JPH01228479A - プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテターゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、プロスタグランジンの生合成に関与するプロ
スタグランジンエンドペルオキシドシンテターゼをコー
トするＤＮＡ、更に詳しくはアラキドン酸ノＪスケート
のシクロオキシゲナーゼ経路におけるアラキドン酸から
プロスタグランジンに２を経て、プロスタグランジンＨ
２を生成させるブロス（来夏以下余白） タグランソンエンドベルオキシドシンテターゼをコード
するＤＮＡ配列に関する。

（従来の技術） アラキドン酸カスケードは、分子状酸素をアラキドン酸
に添加する１連の反応系で、最初の反応に関与する酵素
によって、シクロオキシゲナーゼ経路、リポキシゲナー
ゼ経路、チトクローム　Ｐ−４５０１１路に大別するこ
とができる。シクロオキシナーゼ経路は、プロスタグラ
ンジン（以下ＰＧと称す）、　トロンボキサンと呼ばれ
る１連の有用物質（調節物Ｎ）を産生ずる経路であり、
プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテターゼ（
以下ＰＧＥＳと称す）は、シクロオキシゲナーゼ経路の
アラキドン酸が最初に反応する酵素である。ＰＧＥＳが
関与する反応を詳細に見てみると、アラキドン酸から２
分子の分子状酸素が導入されたエンドペルオキシド型の
第一中間体であるプロスタグランジンＧ２（以下ＰＧＧ
２と称す）を生成するシクロオキシゲナーゼ活性をもつ
酵素とＰＧ２からプロスタグランジンＨ２を生成するＰ
Ｇエンドペルオキシダーゼ活性をもつ酵素が関与してい
る。これらの２種類の酵素反応は、現在までのところ実
験的に各々が酵素として分離されていないこともあり、
両方の酵素活性をもつＰＧＥＳがその主役であると考え
られているく「プロスタグランジンと病態」、室田誠逸
編、東京化学同人、ｐ４８〜ｐ６６（１９８４））。

既にＰＧＥＳは、ウシ或はヒツジの精嚢から分離され均
一な酵素標品にまで精製されてる（Ｍｉｙａｍｏｔｏ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５１．２
６２９−２６３６（１９７６）、Ｖａｎ　ｄｅｒ　０ｕ
ｄｅｒａａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ。

、４８７，３１５−３３１（＋９７７）。この酵素は、
報告によれば生体内ではかなり特異的に局在しており、
各種ＰＧに関わる酵素代謝産物が機能調節や疾患の発症
に何らかの役割を果たしていることが強く示唆されてき
ている（　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ
ｃｈｔｍ、８ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、８７７．１４
４−１５０（１９８６））。

こうした生体内での本酵素の調節機構の解明には、アミ
ノ酸配列等の分子レベルでの解析は必須であるが、本酵
素に関する限り全くの手つかずの状唇である。その為、
工業的な見地からみたＰＧの合成への試み、或は疾病の
分子レベルでの解明の遅れによる治療法の停滞等の種々
の問題点を現在のところ投げかけている。

（発明が解決しようとする問題点） 先に述べた通りシクロオキシゲナーゼ経路のうちＰＧＥ
Ｓの役割は、前述の各種ＰＧ合成経路の合成の第一段階
に関与し、中間体であるＰＧＧ２とＰＧＨ２の生成に携
わっていることである。従って人為的な各種ＰＣの合成
を試みる場合、本酵素処理は不可欠な工程である。しか
し、本酵素がこうした各種ＰＧの合成に必須であるにも
関わらず、現実にはウシやヒツジ等の精嚢由来のものし
かなく、これらは人為的な合成等に必要な大量生産に供
するものではない。

それは先にも述べたが、現在のバイオテクノロジーを用
いた蛋白生産の技術レベルから考えると本酵素の全塩基
配列（全ＤＮＡ配列）がいまだ決定していない為、組損
え体による生産に百度すらたっていないことが１つの大
きな要因となっていることは明白である。又本酵素のＤ
ＮＡ配列が未解決であることは、この酵素におけるＤＮ
Ａレベルでの研究の遅れ、シクロオキシゲナーゼ経路の
分子レベルでの解明の遅れ及び分子レベルでの炎症疾患
等の解明の遅れの１つの原因にもなっている。即ちプロ
スタグランジンエンドペルオキシドシンテターゼのＤＮ
Ａ配列の解明は、プロスタグランジンの研究或は関連疾
病の治療薬の開発においても避けて通れない命題である
と言える。

そこで本発明者は、目的蛋白の遺伝子操作による産生を
目指し、未だ解決されていないプロスタグランジンエン
ドペルオキシドシンテターゼの全ＤＮＡ配列を決定する
ことを問題点として設定するに至った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、ヒツジ精嚢腺ｃＤＮＡライブラリーを作成し
たこと、それを用いて新たにヒツジＰＧＥＳをコードす
るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを同定したものである。

以下にその解決手段を詳細に説明する。

本発明のＤＮＡは、第１図に表示した−７２＠目〜１７
２８番目で示される連続したＤＮＡ配列で示される。又
プロセシングの結果得られる酵素標品（天然型）に対応
するＤＮＡ配列は、本発明者の研究の結果１番目〜１７
１８番目の連続するＤＮＡ配列に対応する。

