される。このような乾燥は
通常数分を必要とするが、より長い乾燥時間も顕著な影
響を伴うことなく採用できる。また、周囲温度以外の温
度もまた顕著な影響を伴うことなく採用することができ
る。

乾燥に続いて、スティック保持体１０のニトロセルロー
ス膜結合端部１１ａは、第２図において膜のコーティン
グを示す中央に孔を開けられたディスク１７によって示
されるように、遮断され、ないしは覆われる。この遮断
は、ニトロセルロースへの免疫化学コンパウンドの非特
異的な結合を阻止する非干渉蛋白質または同様のコンパ
ウンドでニトロセルロースをふさぐために行われる。こ
の遮蔽は最小限度にしか点１６に影響しないものであり
、かつニトロセルロースのような大抵の多孔性膜が広範
囲な蛋白質の非特異的な吸収に対し示す高い親和性を制
限するために行われる。本発明においては、この遮蔽を
行うために、スティック保持体１０の膜結合端部１１ａ
は好ましくは周囲温度で約１５分間トリス−食塩水溶液
中に脱脂粉乳を含む溶液（１０ｍＭ）リスに脱脂粉乳５
％、ｐＨ７，４，０，９％ＮａＣ１）中に浸される。

しかしながら、アルブミン、カゼイン、ゼラチン、洗浄
剤、富アミノ・コンパウンド、その他の溶液を含めて、
他の遮断溶液もまた使用できる。膜が遮断剤にさらされ
る時間および温度は、使用される膜および許容できる感
受性／干渉の所望レベルによって変わる。さらに、低レ
ベルの感受性が許容できる場合には、遮断は完全に省略
できる。

遮断に続いて、スティック保持体１０が蒸溜水で簡単に
ゆすがれ、周囲温度において空気乾燥される。特定の試
験構成に対して高レベルの感受性が必要とされる場合、
緩衝溶液または洗浄剤含有溶液のような他のゆすぎ液を
使用することもできる。遮断されたスティック保持体１
０は、金属箔の袋に包まれ、使用されるまで冷蔵庫温度
で貯蔵されるか、またはそれらの予想される使用態様に
応じて他の適当な容器に入れられるか、または全く包装
されない。ある適用例に対しては、包装された（または
包装されない）スティック保持体１０は、周囲温度で貯
蔵される。さらに、図示されてはいないが、単一の処理
で試験できる特異抗体の数を２倍にするために、２つの
このようなスティック保持体１０を背中合せの構成で一
緒に製造ないしは配置することができる。

第３図は、容器１．２および３において順次行う第１図
および２図のスティック保持体１ｏのインキュベーショ
ン段階（インキュベーション間にはゆすぎを伴う）を含
む本発明の方法の好ましい実施を示す。臨床試料から特
異抗体を検出するために、上述のようにして用意された
スティック保持体１０が容器１．２および３にそれぞれ
収容された３つの別々の免疫化学溶液に５分間、周囲温
度で順次インキュベートされる。スティック保持体はま
た各インキュベーションの間において、好ましくは薄い
食塩（ＮａＣ１）溶液で、ゆすがれる。第３図に示され
ている段階は、好ましくは、周囲条件下で行われるが、
この開示の範囲内において、インキュベーションの速度
を速めたり、遅くしたりするために他のインキュベーシ
ョン温度および時間を採用することもできる。

本発明の方法は、好ましくは、それぞれ免疫化学溶液を
収容する小さなプラスチック容器で行ゎ°れる。各容器
は、該容器に挿入されるスティック保持体１０のニトロ
セルロース膜結合端部を受け入れる。容器１．２および
３は、好ましくは、第５図に示されるように該容器に落
とし入れられる免疫化学試薬の錠剤２０を受け入れる前
は空である。好ましくは、空の乾いた容器に加えられる
各錠剤は１００■の錠剤であり、好ましくは２ｍｌの０
、Ｉ　　Ｍ　　ＮａＣ１溶液で再構成される。スティッ
ク保持体の膜端部を容器に浸す前に、再懸濁された試薬
を適切に混合するべく各錠剤の溶解を確実にするために
図示しない使い捨てのプラスチック・ピペットが各容器
の内容物を撹拌するのに使用でき、該ピペットは各容器
の液体内容物を必要な、数回上下させるように動かされ
る。

