JPH0124799B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はモノクローナル抗体、詳しくはヒト成
人Ｔ細胞白血病関連抗原（ATLA、Adult Ｔ−
cell Leukemia−associated Antigens）、殊に分
子量が28000のATLAに反応性を有するモノクロ
ーナル抗体に関する。 今日、二つの代表的な成人Ｔ細胞白血病
（ATL）に関連した培養株細胞が知られている。
その一つは三好らによつて1980年に報告された
ATL患者の末梢血白血病細胞由来のMT−１株
〔Gann71、155−156（1980）〕であり、他の一つは
同じく三好らによつて1981年に報告された他の
ATL患者の末梢血白血病細胞と正常の臍帯血中
白血球との混合培養により確立されたMT−２株
〔Gann72、978−981（1981）〕である。上記MT−
１株及びMT−２株は、いずれもATL患者血清
のほとんどすべてと反応性を有しており、それ故
ATLAを持つていることが確認された〔Proc.
Natl.Acad.Sci.、USA、Vol.78、No.10、6476−
6480（1981）及びNature、294、770−771
（1981）〕。 之等ATLAを有する細胞（ATLA陽性細胞）
は、またＣ型ウイルス粒子を有すること及び該ウ
イルスがレトロウイルスであること〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、USA、Vol.79、2031−2035（1982）〕
が夫々証明され、該ウイルスはATLウイルス
（ATLV）と命名された。 また1982年に山本及び日沼は、これらの細胞を
あらかじめ ³⁵S−メチオニンで標識したのちの細
胞抽出物を、ATL患者血清と特異的免疫沈降さ
せたのち、沈降物をドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）により分子量に基づく分画を施こして
オートラジオグラフイー法で検索した結果、いく
つかの特異的蛋白質の存在を証明し、上記
ATLAがATLV関連抗原であることを立証した
〔厚生省癌研究助成金によるシンポジウム；成人
Ｔ細胞白血病、リンパ腫（ATL）とその病因、
ライフサイエンスセンター出版、pp137−138、
昭和58年１月５日発行〕。 既に、今日まで多くの動物種では、ウイルスに
よつて各種の癌が引き起されることが知られてい
る。ウシのリンパ腫、ネコの白血病、トリの肉腫
等である。人間でもアフリカの子供たちの顎の腫
瘍が出来るバーキツトリンパ腫等ごく一部の癌は
ウイルスによるものであるとされている。発癌ウ
イルスによる発癌の機構の解明は、この様に動物
レベルでは遺伝子工学的手法に基づいて急速に解
明されつつあるが、その場合に重要な点は遺伝子
産物としての蛋白質や糖蛋白質の作用の解明をま
たなければならないことである。その際最も有力
な方法はそれぞれの遺伝子産物に対する特異的な
抗体を用いて物質を同定しかつ定量することであ
る。 一方ATLがレトロウイルスをその原因因子と
してかかえていることとも関連し、該ATLVは
Ｂ型肝炎ウイルスの場合と同様に、ウイルスキヤ
リヤーからの輪血時における感染が予想され、既
に追跡調査が可能なケースの中でのウイルスキヤ
リヤーから非感染者への輪血後感染が報告されつ
つある。ウイルスキヤリヤーを輪血用溶液からス
クリーニングすることは、この疾患の伝播を防止
する最も有力な予防方法となり得るが、そのため
にはATLVを抗原として特異的に、高感度かつ
迅速に測定する必要があり、抗原の定量には特異
的抗体の利用が、また抗体の測定に用いられる抗
原の調製に当つても、特異的抗体が必要となつて
くる。 本発明は上記ATLA（即ちATLV関連抗原）に
対して特異的なモノクローナル抗体（ATLA抗
体）を提供することを目的とするものであり、該
抗体がATLVで免疫した免疫細胞と骨髄腫細胞
（ミエローマ細胞）との細胞融合法により確立さ
れるハイブリドマーにより産生されることを見出
し完成されたものである。 即ち本発明はATLVで免疫した哺乳動物の免
疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞によ
り産生され、ATLAに特異反応性を有すること
を特徴とするモノクローナル抗体GIN−14およ
びモノクローナル抗体GIN−２に係る。 本発明のモノクローナル抗体は、後記に詳述す
る通り、特定の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融