第１図において０内で示す塩基及びアミノ酸は、図に対
応するその位置において０内で示す塩基或はアミノ酸に
よって置換されてもよいことを示し、本発明者が解明、
発明したＤＮＡ配列においてはそれらをも含む。即ち本
発明においては、０内で示した塩基或はアミノ酸を置換
した第１図で示される連続するＤＮＡ配列が含まれるこ
とを示す。

このＤＮＡ配列を調製し、配列決定する手法は、公知で
あり、概路次の手順で行われる。

（１）アミノ酸配列の決定 ヒツジＰＧＥＳの精製は、官本らの方法（Ｍｉｙａｍｏ
ｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５
１．２６２９−２６３６（１９７６））及びヘムラーら
の方法（Ｈｅｍｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　、２５１．５５７５−５５７９（１９７６
））を用いれば可能であり、こうして得られた精製酵素
から、ハーモドソンらの方法（Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２．３１４
８−３１５３（１９７３））によってピリジルエチル化
し、Ｎ末端及びＣ末端のアミノ酸配列を通常の方法、即
ちエドマン分解及びカルボキシペプチダーゼＹを用いる
方法により決定できる。酵素のペプチド断片は、リジル
エンドペプチダーゼ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉ、和光純薬）によって消化後、
和田らの方法（Ｗａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、！６？、　＋３−１８（＋９８７）
）で分離、精製できる。

Ｎ末端アミノ酸配列は、通常のアミノ酸シークエンサー
を用いて籠単に決定することが可能である。

Ｃ末端、Ｎ末端部分アミノ酸配列は、ｃ　ＤＮＡ全塩基
配列の解読の際の天然型酵素のＣ末端或はＮ末端の決定
並びにリーディングフレームの決定の為の知見として利
用される。

（２）オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成りＮＡプ
ローブとしたものは、ロス（Ｒｏｔｈ）らが解明した本
酵素のアスピリンーアセチレーションサイトのアミノ酸
配列（Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、２２．４ｆｔ？２−４６７５（＋９８３））の知見
を元に、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列に相補的な２１−ｍｅｒ（■）及び２
４−ｍｅｒ（■）のオリゴヌクレオチドと、３５９８目
から３７５番目の塩基配列に相補的な１７−　ｍｅｒの
オリゴヌクレオチド（■）を合成し、ＤＮＡプローブ或
はブライマーとして使用することができる。

これらの合成オリゴマーは、一般的なりＮＡシンセサイ
ザーによって容易に合成が可能である。

本明細で使用した記号の意味は、Ａ；　アデニン、Ｔ；
　チミン、Ｃ；　シトシン、Ｇ；　グアニン、Ｉ；イノ
シンを示す。

■５　’　−ＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＣＴＣＡＣＡＴ−３
’ここで示す０内の塩基は、この合成オリゴヌクレオチ
ドが明記した両方の塩基を含むことを示す。

（３）ｃＤＮＡライブラリーの作成 一方ｃＤＮＡライブラリーは、ヒツジ精嚢腺から抽出し
たｍ　ＲＮ　Ａ　（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８，５２９１−５２９９
（＋９７９））を鋳型として常法に従い作成する（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｎｕａｌ、ｐ２３０−２４１．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｖｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９
８２））　−本明細で用いるｍＲＮＡは、Ｐｏ１ｙ（Ａ
）”　ＲＮ　Ａ　（Ｐｏ１ｙ（Ａ）”を含むｍＲＮＡ）
と同一の言味である。

ｍ　ＲＮ　Ａを抽出する採取源としては、一般的に生き
たヒツジから分離した精嚢腺或は分離直後に凍結して保
存しておいたものであればいずれのものでもよく、特に
限定するものではない。又ｃＤＮＡライブラリー作成に
あたっては、一般的に行われている方法に準拠して行え
ばよく、例えば先に示した参考資Ｆ−Ｌ　　）！ＩＩち
ｍ　ＲＮ　Ａの調製に間しては、キイルブライン（Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ）らの方法（８ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
　１８．５２９１−５２９９（１９７９））又ｍＲＮＡ
からＣＤＮＡライブラリー作成方法に関してはマニアテ
ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法（ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｎｕａｌ、ｐ２３０−２４１．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｈｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｖｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ（１９８２））やオカヤマーパークの方法（ＯＫａ
ｙａｍａｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、
、２，１６１（１９Ｂ２））がその例となる。

例えば、グアニジン−チオシアネート法（ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｅ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ）を用
いて抽出後、オリゴ（ｄＴ）（ｐｏｌｙ（ｄＴ）；ｏｌ
ｉｇｏ（ｄＴ）；　　チミンのポリマー）セルロースク
ロマトグラフィーを用いてｍＲＮＡを単離した後、ブラ
イマーとしてオリゴ（ｄＴ）あるいは先に示した合成オ
リゴヌクレオチドを用いて、調製したｍＲＮＡを４種の
デオ“キシヌクレオチドリン酸（以下４ｄＮＴＰと称す
）存在下でｍＲＮＡをテンプレートとして逆転写酵素（
ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）により
、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを作る。そしてアルカリ
処理により１本鎖ＤＮＡとし、４ｄＮＴＰ及びＤＮＡポ
リメラーゼで処理後、Ｓｌヌクレーアーゼにより２本鎖
ＤＮＡとする。

次にターミナルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ
　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によりポリ（ｄＣ）　　（
ｐｏｌｙ（ｄＣ）；ｏｆ　ｉｇ。

