JPH01224400A - ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上のｆ用 本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に認識する
ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体およびその製造法
に関する。さらに本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原の
定量およびそれに基づく動脈硬化症の診断、ヒト動脈硬
化症の病巣に対するイメージング診断などに有用なヒト
動脈硬化症関連抗原認識モノクロナル抗体を提供するも
のである。

ｉ　の　・および；題 動脈硬化症（Ａ　ｒＬｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は
大動脈、冠動脈、脳動脈および脈動脈等の筋型動脈に多
く発生し、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等の主因となる疾
患である。

その病因として血漿コレステロールの上昇、内皮傷害、
血小板ａ２集、内膜肥厚、粥腫の形成等が提唱されてい
る。しかしその成因はほとんど解析されていないのが現
状である。

正常な大動脈は内皮、弾性繊維と平滑筋細胞よりなる中
膜、弾性繊維よりなる外股の３層により構築されている
。この大動脈が何らかの原因でこの内皮と中膜の境界が
肥厚し、細胞の異常繁殖、壊死が生ずるといわゆる動脈
硬化症として出現する。

すなわち、心筋梗塞、脳梗塞等の重篤な疾患が生ずる原
因として、 ■　コレステロールをはじめとする脂質の動脈壁細胞な
らびに細胞間への蓄積による粥腫形成、■　細胞増殖に
伴う内膜肥厚および ■　内皮の損傷ならびに内股の肥厚に伴う血小板の凝集 等の種々の理由により動脈血管の閉塞がもたらされるこ
とである。その結果、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等の疾
患を発現するものと推定される。

上記内膜肥厚部分には イ）　大量の脂質を取り込んだ泡沫細胞の出現、口）　
細胞間への脂質の蓄積、 ハ）　内膜で゛の平滑筋細胞の増殖、 二）結き組織の増成とカルシウムの沈着、ホ）血小板の
凝集と血栓形成、 等が認められる。

従来、ヒト動脈硬化症の診断法としては、血中コレステ
ロール値の測定、リボ蛋白組成の分析、凝固因子の検索
などから危険度を予測する間接的な方法と、動脈壁の音
波の伝搬速度や反射エコーを利用して動脈硬化の進展度
を測定したり、動脈血管内に造影剤を注入して動脈の侠
窄像を直接観察する方法とがある。

しかしながら、上記の間接法における血中危険因子の測
定は動脈硬化症の直接因子を測定しているものではなく
、確度の高い診断法とは言えない。

一方、反射エコー法、血管造影法による直接診断法はい
ずれも動脈硬化症による血管の狭窄度を測定する方法で
あり、動脈硬化の進展度そのものを測定する方法ではな
い。しかも血管造影法は造影剤を動脈内に注入するため
に技術的な危険性を伴う。

従って、手軽にでき、かつヒト動脈硬化症に特異性の高
い診断法が望まれている。しかしながら動脈硬化症を詮
所するための直接的な血中指標物質ならびに動脈硬化巣
を直接認識する指標物質は何ら見出されていないのが現
状である。

５題を　史　るための 本発明は前述した問題点を解決するものであり、本発明
者等は、ヒト動脈硬化症に直接作用する因子について鋭
意研究した結果、動脈硬化症患者からの血清または動脈
硬化病巣部位を抗原として、家族性高脂血症、心筋梗塞
、脳梗塞等のヒト動脈硬化症の関連抗原を特異的に認識
するモノクロナル抗体産生細胞を単離し、この細胞から
ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体を得ることに成功
した。

すなわち本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に
認識するヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体に関する
ものである。さらに本発明は、ヒト動脈硬化症関連抗原
を含有する溶液で、ヒトを除く哺乳動物を免疫し、該動
物め抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを細胞融合さ
せて抗ヒト動脈硬化症抗体産生融合細胞を単離し、次い
で抗ヒト動脈硬化症抗体産生融合細胞を培養することを
特徴とするヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造
法に関する。

本発明のモノクロナル抗体は、好適な簡便法として、抗
ヒト動脈硬化症抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合
細胞から産生することができる。

