JPH01250046A - 水と相溶性の被還元性化合物並びにそれを用いた被分析物の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 木兄８Ａは臨床化学に関する。特に、本発明は、還元さ
れて検出可能な種を生成しうる水と相溶性の被還元性化
合物並びに該化合物を含む分析用組成物及び要素に関す
る。本発明は、更に、例えば生物学的流体中の被分析物
の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

液体、例えば水、ミルク及び生物学的流体の化学分析は
、健康の維持及び診断にしばしは望ましいか又は必要で
ある。このような分析を容易にするため徨々の組成物及
び要素が知られている。このような組成物及び要素は、
一般に、分析すべき物質（本明細書では、被分析物と示
す）を測定するための試薬組成物を含む。被分析物は、
生存生物又は非生存化学物質であってよい。試薬組成物
は、被分析物と相互反応すると、検出可能な変化（例え
ば色素形成）を生じる。

最近、生物学ｉ流体、例えば全血、血清、血漿又は尿の
迅速かつ高度に定量的な診断又は臨床分析に有用な組成
物及び要素を開発するため、多くの研究がなされた。

例えば、感染症の迅速かつ有効な診断及び治療のために
は、その病気を引き起こしている細菌をできるだけ迅速
に検出できることが望ましい。尿路感染は、最も一般的
細菌感染症のうちでも、呼吸管の感染に次いでしばしば
起こる。実際、多くの病院において、尿路感染は、しば
しばカテーテル及び種々の外科的処置の使用により起こ
る院内感染の最も一般的な形態である。はとんどの尿路
感染は、尿道より誘導される微生物による上行性感染か
ら起こり、感知されない感染から重症の全身症状まで症
度が変動する。このような感染は、通常、尿／ｌＬｔ当
たり／　００．０００以上の細菌数、顕著な細菌尿と言
われる状態と関係する。正常状態では、尿は無菌である
が、適切に集められ、輸送された試料で／−当たり微生
物１０００個までは外性器からの汚染によって存在しう
る。

微生物及び被還元性化合物を還元しうる他の被分析物の
検出における著しい進歩は、欧州特許出願公開第Ｊ／／
　、ｒり２号公報に記載されている。

該公報に記載されている分析法は、被分析物の存在で検
出可能な種を放出する被還元性化合物を利用している。

まｆｃ特特開昭ココ−２ｒｌｒｊ−号にも同様な還元性
化合物を利用する分析法が開示されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

欧州特許出願公開第、２ｉｉ、ｒり１号公報に記載され
ている被還元性化合物は極めて有利な分析法を提供する
が、一般に、水溶液中への溶解度が限られている。従っ
て、還元性化合物の組成物を製造するために、水溶化界
面活性剤を使用しなければならない。

このような組成物に界面活性剤を使用することは、重大
な欠点を有する。界面活性剤は、ある種の細胞（例えは
白血球）を溶解して、該細胞の検出又は同定全困難にす
る傾向を有する。従って、被還元性化合物を利用する迅
速かつ高感度な分析のため、界面活性剤の使用を回避す
る方法が求められている。

この目的に沿って開発されたのが特開昭６一−２ｒｒｔ
ｔＪ号に開示されている方法である。しかしこの方法は
、すぐれた方法ではあるが、水に相溶性を付与するため
の置換基の導入が難しく容易かつ大量に供給する必要が
あるこの分野では著しく制限をうけることとなる。従っ
て合成法が容易で水に相溶性がありかつ適当なＥ−を有
する被還元性化合物が強く求められているのである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的点は、一般式／の構造を有し、２以下のｐＨ
で還元されて移動可能で検出可能な種を放出することが
でき水と相溶性にする部分を少なくとも７個含み、更に
弐／においてＲ５がＨで置換されている場合、そのもの
が、水中で測定して少なくとも＋１０ＯｍＶのＥｉを有
するものである水と相溶性の被還元性化合物を用いて達
成された。

式中Ｒ１、Ｂ２および几３は水素以外の置換基であって
このうちの少なくとも一つは電子受容性の基を表す。

くとも一つは電子受容性の基’ｌす。

几１　、！：Ｂ　２、几２とＲ３、Ｒ３とＲ４、Ｒ４と
ＦＬｌはそれぞれ互いに結合して環を形成してもよい。

ＴｉｍｅはＮ−Ｘ間の一重結合が開裂したときにそれを
引き金としてＲを開裂、放出する基を衣わし、ｔはｏ−
または／を茨わす。

Ｒ５は移動可能で検出可能な種を宍わす。

式中、実線は結合を、破線はそのうちの少なくとも７つ
が結合していることを表わす。

本発明の目的は、更に、ｐＥｌり以下で緩衝された、前
記の水と相溶性の還元性化合物を含む組成物によって達
成された。

本発明の目的は、更に、 Ａ、被分析物を含むと思われる液体試料を前記の水と相
溶性の被還元性化合物と接触させ、そして Ｂ、被分析物の存在の結果として放出される検出可能な
種を検出する 工程を含む、被分析物の測定方法によって達成された。

本発明において、更に有用な被還元性化合物は次の一般
式コで表わされるものである。

式中、Ｒは窒素原子（Ｎ）とＸに結合し、３ないしｔ員
の単環あるいは縮合した複素環を形成するのに必要な原
子群を表わす。

その他の意味は一般式／において述べたものと同じ意味
を表わす。

一般式／又はコにおいてＦＬｌ、Ｂ２、几３、几４の基
の例としては次のものを挙げることができる。

ニトロ基、シアン基、カルボキシ基、スルホ基、ハロゲ
ン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、沃
素原子など）、 アルキル基、アラルキル基（置換されてもよいアルキル
基、アラルキル基。例えば、メチル基、トリフルオロメ
チル基、ベンジル基、クロロメチル基、ジメチルアミノ
メチル基、エトキシカルボニルメチル基、アミノメチル
基、アセチルアミノメチル基、エチル基、−一（≠−ト
チカッイルアミノフェニル）エチル基、カルボキシエチ
ル基、アリルｉ、Ｊ　Ｉ　Ｊ　ｌ　３−１リクロロプロ
ビル基、ロープαピル基、１ｓｏ−プロピル基、ｎ−ブ
チル基、ｉｓ□−ブチル基、５ｅｃ−グチル基、ｔ−ブ
チル基、ローはメチル基、５ｅｃ−はメチル基、ｔ−ペ
ンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、５ｅｃ
−ヘキシル基、ｔ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ロ
ーオクチル基、５ｅｃ−オクチル基、ｔ−オクチル基な
ど）、 アルケニル基（１ｉ１換されてもよいアルケニル基。

