JPH01228491A - 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH01228491A JPH01228491A JP5555788A JP5555788A JPH01228491A JP H01228491 A JPH01228491 A JP H01228491A JP 5555788 A JP5555788 A JP 5555788A JP 5555788 A JP5555788 A JP 5555788A JP H01228491 A JPH01228491 A JP H01228491A
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- acetylchito
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産 土の１
本発明は、高級Ｎ−アセチルキトオリゴ簡の製造法に関
する。
する。
良米辺且１
本発明における高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖とは、ペ
ンタオース、ヘキサオース、ヘプタオースなど５ｖｉ以
上のＮ−アセチルキトオリゴ糖な指し、ビフィズス閑の
増殖促進や臨床検査におけるリゾチーム活性の測定基質
として有用で−また、とくにＮ−アセチルキトヘキサオ
ー又は、哺乳動物に対する免疫機能増強作用、抗腫瘍効
果や植物に対する生理活性作用などが報告されている。
ンタオース、ヘキサオース、ヘプタオースなど５ｖｉ以
上のＮ−アセチルキトオリゴ糖な指し、ビフィズス閑の
増殖促進や臨床検査におけるリゾチーム活性の測定基質
として有用で−また、とくにＮ−アセチルキトヘキサオ
ー又は、哺乳動物に対する免疫機能増強作用、抗腫瘍効
果や植物に対する生理活性作用などが報告されている。
従来、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法としては、酸
によるキチンの限定加水分解［ビオヒミ力・ピオフィジ
力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
によるキチンの限定加水分解［ビオヒミ力・ピオフィジ
力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ） ８３．２４５−２５５
（１９６４）コ、キチナーゼなどの酵素によるキチン
の加水分解［ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ） ２００．
＋１２８ （１９６３）］ 、キチナーゼ、リゾチーム
などの糖転移反応を利用した製造方法（特開昭６２−１
４６５９８）などが知られている。
（１９６４）コ、キチナーゼなどの酵素によるキチン
の加水分解［ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ） ２００．
＋１２８ （１９６３）］ 、キチナーゼ、リゾチーム
などの糖転移反応を利用した製造方法（特開昭６２−１
４６５９８）などが知られている。
しかしながら、酸によるキチンの限定加水分解では、２
〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を比較的高い収
率で得ることができるが、５糖以上の高級Ｎ−アセチル
キトオリゴ糖の収率は非常、に低い。
〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を比較的高い収
率で得ることができるが、５糖以上の高級Ｎ−アセチル
キトオリゴ糖の収率は非常、に低い。
一方、キチナーゼなどの酵素によるキチンの加水分解で
は、５糖以上のＮ−アセチルキトオリボ糖を特異的に生
産する酵素は発見されていない。リゾチームは、通常２
〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖な基質とすると
、糖転移活性を示すが、５糖以上の高級Ｎ−アセチルキ
トオリゴ糖の生成量はきわめて少ない０本発明者らは、
キチナーゼに糖転移能があることを見出し５キチナーゼ
を用いた高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の効率的な生産
を可能とした（特開昭６２−＋４６５９８）、 Ｌ、か
し、この方法は、３￥ｙ１以−ＬのＮ−アセチルキトオ
リゴ糖に作用し５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を
生成するもので、キチンの加水分解で最も収率よく調製
することができる２糖のＮ−アセチルキトビオースには
ほとんど作用しない欠点がある。
は、５糖以上のＮ−アセチルキトオリボ糖を特異的に生
産する酵素は発見されていない。リゾチームは、通常２
〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖な基質とすると
、糖転移活性を示すが、５糖以上の高級Ｎ−アセチルキ
トオリゴ糖の生成量はきわめて少ない０本発明者らは、
キチナーゼに糖転移能があることを見出し５キチナーゼ
を用いた高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の効率的な生産
を可能とした（特開昭６２−＋４６５９８）、 Ｌ、か
し、この方法は、３￥ｙ１以−ＬのＮ−アセチルキトオ
リゴ糖に作用し５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖を
生成するもので、キチンの加水分解で最も収率よく調製
することができる２糖のＮ−アセチルキトビオースには