この製造法は特に限定されるものではなく、例えば、ま
ずヒト動脈硬化症抗原を用いて常法によりヒトを除く哺
乳動物を感作する。ここで用いうるヒト動脈硬化症抗原
としては、例えば家族性高脂血症患者血清や脳梗塞、心
筋梗塞患者血清のようなヒト動脈硬化症患者から分離し
た血清および動脈硬化病巣部位（特に内股肥厚部分）の
ホモゲネートを挙げることができる。血清で感作する場
き、健康人のヒト正常血漿で感作して得た抗体をヒト動
脈硬化症患者の血清と混合し、この混合物を用いて動物
を感作することが好しい。この混合物の使用によって正
常血漿由来の抗原に対する抗体産生を抑え、患者血清由
来の抗原に対する産生の確率を高めることができる、と
いう利点がある。ついで感作された動物の肺臓、胸線、
末梢リンパ節、または末梢血より抗ヒト動脈硬化症抗体
産生のリンパ球を単離して抗ヒト動脈硬化症抗体産生細
胞を得る。さらにこの細胞は、ミエローマ細胞と常法に
より融合させ、抗体産生融合細胞を得る。この融合細胞
を複数のウェルに分注し、培養し、各ウェルの上清を酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法〉、あるいは間接オートラ
ジオグラフィー法等の手段により分析しヒト動脈硬化患
者血清あるいはヒト動脈硬化病巣にのみ特異的に反応し
、正常ヒト血清あるいは正常動脈壁とは反応しないヒト
動脈硬化症認識モノクロナル抗体産生細胞を単離する。

モノクロナル抗体を用いて動脈硬化病巣部位画像解析を
行なう場合、モノクロナル抗体により動脈硬化病巣の表
層をより特異的に認識することが望ましい。前記の間接
オートラジオグラフィー法で分析することによって、動
脈硬化病巣の表層部を特異的に認識する抗体産生細胞を
単離することができるというところに特徴を有する。さ
らにこのモノクロナル抗体産生細胞を直接組織培養す°
るか、または哺乳動物、例えばマウスやモルモットの腹
腔に移植して腫瘍を形成させて腹水から産生された目的
とするモノクロナル抗体を採取し、精製する。

かくして、本発明者等は、ヒト動脈硬化症関連抗原を特
異的に認識する新規ヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗
体を単離することに成功した。

このうち、高脂血症患者、脳梗塞患者、心筋梗塞患者血
清を抗原として得られたモノクロナル抗体１３１Ｂ等は
ヒト思考血清に認められる動脈硬化症関連抗原を特異的
に認識するモノクロナル抗体で、免疫グロブリンクラス
はＩｇＧに分類される。

更に、動脈硬化症患者の内膜肥厚部分のホモゲネートを
抗原としてモノクロナル抗体１２５Ｈを得ることができ
た。このモノクロナル抗体１２５Ｈは免疫グロブリンク
ラスＩｇＧに分類されるもので、動脈硬化巣を特異的に
認識していることが示された。

これらのモノクロナル抗体１３１Ｂおよび１２５Ｈはい
ずれもヒト患者血清あるいは動脈壁ホモゲネートを抗原
として６作し作製したもので、家兎血清ならびに動脈壁
ホモゲネートを抗原として作製したモノクロナル抗体と
は異なる新規なものであった。

さらにこのモノクロナル抗体は、必要に応じてそのまま
、またはその蛋白分解酵素処理による分解産物であるＦ
（ａｂ’　＞２．Ｆａｂとしてヒト動脈硬化症の進展等
を測定する試薬として用いることができる。ちなみに、
このモノクロナル抗体の認識する抗原は、ヒト動脈硬化
症の病巣部位のみならず患者血清中にも存在している。

それゆえ採取した血清を、モノクロナル抗体を反応試薬
として、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼ、パーオキシダーゼ等の酵素、放射性同位元素
、蛍光物質等の認識物質を用いた種々の免疫測定法、例
えば競合法またはサンドイツチ法や′ａ集反応または凝
集阻止反応による測定法またはそれらの改良測定法等公
知の方法により、その抗原を定量または定性し、その結
果から動脈硬化の進展度を判断することができるもので
ある。