例、ｔ　ハ、　　ビニル基、コークロロビニル基、／−
メチルビニル基、−一シアノビニル基、シクロヘキセン
−／−イル基など）、 アルキニ／’ｆｉｇ（置換されてもよいアルキニル基。

例、ｔば、エチニル基、／−プロピニル基、−一エトキ
シ力ルポニルエテニル基−１ど）、アリール基（置換さ
れてもよいアリール基。例えば、フェニル基、ナフチル
基、３−ヒドロキシフェニル基、３−”ロロフェニル基
、≠−アセチルアミノフェニル基、クーへキサデカンス
ルホニルアミノフェニル基、−一メタンスルホニルーグ
ーニトロフェニル４％　　ｊ−ニトロフェニル基、μ−
メトキシフェニル基、ｌ−アセチルアミノフェニル基、
≠−メタンスルホニルフェニルｉ１．２゜弘−ジメチル
フェニル基ｆ！、ト）、 ？Ｊ素環基（置換されてもよい複索環基。例えば、／−
イミダゾリル基、−一フリル基、コーピリジル基、ｊ−
二トローーーピリジル基、３−ピリジルＭ、Ｊｌｊ−ジ
シアノーーービリジル基、よ−テトラゾリル基、！−フ
ェニルー７−テトラゾリル基、コーヘンツチアゾリル基
、コーベンツイミダゾリル基、−一ベンツオキサゾリル
基、−一オキサゾリンーーーイル基、モルホリノ基など
）、アシル基（＆換されてもよいアシル基。例えば、ア
セチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、１ｓｏ−ブ
チロイル基、コ、−−ジメチルプロピオニル基、ベンゾ
イル基、３．μｍｍジクロＣＩ２インジイル、３−アセ
チルアミノ−弘−メトキシベンゾイル基、≠−メチルベ
ンゾイル基など）、スルホニル基（置換されてもよいス
ルホニル基。

例えハ、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、ク
ロルメタンスルホニル基、フロ／ξンスルホニル基、メ
タンスルホニル基、ローオクタンスルホニル基、ベンゼ
ンスルホニル基、μ−トルエンスルホニル基など）、 カルバモイル基（置換されてもよいカル・；モイル基。

例えば、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジメ
チルカルバモイル基、ビス−（−一メトキシエチル）カ
ルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、シクロヘキシ
ルカルバモイル基、ジー０−オクチルカルバモイル基、
３−ドデシルオキシプロピルカルバモイル基、ヘキサデ
シルカルバモイル基、３−オクタンスルホニルアミノフ
ェニルカルバモイルｉ７１　ト）、 スルファモイル基（置換されてもよいスルファモイル基
。例えば、スルファモイル基、メチルスルファモイル基
、ジメチルスルファモイル基、ビス−（−一メトキシエ
チル）スルファモイル基、ジエチルスルファモイル基、
シーｎ−７−チルスルファモイル基、メチル−ｎ−オク
チルスルファモ（Ａ４％ｎ−ヘキサデシルメチルスルフ
ァモイル基、３−エトギシプロビルメチルスルファモイ
ル基など）。

Ｒ１−Ｒ４のうちの少なくとも１つは電子受容性の基を
表わす。

電子受容性の基は電子を受容する基であれは何でも良い
が、好ましくは以下の式（ＥＡＧ）で表されるものが好
ましい。

式（ＥＡＧ） Ｖ　はＺｏ、ｚ２とともに３〜ｒ員の環を形成する原子
団を衣し、ｎは３〜ｔの整数をあられすが ｖ　　ニーＺ−１ｙニーｚ−ｚ４−１ ｖ　　：　−ｚ　　−ｚ　　−ｚ５−１ｖ、ニーＺ３−
Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−１ Ｖ７：−Ｚ３−Ｚ、−Ｚ５−Ｚ６−Ｚ７−１ｖ８ニーＺ
３−Ｚ、−Ｚ、−Ｚ６−Ｚ７−Ｚ８−である。

Ｓｕｂ　　　Ｓｕｂ 一〇−１−Ｓ−１あるいは一８Ｏ２−を表し、Ｓｕｂは
単なる結合（π結合）、水素原子あるいは以下に記した
置換基を表す。Ｓｕｂはそれぞれが同じであっても、異
なっていても良く、またそれぞれ互いに結合して３〜？
負の飽和あるいは不飽和の炭素環あるいは複素環を形成
しても良い。

一般式（Ａ）では、置換基のノ・メット置換基定数σｐ
の総和が＋０．０２以上、さらに好１しくに十０．３以
上、最も好ましくは＋ｏ、ｔｉｚ以上になるように８ｕ
ｂを選択する。