ほとんど作用しない欠点がある。
本発明は、２〜４糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を
基質とし、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解
能を有する酵素な塩析剤の存在下で作用させると合成反
応により効率的に５ｍ以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖
が生成されるという知見に基いている。
基質とし、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解
能を有する酵素な塩析剤の存在下で作用させると合成反
応により効率的に５ｍ以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖
が生成されるという知見に基いている。
一口が ゛しようとする課顕
本発明の目的は、２〜４塘の低級Ｎ−アセチルキトオリ
ゴ糖のいずれを用いても効率的に５糖以上のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を生産する新規な製造法を提供すること
にある。
ゴ糖のいずれを用いても効率的に５糖以上のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を生産する新規な製造法を提供すること
にある。
゛問題を ゛するための−
本発明は、低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有する
酵素を塩析剤の存在下で作用させることを特徴とする高
級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法である。
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有する
酵素を塩析剤の存在下で作用させることを特徴とする高
級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明に使用する低級Ｎ−アセチルキトオリゴ諸は、例
えば、カニ、エビの甲殻からｆ４袈したキチンを酸や酵
素で加水分解して得たものを用いることができる。その
Ｒ’ＳＩ法の一例を示すと、カニの甲殻を希塩酸処理に
よって脱灰後、希アルカ、り処理で除蛋白して得たキチ
ンに濃塩酸を加え、４０℃で３時間部分加水分解する。
えば、カニ、エビの甲殻からｆ４袈したキチンを酸や酵
素で加水分解して得たものを用いることができる。その
Ｒ’ＳＩ法の一例を示すと、カニの甲殻を希塩酸処理に
よって脱灰後、希アルカ、り処理で除蛋白して得たキチ
ンに濃塩酸を加え、４０℃で３時間部分加水分解する。
得られた分解物を水酸化ナトリウムで中和後、残漬を吸
引濾過して除去し、濾液を活性炭カラムに展開し、エタ
ノール直線濃度勾配法で溶出し、Ｎ−アセチルキトビオ
ースからＮ−アセチルキトテトラオースのイ氏級Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖をそれぞれ分離することができる。
引濾過して除去し、濾液を活性炭カラムに展開し、エタ
ノール直線濃度勾配法で溶出し、Ｎ−アセチルキトビオ
ースからＮ−アセチルキトテトラオースのイ氏級Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖をそれぞれ分離することができる。
また、これらの低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の混合物
でも本発明に用いることができる。
でも本発明に用いることができる。
本発明に用いるＮ−アセチルキトオリゴ糖に対して加水
分解能を有する酵素としては、リゾチーム、キチナーゼ
、キトビアーゼなどがあげられる１例えば、市販の卵白
リゾチームやトリコデルマ・リーセイ（Ｔｏｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の生産するキチナーゼ、ノ
カルデイア・オリエンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒ
ｉｅｎｔａｌｉｓ）の生産するキチナーゼ、キトビアー
ゼなどを用いることができる。
分解能を有する酵素としては、リゾチーム、キチナーゼ
、キトビアーゼなどがあげられる１例えば、市販の卵白
リゾチームやトリコデルマ・リーセイ（Ｔｏｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の生産するキチナーゼ、ノ
カルデイア・オリエンタリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒ
ｉｅｎｔａｌｉｓ）の生産するキチナーゼ、キトビアー
ゼなどを用いることができる。
反応溶液中の塩析剤としては、硫酸アンモニウム５＠酸
ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエ
ン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがあげられ、これ
らのうち１種類以上を用いることができるが、好ましく
は硫酸アンモニウムである。適当な濃度としては１〜５
０％、好ましくは２０〜３０％の濃度になるように水ま
たは緩衝液を加えて調整する。
ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、クエ