前記試薬錠剤は下記の材料から調製される。この５１！
において、適当な吸収材料が乾かされ、そして他の化学
試薬と混合される。この混合物は錠剤化産業においては
一般的な、温容および圧縮モールディングまたはスタン
ピングを含む標準的な錠剤化方法により錠剤化される。

前記錠剤は下記の量の化学試薬から調製され、これらの
処方箋はそれぞれおおよそ各試薬の一個の１００−ｇ錠
剤を作る。勿論、実際には前記錠剤は好ましくは一回の
調合量を大きくして調合され、したがって材料の重量は
製造すべき錠剤の数に比例して増加される。加うるに、
試薬の処方箋の種々の変更がこの開示の範囲内で可能で
ある。このような変更は、錠剤の分解時間、安定性、コ
スト、および臨界免疫化学試薬の活性を向上するため採
用される。貯蔵寿命、包装、取り扱い容易性および低生
産コストのため、凍結乾燥された試薬より錠剤化された
免疫化学試薬の方が望ましい。

各容器のための錠剤の好ましい成分は次の通りである。

錠剤化された試料希釈剤 容器１ ３７ｍｇ　　セルロース ２、［１４７膳ｇ　トリスＨＣｌ ０．１８７ｇｇ　　トリス基剤（Ｔｒｉｓ　　Ｂａ５ｅ
）４０■　脱脂粉乳 １９＠ｇＮａｃ１ １ｍｇ　　ステアリン酸マグネシウム 錠剤化された接合体 容器２ ２９．２４−ｇ　セルロース ３．４０８■ｇ　接合体 １３．６９６ｍｇ　　）リスＨＣｌ １．６６４ｇ　　）リス基剤（Ｔｒｉｓ　　Ｂａ５ｅ）
０．２４ｍｇ　　硫酸マグネシウム ４６．７５２ｍｇ　　Ｎ　ａ　Ｃ１ ４■　ウシ血清アルブミン １ｍｇ　　ステアリン酸マグネシウム （接合体は凍結乾燥された接合体、または前記セルロー
スに別個に吸収され、乾燥された液体接合体でよい。） 錠剤化された酵素基質 容器３ ２７．６７　ｅｇｇ　　マンニトール ８Ｌ８２　ｍｇ　　セルロース ０．６８　ｍｇ　　ニトロブル−テトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ） ０．３３３３■　５−ブロム−４−クロロ−３燐酸−イ
ンドリル（ＢＣＩＰ。

５−ｂｒｏｓｏ−４−ｅｈｒｏｌｏ−３−１ｎｄｏｌｙ
ｌｐｈｏｓｐｏｐｈａｔｅ　） １．６８　ｍｇ　　トリスＨＣｌ ２２．８ｍｇ　　トリス基剤（Ｔｒｉｓ　　Ｂａ５ｅ）
１２．０４　ｍｇ　　硫酸マグネシウム１ｍｇ　　ステ
アリン酸マグネシウム （ＮＢＴは０．００８８　ｍｌの７０％ジメチルホルム
アミドに溶解され、そしてセルロースに別個に吸収され
、乾燥される。ＢＣＩＰは０．００６６８７　ｍｌ（７
）ジメチルホルムアミドに溶解され、そしてマンニトー
ルに別個に吸収され、乾燥される。）第３図に示される
ように、３つの容器のうちの、番号１の第１番目の容器
は、好ましくは、患者から供給される臨床試料を薄い濃
度にするべく希釈するために備えられる臨床試料希釈剤
を収容し、かつまた膜への臨床試料の非特異的な結合を
最小限とするための遮断物質を備える。容器１に対する
好ましい再構成希釈剤は上述の通りである。なお、この
開示の範囲内において、例えばトリス−食塩水、燐酸緩
衝食塩水、洗浄剤を含む溶液等のような他の溶液も、こ
のような溶液が免疫化学試薬の非特異的な相互作用を最
小限とするならば、希釈剤として使用することができる
。