さらにまたこのモノクロナル抗体を用いて、ヒト動脈硬
化症の病巣部位の存在または広がりを検査することがで
きる。即ち放射性同位元素、例えばＮａ’コ’　Ｉ　、
ＮａＩ２コ■やＮａ１２’Ｉ等を用いクロラミンＴ法、
酵素法等にてヨードを、又５ｎＣ１２等還元剤の存在下
にＮａ””ＴｃＯ，（過テクネチウム酸ナトリウム）生
理食塩液を加えることによりテクネチウムを、又適当な
キレート剤（無水ＤＴＰＡ　＋Ｄ　１ｅｔｈｙｌｅｎｅ
　Ｔｒｉａｍｉｎｅ　Ｐｅｎｔａ　Ａｃｅｔｉｃ　ａｃ
ｉｄ等の所謂Ｂ　１ｒｕｎｃｔｉｏｎａｌキレート）を
介しインジウムＣ１１■ｎ）を上記のモノクロナル抗体
又はそのＦ（ａｂ’）ｚ、Ｆａｂフラグメント等に結合
させる。

これを無菌無毒性媒体に加え静脈内に投与し、−定時間
後に病巣部位に結合した結果をガンマカメラ等を用いて
体内の放射能分布に基づいたシンチグラムを得る。この
シンチグラムより、脳梗塞、心筋梗塞等のヒト動脈硬化
症の病巣部位の存在または広がりを検査することができ
るものである。

実」１凹− 次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明は何らこれに
よって限定されるものではない。

（１）　モノクロナル抗体の作製 正常者血漿の１名分を２０μ！取り、１８０μｌの生理
食塩水にて１０倍希釈し、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウ
スに腹腔的投与した。さらに３週間後と２ケ月後に同様
の投与を行い、抗正常者血漿抗血清を得た。同時に、家
族性高脂血症患者血清の１９名分を混和しこの２０μｌ
を、８０μｌの生理食塩水にて５倍希釈した。これに１
００μｌのフロイント完全アジュバントを加えてよく混
和し、得られたエマルジョンをＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウスに皮下投与した。２週間後に上記抗正常者血漿抗血
清１０μｌと、家族性高脂血症患者１９名の混合血清１
０μｌとを８０μｌの生理食塩水で希釈後、フロイント
完全アジュバント１００μｌを加えてよく混和し、得ら
れたエマルジョンを先のマウスに皮下投与した。さらに
最終免疫として２週間後に、抗正常者血漿抗血清１０μ
ｌと家族性高脂血症患者１９名の混合血清１０μｌを１
８０μｌの生理食塩水で希釈し腹腔内投与後、３日日に
肺臓を取り出した。

胛細胞はＨＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ　　Ｂｕｆｆｅｒｅｄｌ
（ｎｎｋｓ’Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｎ、
）にてよく洗浄し、同様に洗浄したマウスミエローマ細
胞株Ｐ３／Ｕ１と５：１の割きで混合し、１３００ｒｐ
ｍで５分間遠心した。沈査として得られた細胞を５０％
ポリエチレングリコール４０００を含むＤ’ＭＥＭ（−
）培地ＩＭｌに浮遊させ２分間放置した。次いで、Ｄ’
ＭＥＭ（−）培地１０ｚＮ！を徐々に加えて希釈後、８
００ｒｐ情にて５分間遠心した。次いで得られた細胞を
２０％の牛胎児抗血清を含む）（ＡＴ培地１００Ｍ１に
懸濁し、０．１ｍｅずつを９６ウエルの組織培養プレー
トに分注した。

２〜４日毎に半量ずつ培地を交換し、８日後の培養上清
について抗体価を調べたところ、１０００ウエル中２１
ウエルで強い抗体活性が見られた０次いで限界希釈法に
よりクローニングを行い、正常者１４名の混合血漿及び
１４名の混合血清では抗体活性を示さず、ヒト血清中の
動脈硬化症関連抗原を特異的に認識する株を選別したと
ころ計９株の融合細胞が得られた。さらに最終的に限界
希釈法によりクローニングを行い、より正常者血漿及び
血清で゛は活性を示さず、動脈硬化症関連疾患の患者血
清に特異的に反応する融合細胞を計６株単離した。