ン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがあげられ、これ
らのうち１種類以上を用いることができるが、好ましく
は硫酸アンモニウムである。適当な濃度としては１〜５
０％、好ましくは２０〜３０％の濃度になるように水ま
たは緩衝液を加えて調整する。
反応に用いる低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の量は、反
応溶液の飽和濃度付近が好ましく、また酵素の遣は、用
いた低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ＩＢに対し、リゾチ
ーム活性として１０００〜ｌ口０００Ｕが好ましく、ま
たはキチナーゼ活性として０，０１〜ＩＯＵが好ましい
（リゾチーム活性： Ｍ、 １ｕｔｅｕｓの細胞壁を基
質とし、３５℃、ｐＨ６，２で５４０ｎｍにおける吸光
度を１分間にｏ、 ｏｏｔ減少させる酵素量をＩＵとす
る。キチナーゼ活性：コロダイルキチンを基質とし、４
０℃、ｐＨ５，５で１分間に１μモルのＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンに相当する還元糖を遊離する酵素量を
ｌＵとする）。反応温度は、２０〜６０℃、好ましくは
３０〜５０℃で、反応ｐＨは４〜７が好ましい。反応時
間は酵素量、反応温度、ｐＨによって異なるが、通常は
１２〜１２０時間で目的とする反応生成物が最大用とな
る。
応溶液の飽和濃度付近が好ましく、また酵素の遣は、用
いた低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖ＩＢに対し、リゾチ
ーム活性として１０００〜ｌ口０００Ｕが好ましく、ま
たはキチナーゼ活性として０，０１〜ＩＯＵが好ましい
（リゾチーム活性： Ｍ、 １ｕｔｅｕｓの細胞壁を基
質とし、３５℃、ｐＨ６，２で５４０ｎｍにおける吸光
度を１分間にｏ、 ｏｏｔ減少させる酵素量をＩＵとす
る。キチナーゼ活性：コロダイルキチンを基質とし、４
０℃、ｐＨ５，５で１分間に１μモルのＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンに相当する還元糖を遊離する酵素量を
ｌＵとする）。反応温度は、２０〜６０℃、好ましくは
３０〜５０℃で、反応ｐＨは４〜７が好ましい。反応時
間は酵素量、反応温度、ｐＨによって異なるが、通常は
１２〜１２０時間で目的とする反応生成物が最大用とな
る。
目的とする５糖以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖は、非
常に溶解度が低く、反応液中に不溶物として析出してく
るので、反応の進行状況が確認でき、さらに加熱などに
よる反応停止後、遠心分離、濾過等の操作で回収するこ
とができる。回収された生成物は、５Ｗ！１以上のＮ−
アセチルキトオリゴ糖を多く含む混合物である。
常に溶解度が低く、反応液中に不溶物として析出してく
るので、反応の進行状況が確認でき、さらに加熱などに
よる反応停止後、遠心分離、濾過等の操作で回収するこ
とができる。回収された生成物は、５Ｗ！１以上のＮ−
アセチルキトオリゴ糖を多く含む混合物である。
このようにして得られる反応混合物から５糖以上のＮ−
アセチルキトオリゴ糖の分離、精製は、周知の分離精製
手段により行なうことができる。例えば、活性炭に反応
混合物を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離溶
出する方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
等の手段により分離、精製することができる。
アセチルキトオリゴ糖の分離、精製は、周知の分離精製
手段により行なうことができる。例えば、活性炭に反応
混合物を吸着させ、アルコール濃度勾配法により分離溶
出する方法や、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー
等の手段により分離、精製することができる。
次に、本発明の実施例についてさらに具体的に説明する
が、これらの実施例によって本発明が何ら限定されるも
のではない。
が、これらの実施例によって本発明が何ら限定されるも
のではない。
実ＪＬｆ汁±
Ｎ−アセチルキトテトラオース２００ｍｇを１２％の硫
酸アンモニウムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５
）２ｍｌに溶解し、４０℃に保った後、トリコデルマ・
リーセイ （Ｔｏｒｉｃｈｏ−ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅ
ｉ）の生産するキチナーゼを１００Ｕ添加して、４０℃
で４５時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分
間加熱し反応を停止させた。
酸アンモニウムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５
）２ｍｌに溶解し、４０℃に保った後、トリコデルマ・
リーセイ （Ｔｏｒｉｃｈｏ−ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅ
ｉ）の生産するキチナーゼを１００Ｕ添加して、４０℃
で４５時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分
間加熱し反応を停止させた。
生成した不溶物は、遠心分離によって回収し少量の熱水
に懸濁し、再び遠心分離によって分離した。分離した不
溶物は、凍結乾燥機を用いて乾燥し、３２Ｂの白色粉末
を得た。
