JPH0122901B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は薄層コーテイング支持体およびそれの
製法、とりわけ特に液体クロマトグラフイーに適
する、薄いコーテイングを持つイオン交換支持体
に関する。 最近の高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
においてはクロマトグラフイーカラム中で数千
1b／in²の圧力が加えられる。そのためにカラム
の充填材料は硬く、こわれないものであることが
必要である。そのため今までは多孔性無機材料た
とえばシリカおよびアルミナを表面に有機固定相
を保持する支持体として使い、液体クロマトグラ
フイー用の種種の充填材料を得ている。 現在までに作られている有機固定相を保持する
多孔性クロマトグラフイー用充填材料は、支持体
表面に有機相を結合するために共有結合を使つて
いる。有機相（Ｐ）の無機支持体表面への結合は
中間にシラン結合剤を使つて行なわれ、そのシリ
コン部分は支持体に結合し、オルガノシランの有
機部分は有機相となるかまたはＰに結合してい
る。そのような無機支持体は例えば米国特許第
3983299号および同第4029583号明細書に開示され
ている。 結合剤の主な機能は無機支持体と有機固定相
（Ｐ）の間に化学結合を作ることであり、これは
クロマトグラフの分離能に影響を与える。この合
成物の一般的な化学式は （この式において≡Siはシリカの３個の結合が無
機支持体に直接結合しているかまたは支持体に結
合している隣りのオルガノシランに結合している
ことを表わし、（−CH₂）−_nは残りの固定相（Ｐ）
を支持体に結びつけている結合手であり、ｍは０
〜18の数である） で表わすことができる。 クロマトグラフイー用充填物の製造においては
製造単位ごとの有機相のコーテイングに確実な再
現性を得るよう努めることが必要である。しかし
とりわけオルガノシランを無機物の表面に結合さ
せる種種の方法が開発されてからは、無機支持体
をオルガノシラン溶液で処理する時無機物の表面
に付着するオルガノシランの量の再現性を制御す
ることは困難であることがわかつている。無機支
持体の表面に付着するオルガノシランの量はクロ
マトグラフイーにとつてきわめて重要である。充
填物の結合相のクロマトグラフイーにおける挙動
は、粒子上の有機材料の性質と量に完全に依存す
る。 オルガノシランの化学結合のほかの欠点は結合
相が浸食されることがわかつたことである。カラ
ムが使われ、カラム容積の数百倍の移動相がカラ
ムを通過するとオルガノシランの加水分解が以下
のように起こり得る。 この反応が進むのは遅いとしても、比較的短時
間例えば連続操作中に１ケ月で実質的に機能の低
下を起こし得る。 本発明により支持体材料上の薄層コーテイング
およびそれを作る方法を得る。有機吸着質の薄層
を無機支持体材料の表面に吸着させ、そこで架橋
化させると、そのようにして作つた支持体は液体
クロマトグラフイーにとりわけ適したものとな
り、そこでは吸着層が固定相となる。本発明を使
うと、制御された再現性および均一なコーテイン
グの厚さを持つコーテイング支持体を得、得られ
る支持体は操作中安定である。 従つて本発明の対象は薄層コーテイングを持つ
改良された支持体を得ることである。本発明のも
う１つの対象は安定で再現性のある薄層コーテイ
ングを持つ改良された支持体を製造することであ
る。 本発明のさらにもう１つの対象は改良されたク
ロマトグラフイー用支持体を製造することであ
る。 本発明のさらにもう１つの対象は支持体材料の
表面に吸着しそこで架橋化している薄層を持つ前
記の改良された支持体を製造することである。 本発明のさらにもう１つの対象は、支持体材料
の表面に吸着し、そこで架橋化している吸着質を
持つ前記無機支持体材料を含む改良された充填材
料を製造することである。 本発明のさらにもう１つの対象は支持体材料上
の薄層コーテイングの製造について改良された方
法を得ることである。 本発明のさらにもう１つの対象は支持体材料に
薄層を吸着させ、前記支持体材料上に形成した薄
層を架橋化させる改良された方法を得ることであ
る。 本発明のさらにもう１つの対象は、支持体材料
を吸着質と接触させて支持体材料の表面に吸着質
が吸着してコーテイングを形成できるようにし、
さらに架橋化剤によつて架橋化をさせることによ
つて支持体材料上に薄層を得る改良された方法を
得ることである。 これらの対象および以上の記述によつて当業者
にとつては明らかになる他の対象から、本発明は