（ｄＣ）　；シトシンのポリマー）を３′末端に付加す
る。

こうして構築した２本鎖ＤＮＡは、大腸菌系プラスミド
ベクターを用いて、ライブラリーを作成後、スクリーニ
ングを行う。

ベクターとしては大１１１ｍを宿主として宿主細胞中で
複製可能な複製開始点と薬剤耐性選択マーカー（例えば
テトラサイクリン耐性或はアンピシリン耐性）を含み、
Ｐｓｔ１部位をもつものが望ましい。ベクターの−ＰＬ
ｓＬ　Ｉ部位には、ブライマーとしてオリゴ（ｄＧ）　
　（ｐｏｌｙ（ｄＧ）；ｏｌｉｇｏ（ｄＧ）ニゲアニン
のポリマー）を付加し、ベクター・ブライマーＤＮＡと
して使用する。

具体的にはＥＫベクターとして現在量も多用されている
ｐＢＲ３２２がクローニング部位としてＰｓｔＴ部位を
もち、その詳細な制限酵素地図がつくられ、全塩基配列
も決定されているので好適である。本発明の場合、プラ
スミドｐＢＲ３２２と制限酵素（Ｐｓｔｌ）を用いて切
断後、ターミナルトランスフェラーゼによりポリ（ｄＧ
）を付加し、このベクター・ブライマーＤＮＡと調製し
た２本鎖ＤＮＡとをアニーリングしライブラリーとする
。

（４）スクリーニング こうしてできたｃＤＮＡライブラリーは、カルシウム処
理した大１１１Ｍ株（例えばＥ、ｃｏｌｉ　８Ｂ１０１
株（ＡＴＣＣ３３６９４））に取り込ませてテトラサイ
クリン等の薬剤を含む寒天プレート上にまき一装置く。

こうしてでできた薬剤耐性の大１１１Ｍコロニー（形質
転換体）からＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを
する。

ＤＮＡプローブとしては、先に示したロスらが解明した
本酵素のアスピリンーアセチレーションサイトのアミノ
酸配列の知見をもとに合成した■及び■のオリゴマー、
或はこのプローブからスクリーニングされたプラスミド
から得られたＤＮＡフラグメントをもとにしたＤＮＡプ
ローブを利用することができる。

スクリーニグされたクローンから、それぞれのプラスミ
ドＤＮＡを：Ａ製し、種々のプラスミドＤＮＡを切断し
、ＤＮＡフラグメントを単離し、各々分析することによ
って目的のプロスタグランジンエンドペルオキシドシン
テターゼのｃ　Ｄ’ＮＡを決定することができる。

本発明の場合、こうしたスクリーニングの結果えられた
プラスミドは、８つあり（第２図に示す）それらを解読
、分析することによって目的のプロスタグランジンエン
ドペルオキシドシンテターゼのｃＤＮＡの塩基配列を決
定することができた。

（５）Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定 スクリーニングされたクローンからのｃＤＮＡフラグメ
ントの分析は、常法によって分析が可能である。例えば
、得られたクローンからいくつかのｃＤＮＡフラグメン
トをとり、一般に広く利用されているジデオキシ法（Ｓ
ａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、ｓｃｉ　、ＵＳＡ、、７３．５４６３．（＋９７
７））やマキサムギルバート法（Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ’ｓ　Ｅｎｚｙ＋＋＋ｏ１．＋６５
，４９９−５６０（１９８０））等によって各々配列を
解析し、総合的に分析することで全配列を決定すること
ができる。

こうして分析したプロスタグランジンエンドベルオキシ
ドシンテターゼのｃＤＮＡ全配列は、第１図に示す通り
一７２呑目〜１７２８番目迄の連続したＤＮＡ配列で示
される。

この配列は、全塩基配列からのオープンリーディングフ
レームを分析することにより決定したものであるが、天
然に存在する酵素との整合性を確認するため、酵素を生
化学的手法により精製し、Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸配
列を決定したところ、第１図に示す１〜１７２８のＤＮ
Ａ配列でコードされるアミノ酸配列であることが推定さ
れる。Ｎ末端１１残基のアミノ酸配列は、ファン　デル
オーデラらの報告（Ｖａｎ　ｄｅｒ　０ｕｄｅｒａａ　
ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ。

ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、４８７，３１５
−３３１（１９７７））と同じであった。また酵素蛋白
をリジルエンドペプチダーゼで消化して得られるペプチ
ド断片から決定された部分アミノ酸配列は、上記ＤＮＡ
配列でコードされるアミノ酸配列にすべて含まれた。こ
れらは、酵素蛋白のプロセシングの結果なしえるもので
、通常ｃＤＮＡとして絹換え体出発物質として有効利用
される場合、第１図に示す一７２番目〜１７２８番目迄
の連続したＤＮＡ配列が利用されることは言うまでもな
い。

生体内或は精製時でのタンパク質のプロセシングは、通
常よく観察されるものである（Ｃ未配列の欠失；　Ｒｉ
ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、２５９．６７９０〜６７９７（＋９８０）
）が、本発明の場合、該酵素が膜蛋白であることより、
欠落した２４個のアミノＭ（７２個ＤＮＡ）は、シグナ
ルペプチド（シグナル配列）と推定される。