これらをブリスタンで処理されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスの腹腔内に注入し、１０〜２０日後にその腹水
を採取してモノクロナル抗体を得た。

この６株の融合細胞のうち、１３１Ｂ細胞株から得られ
たモノクロナル抗体は、オフタロニー法による免疫グロ
ブリンクラスは図１に示すようにＩｇＣ；＋に分類され
るもので、ヒト血清中動脈硬化症関連抗原を特異的に認
識するモノクロナル抗体である。１３１Ｂ細胞株は微生
物工業技術研究所特許微生物寄託センター（以下、微工
研と略称する）にＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６７６として寄
託されている。

（２）１３１Ｂモノクロナル抗体による患者血清の測定 被検血清として、家族性高脂血症患者血清（ＦＨ）、■
型高脂血症患者血清（Ｔ　ｙｐｅ　ｍ　＞、低βリポタ
ンパク血症患者血清（Ｈｙｐｏβ）、心筋梗塞患者血清
（ＭＩ＞、脳梗塞患者血清（ＡＰＯ）、ウニルナ−症候
群患者血清（Ｗｅｒｎｅｒ＞、狭心症患者血清（Ａ　Ｂ
ｉｎａ）、正常者血漿（ＮＰ）、正常者１４名より調製
した混合血清（ＮＳ）の１０００倍希釈液１００μｌを
、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３
９１２）に加え、４℃にて一晩放置し吸着させた。１％
ＢＳＡを含む燐酸ｗｉ液でマイクロプレートを処理後、
１３１Ｂモノクロナル抗体溶液を１００μｌ添加し、３
７℃にて２時間反応させた０次いで洗浄後、１０，００
０倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩ
　ｇＧ　（ｔａｇｏ社製）を１００μｔ’添加して３７
℃で１時間反応させ、洗浄後、１１ｇ／ｍｌバラニトロ
フェニルリン酸２ナトリウム塩、０．０１％ＭｇＣ１２
を含む１ｍＭジェタノールアミンＭ街液（ｐＨ９，８）
を１００１□１加え、３７℃にて２時間反応させた。マ
イクロプレート用比色計（バイオ・ラット社製）を用い
吸光度（ＯＤ４．５ｎｍ）を測定し動脈硬化症関連抗原
活性値とした。その結果を、第１表に示す０本発明の１
３１Ｂモノクロナル抗体は、家族性高脂血症患者血清（
ＦＨ）、■型高脂血症患者血清（Ｔｙｐｅｌ［Ｉ）、低
βリポタンパク血症患者血清（Ｈｙｐｏβ）、心筋梗塞
患者血清（Ｍ　Ｉ　＞、脳梗塞患者血清（ＡＰＯ）、ウ
ニルナ−症候群患者血清（Ｖ　ｅ　ｒ　ｎ　ｅ　ｔ　）
、狭心症患者血清（Ａｎｇｉｎａ）の動脈硬化症関連抗
原を強く認識し高い値を示した。しかも正常者血漿（Ｎ
Ｐ）及び血清（ＮＳ）に対する値は小さいことが明らか
であり、このモノクロナル抗体はヒト血清中の動脈硬化
症関連抗原を特異的に認識したものであると判断できる
。

以上の結果を第２図にまとめた。第２図から明らかなよ
うに、家族性高脂血症患者、■工高脂血症患者、低βリ
ポタンパク血症患者、心筋梗塞患者および脳梗塞患者血
清はいずれも正常者血漿及び血清よりも高い値を示した
。

（３）１３１Ｂモノクロナル抗体と反応するヒト血清動
脈硬化症関連抗原物質 家族性高脂血症患者血清をＳＤＳ添加ポリアクリルアマ
イドゲルにて４０Ｖ、−晩電気泳動しニトロセルロース
膜にブロッティングした。この膜を、０．０５％非イオ
ン系界面活性剤ツイーン２０を含む燐酸＆！街液にてよ
く洗浄後、５％ＢＳＡを含む燐酸緩衝液にて一晩処理し
た。洗浄後、１３１Ｂモノクロナル抗体を２時間、アル
カリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１時間
反応させた０反応後、０．２％の５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸パラトルイジン塩を含む０．
７５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，８）の溶液に膜を
浸し、室温にて一晩放置し免疫染色した。その結果、１
３１Ｂモノクロナル抗体の認識するヒト血清動脈硬化症
関連抗原物質の分子量は約５２　、０００と推定される
。