新規の支持体装置および実質的に以下に記載する
その製法、およびとりわけ特許請求の範囲に記載
した事柄に関するが、本発明に詳細に記載した具
体例の変形も本特許請求の範囲の中に含まれるも
のである。 本明細書において支持体材料としてまたは架橋
化剤として挙げる以下の物質名は商品名である。 リクロスフアー Si 500（LiChrospher Si
500） リクロソルブ Si 100（LiChrosorb Si 100） リクロスフアー Si 100（LiChrospher Si
100） クロモソルブ LC−６（Chromosorb LC−６） パーテイシル 10（Partisil 10） バイダツク_tp（Vydac_tp） スフエリソルブアルミナ（Sperisorb
alumina） ビオ−ラツド塩基性アルミナ活性（Bio−
Rad basic alumina、Activity ） ビオ−ラツド酸性アルミナ活性（Bio−Rad
acid alumina、Activity ） コーニングチタニア（Corning titania） エポン 826（Epon 826） エポン 812（Epon 812） 添付した図面は本発明および（または）本発明
の原理の実際の応用のために考案した最も良い形
に従つて本発明を実施した結果を示す。 図１は滴定曲線（HClに対するPH）を示すグラ
フである。 図２はヒト血清タンパク質の分離を示すグラフ
である。 図３はラツト腎臓のホモジネートの乳酸脱水素
イソ酵素の活性図を示すグラフである。 図４はカルボン酸のイソクラテイツク
（isocratic）分離を示すグラフである。 図５はフエノールのイソクラテイツク分離を示
すグラフである。 図６はモノヌクレオチドの分離を示すグラフで
ある。 図７はメタノールで洗浄後のHPLCシリカ（粒
子径10ミクロン）により吸着されたポリエチレン
イミンの保持を示すグラフである。 図８は種種の量のポリエチレンイミン６を含む
架橋化したコーテイングを持つリクロスフア−
Si500（粒子径10ミクロン）のヘモグロビンIEC
（イオン交換能）をピクリン酸IECとして示すグ
ラフである。 本発明は支持体材料上に厚さおよび均一さに再
現性のある吸着層を得ることおよびそのようにし
て作つた支持体または充填材料の操作中の安定性
を得ることをとりわけ目的とする。 固液界面における溶質の濃度は大容量の溶液中
における濃度より大きくなり得ることが物理化学
において広く認められている。表面へのこの吸着
は次の等式 Ｓ＝−Ｃ／RT・dγ／dC （この式においてＳは過剰の溶質濃度／表面のcm²
を表わし、dγ／dCは溶質の濃度に対する溶液の表面 張力の増加度であり、Ｒはガス定数であり、Ｃは
溶液中の溶質の濃度であり、Ｔは絶対温度であ
る）で表わされる。界面における表面張力を減少
させる物質はどれもその界面に集中する。 溶液からそのように吸着が起こることは固体表
面上に溶質分子の単分子層が形成することをひき
おこし、そこでは等式ａ＝KCⁿ（この式でａは吸
着媒の単位量あたりに吸着する溶質量を表わし、
Ｃは溶液中の溶質濃度を表わし、Ｋおよびｎは使
つた吸着媒および吸着質によつて決まる定数であ
る）が広い濃度範囲における吸着過程を良く表わ
す。 溶媒の極性を制御することによつて表面への極
性溶質の吸着を制御できる。溶媒の極性が低いほ
ど吸着は強くなる。分極した表面（P〓^- _sと示す）
および溶媒（P〓⁺ _nと示す）がある場合、溶質（S〓⁺
と示す）の表面への吸着は P〓^- _s＋S〓⁺P〓^- _sS〓⁺ で表わすことができ、一方極性溶媒の吸着は P〓^- _s＋P〓⁺ _nP〓^- _sP〓⁺ _n で表わすことができる。P〓⁺ _nおよびS〓⁺は明らかに
表面P〓^- _sで競合している。表面上の最終的な組成
は異なる成分の表面に対する相対的な親和性およ
び濃度に依存する。 有機溶質（Ｒで示す）の親和性が充分に大きい
ならば、１〜２または３分子の厚みの有機相Ｒの
層で表面は飽和する。この技術により、表面上の
非常に薄く均一な分子フイルムを有機化する簡便
な方法を得る。表面上への有機相Ｒの蓄積にはそ
れ自体で限界がある。すなわち表面活性部分がす
べておおわれれば吸着は止まるのである。これら
の薄い再現性のあるフイルムはクロマトグラフイ
ー用支持体の製造および使用にきわめて適してい
る。 しかし、溶質のカラム体積の数千倍の溶離に支
持体を使つた場合クロマトグラフイーカラム中で
吸着した有機層が充分な長期間の安定性を持たな
いことがあることが明らかである。もつとも強く
吸着した溶質でさえしだいにこし取られることも