合により作成され、選別されたハイブリドーマの
培養により得られること並びに免疫螢光法によつ
て、ATL患者血清で同定されたATLA陽性細胞
に特異的に結合し、その細胞質のみを染色すると
いうATLA特異性を有し、また免疫沈降法によ
つてモノクローナル抗体GIN−14は主に分子量
28000の分画のATLA（p28）を沈降し、また、モ
ノクローナル抗体GIN−２は分子量28000の他に
分子量20000（p20）及び19000（p19）の分画の
ATLAを沈降させることが確認された。従つて
本発明抗体は、イン ビボ乃至イン ビトロにお
けるATLV又はATLAを持つヒトリンパ系細胞
に対するプローブとして利用でき、ATLVに特
異的な抗原の解析ひいてはATL乃至ATLVの感
染、診断、治療、予防等にも役立つものである。 以下本発明のモノクローナル抗体（ATLA抗
体）の製造法につき詳述する。 本発明のATLA抗体は、ATLVで免疫した哺
乳動物の免疫細胞を、骨髄腫細胞と融合させてハ
イブリドーマを作成し、これより上記特性を有す
るモノクローナル抗体を分離することにより収得
される。 上記本発明方法において細胞融合させる一方の
親細胞としての免疫細胞は、免疫抗原として
ATLVを用いて通常の方法により哺乳動物を免
疫することにより調製される。ここで免疫抗原と
してのATLVとしては、特に限定されず、例え
ば前記したMT−１及びMT−２細胞のほか
YAM、TER、ASO、OKI、KEN、SAT、
OKU〔Science、217、737−739（1982）〕細胞等の
公知のATLA陽性細胞の培養液より、常法によ
り分離されたものを使用することができる。上記
ATLVの分離は、通常の遠心分離法等により行
なわれ、これは更に、密度勾配超遠沈法などに従
い精製してもよい。また上記ATLVで免疫する
哺乳動物としては、特に限定されないが、細胞融
合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して選
択するのが好ましく、一般には、マウス、ラツト
等が使用される。免疫方法も亦一般的方法によつ
て行なわれ、例えばATLVを通常の緩衝液等で
適当濃度に希釈し、フロインドの補助液等との懸
濁液とし、動物に皮下注射等によつて投与する。
初回免疫の３〜５週間後に追加免疫を行ない、総
投与量が、２〜３×10⁵個／mlで培養したATLA
陽性細胞の培養液600ml程度から得られるATLV
量／マウス程度になるようにするのが好ましい。
免疫細胞としては、最終免疫の約３日後に摘出し
た脾臓細胞を使用するのが好ましい。また上記の
如くして得られる免疫細胞と融合される他方の親
細胞としての哺乳動物の骨髄腫細胞（ミエローマ
細胞）としては、すでに公知の種々の細胞株、た
とえばp3（p3／×63−Ag8）〔Nature、256、495
−497（1975）〕、p3−U1〔Current Topics in
Microbiology and Immunology、81；１−７
（1978）〕、NS−１〔Eur.J.Immunol.、６；511−
519（1976）〕、MPC−11〔Cell、８；405−415
（1976）〕、SP2／０〔Nature、276；269−270
（1978）〕。FO〔J.Immunol.Meth.、35；１−21
（1980）〕、×63.6.55.3.〔J.Immunol.、123；1548−
1550（1979）〕、S194〔J.Exp.Med.、148；313−323
（1978）〕等や、ラツトにおけるR210〔Nature、
277；131−133（1979）〕等が使用される。 上記免疫細胞と骨髄腫瘍細胞との融合反応は、
基本的には、公知の方法例えばオイ（Oi）及び
ヘルツエンベルグ（Herzenberg）の方法
〔Selected Methods in Cellular Immunology、
p351−371、W.H.Freeman ＆ Co.、USA出版
（1980）〕等に準じて行ない得る。より具体的には
上記融合反応は、例えば融合促進剤の存在下に通
常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤として
は、通常用いられる例えばポリエチレングリコー
ル（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用
され、更に所望により融合効率を高めるためにジ
メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用するこ
ともできる。免疫細胞と骨髄腫細胞との使用比
は、通常の方法と変りがなく、例えば骨髄腫細胞