好ましくは２ｍｌの０．１Ｍ　　ＮａＣ１溶液を使用し
て、第５図に示されるように、希釈剤成分を含む錠剤が
再構成された後、血清、血漿または全血のうちのいずれ
かの１滴が容器１に加えられ、該容器の成分が完全に混
合される。実際には、図示しない使い捨てのピペットを
使うことによって適正な混合が再び保証される。実際に
は、非常に小さい血の滴や、非常に大きい血の滴や、数
滴の血を加えても、試験結果に影響を与えないことが分
った（平均的な滴はおおよそ４５〜５０マイクロリツト
ルである）。特定の適用例に対し全血の数滴が所望され
る場合には、凝固開始前に試料が使用され、かつ廃棄さ
れてしまうように、希釈された血液試料を比較的に急い
で使用することにより、凝固の問題を避けることができ
る。またその代りに、凝固阻止剤を試薬の一部として含
めるか、または再懸濁希釈剤に加えてもよい。この最初
のインキュベーション段階の間に、もし存在すれば、臨
床試料からの特異抗体が特異抗原の点に結合する。

上述の段階１は、矢印Ａで示されるようにスティック保
持体１０を臨床試料および試料希釈剤の存在下でインキ
ュベートすることを含む。約５分間のインキュベーショ
ンの後、スティック保持体は容器１から取り去られ、簡
単にゆすがれる。このゆすぎは、好ましくは第３図の段
階２に示されるように、スティック保持体を渦管１９に
挿入することにより行われる。この洗浄段階を行うため
に、第４Ａ図に示されるように、スティック保持体１０
の上端部は、好ましくはネオブレン、ポリプロピレンま
たは同様の材料により形成されたストッパ１８の下面に
横方向に切られた適当な切り込みに、滑り込ませること
によって挾まれる。前記横方向切り込みの両端は、撓ん
で開いて、それらの間にスティック保持体が挟まれるよ
うにスティック保持体が通るようにし、そして撓み戻っ
て該スティック保持体の端部を把持するようになってい
る。前記切り込みに位置を合わされて桟橋部１８ａが示
されており、この桟橋部に対向してスティック保持体の
一端部が位置される。このように構成されて、スティッ
ク保持体の他端部はネオブレン・ストッパの周囲に実質
的に一直線上に並ぶ。第４Ｂ図に示されるように、操作
者は、好ましくは０．ＩＭ　　ＮａＣ１溶液または同様
のものであるゆすぎ溶液で部分的に充填された渦洗浄管
１９に、ストッパ１８に装着されたスティック保持体１
０を合わせ、下降させる。第４Ｃ図は、渦洗浄管１９に
挿入された、ストッパに装着されたスティック保持体１
０を示し、ストッパ１８はその外周において前記開口端
部に対して撓んで該端部をシールしている。スティック
保持体１０は、第４Ｃ図に示されるように、窓１２が試
験を行う人に向うように位置される。好ましくは、第４
Ａ図から第４Ｃ図までに示されるように、スティック保
持体は各インキュベーション（容器ｌおよび２で行われ
る）間に０．ＩＭ　　ＮａＣ１溶液において渦ゆすぎを
受ける。この洗浄段階はまた、任意的に、最後のインキ
ュベーション（容器３で行われる）の後に行うことがで
きる。このような各洗浄において、第４Ｃ図に示される
ように、スティック保持体１０は、一端部が渦管１９の
壁に当接し、ストッパ１８が該スティック保持体をこの
位置に保持して渦管の端部をシールするように位置され
る。渦洗浄はすべてのゆすぎ段階に対して好ましく、今
や活性化された点１６の許容できる感受性／干渉のレベ
ルを提供するようになっている。この洗浄は同一の溶液
で行うことができる（ただし、必ずしも同一の溶液で行
わなくてもよい）。

容器１および２中のインキュベージ式２間におけるゆす
ぎ段階において、操作者は渦管１９を渦マシン（ｖｏｒ
ｔｅｘ　ｍａｃｈｌｎｅ）内に位置させて垂直に保持し
、最高温速度を使用してスティック保持体１０を最低１
０秒間渦洗浄する。実際には、米国ニューヨーク州ボヘ
ミアのサイエンティフィック・インダストリーズ・イン
コーホレイテッド、によってフィッシャー・サイエンテ
ィフィックのために製造されたボルテックスージ一二（
Ｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ　）　、モデルに−５５０−
Ｇおよびポルテックス・ジーニー２　（Ｖｏｒｔｅｘ　
Ｇｅｎ１ｅ−２）　、モデルＧ５６０として知られてい
る機械がこの洗浄段階を行うのに効率よく作動すること
が分った。