起こる。 本発明では表面上に有機分子を定着させるため
に吸着を使い、ひきつづき隣接する分子の共有架
橋を通して表面の連続皮または層にフイルムを安
定化させる。この架橋化過程によつて有機相Ｒの
溶解度は実質的に減少し、そしてコーテイングが
剥離しにくくなる（剥離を起すためには同時に脱
離させねばならない吸着部分の数が大きく増加す
るからである）。 有機相を吸着した支持体の調製は原料の無機支
持体材料の表面に有機相を吸着させることによつ
て行なう。吸着は有機官能基と表面との間のイオ
ン結合、フアン・デル・ワールス力および／また
は水素結合によつて起こる。この吸着層の脱離を
避けるために隣接する有機基は架橋化させる。本
支持体は単吸着および架橋化相によつてできる。 単に吸着させ次に架橋化させた相における有機
化合物の単分子層表面の吸着は次のように図式的
に表わすことができる。 ここでＡは有機吸着質との親和性を持つ基質表
面の部位であり、ＹはＡと相互作用して全有機部
分の表面への吸着を起こす有機吸着質上のアミノ
基であり、Ｒは前記有機化合物の残基でありそし
てＸは隣接吸着物の架橋化に使用するＲ上のアミ
ノ基である。 高分子薄層を生成するのには各々の吸着質が少
くとも２つの架橋化反応に関与していることが重
要である。一般モデルにおいては、吸着質は次の
ように表わされる （Ｙ）_n−Ｒ−（Ｘ）_o ここでＹとＸとはアミノ基でありｍとｎとは１
から数千まで変わる。 隣接吸着質分子の架橋は一般式 （この式でＡとＢとは架橋化剤分子Ｇ上の官能基
であり、Ｇは吸着質上のＸと反応して吸着質分子
を表面に一緒に連結させる化学結合を生成する）
で表わされる架橋化剤によつてなされる。部位Ａ
とＢとは同じかまたは異なる官能基であり、ｍと
ｎとは１から数百まで変わる。場合により、さら
に有機固定相の性質を変化させてそのクロマトグ
ラフイーでの使用を容易にすることは好ましい。 共有結合した追加の有機部分ＣおよびＤを持つ
架橋化剤Ｇを使用することによつて、全結合化学
を変化させずに充てん物のクロマトグラフイー用
の性質を変えることが可能である。ＣおよびＤ配
位子の数はｏおよびｐで表わされ、架橋分子１個
中で０から数百まで変わる。 例 １ 多孔性シリカ上のポリエチレンイミンコーテイ
ングの調製 リクロスフア−Si500（粒子径10ミクロン）４ｇ
をメタノール15ml中のポリエチレンイミン６（平
均分子量600）1.5ｇの溶液中に加えかきまぜる。
弱い真空で支持体の細孔から空気を除去する。ろ
過によつてシリカを集め、減圧ロート上で40分間
空気乾燥する。ジオキサン12.5ml中にペンタエリ
スリトールテトラグリシジルエーテル1.25ｇを溶
解した架橋化溶液中にコーテイングされたシリカ
を再び加えてかきまぜ、脱気する。この混合物を
16時間室温で放置し、それからスチームバス上で
10分ごとにかきまぜながら40分間加熱する。生成
物をろ過で集め、アセトン、水そしてアセトンで
数回洗浄し、空気で乾燥する。 生成したコーテイングされたシリカは小分子
（ピクリン酸）と大分子（ヘモグロビン）との結
合力と遊離力とを溶液中で測定する。コーテイン
グされた支持体１ｇ当りのピクリン酸のイオン交
換能（IEC）は1.32ミリモルであり、一方このコ
ーテイングされた支持体１ｇ当りのヘモグロビン
のイオン交換能は65ミリグラムである。 コーテイングされたシリカの元素分析はC5.59
％、H1.29およびN2.26％である。酸素（約1.3
％）を加えると、コーテイングは生成物の質量の
約10％を成しているようである。ＣとＮの比は窒
素残基の21％が架橋化していることを示してい
る。 ピクリン酸のIECと元素分析とを比較すると、
窒素残基の77％がピクリン酸分析で検出されそし
てこれがイオン交換に関与できるものである。 コーテイングされた支持体250ミリグラムを
NaClの１モル溶液10ml中に懸濁し、0.1N HClで
滴定する。懸濁液のPHの変化は図１に示されるよ
うに、この材料がPH範囲０〜９に渡る連続的な電
荷の減少に伴い弱い陰イオン交換体として作用す
ることを示している。図１の1M NaCl中の滴定
曲線に示されるように、ＡはリクロソルブSi100
（粒子径10ミクロン）0.25ｇであり、Ｂはポリエ
チレンイミン６でコーテイングされたリクロソル
ブSi100（粒子径10ミクロン）0.25ｇでIEC＝ピク
リン酸495マイクロモルである。 ポリエチレンイミン−コーテイングされたシリ
カはスラリー状で4.2mm×25cmカラム中に詰める。
コーテイングされた大孔シリカ（リクロスフア−
Si500；粒子径10ミクロン）で充てんしたカラム