に懸濁し、再び遠心分離によって分離した。分離した不
溶物は、凍結乾燥機を用いて乾燥し、３２Ｂの白色粉末
を得た。
この白色粉末の生成物組成は、高速液体クロマトグラフ
ィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキトヘブタ
オース３５％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース４７％、
Ｎ−アセチルキトヘプタオース５．８％が含まれていた
。
ィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキトヘブタ
オース３５％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース４７％、
Ｎ−アセチルキトヘプタオース５．８％が含まれていた
。
及五五遣
Ｎ−アセチルキトビオース２００ｍｇを１２％のＦｉＡ
酸アンモニウムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，ｏ
）２ｍｌに溶解し、４０℃に保った後、市販の卵白リゾ
チーム（６回結晶、生化学工業社製）を５．０ＸＩＯ’
Ｕ添加して４０℃で１２０時間反応させた。反応終了後
、１００℃で１０分間加熱し反応を停止させた。生成し
た不溶物は、遠心分離によって回収し、少量の熱水に懸
濁し、再び遠心分離によって分離した、分離した不溶物
は、凍結乾燥機を用いて乾燥し、２０ｍｇの白色粉末を
得た。この白色粉末の生成物組成は、高速液体クロマト
グラフィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキト
ヘプタオース２８％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース３
２％、Ｎ−アセチルキトペンタオース２６％が含まれて
いた。
酸アンモニウムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，ｏ
）２ｍｌに溶解し、４０℃に保った後、市販の卵白リゾ
チーム（６回結晶、生化学工業社製）を５．０ＸＩＯ’
Ｕ添加して４０℃で１２０時間反応させた。反応終了後
、１００℃で１０分間加熱し反応を停止させた。生成し
た不溶物は、遠心分離によって回収し、少量の熱水に懸
濁し、再び遠心分離によって分離した、分離した不溶物
は、凍結乾燥機を用いて乾燥し、２０ｍｇの白色粉末を
得た。この白色粉末の生成物組成は、高速液体クロマト
グラフィーによって確認したところ、Ｎ−アセチルキト
ヘプタオース２８％、Ｎ−アセチルキトヘキサオース３
２％、Ｎ−アセチルキトペンタオース２６％が含まれて
いた。
魚肚り力】
本発明により、従来から製造が非常に困難であった５￥
Ｆｉ１以上の高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を、２〜４
糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ塘を用いて、簡便に、
しかも効率的に製造することができる。
Ｆｉ１以上の高級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を、２〜４
糖の低級Ｎ−アセチルキトオリゴ塘を用いて、簡便に、
しかも効率的に製造することができる。
Claims (1)
- 低級Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を基質とし、Ｎ−アセチ
ルキトオリゴ糖に対して加水分解能を有する酵素を塩析
剤の存在下で作用させることを特徴とする高級Ｎ−アセ
チルキトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5555788A JP2608751B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5555788A JP2608751B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01228491A true JPH01228491A (ja) | 1989-09-12 |
| JP2608751B2 JP2608751B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=13002002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5555788A Expired - Fee Related JP2608751B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2608751B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
-
1988
- 1988-03-09 JP JP5555788A patent/JP2608751B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010178642A (ja) * | 2009-02-04 | 2010-08-19 | Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd | 高級ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2608751B2 (ja) | 1997-05-14 |
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