前記洗浄段階において、ストッパに装着されたスティッ
ク保持体は比較的に振動を免れるようになっていること
が重要である。それ故、渦管１９で渦洗浄する間、操作
者が人さし指をストッパ１９の上端部にしっかりと置き
、渦管を親指と中指との間に保持することが役に立つ。

もし渦洗浄中にスティック保持体１０が前後に振動し始
めたならば、人さし指で僅かな圧力をストッパに下向き
に作用して前記切り込みの端部を閉じ、それ以上の振動
を阻止するようにスティック保持体の端部をクランプす
る。

所望ならば、ネオプレンのストッパ１９は、同一の機能
、すなわち渦洗浄処理中に抗原を点付けされたスティッ
ク保持体の膜をしっかりと適所に保持するという機能を
果たすように使用できるならば、他の同様の装置に置き
換えることができる。

また、ゆすぎないしは洗浄溶液は、量および成分の両方
を変更することができる。しかしながら、種々の濃度が
適当であるが、ＮａＣ１が溶液で使用されることが重要
であり、ＩＭ〜０．１ＭＮａｃｌ溶液が好ましい。この
ようなＮａＣ１溶液は免疫化学反応の強度を高め、試験
完了時に、より強い視覚的な指示を可能にすることが分
った。

渦洗浄は、再現性が高度で、速く、免疫化学反応感度を
高め、洗浄溶液の量を最小にし、消費者にアピールする
という点で望ましい。

第一のゆすぎの後（段階２の矢印Ｂ）、スティック保持
体１０は容器２に挿入される。この容器は、好ましくは
約２ｍｌの０．１Ｍ　　ＮａＣ１溶液と錠剤化された接
合体とを混合することにより調製された再構成接合体を
好ましくは収容する。好ましい接合体は前述の通りであ
る。しかしながら、他の特異性の接合体もまた本発明の
範囲内であることが理解されなければならない。酵素接
合体の使用は、前記本発明者のうちの３人の先行特許出
願において明らかにされた酵素結合免疫吸着検定法（Ｅ
ＬＩＳＡ　）に基づく処理を実質的に提供する。

それ故、ここではさらに議論しない。容器２におけるス
ティック保持体１０のこのインキュベーションの間に、
酵素標識接合体は、容器１における最初のインキュベー
ションで特異抗原の点に結合された臨床試料の抗体に結
合する。なお、このインキュベーションの間に、前記接
合体はまた前記陽性対照点（好ましくはヒトＩｇＧ）に
結合する。

容器２内のスティック保持体１０のインキュベーション
は、段階３における第３図の矢印Ｃの前の渦管１９で示
されるもう１回のゆすぎの後に行われる。好ましくは、
この洗浄は前述の渦洗浄処置と実質的に同様に行われる
。この洗浄段階においては、第一回の洗浄に使用された
洗浄溶液を再使用してもよいし、新しいＮａＣ１溶液の
洗浄液を使用してもよい。また、この二回目の洗浄溶液
におけるＮａＣ１の存在は重大でないので、ＮａＣ１は
影響なしに省くことができ、蒸溜水をその。

代りに使用できる。しかしながら、最初の洗浄溶液を再
使用することが望ましい。何故ならば、そうすれば、包
装されるべき試薬の量を最小化し、かつ試験手順を簡単
化できるからである。

第二回目の渦洗浄の後、スティック保持体１０は、前記
酵素接合体に対する酵素基質を収容する第三の容器に入
れられる。前記酵素基質は前記接合体の存在を視覚的に
示すように該接合体に反応する。好ましい酵素基質は前
述のものであり、錠剤化された形の該酵素基質を約２ｍ
ｌの０．１ＭＮａＣｌ溶液と混合することにより再構成
される。

しかしながら、スティック保持体のニトロセルロース膜
上の特定の点１６に目に見える色変化を生じさせる限り
は、この開示の範囲内において他の酵素基質も代わりに
使用できることが理解されなければならない。このイン
キュベーション期間の間に、好ましいとされたアルカリ
ホスファターゼがＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質と相互作用する
。この酵素的相互作用の結果である段階３の産物は、結
合酵素接合体の点１６の部位でのニトロセルロース膜１
４上における不可溶性の色の着いた沈降物の産生および
沈着である。この沈着および前記膜への該沈着の堅い結
合は、楕円窓１２内においてスティック保持体１０上に
、ニトロセルロース膜１４の白い背景に対比して青紫色
の点１６を生ずる。