はタンパク質混合物の分割に使用する。人間の血
清タンパク質の分割は図２に示した。図２におい
て、カラムはポリエチレンイミンコーテイングさ
れたリクロスフア−Si500（粒子径10ミクロン）、
25×0.4cmであり、試料は33％に希釈した人間の
血清100μ、溶離は20分直線勾配で0.02Mトリス
アセテートPH8.0から0.02Mトリスアセテート＋
0.5M酢酸ナトリウムPH8.0であり、流速は2.0ml／
分、入口圧は1400psiそして検出はA₂₈₀の測定で
ある。 イソ酵素は適当なポスト−カラム反応器および
検出器でその酵素活性を測定することによつて検
出する。図３はラツトの腎臓ホモゲネートからの
乳酸塩脱水素イソ酵素の活性プロフイルを示して
いる。図３において、カラムはポリエチレンイミ
ンコーテイングされたリクロスフア−Si500（粒子
径10ミクロン）、25×0.4cmであり、試料は15倍に
希釈した、105000×ｇで遠心分離した上澄み
100μであり、流速は1.5ml／分、入口圧は
2600psiそして検出は乳酸およびNADをポスト−
カラム反応器で反応させ螢光を測定する。 表面上層をコーテイングしたシリカ（リクロソ
ルブまたはリクロスフア−Si100、粒子径10ミク
ロン）をカラムに詰め、小分子混合物分割に使用
する。この充てん物の高IECおよび選択性により
多くの化合物のイソクラテイツク（isocratick）
分割が可能である、例えば図４に示すようなカル
ボン酸および図５に示すようなフエノールであ
る。 図４において、フエノキシ酢酸は次のように示
される、(A)フエノキシ酢酸、(B)ｏ−クロロフエノ
キシ酢酸、(C)２，６−ジクロロフエノキシ酢酸、
(D)２，４−ジクロロフエノキシ酢酸、(E)２，３−
ジクロロフエノキシ酢酸そして(F)２，４，５−ト
リクロロフエノキシ酢酸。そしてカラムはポリエ
チレンイミン−コーテイングされたリクロソルブ
Si100（粒径10ミクロン、25×0.4cmであり、試料
は、それぞれの化合物を0.02mgずつ含有する液
100μであり、溶離剤は0.05Mリン酸カルシウム
＋0.1M酢酸ナトリウム、PH7.5であり、流速は1.0
ml／分、入口圧は1250psiそして検定はA₂₅₄の測
定である。 図５において、フエノールは次のように示され
る、(A)フエノール、(B)カテコール、(C)レゾルシノ
ール、(D)フロログルシノール、そしてカラムはポ
リエチレンイミン−コーテイングされたリクロソ
ルブSi100（粒子径10ミクロン）、25×0.4cmであ
り、試料はそれぞれの化合物を0.1mgずつ含有す
る液100μであり、溶離剤はメタノールを10％
含有する0.05Mリン酸カリウム＋0.1M酢酸ナト
リウム、PH5.5であり、流速は1.0ml／分、入口圧
は950psiそして検定はA₂₈₀の測定である。 モノヌクレオチドを階調度で分割し、図６に示
した。これには短いカラム（6.2cm）で充分であ
る。図６において5′−モノヌクレオチドは次のよ
うに示される、(A)CMP、(B)AMP、(C)UMPそし
て(D)GMP。そしてカラムはポリエチレンイミン
コーテイングされたリクロソルブSi100（粒子径10
ミクロン）、6.2×0.4cmであり、試料はそれぞれ
の化合物を0.07mgずつ含有する液100μであり、
溶離は３分直線勾配（1.75分遅延）で0.01Mリン
酸カリウムPH3.0から1.0Mリン酸カリウムPH2.0で
あり、流速は3.0ml／分、入口圧は250psiそして
検定はA₂₅₄の測定である。 例 ２ 多孔性シリカによるアミンの均一な吸着の実証 多孔性シリカ（次に規定する）１〜２ｇをメタ
ノール中のポリエチレンイミン６の10％溶液中に
加えかきまぜて脱気し、ろ過しそして減圧ロート
で空気乾燥する。得られた、コーテイングされた
架橋化していない材料100mgをピクリン酸IECの
検定のために取り出す。残りの材料はメタノール
と水蒸気で湿潤させロート中で簡単にスラリーに
し、そして乾燥する。この洗浄工程を８回くり返
し、各洗浄操作後ごとに材料の試料をピクリン酸
分析のために取り出す。図７のグラフは吸着した
アミンが容易に洗い落とされ、強固に保持された
層、おそらく単分子層に４回または５回の洗浄で
達することを示している。その後の洗浄はこの層
をもつとずつとゆつくり取り除いていく。市販の
HPLCシリカは最初に吸着したアミンの量と単分
子層に残つたアミンの量とにある４つの要素と同
様のものによつて多様である。吸着は活発な工程
であり、シリカ表面の組成によつて影響されるこ