また、１３１Ｂ抗体が認識する抗原物質は、動脈硬化症
と密接な関係にあると言われているリボ蛋白の構成成分
ＡｐｏＡ　　Ｉ　、Ａ−ｆｆ、Ｂ　−１００，Ｂ　−４
８゜Ｅ、Ｄなどとは異なる高脂血症特異抗原物質である
（第３図参照）。

さらに本抗体の認識する抗原物質は図４に示すように、
家族性高脂血症患者血清ＩＲ１をＮ　ａ　Ｂ　ｒにて比
重を１．２５に合わせ、その上に比重１．１５３の生理
食塩水を２ｚｌ、さらに比重１．０６３の生理食塩水１
．６ｄ重層し、３００００ｒｐｍ２４時間の条件下で遠
心しても浮上しない画分に存在する。しかも図５に示す
ように家族性高脂血症患者のコレステロール値との相関
が小さい（Ｒ＝０．１０４）ことから、この１３１Ｂモ
ノクロナル抗体はＬＤＬをはじめとする、リボ蛋白質を
抗原物質として認識しないことが確認された。

以上の結果より、１３１Ｂモノクロナル抗体は動脈硬化
症血清中に特徴的に共通して存在する抗原物質を認識し
ていると結論される。

また１３１Ｂモノクロナル抗体は血漿成分が混入しても
、実質上反応に影響を与えないことが判っている。

第１表 １３１　Ｂモノクロナル抗体による動脈硬化関連疾患Ｔ
、Ｃ，：総コレステロール ＦＨ：家族性高脂血症 ＡＰＯ：＆ｉ梗塞 ＭＩ　　：心筋梗塞 Ｈｙｐｏβ：低βリボ蛋白血症 Ｔｙｐｅｍ：ｍ型高脂血症 ｗｅｒｎｅｒ　：ウエルｆ　　Ｍ　候ＩＴＡＢｉｎａ　
：狭心症 ２　動　硬　病巣を　　として；製した（１）抗原の調
製方法 ヒト胸部及び腹部大動脈硬化壁を摘出し、冷所にて血管
を切開したのちビンセットにて内膜肥厚部（動脈硬化病
巣）を剥離し、ハサミにて１１角に細切後、１　ｍＭ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、０．１％エタノールを含む水溶液（
ｐＨ７，４＞を湿重量１ｇ当り５〜１０ｍ１の割合で加
え、ポリトロンホモゲナイザー（ｐｏｌｙｔｒｏｎｈｏ
ｍｏＦｌｅｎｉｚｅｒ）にてホモゲネー）　（ｈｏｍｏ
ｇｅｎａｔｅ）を調製した。

このホモゲネート３名（５検体）分の混合物を４重のガ
ーゼでヂ過し、ｒ液を抗原液とした。

（２）モノクロナル抗体の作製− ホモゲネート０．５ｚｇ（２００μｉ）に２００μｌの
フロイント完全アジュバントを加えてよく混和した。得
られたエマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与
した。９週後に同様の投与を行い、さらに１８週後に最
終免疫として０．５Ｂ（２００μｌ）のホモゲネートに
Ｄ’ＭＥＭ（−）培地２００Ａｔ１を加えたちのを腹腔
内投与し、３日目に肺臓を取り出した。これをＤ’ＭＥ
Ｍ（−）にてよく洗浄し、同様に洗浄したマウスミエロ
ーマ細胞株Ｐ３／Ｕｌと５：１の割合で混合し、ＩＱＯ
Ｏｒｐ−で５分間遠心した。

沈さとして得られた細胞を４５％のポリエチレングリコ
ール４０００を含むＤ’ＭＥＭ（−）培地１ｘｌに浮遊
させ２分間放置した０次いで、Ｄ’ＭＥＭ（−）培地１
０ｚｉを徐々に静かに加えて希釈後、１０００ｒｐ＋＊
にて５分間遠心した０次いで得られた細胞を１０％の牛
胎児血清を含むＤ’ＭＥＭ培地１２７ｚｊ！に懸濁し、
１１１ずつを２４ウエルの組織培養プレートに分注した
。