このインキュベーションの後、簡単なゆすぎ（これもま
たＮａＣ１溶液または蒸溜水の渦洗浄であることが好ま
しい）を行ってもよい。ただし、必ずしも行わなくても
よい。

第三回目のインキュベーションの後、１つ以上の窓内に
あられれた色点は、臨床試料中に特異抗原に対する特異
抗体が存在することを示し、このような色点が存在しな
ければ、そのような特異抗体が存在しないことを示す。

さらに、試験結果の有効性の検証として、陽性および陰
性対照窓ＰおよびＮを調べたとき、陽性対照窓には色点
が存在しなければならず、かつ陰性対照窓には検出でき
る色点が存在してはならない。前記２つの対照に対する
それ以外の結果は試験を無効にする。これは、陽性対照
の色変化および陰性対照の色の不変化は、試験時にすべ
ての試験試薬が適正に働いており、かつ試験遂行のため
に適正な処置が行われたことを示すからである。

前記先行の特許出願において、幾つかの例が詳述され、
試験手順の操作および結果が示されている。この手順の
有用性および実用性の論証として、前記例および前記先
行出願全体が引用される。したがって、ここではそれら
の例をこれ以上論議しない。

一つ以上の抗体の存在を試験するための本発明および前
記先行出願のドツト・プロット・システムは、従来の血
清学的処置に比し幾つかの長所を有することが分った。

特に、この試験は、幾つかの抗原に対（で抗体の存在を
同時に識別することができ、−滴の全血を使用して試験
を行うことができ、高度に訓練された人員や高級な機器
を必要とせず、２０分以内と素早く行うことができ、好
ましくは陽性および陰性対照を内蔵し、容易に読み取る
ことができ、試験されたスティック保持体は永久記録と
して保存できる。