とが実証された。 リクロスフア−Si500（粒子径10ミクロン）は
種々の量のポリエチレンイミン６でコーテイング
される。コーテイングされた試料は前記例１に記
載したジオキサン中のペンタエリスリトールテト
ラグリシジルエーテルの10％溶液で架橋化され、
そしてそのピクリン酸およびヘモグロビンのIEC
を検定する。図８のグラフはヘモグロビンIEC
が、コーテイングされた支持体１ｇ当りのアミン
の濃度が450マイクロモルになるまでは表面アミ
ンの量（ピクリン酸で決定）に伴つて急速に増加
することを示している。アミンの量が増加して前
記濃度を越えるとヘモグロビンIECの上昇はずつ
と遅くなる。これはそのシリカ上のポリエチレン
イミン６の単分子層コーテイングがコーテイング
された支持体１ｇ当り450マイクロモルのアミン
残基を含有していることを意味する。同じ値が別
に図７に示したメタノール洗浄実験からも得られ
る。これらの結果は、シリカの表面は前記濃度で
ポリエチレンイミン６によつて完全に被覆され、
コーテイングは大きな非被覆はん点を全く残して
いないことも示している。 例 ３ 多種のアミンによる多孔性シリカ上の薄層コー
テイングの調製 リクロソルブSi100（粒子径10ミクロン）を後に
特定する多種のアミンの10％溶液中に加えかきま
ぜ脱気し、生成物をろ過で集め前記例１の記載の
ようにペンタエリスリトールテトラグリシジルエ
ーテルで架橋化する。得られたコーテイングのア
ミン含量をピクリン酸検定で測定した。結果は次
の表１である。

【表】 前記のように、これらのアミンは互いに同様で
あり、同じ支持体上のポリエチレンイミン６の単
分子層と同様であつてコーテイングされた支持体
１ｇ当り1500〜1600マイクロモルのアミンである
（図７参照）。単分子層より過剰のどんな小アミン
も架橋化工程中に洗い落とされることがわかる。
そしてアミンが単独でも重合体でも単分子層中の
アミン残基の数と表面吸着部位とは１対１の関係
であることもわかる。 これらの結果に対する１つの例外が、貧弱なコ
ーテイングを与えるＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジ
アミンに認められた。これは分子中の活性水素の
数の少いことに基因するもので、それは広く架橋
化することをはばむものである。生成したコーテ
イングは不安定でそしてその後の架橋化処理中に
洗い落された。 例 ４ 多孔質シリカ状に薄層コーテイングを安定化す
るための種々な架橋化剤の使用 リクロスフア−（Lichrospher）Si500（粒子径10
ミクロン）２ｇを、ポリエチレンイミン６のメタ
ノール中15％を含む溶液中でかきまぜ、そして脱
気する。次にそれを減圧ろ−と上でろ過し、そし
て風乾する。コーテイングされたが架橋化されて
いないこの生成物を８つの270mgの試料に分け、
それをそれぞれ異なる架橋化剤で次のように処理
する。 試料Ａ； ２−メチル−２−ニトロ−１，３−プロパン
ジオール２ミリモルを含むジオキサン５ml中で
かきまぜそして脱気した。この混合物を３日間
室温に放置し、次に蒸気浴上で時々かきまぜな
がら30分間加熱した。生成物をろ過して集めそ
してアセトン、水、ジエチルアミン、水そして
再びアセトンで洗浄し、そして風乾した。 試料Ｂ；１，３−ジブロムプロパン２ミリモルを
含むジオキサン５ml中でかきまぜそして脱気し
た。この混合物を室温に24時間放置し、次に蒸
気浴上で時々かきまぜながら30分間加熱した。
生成物をろ過しそして試料Ａと同様にして洗浄
した。 試料Ｃ；ジチオビス（スクシンイミジルプロピオ
ネート）２ミリモルを含むジオキサン５ml中で
かきまぜそして脱気した。この混合物を室温に
24時間放置し、次いでろ過しそして試料Ａと同
様にして洗浄した。 試料Ｄ；エチレングリコールジグリシジルエーテ
ル２ミリモルを含むジオキサン５ml中でかきま
ぜそして脱気した。この混合物を室温に24時間
放置し、次に蒸気浴上で時々かきまぜながら40
分間加熱した。生成物をろ過しそして試料Ａと
同様にして洗浄した。 試料Ｅ；塩化シアヌル２ミリモルを含むジオキサ
ン５ml中でかきまぜそして脱気した。この混合
物を室温に24時間放置し、次いでろ過し、そし
てメタノール、水、ジエチルアミン、水メタノ
ールおよびアセトンで洗浄しそして風乾した。 試料Ｆ；ジメチルアジピミデートジヒドロクロリ
ド５ミリモルを含む0.01モルのほう酸ナトリウ
ム緩衝液（PH9.2）中でかきまぜそして脱気し
た。この混合物を室温に24時間放置し、次でろ
過した。生成物を水、ジエチルアミン、水およ