に対し、免疫細胞を約１〜10倍程度用いればよ
い。上記融合時の培地としては、例えば上記骨髄
腫細胞株の増殖に使用されるようなRPMI−1640
培地、MEN培地、その他この種の細胞培養に使
用される通常の各種培地を利用でき、通常は牛胎
児血清（FCS）等の血清補液を抜いておくのがよ
い。融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞との所定
量を上記培地内でよく混合し、予め37℃程度に加
温したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6000
程度のものを、通常培地に約30〜60W／Ｖ％の濃
度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以
後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除
去する操作を繰返すことにより所望の融合細胞
（ハイブリドーマ）が形成される。 得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常
の選別用培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で
培養することにより行なわれる。該HAT培地で
の培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞
（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通
常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化
が行なわれる。上記した所望のハイブリドーマの
検索は、例えば、日沼等により提案された
ATLA抗体の間接免疫螢光法〔Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.、Vol.78、No.10、6476〜6480頁
（1981）〕及び酵素抗体法（EIA）、中和反応法、
沈降反応法、補体結合反応法、凝集反応法、オク
タロニイー法、RIA法等の一般に抗体の検出に用
いられている種々の方法によつて行なわれる
〔「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」(株)Ｒ
＆Ｄプランニング発行、pp30〜53、昭和57年３
月５日〕。 かくして得られる本発明のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代
培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が
可能である。このハイブリドーマの代表例として
は、後記実施例によつて得られるGIN−２及び
GIN−14を例示できる。これらは本発明者らに
より分譲可能な状態に保持されている。 上記のようにして得た特定のハイブリドーマか
ら本発明のATLA抗体の製法としては、該ハイ
ブリドーマを常法に従つて培養し、その培養上清
から所望抗体を分離する方法、あるいはハイブリ
ドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与し増
殖させ、その腹水より所望抗体を分離する方法な
どが採用される。前者の方法は、高純度のものを
得るのによく、後者の方法は大量生産に優れてい
る。 かくして本発明によれば後記試験例に示す如
く、ATLA、殊にp28に反応性を有するモノクロ
ーナル抗体が得られる。 次に参考例、実施例及び試験例を挙げて説明す
る。 参考例、実施例及び試験例で使用した培養細胞
株は、すべて公知のものであり、以下に示す通り
である。 (1) ATLA陽性細胞株 MT−１〔Gann71、155−156（1980）〕及び
MT−２細胞株〔Gann72、978−981（1981）〕
を主として用いた。また、下記数種類の
ATLA陽性細胞株〔Science、217、p737−739
（1982）〕を用いた。即ち、健常成人末梢血リン
パ球（PBL）と致死量の放射線照射されたMT
−２とを混合培養することによつて樹立した
YAM、TER及びASO株、イン ビトロでIL
−２の連続的供給下でATL患者の末梢血リン
パ球を培養することにより樹立したKEN、
OKI及びSAT株、並びにATL患者からの自発
的細胞株でその生育はIL−２非依存性である
OKI株を夫々利用した。 (2) ATLA陰性細胞株 コントロールとして下記の細胞株を用いた。 Ｔ細胞株； Molt−４〔Biochem.Biophys.Res.Commun.、