１日目にＨＡＴ培地１１１を加え、１〜２日毎に半量ず
つ培地交換を行い、８日後の培養上清の抗体価をＥＬＩ
ＳＡ法で調べた。

抗原として前記のヒト病巣内膜肥厚部のホモゲネートを
１０μｇ／ｍｌに調製し、１００μｌをＥＬＩＳＡ用マ
イクロプレート（タンク社製）に加え、４℃にて一晩放
置して吸着させた。２％ＢＳＡ溶液でマイクロプレート
を処理後、１２７ウエルの培養上清を１００μ！添加し
て室温にて２時間反応させた。

次いで洗浄後、ａ、ｏｏｏ倍希釈したアルカリフォスフ
ァターゼ標識抗マウス１．Ｇ抗体（フジ社製）を１００
μ！添加して室温で２時間反応させ、洗浄後、１ａｇ／
ｘｉバラニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩、０．０
１％ＭｇＣ１，を含む１ｍＭジェタノールアミンＭ衝液
（ｐＨ９，８＞を１００μＩ加え、室温にて１時間反応
させた。マイクロプレート用比色計（バイオ・チック社
Ｗ）を用い吸光度（ＯＤ　、。ｇｎｍ）を測定した。吸
光度０．５以上の６５ウエルについてさらにオートラジ
オグラフィー法で検討した。

１％コレステロール添加食で４ケ月飼育した動脈硬化症
モデルウサギの動脈硬化病巣を取り出し、６５の小片に
切断する。これを５％ＢＳＡ溶液で処理後、６５ウエル
の培養上清を１１１１添加して４℃で５時間反応させた
０次いで洗浄後、５％正常ヤギ血清で処理し、２００μ
ｌ（１，７μＣｉ／ｚｊりの１２５工標識抗マウスＩｇ
Ｇ抗体く非標識体：フジ社製）を添加して４℃、３時間
反応させた。洗浄後、Ｘ−ｒａｙフィルム（フジ社製）
を用いオートラジオグラフィーを行った。

この中から特異的な反応を示し、結合率の高い１０ウエ
ルを選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。

その結果、計２株の融合細胞が単離された。これらをプ
リスタンで処理されたＢＡＬＢ　／　ｅマウスの腹腔内
に注入し、１０〜１６日後にその腹水を採取してモノク
ロナル抗体を得た。この２株の融合細胞のうち、１２５
Ｈ細胞株から得られた１２５Ｈモノクロナル抗体は、Ｅ
ＬＩ　ＳＡ法による免疫グロブリンクラスはＩｇＧ、ｂ
に分類されるもので、動脈硬化壁内膜肥厚部を特異的に
認識するモノクロナル抗体である。この１２５Ｈ細胞株
は微工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−１６７５として寄託された
。

（３）１２５Ｈモノクロナル抗体の特異性蛋白量１０μ
ｇ／ａｌの調製した色々なヒト病巣内膜肥厚部および正
常動脈内膜のホモゲネート１００μｌを用い、上記ＥＬ
ＩＳＡ法にて１２５Ｈモノクロナル抗体の反応性を検討
した。その結果を第２表及び第６図に示すが、このモノ
クロナル抗体はヒト動脈硬化症病巣と強い反応性を示す
ことが確認できた。

なお、総コレステロール（ＴＣ）値の測定は、コレステ
ロール測定キット（Ｖ−コレスターゼ「ニツスイ」：口
承製薬社製）を用いた。

また、この１２５Ｈモノクロナル抗体のウサギの動脈硬
化内膜肥厚部との反応性を検討した。１％コレステロー
ル食で飼育した動脈硬化症モデルウサギの動脈硬化病巣
の凍結切片を用いた間接蛍光抗体法による免疫染色およ
びオイルレッド０による染色の様子をそれぞれ第７図お
よび第８図に示す。