こうして得られるＰ　Ｇ　Ｅ　ＳをコードするＤＮＡは
、組換え体の出発物質として用いることにより、人為的
な各種ＰＧの合成を試みる場合のＰＧＥＳの生産や研究
用試薬としての生産等の商業的レベルての大量生産に供
することができる。

また、シクロオキシゲナーゼ経路の分子レベルでの研究
やその他種々の研究用材料としても利用することができ
る。

以上、本発明を一般的に記載したが、以下に更に実施例
を用いて具体的に説明する。

（実施例） 実施例１　　ｃＤＮＡ塩基配列の決定 （１）ｍＲＮＡの調製 摘出後すぐに液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存し
ておいたヒツジの精嚢腺（ｌｏｇ）をワーリングブレン
ダーを用いて液体窒素の中で粉砕した。得られた組織粉
末を８０１のグアニジンチオシアネート（４Ｍグアニジ
ンチオシアネート、６３ｍＭクエン酸ナトリウム、１．
２７χＮ−ラウロイルサルコシン、０゜１Ｍ　２−メル
カプトエタノールを含むｐＨ７，０）に加えて激しく攪
拌し、ボッターのホモジナイザーでホモジナイズした後
、１００ＯＸＩ！ｉ、１０分間遠心分離した。

−ｈ清に塩化セシウムを２．５ｍｌ当たり１ｇの割合で
添加して溶解し、更にホモジナイズし、１９Ｇ注射針を
通してＤＮＡを短く切断した０次いで０．１Ｍ　ＥＤＴ
Ａを含む５．７Ｍｍ化セシウムＮａ液ｐ）１７．０ヲｌ
ｏｍｌづつ４本の遠心チューブ（日立４０ＰＡ）に分注
し、この溶液の上に得られたホジネートを重層し、日立
スウィングミータ−５ＲＰ２Ｂに遠心チューブをセット
し、日立超遠心機にて２７，０００ｒｐｍ、２０℃で２
０時間遠心分離を行なった。得られた沈澱を７５Ｘエタ
ノール溶液で２回洗浄した後、少量の水に溶解して回収
し、１／２０容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，２と２倍
容のエタノールを添加して一２０℃で１時間放置しＲＮ
Ａを沈澱させた。再び少量の水に溶解して同様にしてエ
タノール沈澱を行ないｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。ｔｏ
ｔａｌ　ＲＮＡ（２，６ｍｇ）を約６１の０．５ＭにＣ
１を含むｌ（１ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｌｉ衝液ｐＨ７
，５に溶解し、同じ緩衝液で平衡化されたオリゴ（ｄＴ
）セルロースカラム（ｌＸ４ｃｍ）に流してｐｏｌｙ（
Ａ）”ＲＮＡをカラムに吸着させ、ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ
ｌｌＣｌ緩衝液ｐ）１７．５にて溶出させた。その後ｐ
ｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを含む両分を集めてエタノール沈
澱を行ない、７０％エタノール溶液中−２０℃で保存し
た。この場合、２．６ｍｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡより約
３００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡが得られた。

（２）ＤＮＡライブラリーの作製 このようにして得たｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）を鋳型（テンプレート）とし、オリゴ（ｄＴ）＋２−
＋ｓ　（ファルマシア）、 （１：イノシンを示す）あるいは５’−ＡＧＴＡＴＡＡ
ＴＡＧＣＴＣＡＣＡＴ−３’をそれぞれブライマーとし
てＤＮＡを合成させ、これをベクターに組み込みＤＮＡ
ライブラリーを作製した。

すなわち、ｌ０Ｂｙ、のｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを１０
μｍの水に溶解し、０．１Ｍ水酸化メチル水銀を１μｍ
添加して室温で５分間放置してＲＮＡを変性させ、２μ
ｍの７００ｍＭ　２−メルカプトエタノールを加えて余
分な水酸化メチル水銀を不活化させた（室温５分間）、
処理されたｐｏｌｙ（Ａ）”　ＲＮＡと１０７１ｇのオ
リゴ（ｄＴ）＋２−ｔｅをＯ，ＩＭＴｒｉｓ−ｆｌｃｌ
緩衝液ｒ＋Ｈ８，３（４２℃）、１４０ｍＭ　ＫＣＩ、
ＩＯｍＭＭｇＣｈ、４種類のＩｍＭ　ｄＮＴＰを含む反
応液に添加して全量を５０７ｚｌとし、ＡＭＶ逆転写酵
素（Ｍ　１ｄｖｅｓｔ）４０単位を加えて４２℃、３時
間反応させ、−本ｇｌｃＤＮＡを合成した。

なお、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドをブライマ
ーとする場合は、ｌｏｏμｇのｐｏ　ｌ　ｙ（Ａ）”　
ＲＮＡを使用して１０倍の反応系で同様に反応を行った
。