びアセトンで洗浄し、次いで風乾した。 試料Ｇ；エピクロルヒドリン２ミリモルを含むジ
オキサン５ml中でかきまぜそして脱気した。こ
の混合物を室温に1.5日間放置し、次いで蒸気
浴上で時々かきまぜながら40分間加熱した。生
成物をろ過しそして試料Ａと同様にして洗浄し
た。 試料Ｈ（対照試料）；架橋化剤を何も含まないジオ
キサン５ml中でかきまぜそして脱気した。それ
を蒸気浴上で30分間時々かきまぜながら加熱
し、ろ過しそして試料Ａと同様にして洗浄し
た。この生成物を風乾した。 これらの生成物についてそれらのヘモグロビン
およびピクリン酸イオン交換能（IEC）を分析
し、次の通り第２表に示した。

【表】 ドリン
H なし 16 16
第２表は、ジエポキシ樹脂、ニトロアルコール
および臭化アルキル架橋化剤は小さい分子および
たん白質のどちらに対しても良好な陰イオン交換
コーテイングを生成したことを示している。その
他の架橋化剤はこの目的に対しては余り適さない
ものであつた。ジメチルアジピミデートジヒドロ
クロリドは、小分子IECは低いのにたん白質IEC
は高いコーテイングを生ずるという異常なケース
であつた。 同様な実験において、種々のエポキシ樹脂が架
橋化剤として比較された。リクロソルブ
（LiChrosorb）Si100（粒径30ミクロン）1.2ｇにメ
タノール中５％の溶液からポリエチレンイミン６
がコーテイングされた。この生成物の130mgを試
料として、ジオキサン中のエポキシ樹脂10％
（ｗ／ｖ）溶液５ml中でかきまぜそして脱気した。
この混合物を室温で16時間放置し、次に蒸気浴上
で時々かきまぜながら45分間加熱した。この生成
物をろ過して集めそしてアセトン、水そして再び
アセトンで洗浄し、それから風乾した。この生成
物のIECはピクリン酸試験で定量し第３表に示す
通りである。

【表】 どのコーテイングも小分子のIECで著しく変つ
たものはなかつた。これは、いずれの多官能性エ
ポキシ樹脂もポリエチレンイミン６と良好な架橋
化された陰イオン交換コーテイングを作るであろ
うということを示している。エポン826で作られ
たコーテイングはたん白質クロマトグラフイには
適さないだろう。その理由はそれが芳香族残基を
含むからである。しかしそれもある特定された適
用面には有用かも知れない。 第２表と第３表に記載した架橋化剤は、第４表
中のこれまで述べた一般構造の面で次のような特
徴をもつている。

【表】 例 ５ 種々の無機物質上の薄層ポリエチレンイミンコ
ーテイングの製造 シリカ、アルミナまたはチタニアのいずれかの
200mgを、メタノール中ポリエチレンイミン６の
10％溶液中でかきまぜそして脱気した。この物質
をろ過によつて集め、そして減圧ろ−と上で風乾
した。コーテイングされた支持体をジオキサン中
ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル
10％の溶液中でかきまぜそして架橋化し、そして
室温に11時間放置し、それから蒸気浴上で時々か
きまぜながら50分間加熱した。生成物をろ過し、
アセトン、水そして再びアセトンで洗浄し、次い
で風乾した。生成したコーテイングの小分子IEC
を下記第５表に示すようにピクリン酸で定量し
た。制御された細孔のあるガラスの試料を同様に
処理した。ただし架橋化はエポン812の10％溶液
で行つた。第５表は次の通りである。

【表】 アルミナとチタニアとはシリカよりも密度が高
いので、支持体の体積よりもむしろ質量に基づい
てコーテイングを比較することは、アルミナまた
はチタニアをつめたカラムで実施することを軽視
することになる。このようなカラムはシリカが安
定でないPHの高い処での用途に有用になりうる。 例えば例１に記載したような薄層陰イオン−交
換コーテイングは、シランに基づいた共有結合し
た陰イオン交換コーテイングにまさる次のような
利点をもつている。 (a) イオン−交換能（IEC）：薄層コーテイング
をもつ支持体のIECはアミン含有シランのコー
テイングをもつ支持体のそれよりも20倍まで大
きい。これがためにカルボン酸のようなある種
の化合物の分析が傾斜なしにできる。それはま
た傾斜で分析決定されるたん白質およびヌクレ
オチドのような物質のより有効な分離を提供す
る。 (b) 再現性：薄層コーテイングをもつHPLC支持
体の種々のバツチのIECは10％以下の差であ
る。 (c) 耐久性：シランに基づく陰イオン−交換コー
テイングは水性緩衝液で溶離するときには品質
が低下すると報告されている。薄層コーテイン
グにはそのような品質低下は観察されないで、