51、529−535（1973）〕 CCRF−CEM〔Cancer、18、522−529（1965）〕 RPMI 8402〔J.Natl.Cancer Inst.、55、11−
14（1975）〕 TALL−１〔Nature（London）、267843−844
（1977）〕 HPB−ALL〔Int.J.Cancer21、166−170
（1978）〕 HPB−MLT〔同上〕 Ｂ細胞株； TL−１〔Jpn.J.Exp.Med.、50、423−434
（1980）〕 BJA−Ｂ〔Biomedicine、22、276−284
（1975）〕 Daudi〔Cancer Res.、23、1300−1310（1968）〕 P3HR−１〔J.Virol.、１、1045−1051（1967）〕 Raji〔J.Clin.Pathol.、18、261−273（1965）〕 LCL−TAN〔J.Immunol.、128、1241−1245
（1982）〕 LCL−KIT〔同上〕 non−Ｔ、non−Ｂ細胞株； HPB−NULL〔島根医大、森川茂教授より入
手〕 HL−60〔Proc.Natl.Acad.Sci.、75、2458−
2462（1978）〕 Ｋ−562〔J.Natl.Cancer.Inst.、50、535−538
（1973）〕 また、長期培養されたCytotoxicT細胞、
YT−13及びTC−SUG＃14〔J.Immunol.、128、
1241−1245（1982）及び同128、1749−1752
（1982）〕や、新鮮PBLもまた、ATLA陰性細
胞として用いた。 (3) 上記の各細胞は、RPMI−1640培地に10〜20
％の熱で不活性化された牛胎児血清（FCS）、
100IU／mlのペニシリン、100μｇ／mlのストレ
プトマイシン及び４ｍＭのＬ−グルタミンを含
む混合培地中で培養した。 IL−２依存性細胞は、IL−２としてヒト脾
細胞をPHAとアロジエニツク細胞で刺激した
細胞培養の上澄〔Microbiology and
Immunology、25、1077−1086（1981）〕の25％
（Ｖ／Ｖ）を上記混合培地に加えて培養した。 各細胞は３〜４日毎に２〜３×10⁵個／mlの
濃度で維持した。 参考例 １ MT−２細胞を３×10⁵個／ml上記混合培地の
濃度で５日間培養し、これを４℃で1500rpmで20
分間遠心する。その上澄を更に４℃、3000rpmで
15分遠心して４の上澄を得た。これをベツクマ
ンJA−20ローター（ベツクマン社）を用いて４
℃、20000rpm、１時間遠心する。得られる沈渣
を10mlのTEN緩衝液（１ｍＭ EDTA、100ｍＭ
NaClの20ｍＭトリス−HCl緩衝液、PH＝7.5）
に懸濁させ、フアルコン1058（フアルコン社）の
プラスチツク皿にのせ、紫外線（6000erg／
min／mm²）を20分間照射したのち、再びこれを上
記と同様にして超遠心した。得られた沈渣を６ml
のTEN緩衝液に懸濁して粗ATLVを得た。その
1.5mlを初回免疫用として−20℃で凍結保存した。 残りを更に蔗糖密度勾配遠沈法により部分精製
した〔Proc.Natl.Acad.Sci.、Vol.79、2031−
2035（1982）〕。即ち、上記と同様に超遠心後、そ
の沈渣を1.5mlのTEN緩衝液に懸濁し、これを20
〜60％の蔗糖密度勾配35mlの上に重層し、４℃で
ベツクマンSW27ローター（ベツクマン社）を用
いて、27000rpmで18時間超遠沈した。密度1.15
〜1.16のウイルス粒子のバンドを回収し、TEN
緩衝液で希釈後、更にベツクマンSW50.1ロータ
ー（ベツクマン社）を用いて４℃で45000rpmで
１時間遠沈した。沈渣を１mlのTEN緩衝液に懸
濁して−20℃にて保存した（ATLV標品）。 参考例 ２ 免疫及び細胞融合 ６週令の５匹の雄性BALB／ｃマウスにつき、
上記粗ATLVの0.3ml（MT−２細胞培養液の約
200mlから得られるATLVに相当）を同量のフロ
インドの完全アジユバンドで懸濁した後、皮下免
疫した。30日後、上記ATLVの標品の0.13ml
（MT−２細胞培養液の約400mlから得られる
ATLVに相当）をアジユバンドと混ぜることな
く先の免疫マウスの腹腔内にブースター注射し
た。 細胞融合は、1980年オイとヘルツエンベルグら
によつて報告された方法を部分的に修正した方法
で行なつた。即ちブースター注射後３日目に脾臓
を取り出しその脾細胞3.2×10⁸個と3.2×10⁷個の
P3／×63−Ag8細胞〔Selected Methods in
cellular Immunology、p351−371、W.H.