但し、各合成オリゴヌクレオチドは５００ｐｍｏ　Ｉ使
用し、反応前に７０℃２分間インキュベートした後、水
中で急冷して変性させておいた。

こうして得た反応液にｌ／２０容の０．５Ｍ　ＥＤＴＡ
と１０χＳ０５をそれぞれ添加して反応を停止させ、フ
ェノール：　クロロホルム抽出を行なった後、水層に１
／２容の３Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容菫のエタノー
ルを添加し、−８０℃５分間放置して核酸を沈澱させた
。沈澱は１００〜２００μｍのＴＥ（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−）１ｃＩ　ｐＨ７゜４、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解
し、同緩衝液で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１
０００カラム（約０．６Ｘ　２０ｃｍ）に流し、遊離の
ｄＮＴＰを取り除き、ＲＮＡと合成されたＤＮＡを含む
両分を集め、エタノール沈澱させた。この沈澱を洗浄・
乾燥させた後、５０μｍの水に溶解し、５０ｎ＋Ｍ　Ｅ
ＤＴＡヲ含む１．８Ｎ　ＮａＯＨを２０μｌ添加し、７
０”Ｃで３０分間インキュベートしてｍＲＮＡを分解し
た。次いでＩｌｌ　ＨＣＩ（３６μ＋）とＩＭ　Ｔｒｉ
ｓ−）ＩＣＩ　　ｐ）１７．４（４μＩ）を加えて中和
し、エタノール沈澱を行なった。こうして得られた一本
鎖ｃＤＮＡは二本鎖ｃＤＮＡの合成を行なうタメニ、０
．１Ｍ　＋１ＥＰＥｓ（１１）１７．０）、７０ｍＭ　
ＫＣＩ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１８ｍＭ　２−メルカプ
トエタノール、４種Ｂノ０．５１ＩＩＭ　ｄＮＴＰを含
む反応液（全１１１００μｌ）中で、約７０単位の大腸
Ｍ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（にＩｅｎｏｗフラグメント
：　宝酒造）と１３℃７時間〜−晩反応させた後、０．
５Ｍ　ＥＤＴＡ（５１ｚ　Ｉ）と１０Ｘ　５ＤＳ（５μ
ｌ）を加えて反応を停止させ、フェノール：　クロロホ
ルム溶液で処理し、二本鎖ｃＤＮＡをエタノール沈澱に
よって回収した。

更にこれを既に上述した逆転写酵素反応液（全量５０μ
ｍ）中で４０単位の逆転写酵素と４２℃で１時間反応さ
せ、ＥＤＴＡとＳＯ５による反応停止後、フェノール：
クロロホルム混液処理およびエタノール沈澱により二本
鎖ｃＤＮＡを回収した。次ぎにヘアピン部分を削除する
ために、二本鎖ｃＤＮＡは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐｌ
＋４．５．０．２Ｍ　ＮａＣｌ、ＩｍＭ　Ｚｎ５Ｏａ、
０，５Ｉグリセロールを含む反応液（全量ｌＯＯμｍ）
中で２０単位の５１ヌクレアーゼ（ファルマシア）と１
３℃３０分間反応サセタ。す＋Ｚ　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ
（１，５μ＋）とｌｏｇ　５Ｏ５（１，５１１１）を添
加して反応を停止させ、フェノール：　クロロホルム混
液で処理した後、エタノール沈澱によってｃＤＮＡを回
収した。回収した二本鎖ｃＤＮＡを５０μｍの水に溶解
し、ＴｄＴ　（ターミナルトランスフェラーゼ）５×テ
イリングバツフアー（ベセスダ・すｆ−チーーｙ；ｆｃ
９ト’）−社）２０μｌ、ｌｏｍＭ　ｄＣＴＰ　（デオ
キシシチジン３リン酸’）　　１０μｍ、ターミナルデ
オキシヌクレオチドトランスフェラーゼ２０単位と水を
加えて全量を１００μｍとし、３７℃２０分間反応させ
、二本鎖ｃＤＮＡの３′末端にｄＣＴＰによるテール（
ｔａｉｔ）　ヲ形成すセｔ−。ソノ後０．５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ（２）ｚ　Ｉ）と１０％５Ｏ５（２μｍ）を添加して
反応を停止させ、フェノール：クロロホルム処理、エタ
ノール沈澱によってｃＤＮＡを回収した後、洗浄後乾燥
させたｃＤＮＡの沈澱は、Ｊ５０ｍＭ　ＮａＣｌ、Ｉｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含むｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　ｐ
Ｈ７゜５１００１１１に溶解した。ｄＣテール（ｄＣｔ
ａｉｌ：ｏｌｉｇ。

Ｃｌを示す）のついた二本鎖ｃ（ｌＮ＾は田１で消化し
てｄＧデテールｄＧ　ｔａｉｌ：ｏｌｉ、ｇｏ　Ｇ鎖を
示す）をつけたｐＢＲ３２２と混和し、１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　ｐ）１７．５溶液中で６７℃、５分間インキュ
ベートし、徐々に温度を下げて５７℃で２時間インキュ
ベートし、ｃＤＮＡとベクターＤＮＡをアニーリングさ
せた。アニールしたＤＮＡは１０μｍ当たり５０７ｚｌ
の１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、４０１１Ｍ　ＭｇＣｌ２、５
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ　　ｐ）１７．５を含む溶液
とし、等容量の形質転換コンピテント細胞（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉの８８１０１株）を加えて形質転換させた。

通常環状ｐＢＲ３２２（７）　ＤＮＡ　Ｉ　μｇ当たり
０．６〜ＩＸ　１０”個の形質転換体を得るコンピテン
ト細胞を使用する。

１５μｓ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地
（φ１００ｍｍ）の上にオートクレーブしたニトロセル
ロース膜（ミリポア社！りをのせ、その上に形質転換さ
れた細胞をまき、３７℃で１３〜１５時間培養した。