８ｕｂが置換基の時の例を列挙する。（炭素数はそれぞ
れＯ−２０個が好ましい） 置換あるいは無置換のアルキル基（例えばメチル基、エ
チル基、５ｅｃ−ブチル基、ｔ−オクチル基、ベンジル
基、シクロヘキシル基、クロルメチル基、ジメチルアミ
ノメチル基、トリフルオロメチル基、Ｊ、Ｊ、！−トリ
クロロプロピル基、メトキシカルボニルメチル基など）
、置換あるいは無置換のアルケニル基（例えばビニル基
、コークロロビニル基、／−メチルビニル基など）、置
換あるいは無置換のアルキニル基（例えはエチニル基、
／−フロビニル基など）、シアン基、ニトロ基、ハロゲ
ン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、置換あるいは
無！袂のへテロ環残基（−一ビリジル基、／−イミダゾ
リル基、ペンゾチアゾール−一−イル基、モルホリノ基
、ペンゾオキサゾールーーーイル基など）、スルホ基、
カルバモイル基、置換あるいは無置換のアリールオキシ
カルボニルまたはアルコキシカルボニル基（例工ば、メ
トキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、テトラデ
シルオキシカルボニル基、コーメトキシエトキシカルボ
ニル基、フェノキシカルボニル基、μｍシアノフェニル
カルボニル基、−一クロロフエノキシカルボニル基など
）、置換あるいは無置換のカルバモイル基（例えば、カ
ルバモイル基、メチルカルバモイル基、ジエチルカルバ
モイル基、メチルヘキサデシルカルバモイルＭｓ、ｉ＋
弘、≦−）　ＩＪジクロロェニルカルバモイル基、Ｎ−
エチル−Ｎ−フェニルカルバモイルＭｆｘ　ト）　、ヒ
ドロキシル基、置換あるいは無置換のアゾ基（例えばフ
ェニルアｙ”ｉ、ｐ−メトキシフェニルアゾ基、−一シ
アノー弘−メタンスルホニルフェニルアゾ基など）、置
換あるいは無置換のアリールオキシまたはアルコヤシ基
（例えばメトキシ基、エトキシ基、ベンジルオキシ基、
フェノギア基、弘−メトキシフェノキシ基、３−アセチ
ルアミノフェノキシ基、３−メトキシカルボニルプロピ
ルオキシ基、−一トリメチルアンモニオエトキシ基など
）、スルフィノ基、スルフェノ基、メルカプト基、置換
あるいは無置換のアシル基（例えばアセチル基、トリフ
ルオロアセチル基、ｎ−ブチロイル基、ｔ−プチロイル
基、ベンゾイル基、λ−カルどキシベンゾイル基、３−
二トロベンゾイル基、ホルミル基など）、置換あるいは
無置換のアリールまたはアルキルチオ基（例えばメチル
チオ基、エチルチオ基、ｔ−オクチルチオ基、ヘキサデ
シルチオ基、フェニルチオ基、コ、≠、ｔ−トリクロロ
フェニルチオ基、コーメトキシー１−１−オクチルフェ
ニルチオ基、−一アセチルアミノフェニルチオ基など）
、置換あるいは無置換のアリール基（例えばフェニル基
、ナフチル基、３−スルホフェニル基、≠−メトキシフ
ェニルａ、ｓ−ラｒ：ｙロイルアミノフェノ基など）、
置換あるいは無置換のスルホニル基（例えばメチルスル
ホニル基、り′ロルメチルスルホニル基、ｎ−オクチル
スルホニルａ、ｎ−ヘキサデシルスルホニ／’Ｍ、５ｅ
ｃ−オクチルスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル！
、＄−クロロフェニルスルホニル基、３−ニトロフェニ
ルスルホニル基など）、置換あるいは無置換のスルフィ
ニル２！１ｉ−（例、ｔばメチルスルフィニル基、フェ
ニルスルフィニル基、仏−ニトロフェニルスルフィニル
基など）、置換あるいは無置換のアミノ基（例えば、メ
チルアミノ基、ジエチルアミノ基、アミン基、メチルオ
クタデシルアミノ基、フェニルアミノ基、エチルフェニ
ルアミノ基、アセチルアミノ基、トリフルオロアセチル
アミノ基、Ｎ−ヘキサデシルアセチルアミノ基、Ｎ−メ
チルベンゾイルアミ７基、メトキシカルボニルアミノ基
、フェノキシカルｆニルメチルアミノ基、Ｎ−メトキシ
アセチルアミ７基、アミジノアミノ基、フェニルアミノ
カルボニルアミノ基、≠−シアノフェニルアミ７カルボ
ニルアミノ基、Ｎ−ｘチルエトキシカルボニルアミノ基
、Ｎ−（コーシアノエチル）−ｐ−トルエンスルホニル
アミノ基、トリメチルアンモニオ基など）、置換あるい
は無置換のスルファモイル基（例えば、ジメチルスルフ
ァモイル基、スルファモイル基、ヘキサデシルスルファ
モイル基、λ−シアノエチルへキサディルスルファモイ
ル基、フェニルスルファモイル基、Ｎ−（Ｊ、≠−ジメ
チルフェニル）−Ｎ−オクチルスルファモイル基、ジブ
チルスルファモイル基、ｂｉｓ−（コーメトキシカルｆ
ニルエチル）スルファモイル基など、置換あるいは無置
換のアシルオキシ基（例えば、アセトキシ基、ベンゾイ
ルオキシ基、クロロアセトキシ基など）、置換あるいは
無置換のスルホニルオキシ基（例工ばメチルスルホニル
オキシＭ、ｐ−１−ルエンスルホニルオキシ基、ｐ−ク
ロロフェニルスルホニルオキシ基すど）、が挙げられる
。

電子受容性の基のより具体的な例をあけると、少なくと
も一つの電子吸引性基で置換された了り−”基１１Ｊｔ
ば、≠−二トロフェニル基、λ−二トｏ−弘−Ｎ−メチ
ルーＮ−オクタデシルスルファモイルフェニル基１．２
−Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファモイル−弘−二トロフェニ
ル基、λ−シフ／−Ｓ−オクタデシルスルホニルフェニ
ル！１．２゜グージニトロフェニル基、−、グ、ぶ一ト
リシアノフェニル基、−一二トロー弘−Ｎ−メチルーＮ
−オクタデフル力ルバモイルフェニル！、−２−＝ドロ
ーオーオクチルチオフェニル基、！、４ｔ−ジメタンス
ルホニルフェニル％、Ｊ、Ｊ−−ジニトロフェニルｉ、
−２−クロロ−弘−ニドロー７−メｆルフエニル基、コ
ーニトロー３．ｊ−ジｆｉ＋ルー弘−テトラデシルスル
ホニルフェニル基、コ、≠−ジニトロす７チル基、λ−
エチルカルバモイルーグーニトロフェニル基、−１４ｔ
−ビス−ドデシルスルホニル−ｚ−トｖフルオロメチル
フェニル基、コ、３．≠、ｊ、Ｊ−ペンタフルオロフェ
ニル基、コーアセチルー弘−二トロフェニル基％Ｊｌ≠
−ジアセチルフェニル基、−一二トロー弘−トリフルオ
ロメチルフェニル基など）、置換あるいは無置換の複素
環（例えば、−一ピリジル基、−一ピラジル基、！−二
トローーーピリジル基、ｊ−Ｎ−メチル力ルバモイルー
ーービリジル基、≠−ピリジル基、３．！−ジシアノー
２−ピリジル基、！−メタンスルホニルーコーピリジル
基、！−シアノーーービラジル基、弘−ニトロテオフエ
ンーーーイル基、！−ニトロー／１．２−ジメチルイミ
ダゾール−≠−イルｉ、ｊ、ｊ−ジアセテルーーーヒリ
シル基、／−ドデシル−よ−カルバモイルピリジニウム
ーコーイル基など）、置換あるいは無置換のキノン類（
例えば、／、グーペンゾキノンーーーイル基、Ｊ、ｊ−
、ｔ−トリメチル−／。

弘−ペンゾキノン−コーイル基、３−メチル−／。

≠−ナフトキノンーコーイル基、３．ぶ−ジメチルーよ
−へキサディルチオ−／、弘−ベンゾキノンーλ−イル
基、！−メチルー／、−−ペンソキノンーμｍイル基な
ど）あるいは、以上あげたもののビニローブの他にニト
ロアルキル基（例えば、−一二トローーーフロピル基）
、ニトロアルケニル基（例えば、コーニトロエテニル基
）、α−ジケト化合物の一価の基（例えば、−一オギソ
プロノｅノイル基ｆｔ　ト）　、ニトロアルカン、ニト
ロアルケン類等が挙けられる。