Freeman ＆ Co.、USA出版（1980）〕とを、
RPMI−1640培地にて洗浄後、これを混合し、
1000rpmで10分間遠沈した。上清を除去して得た
細胞ペレツトに、37℃に加温した42.5％のポリエ
チレングリコール−1000（PEG−100）と15％ジ
メチルスルフオキシド（DMSO）を含むRPMI−
1640培地の１mlを加え、１分間振とう後、これに
RPMI−1640培地の１mlを加え、１分間振とうし
た。更にRPMI−1640培地の１mlを加え、１分間
振とうし、これに0.5ml／min.にて総量７mlの同
培地を加え、同様に振とうした。これを
1500rpm、５分間遠沈して上清を除去し、15％
FCS含むRPMI−1640培地の10mlを静かに加えて
細胞懸濁液を得た。該懸濁液を96穴の平板の組織
培養用プレート（ヌンク（NUNC）社製）に、
１×10⁶細胞／ウエルにて分注した。HAT培地
（10^-4Mヒポキサンチン、４×10^-7Mアミノプテ
リン、1.6×10^-5Mチミジン及び15％FCSを含む
RPMI−1640培地）での選択は、24時間後から開
始し、各ウエルにつき３、５、８、12、14日後及
びその後は週２回の割合で半量の培地交換を行な
つて細胞を増殖させた。 細胞融合２〜３週間後より、増殖細胞の培養上
澄をATLA抗体のスクリーニングに供した。
ATLA抗体を、1981年日沼らによつて報告され
ている間接免疫螢光法によつて測定した。即ち、
ハイブリドーマ培養上澄を空気乾燥後アセトン固
定したMT−１又はMT−２細胞のスメアーとイ
ンキユベーシヨンした。37℃、30分の反応後、生
理的濃度の食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液
（PBS）で２度洗浄し、引き続き、カペル社
（Cappel Lab.）より購入した抗マウスIgGウサギ
Ｆ（ab′）₂にFITCを標識した試薬を、１：30に希
釈した溶液とともに、37℃、30分インキユベーシ
ヨンした。再びPBSで洗浄後、細胞スメアーを、
50％グリセロールを含むPBSで処理し免疫螢光
を測定した。 アセトン固定化MT−１細胞の免疫螢光の測定
は、ハイブリドーマ培養上澄中の非特異的抗体か
らATLA抗体を識別する上で非常に有用であつ
た。なぜなれば、MT−１細胞中わずか１〜５％
の細胞のみがATLA陽性細胞であり、それらは
またほとんど多核化した巨大細胞であるためであ
る。 かくの如く、最初の培養液におけるATLA抗
体のハイブリドーマスクリーニングの規準は、そ
れが主としてATLA陽性細胞に対して結合性を
もち、他のATLA陰性細胞とは反応しない抗体
を産生しているということであつた。 ハイブリドーマ細胞の増殖は、384穴すべての
ウエルに見られた。これらのうち33ウエルは
ATLA抗体陽性であつた。これらATLA抗体陽
性の培養液中の10個を選択し、培養を拡大し、そ
して最初のスクリーニング後１週間目に再び
ATLA抗体のテストをした。 ATLA抗体の高力価でかつ非特異的反応の弱
い培養液を、ハイブリドーマ0.5個／ウエルとな
る様に限界希釈法によりクローン化し、そして選
択されたクローンを同様の方法で再度クローン化
した。 かくしてクローンNo.GIN−２及びGIN−14の
単クローン株を得た。該細胞株はこれが産生する
モノクローナル抗体によつて特定され、これらは
後述の試験例に示す特性を有する。 上記GIN−２及びGIN−14は液体空気中で安
定に保存されている。 実施例 １ 上記参考例２で得たGIN−２及びGIN−14の