（３）ｐＰＥｓｌｌ、ｐＰＥＳ２８、ｐＰＥＳ３１、ｐ
、Ｐ　Ｅ　Ｓ　４０、　ｐＰＥＳ３３、　ｐＰＥｓ４３
、ｐＰＥＳ　１０２及びｐＰＥｓ１０３（７）単離（２
）のように作製したｃＤＮＡライブラリーからニトロセ
ルロースフィルターにレプリカをとり、テトラサイクリ
ンを含むＬＢ寒天培地にのせて３７℃、５時間培養した
。次いで５０Ｐｇ／ｍ　Ｉクロラムフェニコールを含む
ＬＢ寒天培地にニトロセルロースフィルターをうつし、
更に３７℃、１２時間培養した。

フィルターを０．５Ｎ　Ｎａ０１１／１．５Ｍ　ＮａＣ
ｌでしめらせてアルカリ処理（５分間、２回）した後、
ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，４更に０．５Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，４／１．５ＭＮａＣｌで処理し、
風乾させた後、８０℃で２時間ベーキングし、ＤＮＡを
ニトロセルロースに固定した。

コミニーハイブリダイゼーションは、合成オリゴヌクレ
オチドを用いた方法とｃＤＮＡフラグメントを用いた両
方をもちいて行ったが、本実施例では合成オリゴヌクレ
オチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション法を例
示する。

固定化させたニトロセルロースフィルターは、３ｘＳＳ
Ｃ／　Ｏ，ＩＸ　５ＤＳｌａ　液中テア０”Ｃ５３０分
間２回処理し、ＸＩ胞残渣を十分に取り除き、４ｘＳＳ
Ｃ／ｌ０ｘｌ）ｅｎｈａｒｄｔ溶？’ｌ　／　０．　Ｉ
ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で６０℃、　１
時間プレハイブリダイゼーションを行った。

２１−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチド、の５′末端を
［ｒ　−３２Ｐ　］　ＡＴＰで標識し、１ｍｌ当り１．
２ｘｌｏ’ｃｐｍになるようにハイブリダイゼーション
液を調製し、６０℃１０分間インキュベートした後、室
温で１８時間ハイブリダイゼーションを行った。

ニトロセルロースフィルターは、４ｘＳＳＣ１０、ｌＸ
５Ｏ５１０，２χビロリン酸ナトリウム溶液で室温１０
分間２回洗浄し、更に３０℃で１５分間２回洗浄した後
、フィルターを風乾させ、オートラジオグラフィーを行
った。

ｃＩ）ＮＡフラグメントを用いた場合、３　ｘ　ＳＳＣ
を含むハイブリダイゼーション液で６０″ＣＩ８時間ハ
イブリダイゼーションを行い、３　ｘ　５ＳＣ１０，１
χＳＯＳ溶液で室温洗浄後、　０．１　　ｘ　５ＳＣ１
０，１！ＳＤＳ溶液で６０℃１５分間２回ン先θした。

二のようにしてスクリーニングした結果、塩基配列１４
３６〜１５１６番を含むｐＰＥｓｌｌを得た。このｐＰ
ＥＳＩＩのｃＤＮＡフラグメントをプローブとしてオリ
ゴ（ｄＴ）をブライマーとして作製したｃＤＮＡライブ
ラリー（７χ１０ａトランスフオーマント）をスクリー
ニングし、　　ｐＰＥＳ２８　　（９７０〜２５００）
、　　ｐＰＥｓ３１　　（６３３〜１５８５）、ｐＰＥ
Ｓ３３　（９７０〜２＋８７）を得た。

ｐＰＥｓ３１をＰｓｔＩで消化して得られたフラグメン
ト（６３３〜１００１）をプローブとして２４−ｍｅｒ
オリゴヌクレオチドからのｃＤＮＡライブラリー（１ｘ
ｌＯ’　）ランスフォーマント）より、ｐＰＥｓ４０　
（５３〜９５３）　ヲ、更ニｐＰＥｓ４０を５ａｕ３Ａ
　ＩとＱｉｎｆＩテ消化した得たフラグメント（６４〜
３４６）をプローブとして、上記のオリゴ（ｄＴ）から
のｃＤＮＡライブラリーより、ｐＰＥＳ４３　（−６〜
４９１）を得た０次いで塩基配列３５９〜３７５番に相
補的な配列をもつ１７−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを
合成し、これをブライマーとして作製したｃＤＮＡライ
ブラリー（ｌＸｌ０’　トランスフォーマント）を、ｐ
ＰＥＳ４３を５ａｕ３ＡＩ′Ｔ！消化して得たフラグメ
ント（−６〜６３）をプローブとし１”　ｐＰＥＳ１０
２　（−１１１〜２３９）　トｐＰＥＳ＋０３　（−９
４〜３５８）を得た。

（４）ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定得られた
ｃＤＮＡ配列決定の為に、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ　Ｉサ
イトに組み込まれたｃＤＮＡインサートを精製し、種々
の制限酵素で切断あるいはＢＡＬ３１ヌクレアーゼで消
化し、ｃＤＮＡフラグメントを調製した。これらをｐＵ
ｃ１９のマルチクローニングサイトに挿入してサブクロ
ーニングを行い、目的のｃＤＮＡフラグメントを有する
クローンを培養し、プラスミドを調製し、更にアルカリ
処理によって変性させ、ジデオキシ法にて塩基配列を決
定した。以下例としてｐＰＥＳ１０２の場合を記す。他
のプラスミドよりのＤＮＡフラグメントの場合も同様に
して決定した。