Ｒ６は前述し次ように窒素原子、酸素原子と結合し３〜
．ｒ員の複素環を形成するのに必要な厚子群を表すが、
以下にこの複素環についていくつか例をあげる。

これらの環には置換基が導入されてもよい。

本発明では！に次の一般式３で表わされる被還元性化合
物が好ましい。

式中、几　、几　はそれぞれ単なる結合手、水素原子あ
るいはこれを置換可能な基であり、互いに結合し、飽和
、あるいは不飽和の炭素環あるいは複素環を形成しても
良い。

Ｙは一価の連結基金衣わし、ＥＡＧは電子受容性の基ヲ
衆わす。その他の意味は一般式／において述べたのと同
じ意味を表わす。

Ｒ７、Ｒ８の置換可能な基は具体的にはＲ１−Ｒ４にお
いて説明したと同じ範囲の中から選ぶことができる。Ｒ
，Ｒは互いに結合して飽和あるいは不飽和の炭素環また
は複素環を形成してもよい。

特に有用な水と相溶性の被還元性化合物は、−般式≠で
表わされる構造を有するものである。

式■において、Ｙは一価の連結基を表わすが好ましくは
−Ｃ−あるいは一５Ｏ２−を表わす。

Ｒ７の好ましい例としては、水素原子、置換、無置換の
アルキル基（メチル基、エチル基、１−ブチル基、オフ
タテシル基、フェネチル基、カルボキシメチル基など）
、置換あるいは無置換のアリール基（フェニル基、３−
ニトロフェニル基、参−メトキシフェニル基、μｍアセ
チルアミノフェニル基、弘−メタンスルホニルフェニル
基、μ−スルホフェニル基、≠−カルボキシフェニル基
など）、置換あるいは無置換の複素環基（λ−ピリジル
基、コーフリル基、３−ピリジル基など）があり、 凡　の好ましい例としては、水素原子、置換あるいは無
置換のアルキル基（メチル基、ヒドロキシメチル基、Ｃ
Ｈ２−（Ｔｉｍｅ）ｔ−ＦＬ３基など）、置換あるいは
無置換のアリール基（フエニるいは無置換の複素環基（
≠−ピリジル基など）がある。さらに几　と几　が環を
形成し縮合環を形成する場合の特に好ましい例としては
以下のものかあけられる。

Ｕノ ゝＮ 一般式≠においてＲ５は還元性化合物から放出された時
に検出可能な種を我わす。筐たＲ５がＨで置換されてい
る場合にはそのものは少なくとも＋１０ＯｍＶのＥ−を
有し、Ｒ７、几８、几９、Ｂ　１０又はＲ１１のうち少
なくとも７個は水と相溶性の部分を少なくとも１個含む
ものである。

一般式弘においてＲ９，ＢＩＯそしてＲ１１について詳
述する。

Ｒ９、ＲＩ　Ｏ１凡　　はアルコキシ基（ｆｉｇ換基を
有するものを含む。例えば、メトキシ基、−一・メトキ
シエトキシ基、フェノキシ基、弘−ｎ−へキサデシルカ
ルバモイルフェノキシ基、エトキシ基、ｎ−へキシルオ
キシ基、ｎ−ヘキサデシルオキシ基、メトキシプロピル
基なト）、アシル基（置換基全音するものを含む。例え
ば、アセチル基、ｎ−ドデカノイル基、ベンゾイル基、
コーエトキシカルボニルベンゾイル基、−２−一ジメチ
ルプロパノイル基など）、アルコキシまたはアリールオ
キシカルボニル基（置換基を有するものを含む。例えば
、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−
オクチルオキシカルボニル基、ｎ−ヘキサデシルオキシ
カルボニル基、フェノキシカルボニル基など）、スルホ
ニル基（置換基を有するものを含む。例えば、メチルス
ルホニル基、りａルメチルスルホニル基、エチルスルホ
ニル基、ｎ−１−ｆシルスルホニル基、ｎ−テトラデシ
ルスルホニル基、フェニルスルホニル基、≠−メチルフ
ェニルスルホニル基、ｔ−ドデシルスルホニル基など）
、カルバモイル基（置換基を有するもの金含む。例えば
、カルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ジエチル
カルバモイル基、ｎ　−−ｆチルカルバモイルｉ、Ｊ−
（コ、４！−ジーｔ−ペンチルフェノキシ）フロビルカ
ルバモイルｉ、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−オクチルカルバモ
イル基、（３−ヘキサデシルスルファモイル）フェニル
カルバモイル基、Ｎ−メチル−Ｎ　−ｎ−オクタデシル
カルバモイル基、ｎ−ヘキサデシルカルバモイル基、Ｊ
−ｎ−ドデシルオキシプロピルカルバモイル基、なト）
、スルファモイル基（置換基全音するものを含む。例え
ば、メチルスルファモイル基、ジメチルスルファモイル
基、ジエチルスルファモイル基、ジブチルスルファモイ
ル基、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−へキシルスルファモイル基
％　Ｎ−’チに−Ｎ−ｎ−オクチルスルファモイル基、
Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−ヘキサデシルスルファモイル基、
Ｎ−メチＡ／　−Ｎ　−ｒｌ−オクタデシルスルファモ
イル基、ｎ−ドデシルスルファモイル基、Ｎ−フェニル
−Ｎ−ヘキサデシルカルバモイル基、Ｎ−メｆ−ルーＮ
−３−メトキシプロピルスルファモイル基、　　゛ビス
（コーメトキシエチル）スルファモイル基、ナト）、ニ
トロ基、シアノ基、ハロゲン原子、カルｒ６キシ基また
はトリフルオロメチル基、スルホ基、Ｃ０２ｅ基、５Ｏ
３ｅ基の中から選ばれる基であり、几　およびＢ　１０
は少なくとも一方がニトロ基、シアノ基、スルホニル基
またはトリフルオロメチルから選ばれる。几　、Ｒは好
ましくは少なくとも一方はニトロ基あるいはスルホニル
基である。特にＲ，Ｒの少なくとも一方がニトロ基であ
るものが好ましい。

この時Ｒ９、ＲＩＯのニトロ基以外の一方の基および／
またはＲがスルホニル基、スルファモイル基、アルコキ
シカルボニル基、カルバモイル基、アシル基、トリフル
オロメチル基又はシア、・′基であるものが好ましい。

・荷に、Ｒ９がニトロ基であり、Ｒ１０がスルファモイ
ル基、カルバモイル基、アルコキシカル「８ニル基また
はトリフルオロメチル基であり、Ｂｌｌが水素原子であ
るものが好ましい。