また１％コレステロール食で飼育した動脈硬化症モデル
ウサギの動脈硬化病巣を取り出し、上記オートラジオグ
ラフィー法にて１２５Ｈモノクロナル抗体の反応性を検
討した０間接オートラジオグラフィー法による反応の様
子および病巣の様子をそれぞれ第９図および第１０図に
示す。

図から明らかなように１２５Ｈモノクロナル抗体はウサ
ギ動脈硬化内膜肥厚部を特異的に認識した。

従って、本１２５Ｈモノクロナル抗体は体内投与に際し
ても病巣と反応することが期待される。また、ヒト動脈
硬化症診断のための画像解析用試薬を調製し、ヒトに応
用するに際し、ウサギを用いて投与量、安全試験等の予
備試験を十分に行うことができるものであり、ヒト動脈
硬化巣の部位特定や広がりを調べるための画像解析等へ
の応用が期待される。

（４）　　１２５８モノクロナル抗体と反応する動脈硬
化壁抗原物質 病巣肥厚内膜および正常動脈壁のホモゲネートをＳＤＳ
添加ポリアクリルアマイドゲルにて２０１ＩＡ、２時間
電気泳動し、さらにニトロセルロース膜に電気的にブロ
ッティングした。この膜を、０．０５％非イオン系界面
活性剤ツイーン２０を含む燐酸Ｍ衝液にてよく洗浄後、
２％ＢＳＡ溶液にて６時間処理した。洗浄後、１２５Ｈ
モノクロナル抗体と１６時間、アルカリフォスファター
ゼａ識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体と２時間反応させた
０反応後０．１％の５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルリン酸パラトルイジン塩を含む０．７５Ｍ　）リ
スー塩酸Ｍｆｆｌ液（ｐＨ８，８）の溶液に膜を浸し、
室温にて２時間放置した。その結果、１２５Ｈモノクロ
ナル抗体が認識する抗原物質の分子量は約４４．Ｇｏｏ
であることが確認された（第１１図参照）。

第２表 病変名・・・　ＦＰ：ファイブラスプラークＦＳ：ファ
ッティストリークス ＡＰ：アテロマタスプラーク ＣＯ：石灰化 Ｎ　：正常 判定基準・・・ＥＬＩＳＡ（ＯＤ、。５）の値による０
、８以上　：４＋ ０．６〜Ｇ、８：３＋ ０．４〜０．６：２＋ ０．２〜０．４：＋ ０．２以下　二　　− Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／　ｐ、（コレステロール／タ
ンパク質）＝　（ｍｇ／　ｄ／）／　（贋ＩＦ／　Ｉ／
）