夫々を、10％FCS、100IU／mlペニシリン、100μ
ｇ／mlストレプトマイシン及び４ｍＭのＬ−グル
タミンを含むRPMI−1640培地にて、２×10⁶細
胞／mlで、５％炭酸ガスインキユベーター中で、
37℃にて48時間培養した。培養液を遠心分離
（3000rpm、10分）して本発明のモノクローナル
抗体を含む培養上清夫々約1000mlを取得した。以
下ハイブリドーマGIN−２及びGIN−14由来の
培養上清を夫々「GIN−２抗体」及び「GIN−
14抗体」と指称する。 試験例 (1) IgGサブクラスのオクタロニイーテスト 上記実施例１で得たGIN−２抗体及びGIN
−14抗体のそれぞれを、50％飽和の硫安溶液の
添加により約10倍に濃縮して、1.5％寒天を含
むPBSのオクタロニイープレートの中央にの
せた。マイルス（Miles Lab.）社より購入し
たマウスIgG₁、IgG₂a、IgG₂b及びIgG₃に対す
るサブクラス特異的な家兎血清を、その回りの
ウエル中にのせ、１〜２日後モノクローナル抗
体のサブクラスを寒天ゲル内に現れた免疫沈降
線によつて判定した。 結果GIN−２抗体は、IgG₁とIgG₃とを含ん
でおり、一方GIN−14抗体はIgG₁のみを含ん
でいた。 細胞融合に用いたP3／×63−Ag8ミエロー
マ細胞は、常時IgG₁を分泌しているので、
ATLAに対して特異的な結合活性を有する
GIN−２とGIN−14の抗体は、それぞれIgG₃
とIgG₁のサブクラスを有している。 (2) 免疫螢光法に基づく解析 各種リンパ系細胞や新鮮なヒトリンパ球と
GIN−２及びGIN−14抗体との反応性と、そ
の特異性を、前述の間接免疫螢光法に準じて検
索した。 また、間接免疫螢光法は、1966年クライン等
によつて報告されている方法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、55、1628−1635（1966）〕に従つて
行なつた。 結果を下記第１表、参考図１及び参考図２に
示す。

【表】

【表】 上記第１表より、GIN−２とGIN−14抗体
は、先に間接免疫螢光法によりATLA抗体陽
性ヒト血清でATLAを持つていることが示さ
れたATLA陽性細胞株とのみ反応した。両モ
ノクローナル抗体で染色されたATLA陽性細
胞の螢光陽性細胞の割合は、抗ATLAヒト血
清によつて染色されるものと非常に近接してい
た。 Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、non−Ｔ、non−Ｂ細
胞株、正常のIL−２依存性Cytotoxic Ｔ細胞
株、正常の末梢血リンパ球並びにATLA患者
から分離された新鮮末梢血リンパ球等ATLA
陰性細胞株とは反応性を示さなかつた。 参考図１は、上記MT−２細胞を使用する間
接免疫螢光法において、本発明のGIN−２抗
体を使用した場合の細胞の染色像を、参考図２
は同じく、GIN−14抗体を使用した場合の細
胞の染色像を示す。 両図より、これらのモノクローナル抗体は、
ATLA陽性細胞株の固定化細胞の細胞質のみ
染色し生細胞の膜は染色しなかつた。また、間
接免疫螢光法にもとづくGIN−２とGIN−14
抗体により標識される免疫螢光の特性は異なつ
ていた。即ちGIN−２抗体は参考図１に示さ
れる如く、細胞質の一部を染色するのに対し
GIN−14抗体は参考図２に示される如く細胞
質全体を染色した。これらの発見はGIN−２
とGIN−14のモノクローナル抗体が異なつた