一般弐／〜≠においてＴｉｍｅはＮ−Ｘ結合の開裂をひ
きがねとして、後続する反応を介して几５全放出する基
を表わす。ｔはＱまたは／全衣わす。

Ｔｉｒｎｅで表わされる基は種々公知であり、例えば特
開昭ｔ／−／グー／グア号（！〕頁〜（６）函、同４／
−２３６ｊ弘り号（Ｊ’）頁〜（ハ・頁、欧州特許公開
−２０，７４ＩＬＪ号（／　０　）　〜（Ｊ、２）頁に
記載の基が挙げられる。

本発明の実施に有用な、水と相溶性の被還元性化合物は
、広義には、生理学的ｐＨ（すなわち、り以下）で還元
されて移動可能で、検出可能な程を放出しうる、移動可
能で、検出可能な種を含む水と相溶性の有機化合物と定
義される。用語“移動可能な”とは、（１）被還元性化
合物に結合しているときに第一スペクトル吸収バンドを
有し、放出されたときに第ニスはクトル吸収バンドを有
する色原体部分又は被還元性化合物に結合しているとき
に第一スペクトル励起及び発光バンドを有し、放出され
たときに第ニスベクトル励起及び発光バンドを有する螢
光原体部分、（２）被還元性化合物に結合しているとき
は不活性であるか、遮断されているか又は接近できない
が、放出されたときは活性であるか、遮断されていない
か又は接近できる化学的又は生物学的に有用な部分、又
は（３）被還元性化合物に結合しているときは活性であ
るか又は接近できるが、放出されたときは不活性である
か又は接近できない化学的又は生物学的に有用な部分と
、定義される。

従って、検出可能な種は、被還元性化合物に結合される
場合に化学的に変形され、例えば、前記の（１）につい
ては、被還元性化合物のスペクトル／ζノドは、その種
が放出されたときに有するバンドからは“移動”してい
る。必ずというわけではないが、一般に、バンドは種が
被還元性化合物の一部である場合に実質的に更に短波長
側に移動する。

すべての場合に、バンドは顕著な程度には重ならない。

一つのスペクトルバンドから他への変化は、被還元性化
合物からの部分の単なる放出によるか、又は、このよう
な放出が放出された部分と金にイオン又は媒染剤との相
互反応を伴うか又は分析環境の変化（例えばｐＨの変化
）を伴うことによって起こりうる。環境におけるこのよ
うな変化とともに、９Ｈはり以下に留１らねばならない
。

また、前記のように、移動可能で、検出可能な種は、水
と相溶性の被還元性化合物に結合したときに不活性であ
るか又は遮断されているか又は接近できないが、生理学
的ｐＨで放出されると、その後の相互反応のため生物学
的又は化学的に活性であるか又は接近できるようになる
化学的又は生物学的に有用な部分であってもよい。放出
された活性種は、それ自体で検出可能であるか、又は７
個以上のその後の化学的、物理的若しくは生物学的反応
により検出可能な種を生成することができる。本発明方
法は、種々の化学的又は生物学的目的で、好ましくは生
理学的ｐＨで、被還元性化合物を還元する際に、このよ
うな部分を放出する手段、例えば電子移動剤、酵素、酵
素基質、酵素禁止剤、補助因子、触媒又は反応体を提供
する。

更に、移動可能で、検出可能な種は、被還元性化合物に
結合したときには７個以上のその後の化学的、物理的若
しくは生物学的反応のため活性であるか又は接近できる
が、生理学的ｐ■ｌで放出されたときは、そのような反
応に対して不活性になるか又は接近できなくなる化学的
又は生物学的に有用な基であってよい。

本明細書に記載する被還元性化合物は、水と相溶性〔無
極性有機溶剤中より、極性有機溶剤（例エバ、アルコー
ル、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド又
はジメチルスルホキシド）、水又は少量の４種以上の極
性有機溶剤を含む水溶液に一層容易に溶解しうると定義
される〕である。

どの溶剤が極性であるか、無極性であるかは、当業者に
よって容易に決定されうる。この水相溶性は、化合物上
に７個以上の水と相溶性にする置換基によって与えられ
る。このような置換基は、広義には、−コ、Ｏ未滴の疎
水性パラメータ（Ｐｉ）を有する基と定義される。この
ようなパラメータは、例えば、Ｍａｒｔｉｎ　、Ｍａｒ
ｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　。

Ｉｎｃ、、にューヨーク、／り７１年）発行のれている
ような所定の基に対する標準値である。

これらの部分は、水中で容易にイオン化可能である（例
えば、カルボキシ基又はスルホ基）か又は水中でイオン
化されない（例えばヨードキシ基又はグルコシル基）６
好ましい水相溶性化置換基はカルボキシ基である。他の
有用な置換基はヒドロキシ基、第四級アンモニウム基、
スルホンアミド基等を包含する。

本発明において、一般式ｌ−≠で定義したＲ５すなわち
移動可能で検出可能な種の測定は示差パルスポーラログ
ラフイ又は循環電圧測定（ｃｙｃｌｉｃ　　ｖｏｌｔａ
ｍｅｔｒｙ）ｆ使用して標準電気化学的技法によシ行う
〔例えば、Ｓａｗｙｅｒ　及Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　　
＆　５ｏｎｓ、　　二、：Ｌ−ヨーク、／２７ケ年、参
照〕。Ｅ−値か水中で測定して十／ｏｏｍｖ　〜＋ｔｉ
００ｍＶであるのが好ましい１、Ｐｉ値の測定に関する
詳細は、更に下記の第１表の前に記載する。所望のＥ−
ｆｌ、当業者にとってよく知られた手段によって達成さ
れる。例えば−般式３の几　、Ｒそして匡■口上の適切
な電子吸引性基によって又は核に結合した歪ある縮合環
又は両者の組合せによって達成される。

本発明に用いられる水と相溶性の被還元性化合物は、７
個以上の電子を提供する適当な還元剤例よって還元され
るが、この還元ならびに引き続いて起こる移動可能で検
出可能なる種の開裂様式に関しては写真の分野において
すでに欧州特許公開ココ０．フ≠６号に詳細に述べられ
ている。

写真分野で使用される被還元性化合物と比較した場合、
本発明の化合物の違う点は、高いＥ−値を有し、これに
より生理学的ｐＨ（すなわちり以下）で還元及びその後
の移動可能で検出可能な種の放出を容易にすることであ
る。

本発明における移動可能で検出可能な種凡　の例として
は、ます分子残部と共に第一スペクトルバンドを有する
が、本発明の化合物から脱離されると、第ニスベクトル
バンドを有する検出可能の種全生じるものを挙げること
ができる。この種は、存在する還元剤の情に正比例しう
る量で放出される。Ｆ几Ａ（）の特定の組成は、所望の
検出可能な種の種類及び使用する特定の検出手段に応じ
て著しく変動しうる。