ｐＰＥｓ＋０２ＰＥ−ンを１５７１３／ｍｌテトラサイ
クリンを含む５００ｍ１ＬＢ培地で３７℃１２時間培養
した。この大腸菌よりプラスミドを調製し、これを５０
ｍＭＴｒｉｓ−１（ＣＩｐＨ７，５，１００ｍＭＮａＣ
ｌ、ｌｏｍＭＭｇｃＩ２．１ｍＭＤＴＴ　（ジチオスレ
イトール）を含む反応液（５００μｍ）中でＰｓｔＩ（
５０単位）と３７℃２〜３時間反応させた０次いでフェ
ノール：　クロロホルム抽出し、エタノール沈澱によっ
て回収したＤＮＡのうちＩ／２ｆｆｉを更にｌｏｍＭＴ
ｒｉｓ−）ＩＣ１ｐ）１８．０．７ｍＭＭｇＣｈ、２０
ｍＭにＣ１７ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含む反
応液（５００μＩ）中でＳｍａ　Ｉ　（３０１位）と３
７℃２〜３時間反応させ、フェノール：　クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱によってＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡとさきほどの残りＤＮＡを５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて分離し、ｃＤＮＡフラグメント（
約２μｇ）をＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（０，５単位）と
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，０，＋２１ＷＭ　Ｃ
ａＣｌ２．１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２００ｍＭＮａＣｌ
、ＩｍＭ　ＥＤＴＡを含む反応液（＋０７ｚｌ）中で室
温反応させ、２０．４０．６０秒後に３．３μｍづつ反
応液をとり、　１μｍの０．２Ｍ　ＥＧＴＡｐ）１８．
０と５．７μｍの水を入れておいたチューブに入れて反
応を停止させた。そしてそれぞれ５μｉずつをアガロー
スゲル電気泳動に流してフラグメントと大きさと量をチ
エツクした。

こうして得たＰｓｔｌフラグメント、Ｐｓｔ　Ｉ　４駐
１フラグメント及？、ＦＢＬＡ３１ヌクレアーゼフラグ
メントをサブクローニングした。ＰｓｔＩフラグメント
は、Ｐｓｔ　Ｉ消化後、アルカリフォスファターゼ処理
したｐｔノＣ＋９と１０二ｌのモル比で、Ｐｓｊ　Ｉ−
針３Ｉフラグメントは、Ｐｓｔｌ及びＳｍａ　Ｔで消化
後、アルカリフォスファターゼ処理したｐ（ＪＣＩ９と
１〜２：ｌのモル比で、またＢＡＬ３１ヌクレアーゼで
消化したフラグメントは・５ｍａ　ｒで消化後アルカリ
フォスファターゼ処理したｐＨｃ１９と１〜２：ｌのモ
ル比でライゲーションさせた・反応液中に含まれるもの
は、以下の通り。

６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐ）１７．６、ＩｍＭ　Ａ
ＴＰ、１ｍＭスペルミジン、１０　ＩｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１５ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２％　ＢＳＡ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（１単位）ベクターＤＮＡ　（１４，４ｆｍｏ
ｌ）　、ｃＤＮＡフラグメント。

１６℃、３〜１２時間反応させた後、反応液５１１１を
４５μｍの１０　ｍＭ　ＣａＣｌ２／４０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　ｐＨ７，４に添加し
、５０μｍのコンピテント細胞（Ｅ、Ｃｏ１１ＨＢＩＯ
Ｉ）を加えてｃＤＮＡフラグメントとライゲーションし
たベクターＤＮＡを形質転換した。５０μｇ１１のアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地に細胞をまき、３７℃１０
〜１２時間培養し、任意にコロニーを選び出し、５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８ｍ１ＬＢ培地で大腸菌
を培養して（３７℃１０〜１２時間培養）プラスミドを
調製した。１／ｆｌｉｔのプラスミドを適した制限酵素
で消化し、５ｘアクリルアミドゲル電気泳動にてインサ
ートＤＮＡをチエツクし、残りのプラスミドは、塩基配
列決定に使用した。

目的のｃＤＮＡフラグメントをインサートして有するプ
ラスミド（２０μｍ）に２Ｎ　Ｎａ０）１　（４μｌ）
、２ｍＭＥＯＴＡ（４μｍ）、水（１２μｍ）を添加し
、３７℃５分間インキュベートし、５Ｍ酢酸アンモニウ
ム（ｐＨ４゜５．１６μｍ）とエタノール（２００μｍ
）を加えて一２０℃２０分間放置し、遠心後、沈澱を７
０％エタノールで洗浄し、乾燥させた。