それは水性媒質中に基礎をなしているシリカの
ように安定である。薄層物質をつめたカラム
は、シランに基く物質をもつカラムに比べて、
カラムが駄目になるまで著しくより長い持続力
がある。そして薄層コーテイングはまた基礎を
なしているシリカをある程度まで保護している
ことを示している。 このように本発明は、多孔質であれ非多孔質で
あれ、高速液体クロマトグラフイにおいて使われ
るすべての無機物質に適用することができる高能
力のイオン交換コーテイングを提供するものであ
る。 種々のアミン、架橋化剤または無機物質の使用
は前記の実施例中に記載されており、そしてイオ
ンの吸引に代る力を通して薄層の吸着も記載され
ている。 本発明は液体クロマトグラフイでの使用によく
適するのであるが、薄層アミンコーテイングをも
つ物質は産業水の処理の分野でも使うことができ
る。例えばこのようなコーテイングをもつた高価
ではないシリカをキレート金属イオンに使いそし
てそれらを溶液から簡単なろ過によつて除去する
ことができるし、そして非常に強い陰イオン性の
廃物もこのような処理法で除くことができる。こ
れに加えて、吸着によつて産業上興味のある酵素
の固定化が同じ安いシリカで実施できるのであ
る。このような酵素はその活性を保留するであろ
う、そして触媒としてその使用後混合物の簡単な
ろ過によつて回収することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は滴定曲線（HClに対するPH）を示すグラ
フである。図２はヒト血清タンパク質の分離を示
すグラフである。図３はラツト腎臓のホモジネー
トの乳酸脱水素イソ酵素の活性図を示すグラフで
ある。図４はカルボン酸のイソクラテイツク
（isocratic）分離を示すグラフである。図５はフ
エノールのイソクラテイツク分離を示すグラフで
ある。図６はモノヌクレオチドの分離を示すグラ
フである。図７はメタノールで洗浄後のHPLCシ
リカ（粒子径10ミクロン）により吸着されたポリ
エチレンイミンの保持を示すグラフである。図８
は種種の量のポリエチレンイミン６を含む架橋化
したコーテイングを持つリクロスフア−Si500（粒
子径10ミクロン）のヘモグロビンIEC（イオン交
換能）をピクリン酸IECとして示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 吸着質として、２個のアミノ基をもつアミン
   を、そのアミノ基に対してイオン相互作用による
   親和性を示す表面をもつ支持体材料に接触吸着さ
   せて、該アミンの薄層コーテイングを該支持体材
   料表面上に形成し、該薄層コーテイングに、その
   アミノ基と化学反応する少なくとも２個の官能性
   基をもつ化学的架橋化剤を作用させて、該支持体
   材料表面上に架橋化した薄層コーテイングを形成
   する ことから成る、支持体材料上に吸着質の架橋化薄
   層コーテイングを製造する方法。 ２ 支持体材料として、シリカ、アルミナおよび
   チタニアから成る群から選んだ無機支持体材料を
   使う、前項１に記載の方法。 ３ 支持体材料として、多孔性シリカ、制御され
   た孔をもつガラス、アルミナ、塩基性アルミナ、
   酸性アルミナおよびチタニアから成る群から選ん
   だ無機支持体材料を使う、前項１に記載の方法。 ４ アミンとして、ポリエチレンイミン６、１，
   ３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、テトラ
   エチレンペンタミンおよびエチレンジアミンから
   成る群から選んだものを使う、前項１に記載の方
   法。 ５ 架橋化剤として、臭化アルキル、エポキシ樹
   脂およびニトロアルコールから成る群から選んだ
   ものを使う、前項１に記載の方法。 ６ 臭化アルキルとして１，３−ジブロムプロパ
   ンを、ニトロアルコールとして２−メチル−２−
   ニトロ−１，３−プロパンジオールを使う、前項
   ５に記載の方法。 ７ エポキシ樹脂として多官能性エポキシ樹脂を
   使う、前項５に記載の方法。 ８ エポキシ樹脂として、ペンタエリスリトール
   テトラグリシジルエーテル、ビスフエノールＡジ
   グリシジルエーテル、グリセリルジグリシジルエ
   ーテルおよびエチレングリコールジグリシジルエ
   ーテルから成る群から選んだものを使う、前項７
   に記載の方法。 ９ 支持体材料表面と吸着質との接触を、実質的
   に単分子層の吸着質が均一な薄層コーテイングを