臨床試料中の抗体を検出するための改良された試験装置
およびその使用方法における本発明の好ましい実施例が
これまで示され、かつ説明されてきたが、この開示は例
示のためにだけなされており、前記特許請求の範囲内に
入る主題から逸脱することなく本開示の範囲内において
、前記装置および方法に対する変形が可能であることは
明白である。我々は前記特許請求の範囲を我々の発明と
みなす。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスチック支持体に並べられたニトロセルロ
ース膜片の分解図で、膜と支持体とを結合する護膜への
制御された熱および圧力の付与をあられす矢印が示され
ている： 第２図はスティック保持体を構成するように結合される
第１図の膜および支持体の分解斜視図で、支持体は間隔
をおいて穴を開けられて示されており、ニトロセルロー
ス膜の表面は精製された抗原の列を、別々の遮蔽された
ドツトとして、受け入れて該表面に固定されるように露
出されており；第３図は本発明の方法の実施に伴う段階
を、臨床試料中に存在する特定の固定化抗原に対する抗
体の存在を各点の色変化によって決定するための第２図
のスティック保持体とともに示す概略流れ図： 第４Ａ図から４Ｃ図までは渦洗浄のために渦洗浄管に装
着される第２図のスティック保持体を示し； 第５図は第３図のインキニベーシ目ン段階の一つにおい
て使用するための容器の図で、錠剤化された試薬および
ＮａＣ１活性化溶液の導入および混合を矢印で示してい
る。 １〜３・・・容器、１０・・・スティック保持体、１１
・・・プラスチック支持体、１１ｂ・・・スティック保
持体の把持端部、１２・・・窓、１４・・・多孔性ニト
ロセルロース膜、１５・・・文字、１６・・・抗原の点
、１８・・・ストッパ、１９・・・渦管、２０・・・錠
剤。 特許出願人　ジェネラル曇バイオメトリックス・インコ
ーホレイテッド 代　理　人　弁理士　　大森　泉 ・− 曽 り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、臨床試料中の特異抗体の存在を視覚的に検出するた
   めの固相酵素免疫検定システムであって、 複数の開口を形成されている化学的に中立なプラスチッ
   ク支持部材を有し、 前記プラスチック支持部材に、該支持部材との結合部に
   おいて材料の液体化および流動が生じるような温度およ
   び圧力で熱結合され、スティック保持体を構成する多孔
   性ニトロセルロース膜を有し、この多孔性ニトロセルロ
   ース膜のうちの複数の区画は前記プラスチック支持部材
   の開口を通して露出されていて、複数の選択された精製
   抗原の点のそれぞれを該部分にプロットされて受け入れ
   、かつ保持するようになっており、 選択された精製抗原の各点は前記多孔性のニトロセルー
   ス膜上において前記開口のそれぞれに一つずつプロット
   され、 錠剤化された免疫化学成分からそれぞれ再構成された免
   疫化学溶液に前記スティック保持体の前記多孔性ニトロ
   セルロース膜端部を順次受け入れてインキュベートする
   ための容器手段を有し、各錠剤は前記容器手段内に約０
   ．１ＭＮａＣｌ溶液ととともに加えられて混合されるこ
   とにより再構成され、第一の容器手段は約１滴の少量の
   血漿、血清または全血を加えられる臨床試料希釈剤を収
   容するようになっており、第二の容器手段は臨床試料中
   に存在する特異抗体および前記ニトロセルロース膜に点
   付けされる特定の精製抗原に結合する酵素接合体を収容
   するようになっており、第三の容器は前記特異抗体およ
   び前記特定の精製抗原の点に結合した前記酵素接合体に
   相互作用して前記点に視覚的な色変化を生じさせる酵素
   接合体基質を収容するようになっており、 インキュベーション間において前記スティック保持体の
   前記多孔性ニトロセルロース膜端部を渦洗浄するための
   手段を有する固相酵素免疫検定システム。 ２、前記開口を通して露出された前記多孔性ニトロセル
   ロース膜の表面に固定された特異精製抗原の点を識別す
   るために前記プラスチック支持部材に各開口の近くにお
   いて印を形成することを含み、前記開口は間隔を置いて
   形成されており、前記スティック保持体は書き込みのた
   めでもある粗い部分からなる指係合部を該支持体の一端
   部に含む請求項１記載の固相酵素免疫検定システム。 ３、前記プラスチック支持部材と前記多孔性ニトロセル
   ロース膜との熱結合は約１秒±０．２秒の間で３０ポン
   ド／ｉｎ＾２±３ポンド／ｉｎ＾２の接触圧力、および
   華氏２２０度±２０度の温度において行われる請求項１
   記載の固相酵素免疫検定システム。 ４、一列に並べられた６つの開口が前記プラスチック支
   持部材に長さ方向に間隔を置いて形成され、各開口は多
   孔性ニトロセルロース膜の区画を露出し、下側の４個の
   開口はそれぞれ該開口内に露出された前記多孔性ニトロ
   セルロース膜の前記区画に特異精製抗原の点を受け入れ
   て固定されるようになっており、残りの２つの上側の開
   口は該開口内に露出された前記多孔性ニトロセルロース
   膜の前記区画に陽性および陰性対照の各点をそれぞれ受
   け入れて固定されるようになっている請求項１記載の固
   相酵素免疫検定システム。 ５、前記陽性対照は、前記免疫化学溶液中で順次インキ
   ュベーションされた後、試験試薬が適正に作用しており
   、かつ適正な試験手順が行われたことを示すように色変