配列決定用の試薬として、ＴＡＫＡＲＡ旧３シークエン
スキット（宝酒造）、旧３　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎ
ｄ　ｐｒｉｍｅｒ（１７ｂａｓｅｓ、Ａ２ａｓ＝０．０
３フアルマシア）及びｒｅｖｅｒｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅ　ｐｒｉｍｅｒ（１７ｂａｓｅｓ、Ａ２ｇ＠＝０．１
フアルマシア）を使用した。得られた変性プラスミドの
１７２量に１０倍濃縮バッファ　−１，５μＩ、ＭＩ３
　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒ　３Ｂ　
ｌ、或はｒｅｖｅｒｓｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｐｒｉｍ
ｅｒ１μｍと水を加えて全ｆｆ１１２μｍとし、６０℃
２０分間インキュベートした後、ゆっくりと室温までも
どし、プラスミド（鋳型ＤＮＡ）とブライマーをアニー
ルさせた。マイクロ遠心チューブに４種類のｄＮＴＰ−
ｄｄＮＴＰ混合液（ｄｄＮＴＰは、４種のジデオキシヌ
クレオチドリン酸を示す）を２μｍずつ分注し、プラス
ミドとブライマーの混合液に［α３２Ｐ　］　ｄＣＴＰ
　（４００ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマジャム）２μｍとに１
ｅｎｏ−酵素（２単位／７１１）を加え、３．５μｍず
つを、先はど分注しておいた４本のｄＮＴＰ−ｄｄＮＴ
Ｐ混合液に加えて、更に３７℃、２０分間インキュベー
トした。これにチェース混合液を１μｍずつ加えて、更
に３７℃、２０分間インキユベートシた。

６７ｚｌのホルムアミド停止液を加えた後、９０℃、３
分間加納し、氷上で急冷し、サンプルを２μｍずつ６χ
グラジエントシークエンスゲルにのせて、泳動を行った
。泳動後１ｏｚメタノールハＯｚ酢酸水溶液に’７’　
）”２　ｆＦｔ　Ｌ／　下固定し、ろ紙（Ｗｈａｔｍａ
ｎｎ　３ＭＭ）の上にゲルを移し、ゲル乾燥器にて、乾
燥させた後、オートラジオグラフィーを行い、塩基配列
を解読した。　Ｓｉｎｇｌｅ−５ｔｒａｎｄ　ｐｒｉｍ
ｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ
を用いることで、ｃＴｈＮＡの正逆両値の塩基配列を解
読することができた。このようにして他のプラスミドよ
りのｃＤＮＡフラグメントも解読し・　全ｃＤＮＡを決
定することができた。結果は、第１図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＧＥＳをコードするＤＮＡ配列及びＰＧＥ
Ｓのアミノ酸配列を示す。第１図においてｐＧＥＳをコ
ードするＤＮＡは、−７２番目〜１７２８番目迄の連続
するＤＭＡ配列で示される。 又、プロセシングの結果得られる天然型のＰＧＥＳは、
１番目〜１７２８番目迄の連続したＤＮＡ配列で示され
る。使用した記号は、Ａ；　アデニン、Ｇ；　グアニン
、Ｔ；　チミン、Ｃ；　シトシンを示す。 又、アミノ酸の表示は、日本生化学学会績、生化学デー
タブック１．　　ｐ３０の表示方法に従った。 又、　０内で示される塩基及びアミノ酸は、図の配列に
対応する位置においてその塩基或はアミノ酸により置換
される場合の配列を示している。 第２図は、得られたｃＤＮＡの制限酵素地図をを示す。 図の表示の中で最も太い実線で示した部分はＰＧＥＳの
ｃＤＮＡ部分を示し、それζこ伴って示した各制限酵素
は、それぞれの切断部１位を示す。表示した番号は、各
々第１図に示した塩基配列の番号に対応する。又、各プ
ラスミドに対応する図面下側の実線で示される部分は、
スクリーニングの結果得られた８つのプラスミドより単
離されたＤＮＡフラグメントのｃＤＮＡにおける位置を
示す。プラスミドを示すｐＰＥＳｌｌ、ｐＰＥＳ２Ｂ、
ｐＰＥＳ３１％　ｐＰＥｓ３３、ｐＰＥＳ４０、ｐＰＥ
Ｓ４３、ｐｐＥｓ　１０２、ｐＰＥＳ１０３は、便宜上
つけたプラスミド名である。 第２図 ＰＥｓ４３ 手続十市正書（方ヱ０ 昭和６３年　６月　７日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　　殿 １、事件の表示 特願昭６３−０５４９４１号 ２、発明の名称 プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテクーゼを
コードするＤＮＡ ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都中央区京橋２丁目３番６号名称　（６
１３）明治乳業株式会社 代表者　島村端三 ４、代　理　人 住　所　　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号６、補正
の対象 明細書 ７６補正の内容 明細書第２頁第７行目と８行目の間に「３、発明の詳細
な説明」の項目を加入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテター
   ゼをコードする塩基配列の一部または全部を有するＤＮ
   Ａ ２、第１図で示されるアミノ酸配列を有するプロスタグ
   ランジンエンドペルオキシドシンテターゼをコードする
   請求項１記載のＤＮＡ ３、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテター
   ゼをコードする塩基配列が第１図で示される−７２番目
   〜１７２８番目迄の塩基配列である請求項１記載のＤＮ
   Ａ ４、第１図の１番目〜１７２８番目で示されるアミノ酸
   配列を有するプロスタグランジンエンドペルオキシドシ
   ンテターゼをコードする請求項１記載のＤＮＡ ５、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンテター
   ゼをコードする塩基配列が第１図の１番目〜１７２８番
   目で示される塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ ６、塩基配列が第１図で示される−７２番目〜１７２８
   番目迄の塩基配列と実質的に構造遺伝子として同じ機能
   を有する塩基配列からなる請求項１記載のＤＮＡ