抗原を認識していることを示唆している。 (3) 免疫沈降法に基づく解析 GIN−２及びGIN−14抗体の標的ポリペプ
チドを免疫沈降法とSDS−PAGE解析によつて
検索した。MT−２細胞を ³⁵S−メチオニンに
より代識的に標識化し、NP40を用いた溶解
後、得られる細胞抽出物と培養上澄から集めら
れた精製ATLV標品を、NP40で可溶化した両
サンプルについて検討してみた。即ち、メチオ
ニンを欠く培地に放射比活性800−1000Ci／ｍ
moleのＬ−〔 ³⁵S〕メチオニンを25μCi／mlの
濃度で添加した細胞培養液10ml中で、MT−２
細胞が１ml当り５×10⁶細胞の濃度にて37℃、
10時間インキユベーシヨンした。引続き細胞
を、PBSを用いて３回徹底的に洗浄し、その
後0.14M NaCl、３ｍＭ MgCl₂、１ｍＭジチ
オスレイトール、２ｍＭフエニルメチルスルフ
オニルフルオライド（PMSF）、10ｍＭ Tris
−HCl、PH8.0に、0.5％NP40（半井化学社）、を
含む氷冷された低塩濃度の抽出用緩衝液１mlを
加えて、溶解した。NP−40可溶性細胞質抽出
物、ボルテツクスミキサーで撹拌後、氷水中に
20分間放置した後、４℃、12000ｇで10分間遠
沈してその上澄としてえた（細胞抽出液）。 前記参考例１と同様にして得たATLV標品を
PBSで３回遠心洗浄後、氷冷された上記抽出用
緩衝液に、約0.1mg蛋白質／mlとなる様に溶解し
た。この溶液100μに１ｍCiの ¹²⁵I−Na塩（N.
E.N.社製）を加えた、これに50mg／mlのクロシ
ランＴの0.2M−PBS（PH＝7.2）20μを加え室温
で15秒間反応後100mg／mlのDMSOの0.2M−PBS
（PH＝7.2）50μを加え反応を停止させた。反応
終了後１mg／mlの ¹²⁵I−Na塩のPBSを100μ加
え、更に１％BSAのPBS200μを加えた。この
混合溶液をセフアデツクスＧ−10（フアルマシア
社）カラム（1φ×20cm）に付しPBSにて溶出し、
排除容量（ボイドボリウム分画）の放射活性画画
分を得た（ ¹²⁵I標識 ATLV標品）。 上記細胞抽出液又は ¹²⁵I標識ATLV標品をい
くつかに分注したのち、ハイブリドーマの培養上
澄200μと共に４℃で２時間インキユベーシヨ
ンし、更に抗マウス１ｇＧ家兎血清1.5μを添加
後、更に２時間インキユベシヨンした。 更にスタフイロコツカス・オーレオス
（Staphylococcus aureus）懸濁液（フアルマシ
ア社）（10％Ｗ／Ｖ）・200μを添加し、４℃で
２時間インキユベーシヨンした後、この細菌を
12000ｇで２分間遠沈させた。 この沈渣を20ｍＭ Tris−HCl、PH7.6、0.5M
NaCl、１ｍＭ EDTA、0.5％NP40と１％デス
オキシコレートを含む洗浄用緩衝液に30％の蔗糖
を加えた液で２回洗浄し、引続き10ｍＭ NaCl
を含む10ｍＭ Tris−HCl、PH7.6で２回洗浄し
た。 抗原−抗体−細菌複合体を70μの電気泳動用
緩衝液（0.0625M Tris−HCl、PH6.8、２％SDS、
４％メルカプトエタノール、10％グリヤロール、
0.05％ブロモフエノール ブルー）に再び懸濁
し、そして熱湯水中で３分間加熱した。 上記サンプル30μを分析用SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供した。 SDS−ポリアクリルアミドスラブゲルに於ける
電気泳動は、1970年レムリ（Laemmli）によつ
て報告された５％濃縮用ゲルをもつ10％分離用ゲ
ル中で100Vの定電圧下で行なつた〔Nature、