【図面の簡単な説明】

第１ｒＭはオフタロニー法による１３１　Ｂモノクロナ
ル抗体の免疫グロブリンクラスを示す写真である。 第２図は第１表に示した１３１Ｂモノクロナル抗体の疾
患側抗原活性をプロットした図である。 第３図は１３１Ｂモノクロナル抗体が認識する動脈硬化
関連物質をタンパク染色及び免疫染色によって示す図で
ある。 第４図は１３１Ｂモノクロナル抗体の認識する抗原物質
比重を示す図である。 第５図は１３１Ｂモノクロナル抗体の認識する抗原物質
と家族性高脂血症患者のコレステロール値との相関を示
す図である。 第６図は第２表に示した１２５Ｈモノクロナル抗体の疾
患別抗原活性をプロットした図である。 第７図及び第８図は１２５Ｈモノクロナル抗体と反応さ
せたウサギの動脈硬化病巣の凍結切片を用いたそれぞれ
間接蛍光抗体法による免疫染色及びオイルレッドによる
染色の様子を示す写真である。 第９図及び第１０図はウサギの動脈硬化病巣に対する１
２５Ｈモノクロナル抗体の間接オートラジオグラフィー
法による反応の様子及び病巣の様子をそれぞれ示す写真
である。 第１１図は１２５Ｈモノクロナル抗体が認識する抗原物
質をタンパク染色及び免疫染色によって示す写真である
。 １３１Ｂモノクロ一ナル伍体疾患別伍原活性）６　　ろ
　　１ン］ 笛４図 ｄ＝１．０６３　−　　’７ラタンヨン吟号　　　　ｄ
＝１．２５０第　ケ記 垂龜・コレフチＯ−Ｉし　　（ｍｇ／ｄｆ　）１４図 １２５Ｈモノクロナル抗体 ′）１１　ノ　≧【ｊ ・￥Ｊ　罰 づ　　　　　　、−Ｉ　＼：、１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト動脈硬化症関連抗原を特異的に認識するヒト
   動脈硬化症認識モノクロナル抗体。 （２）モノクロナル抗体が抗ヒト動脈硬化症抗体産生細
   胞とミエローマ細胞との融合細胞からのモノクロナル抗
   体である請求項第１項記載のヒト動脈硬化症認識モノク
   ロナル抗体。 （３）ヒト動脈硬化症抗原が家族性高脂血症患者血清に
   おける抗原である請求項第２項記載のヒト動脈硬化症認
   識モノクロナル抗体。 （４）ヒト動脈硬化症抗原が脳梗塞、心筋梗塞患者血清
   における抗原である請求項第２項記載のヒト動脈硬化症
   認識モノクロナル抗体。 （５）ヒト動脈硬化症抗原が動脈硬化病巣からの抗原で
   ある請求項第２項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナ
   ル抗体。 （６）動脈硬化病巣が内膜肥厚部分である請求項第５項
   に記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体。 （７）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇＧ
   である請求項第１項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロ
   ナル抗体。 （８）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇＭ
   である請求項第１項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロ
   ナル抗体。 （９）モノクロナル抗体が１３１Ｂまたは１２５Ｈであ
   る請求項第７項または第８項のモノクロナル抗体。 （１０）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液で、ヒ
   トを除く哺乳動物を免疫し、該動物の抗体産生リンパ球
   とミエローマ細胞とを細胞融合させて抗ヒト動脈硬化症
   抗体産生融合細胞を単離し、次いで抗ヒト動脈硬化症抗
   体産生融合細胞を培養することを特徴とするヒト動脈硬
   化症認識モノクロナル抗体の製造法。 （１１）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が家族
   性高脂血症患者血清である請求項第１０項記載のヒト動
   脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法。 （１２）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が脳梗
   塞、心筋梗塞患者血清である請求項第１０項記載のヒト
   動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法。 （１３）ヒト動脈硬化症関連抗原を含有する溶液が動脈
   硬化病巣のホモゲネートである請求項第１０項記載のヒ
   ト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造法。 （１４）動脈硬化病巣が内膜肥厚部分である請求項第１
   ３項記載のヒト動脈硬化症認識モノクロナル抗体の製造
   法。 （１５）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇ
   Ｇである請求項第１０項記載のヒト動脈硬化症認識モノ
   クロナル抗体の製造法。 （１６）モノクロナル抗体が免疫グロブリンクラスＩｇ
   Ｍである請求項第１０項記載のヒト動脈硬化症認識モノ
   クロナル抗体の製造法。 （１７）モノクロナル抗体が１３１Ｂまたは１２５Ｈで
   ある請求項第１０項のヒト動脈硬化症認識モノクロナル
   抗体の製造法。 （１８）酵素または放射性同位元素で標識されたヒト動
   脈硬化症認識モノクロナル抗体。（１９）放射性同位元
   素が＾１＾２＾５Ｉである請求項第１８項の標識モノク
   ロナル抗体。 （２０）酵素または放射性同位元素で標識されたヒト動
   脈硬化症認識モノクロナル抗体からなるヒト動脈硬化症
   診断用試薬。 （２１）放射性同位元素で標識されたヒト動脈硬化症認
   識モノクロナル抗体からなるヒト動脈硬化症画像診断用
   試薬。 （２２）ヒト動脈硬化症が心筋梗塞または脳梗塞である
   請求項第２０項または２１項の診断用試薬。 （２３）放射性同位元素が＾１＾２＾３Ｉ、＾１＾２＾
   ５Ｉ、又は＾１＾３＾１Ｉである請求項第２２項の診断
   用試薬。 （２４）放射性同位元素が＾１＾１＾１Ｉｎである請求
   項第２２項の診断用試薬。 （２５）放射性同位元素が＾９＾９＾ｍＴｃである請求
   項第２２項の診断用試薬。