移動可能で、検出可能の種は、適当な手段によって直接
検出しうる物質、及び他の物質、例えば被分析物、酵素
又は他の試薬と反応して検出可能な種を生成しうる物質
であってよい。このような種は、比色計で検出されうる
色原体（例えば染料又は顔料）及び螢光測定で検出しう
る螢光原性物質（例えば螢光性染料又はプローブ）を含
めて、放射測定手段によって検出可能なものを包含する
。

更に、検出可能な稿は、燐光性種、化学発光性種、又は
当業者に公知の他の任意の検出可能な種であってよい。

特に有用な移動可能で、検出可能な種は、放出前には第
一スペクトルバンドを有し、放出後に測定すると第ニス
はクトルバンドを有する色原体及び螢光原性物質である
。色原体の有用なものの例は、アゾ染料、アゾメチン染
料、ニトロフェノール染料、インドフェノール染料、イ
ンドアニリン染料及びトリアリールメタン染料、及びこ
の分野で公知の他のものであり、アゾ染料が好ましい。

螢光原性物質の有用なものの例は、クマリン類、μｍオ
キソ−≠Ｉ（−ベンゾ−（ｄ、ｅ）アントラセン及びそ
の誘導体、フェナレノン類及びベンゾフェナレノン類、
フルオレセイン及びロータミンフルオレセイン染料、並
びにこの分野で公知の他のものである。フェナレノン染
料が特に有用である。

有用な燐光性種は　、２　／　、　ｚ　／−ジブロモフ
ルオレセイン及びａ／、Ｚ／−ショートフルオレセイン
のような燐光性物質を包含する。有用な化学発光種はル
シフェリンである。

以下に本発明で用いる被還元性化合物の具体例を挙げる
。

本発明の水と相溶性の被還元性化合物はすべて欧州特許
公開−一〇、７参〇号等によって公知の方法あるいは、
又熟練した合成化学者には容易に判る技法及び出発原料
を用いて製造することができる。

特に特願昭ツー−２８１３号には本発明の化合物におい
て移動可能で検出しうる種Ｒを導入する為の合成中間体
の詳細な合成法が述べられており、本発明の化合物群の
合成にはきわめて有用である。

合成例 ｔ　前記衣中の化合物／の合成 （クロル体〕 原料であるクロル体（ｍ、ｐ、ＪｊＪｏ）を特願昭／、
２−ｊｊｌ！ｊ号に記載されている方法を用いて合成し
た。

クロル体Ｊ　、　ｌｒ　ｆｔ−ＤＭＦＪ　Ｏ−に溶解し
その中に水素化ナトリウム≠００■（ｔｏ％分散油）を
入れｚ　’Ｃで７０分間攪拌した。

化合物Ａ／、７ＰをＤＭＦ１０ｍｌＶＣ溶解し水素化ナ
トリウム１００■（ｔｏ％、分散油）を入れ１０分間室
温で攪拌する。両者を混合して４ｔｏ℃で３時間攪拌し
た後、溶媒を留去し、テトラヒドロフランを加え加熱濾
過し、母液を結晶化すると７．４（ｒの／が得られた。

ｍ、ｐ、Ｊ７０’ｃ以上。

２　化合物３の合成 （クロル体） 原料であるクロル体（ｍ、ｐ、／ターー／り４ｔｏ）を
特願昭６−−２８１３号に記載されている方法を用いて
合成した。

化合物Ｂ／、り！？をＤＭＦＪＯ胤ｌに溶解し、ｔ−ブ
トキシカリウム／、／ｆｆ加えて、室温にて３０分間攪
拌した。その中にクロル体３．ｒ？のＤ　Ｍ　Ｆ溶液１
０ｔｘｌｆ徐々に加えて滴下後μ時間μｏ　’Ｃで攪拌
【、また。

反応終了後、溶媒全留去し食塩水を加え酢酸エチルにて
くり返し抽出した後溶媒を留去し得られ±固形物を酢酸
エチルにて再結晶すると化合物３がη、−２得られた。

ｍ、ｐ、、２Ａ００゜３　化合物りの合成 （ユウａル体） 原料であるクロル体（ｍ、ｐ、／りＯ〜／り１００分解
）は、既知化合物である。

また色素部Ｃも写真業界では公知の化合物である（この
色素の類似した反応については、％開昭ｊ／−１ｊ４０
μ７号等に記載されている。）。

化合物Ｃｊ　、　４ｔｒ′ｔ−ＤＭＦ／　Ｏｔｓノに溶
解し、その中に水素化ナトリウム≠００ｍｇ（４０％分
散油）を入れ室温にて７０分間攪拌した。

一方、クロル体３．／ｆをＤＭＦｊＯｄに溶解しその中
に水素化す）　ＩＪウム４ｔｏｏ■（４０％分散油）を
入れ室温にて７０分間攪拌した。両者を室温下混合し５
、反応混合物音≠ｏ　’Ｃにて３時間攪拌した。溶媒を
留去し、テトラヒドロフランを加え熱時濾過しＦ液を放
置すると目的の化合物りが７．３２得られた。ｍ、ｐ、
Ｊ７０’ｃ以上。

本明細書に記載する水と相溶性の被還元性化合物は、適
当な緩衝剤及び場合により水と混和しうる溶剤を含む水
性組成物とすることができる。

組成物は、下記の一般的方法で製造することができ、こ
のような製造の特別の詳細については、下記の例弘に記
載する。被還元性化合物をその分子量に応じた濃度で、
−殻内には緩衝液／　ａｔ当たり／〜ｉｏｏ■、好まし
くは！〜ｔｏｔｒＩ！で緩衝液に溶解する。あるいは、
被還元性化合物を水と混和しうる溶剤に溶解し、次いで
適当な緩衝剤と混合することができる。

緩衝液は、一般に分析を生理学的ｐＨ（以下）に維持す
る。水性組成物中の緩衝剤の濃度は、広範に変動しうる
が、一般には０．０／〜０．１モルである。代表的緩衝
剤は、燐酸塩、硼酸塩及びｉｏａ巻３００頁（／りｔｏ
）に報告されたものを包含する。