   化を表わす精製ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の点で
   あり、 前記陰性対照は、他の開口に付けられた抗原の点の可溶
   化／希釈のために適当な緩衝溶液の点か、またはウィル
   ス性抗原産生に使用される感染していない細胞の細胞抽
   出物のような陰性対照抗原であり、該陰性対照は、試験
   試薬が適正に作用しておりかつ適正な試験手順が行われ
   ていれば、前記免疫化学溶液中で順次インキュベーショ
   ンされても変化しないようになっている請求項４記載の
   固相酵素免疫検定システム。 ６、免疫化学試薬の非特異的結合を防ぐために非干渉蛋
   白質で各開口において前記多孔性膜の区画領域を遮断す
   ることをさらに含む請求項１記載の固相酵素免疫検定シ
   ステム。 ７、試料希釈剤は、錠剤化された前記免疫化学試薬の非
   特異的相互作用を最小化するように選択された緩衝剤で
   あり、前記第一の容器に導入されて約２ｍｌの０．１Ｍ
   ＮａＣｌ溶液と混合されることにより該第一の容器にお
   いて再構成される請求項１記載の固相酵素免疫検定シス
   テム。 ８、前記酵素接合体は、非特異的相互作用を最小化する
   ように選択されたものであり、錠剤化され、前記第二の
   容器に導入されて約２ｍｌの０．１ＭＮａＣｌ溶液と混
   合されることにより該第二の容器において再構成される
   請求項１記載の固相酵素免疫検定システム。９、前記酵
   素接合体基質は、前記選択された酵素接合体に反応して
   、前記抗原の点において検出可能な色変化を生じるもの
   である請求項１記載の固相酵素免疫検定システム。 １０、前記多孔性ニトロセルロース膜の前記点を付けら
   れた露出された区画は、インキュベーション間に、０．
   １ＭＮａＣｌ溶液を収容した渦管手段に前記スティック
   保持体を装着することによりゆすがれ、前記渦管手段は
   前記スティック保持体の前記多孔性ニトロセルロース膜
   部分に渦洗浄を行うように作動される渦機械手段に支持
   されるようになっている請求項１記載の固相酵素免疫検
   定システム。 １１、臨床試料中の特異抗体の存在を視覚的に検出する
   方法であって、 プラスチック支持部材により支持された多孔性ニトロセ
   ルロース膜に特異抗原の点を間隔を置いてプロットして
   固定する段階を有し、 錠剤化された状態から０．１ＭＮａＣｌ溶液と混合され
   ることによってそれぞれ再構成される選択された免疫化
   学薬品中で前記抗原の点を付けられた前記多孔性ニトロ
   セルロース膜を次々とインキュベーションする段階を有
   し、前記抗原の点の第一のインキュベーションは、臨床
   試料を形成するべく約１滴の少量の血漿、血清または全
   血を加えられた緩衝剤からなる試料希釈剤中で行われ、
   前記希釈剤は所望の化学反応に干渉するような非特異的
   免疫化学相互作用を最小化しながら前記試料を希釈する
   ように選択されており、 前記抗原の点が固定された前記多孔性ニトロセルロース
   膜を０．１ＭＮａＣｌ溶液で渦洗浄する段階を有し、 酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）ベースの処理を行
   うに好適な酵素接合体中における前記抗原の点の第二の
   インキュベーション段階を有し、前記接合体は前記多孔
   性ニトロセルロース膜上の前記特異抗原の点のあるもの
   に結合した前記臨床試料の抗体に結合するようになって
   おり、 前記抗原の点が固定された前記多孔性ニトロセルロース
   膜を０．１ＭＮａＣｌ溶液または蒸溜水で渦洗浄する段
   階を有し、 検出できる点の色変化を生じるように選択された第二の
   インキュベーションの酵素の酵素接合体基質中における
   前記抗原の点の第三のインキュベーション段階を有する
   方法。 １２、前記プラスチック支持部材は長さ方向に等間隔に
   設けられた複数の開口を備えられ、前記多孔性ニトロセ
   ルロース膜が前記支持部材に熱結合され、すなわち前記
   ニトロセルロース膜の特性を変化することなしに材料が
   溶接されるようにある時間、温度および圧力が加えられ
   、前記多孔性ニトロセルロース膜の区画が各前記窓を通
   して露出され、各前記窓内の前記多孔性膜の区画は、特
   異精製抗原の点を受け入れて付けられ、そこで乾燥させ
   るようになっている請求項１１記載の方法。 １３、前記特異精製抗原の点に加えて、前記多孔性ニト
   ロセルロース膜は前記開口のうちのあるものにおいて陽
   性および陰性対照を点付けされ、前記陽性対照は、前記
   選択された免疫化学溶液中で順次インキュベーションさ
   れた後、色変化を示すヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
   の点であり、前記色変化は前記化学薬品が適正に作用し
   ており、かつ適正な試験手順が行われたことを示し、前
   記陰性対照は、他の開口に付けられた抗原の点の可溶化
   ／希釈のために適当な緩衝溶液の点であり、該陰性対照
   は、前記再構成された免疫化学溶液中で順次インキュベ
   ーションされても変化せず、前記化学薬品が適正に作用
   しておりかつ適正な試験手順が行われたことを示すよう
   になっている請求項１２記載の方法。 １４、非特異的免疫化学結合を防ぐために非干渉蛋白質
   で各開口において前記多孔性ニトロセルロース膜の区画
   領域を遮断することをさらに含む請求項１３記載の方法
   。