227、680−685（1970）〕。 電気泳動後、ゲルを1974年ボナー（Bonner）
とランセイ（Laslcey）らの報告した方法に準じ
てフルオログラフイーのために調整した
〔Europian J.of Biochemistry.、46、83−88
（1974）〕 分子量を決定するためフアルマシア社製の分子
量決定キツトを用いた。このキツトはホスホリラ
ーゼｂ（分子量94000）、牛血清アルブミン（M.
W.＝約67000）、卵白アルブミン（M.W.＝約
43000）、カーボニツクアンヒドラーゼ（M.W.約
＝30000）、ソラマメトリプシンヒビター（M.W.
＝約20100）、及びα−ラクトンアルブミン（M.
W.＝約14400）を含んでいる。 ATLA陽性あるいは陰性ヒト血清を用いる免
疫沈降法を、1982年山本及び日沼によつてすでに
報告されている方法に準じて行なつた〔厚生省癌
研究助成金によるシンポジウム；成人Ｔ細胞白血
病、リンパ腫（ATL）とその病因、ライフサイ
エンスセンター出版、p137〜138、昭和58年１月
５日発行〕。 MT−２細胞抽出液を用いた結果を、第２図に
示す。図中、縦軸は分子量を、各レーンの略号は
下記の通りである。 （−）HS；ATLA抗体陰性ヒト血清 ×63；P3／×63−Ag8の培養上清 （＋）HS；ATLA抗体陽性ヒト血清 GIN−１；GIN−14抗体 GIN−２；GIN−２抗体。 該第１図より明らかな通り、GIN−２及び
GIN−14の各モノクローナル抗体は、ATLAの
異なつた抗原かまたは抗原決定基を認識している
ことが判明した。MT−２細胞抽出液のGIN−２
抗体によつて特異的に沈降されてくるバンドは
p28とp20でありp19がわずかに沈降してくるのに
対して、GIN−14はp28のみを主として沈降し
た。 この免疫沈降分析に於いて沈降してくる放射性
物質のいくつかの淡いバンドも又観察された。こ
れらはp36とp23でそれらは又ヒトのATLA抗体
陰性血清やミエローマ上澄で処理された後のもの
よりもGIN−２やGIN−14抗体で処理された時
の方がより多くの沈降線を示した。 データには示していないが、 ¹²⁵I−標識
ATLV標品からの特異的な沈降線は白血病２及
びGIN−14モノクローナル抗体いずれの場合に
も観察出来なかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、MT−２細胞抽出液より本発明の抗
体により特異的に沈降した抗原物質のSDS−
PAGE解析結果を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルスで免疫した哺
   乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融
   合細胞により産生され、主として分子量28000の
   分画のヒト成人Ｔ細胞白血病関連抗原に特異反応
   性を有することを特徴とするモノクローナル抗
   体。 ２ 分子量20000および19000の分画のヒト成人Ｔ
   細胞白血病関連抗原にも特異反応性を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノク
   ローナル抗体。 ３ 分子量20000および19000の分画のヒト成人Ｔ
   細胞白血病関連抗原には特異反応性を有しないこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のモノ
   クローナル抗体。