本明細書に記載する水と相溶性の被還元性化合物は、水
性及び非水性液体、例えば生物学的流体、製造工程液、
廃水又は食品原料の分析測定（すなわち、定性又は定量
内構ｌ１ｔｉ）用の組成物に有用である。化合物を還元
し、検出可能な種を放出する一つの反応又は一連の反応
により株々の被分析物を測定することができる。分析物
は、生存細胞（例えば細菌、白血球、酵母又は真菌）、
酵素（例えばオキシドレダクターゼ、例えば乳酸デヒド
ロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ又はグルコー
ス−６−ホスフニートテヒドロケナーセ、オキシダーゼ
、例えばグルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ又
はα−グリセロホスフェートオキシダーゼ、トランスフ
ェラーゼ、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ又
はアスパラギン酸アミントランスフェラーゼ、ヒドロラ
ーゼ、例、ｔばリハーゼ、カルホキジェステラーゼ、及
びその他（７）　ＮＡＤＨ，ＦＡＤＨ又はオキシダーゼ
に基づく分析）、被還元性化合物を還元する生存細胞以
外の生物学的又は化学的還元剤（例えばアスコルビン酸
塩、システィン、グルタチオン又はチオレドキシン）、
代謝可能な物質（例えはグルコース、乳酸、トリグリセ
リド又はコレステロール）、免疫反応体（例えは抗原、
抗体又はハプテン）を包含する。

酵素レドックス反応並びに７ラビンアデニンジヌクレオ
チド（ＦＡＤ−ＦＡＤＨ）ｉ基質とする反応及びニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ）
を基質とする反応及び（ＮＡＤＰ−ＮＡＤＰＨ）ｔ−基
質とする反応を監視するため、組成物を使用することが
できる。このような場合には、ＮＡＤＨ，ＦＡＤＨ又は
ＮＡＤＰＨの代わりに検出可能な穐ヲ生じる被還元性化
合物を使用することができる。

本発明は、生物学的試料中の生存細胞の検出又は定量に
特に有用である。生存細胞を含むと思われる生物学的試
料（例えば食品、組織、地下水、冷却水、医薬生成物又
は下水）ヲ、細菌、酵母又は真菌について本発明によっ
て分析することができるが、水性液体、例えばヒト及び
動物の流体（例えば尿、脳を髄液、血液及び糞便排泄物
）及びヒト又は動物組織の懸濁液中の細菌検出に特に有
用である。本発明の実施は、尿中で（希釈又は未希釈）
尿路感染の検出に特に重要である。

被還元性化合物を使用して生存細胞を測定する場合、こ
のような測定中で迅速な染料放出に１ケ、生存細胞が電
子移動剤（以下、ＥＴＡと言う）と相互作用するのが好
ましい。ＥＴＡの存在は、非生存被分析物の分析測定の
ため、−層有効な染料放出を生じる。ＥＴＡは、測定す
る物質（例えば生存細胞）と被還元性化合物との間の媒
介物として作用する移動性化合物である。あるＥＴＡは
、所定の生物（下記の例／／参照）を測定する際に特に
良好に作用する。

一般に、本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、示差パ
ルスポーラログラフイー技法を使用して水性緩衝液（ｐ
Ｈ７）中で標準水素電極に対して測定して、−３コＯ〜
十弘ｏｏｒｎＶの範囲のＥ、を有する。一般に、ＥＴＡ
の電位は、測定すべき物質（すなわち、被分析物）の電
位より正側に高く、被還元性化合物の電位より低いもの
であるべきである。すなわち、ＥＴＡは、被分析物より
一層容易に還元され、被還元性化合物より容易には還元
されないものであるべきである。一般に、ＥＴＡ化合物
は、被分析物の濃度に依存する濃度で、好ましくは／Ｘ
ｌ０−７モル〜ノ×１０　　モルの濃度で存在する。

本発明の実施に有用なＥＴＡ化合物は、フェナジンメト
スルフェート、フェナジンエトスルフェート及び当業者
に公知の類似化合物を包含する。

必要に応じて、異なるＥＴＡ化合物の組み合わせを使用
することができる。

更に、低バツクグラウンドという利点を生じる、本発明
の実施に有用な、好ましいＥＴＡ化合物は、欧州特許出
願公開筒１り０，７参〇号公報に記載されているもので
ある。一般に、これらの化合物は、置換ベンゾ−及びナ
フトキノンである。この株のキノン類は、例えばコア３
−ジメチル−１−ヒドロキシメチル−／、４ｔ−ベンゾ
Φノン、−２！−ジメトキシ−／、クーベンゾキノン、
コ、３゜７−）！Ｊメチルー１．グーベンゾキノン、テ
トラメチル−７，４ＬＬ−＜ンゾキノン、−２３−ジメ
トキシ−！−メチルー７．≠−ベンゾキノン、コーヒド
ロキシメチルー／９μｍナフトキノン及びコ−（，２−
ヒドロキシメチル）−／、４４−ナフトキノンである。

生存細胞、及び特に微生物の検出は、しばしばこれらの
細胞に対する栄養素の存在で実施されるが、その存在は
必須ではない。有用な炭素源及び場合により窒素源を含
む任意の栄養培地を使用することができる。適切な成分
及び［）Ｈを有する適当な栄養培地は、文献に良く知ら
れている。特に有用な栄養素は、グルコース又はトリプ
トースの単独又は組み合わせである。

本発明は、溶液又は乾式分析に適用しうる。溶液分析に
おいては、被還元性化合物、及び好ましくはＥＴＡを含
む溶液を製造し、測定すべき生存細胞又は被分析物を含
むと思われる液体試験試料と接触、混合させる。被還元
性化合物と混合する前にＥＴＡ’ｌｒ試験試料と混合す
ることもできる。

一般Ｋ、被還元性化合物を適当な容器（例えば試験管、
ベトｖ皿又はキュベツト）中で試験試料と混合する。生
じる溶液を穏和に混合し、４ｔｏ’ｃ以下の温度、一般
には一０〜ａｏ　ｃの温度で比較的短時間（すなわち、
３０分以下）、保温する。

次いで、検出可能な種を、例えば、色原体種のスペクト
ル吸収バンドにおける波長で、又は螢光原性種の発光バ
ンドにおける波長で（そのバンドは、被還元性化合物が
８１を放出する前に有していたバンドとは異なる）測定
することによって試験試料を評価する。このような評価
は、適当な検出装置を用いて行うことができる。

分析前に、必要に応じて、妨害物質を除去するか又は細
胞を濃縮する前処理工程を実施することもできる。

試験試料を含む多孔性吸収性物質、例えば紙ストリップ
を被還元性化合物の溶液と接触させることＫよって溶液
分析を実施することもできる。試験試料中の被分析物は
、多孔性物質から溶液中に移動し、測定に必要な分析反
応を開始することができる。溶液分析において、存在す
る水と相溶性の還元性化合物の量は、少なくともｏ、ｏ
ｏｉミリモル濃度、好ましくはｏ、ｏｉ〜／、Ｏミリモ
ル濃度でおる。他の試薬は、当業者によって容易に決定
される量で存在することができる。