   形成するように制御する、前項１に記載の方法。 １０ 吸着質を溶媒中に含ませてその溶媒の極性
   を制御することによつて少なくとも部分的に吸着
   の制御を行なう前項９に記載の方法。 １１ 薄層コーテイングを、実質的に単分子層の
   厚さの液体クロマトグラフイー用の安定なイオン
   交換コーテイングとして形成する、前項１に記載
   の方法。 １２ シリカ、アルミナおよびチタニアから成る
   群から選んだ、吸着質に親和性の表面をもつ無機
   支持体粒子を用意し、 この粒子の表面上に均一な薄層コーテイングを
   形成するように、ポリエチレンイミン６、１，３
   −ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、テトラエ
   チレンペンタミンおよびエチレンジアミンから成
   る群から選んだ吸着質を含む溶液中で前記粒子を
   かきまぜ、 この薄層コーテイングした粒子を脱気し、そし
   て この薄層コーテイングが前記表面上で架橋化す
   るように、ペンタエリスリトールテトラグリシジ
   ルエーテル、ビスフエノールＡジグリシジルエー
   テル、グリセリルジグリシジルエーテル、エチレ
   ングリコールジグリシジルエーテル、１，３−ジ
   ブロムプロパン、２−メチル−２−ニトロ−１，
   ３−プロパンジオールおよびジメチルアジピミデ
   ート２塩酸塩から成る群から選んだ架橋化剤を含
   む溶液中で前記の薄層コーテイングされた粒子を
   かきまぜる ことから成る、無機支持体粒子上に架橋化した薄
   層イオン交換コーテイングを製造する方法。 １３ 粒子として粒径約５〜240ミクロンのもの
   を使う、前項１２に記載の方法。 １４ 吸着質含有溶液中で粒子をかきまぜた後そ
   の溶液をろ過して溶液からコーテイングされた粒
   子を回収し、架橋化剤溶液中でかきまぜる前にこ
   の回収したコーテイング粒子を空気乾燥し、この
   コーテイング粒子を架橋化剤溶液中にしばらく放
   置してから加熱し、粒子を含む架橋化剤溶液をろ
   過し、そして架橋化されたコーテイングをもつ粒
   子を空気乾燥することを含む、前項１２に記載の
   方法。 １５ ２個のアミノ基をもつアミンのアミノ基に
   対してイオン相互作用による親和性を示す表面を
   もつ支持体材料と ２個のアミノ基をもち、その一方のアミノ基は
   前記支持体材料の表面に吸着されそして他方のア
   ミノ基はこれと化学反応する少なくとも２個の官
   能性基をもつ化学的架橋化剤により架橋されてい
   る、アミン吸着質の架橋化した薄層コーテイング
   と から成る、架橋化した薄層コーテイング支持体。 １６ 支持体材料として無機支持体材料を使つ
   た、前項１５に記載の支持体。 １７ 無機支持体材料として、シリカ、アルミナ
   およびチタニアから成る群から選んだものを使つ
   た、前項１６に記載の支持体。 １８ 無機支持体材料として、多孔性シリカ、制
   御された孔をもつガラス、アルミナ、塩基性アル
   ミナ、酸性アルミナおよびチタニアから成る群か
   ら選んだものを使つた、前項１６に記載の支持
   体。 １９ 支持体材料として粒径約５〜240ミクロン
   の粒子から成るものを使つた、前項１５に記載の
   支持体。 ２０ 薄層コーテイングを支持体表面上に隣接分
   子が架橋化している約１分子ないし数分子の厚さ
   の有機分子のフイルムとして形成した前項１５に
   記載の支持体。 ２１ アミンとして、ポリエチレンイミン６、
   １，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、テ
   トラエチレンペンタミンおよびエチレンジアミン
   から成る群から選んだものを使つた、前項１５に
   記載の支持体。 ２２ 架橋化剤として、臭化アルキル、エポキシ
   樹脂およびニトロアルコールから成る群から選ん
   だものを使つた、前項１５に記載の支持体。 ２３ 架橋化剤として、ペンタエリスリトールテ
   トラグリシジルエーテル、ビスフエノールＡジグ
   リシジルエーテル、グリセリルジグリシジルエー
   テル、エチレングリコールジグリシジルエーテ
   ル、１，３−ジブロムプロパン、２−メチル−２
   −ニトロ−１，３−プロパンジオールおよびジメ
   チルアジピミデート２塩酸塩から成る群から選ん
   だものを使つた、前項２２に記載の支持体。 ２４ 薄層コーテイングを実質的に単分子層の厚
   さに形成した前項１５に記載の支持体。