また、本発明方法を乾式分析要素を用いて乾式分析法で
実施することができる。このような要素は、被還元性化
合物又はこれを含む分散液の乾燥残渣を含む吸収性担体
物質、すなわち、自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシ
ート又はス）　ＩＪツブ、例えば口紙又はストリップで
あってよい。このような要素は、試験ストリップ、診＃
ＪＴ要素、デイツゾスティック又は診断剤として公知で
ある。

本明細書に記載する被還元性化合物を乾式分析要素に使
用する場合、これを適当な吸収性担体物質中に吸収又は
含浸によって混入させるか、又は適当な吸収性担体物質
上に塗布することができる。

また、化合物を分析中に要素に混入することができる。

有用な担体物′Ｘは不溶性であり、水又は生理学的液体
、例えば尿又は血清と接触させたときに、その構造上の
一体性全維持するものである。

有用な担体物質は、紙、多孔性粒状構造体、セルロース
、多孔性ポリマーフィルム、ガラスＦ１１維、織布及び
不織布（合成及び非合成）等から製造することができる
。このような要素全作製するために有用な物質及び操作
は、例えば米国特許筒３゜ｏｙａ、ｐｔｚ号、同第ｊ　
、１ｒ０２．１１１２号、同第３．り／よ、ｔ≠７号、
同第３．り／７．≠ｊＪ号、同第３．りＪｔ、３１７号
、同第≠、−μｒ、ｒ−タ号、同第≠、、２６！、３１
μ号及び同第１！、２７０，２２０号明細書によって周
知である。

乾式分析は、吸収性担体物質として少なくとも７個の多
孔性拡散帯域をその上に有する支持体を含む分析要素を
用いて特に有利に実施することができる。被還元性化合
物は、拡散帯域又は異なる帯域（例えば試薬帯域、記録
帯域又は親水性帯域）に存在することができる。拡散帯
域は、任意の適当な繊維性又は非繊維性物質又はその一
方若しくは両方の混合物から製造することができる。

拡散帯域は、米国特許第弘、−タコ、２７．２号明ｉ書
に記載されているような、適当な結合剤と混合したか又
は布に織った繊維材料を使用して、ポリマー組成物〔例
えばプラッシュ（ｂｒｕｓｈ）ポリマー〕又は米国特許
第３．タター、／！♂号、同第μ、コ！？、００／号及
び同第≠、≠３０゜≠３を号明細書及び特開昭ｊ７（／
ＰＩコ）−１０／７６０号公報に記載されているような
粒状物質（結合接着剤を含むか又は含まない）から製造
することができる。拡散帯域は等方性に多孔性である、
すなわち、孔度が粒子、繊維、ポリマーストランド等の
間の連続空間又は孔によって生じるように帯域のどの方
向でも同一であるのが望ましい。

本発明の乾式分析要素は、被還元性化合物及び特定の用
途のため所望の他の試薬を含む単一の自立性多孔性拡散
域であってよいが、このような帯域は適当な支持体上に
担持されているのが好ましい。このような支持体は、任
意の適当な寸度安定性で、好ましくは非多孔性で、２０
０〜ｙｏ。

ｎｍの波長の電磁線を透過する透明な芯輻射線透・過性
）フィルム又はシート物質である。特定の要素のため選
択される支持体は意図する検出方法（反射、螢光又は透
過分光分析）と認容性であり、分析に使用する化学試薬
及び液体試料に対して不活性であるべきである。有用な
支持体物質は、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカー
ｆネート及びセルロースエステルを包含スる。

要素は、７個より多くの帯域、例えば試薬帯域、記録帯
域又は下塗帯域を有していてよい。帯域は、一般に、相
互に液体接触〔液体、試薬及び反応性成物が隣接帯域の
重なった領域の間を通過しうろことを意味する〕してい
る。帯域は、別々に墜布された、重ねられた層であるの
が好ましいが、一つの被積層にコ以上の帯域が存在して
もよい。前記の特許の他に、例えば米国特許第≠、　０
１７２　。

３３３号及び同第ａ、１ｔａａ、３ｏ６号明ａＩ＋及び
米国再発行特許第３０，２４７号明細書にも、適当な要
素構造及び成分が記載されている。

本発明の要素において、水と相溶性の被還元性化合物の
量は、広く変動しうるが、一般に少なくともｏ、ｏｉ？
／ｍ　　ｓ好ましくはｏ、ｏｔ〜ｏ。

２　ｔ　／　ｍ　　の被５ｉ量で存在する。必須ではな
いが、好ましい試薬は、一般に下記の被覆鼠で存在する
：ＥＴＡ：　　一般に少すくとも０．００／ｌ／ｍ２゜
好１しくは０．０／　〜／ｆ／ｍ　　。

栄養素二　一般に少なくとも０．０！？／ｍ２、好まし
くはｏ、ｉ〜コｆ／Ｗ１２Ｃ生存細胞の検出の際にのみ
使用）、 緩衝剤（ｐＨ≦り）：　一般に少なくとも０．１２７ｍ
２、 好ましくは０．３〜−９／ｍ２． ７以上の帯域が種々の他の所望であるが、必須ではない
成分〔文献に公知の活性剤、結合剤（−般に親水性）又
は酸化防止剤を含む〕及び特定の被分析物の分析に必要
な任意の試薬を含んでいてよい。

本発明の一実施態様では、水性液体中の微生物（例えば
、酵母、真菌又は細菌）の検出用の要素は、前記の電子
移動剤及び被還元性化合物を含む。

これらの要素は、更に、生存細胞のための栄養素及び分
析中（例えば試験液体の／〜、２００μｌの試料と接触
させる場合）、生理学的［）Ｈを維持する緩衝剤を含む
のが望ましい。このような要素を、試料及び要素を適当
な方法で物理的に接触させ、細菌の存在の結果として還
元性化合物から放出された検出可能なａ［全適当な波長
で検出することによって、例えば尿試料（例えば妨害物
質を除去するか又は細胞を濃縮するため前処理されたも
の）中の細菌を検出するため使用することができる。

本発明の別の実施態様では、要素を水性液体中の非生存
生物学的又は化学的被分析物を測定するため使用する。

被分析物が本明細書に記載した被還元性化合物を直接還
元して検出可能な釉を放出し得ない場合には、分析に更
に被分析物と相互作用して被還元性化合物を還元する生
成物を生成する試薬を／Ｓ以上含む相互作用組成物を使
用する。

この相互作用組成物を要素中に混入するか又は分析時に
添加することができる。このような被分析物の例は、上
に記載した。検出される検出可能な、種の量を、液体試
料中に存在する被分析物のｔに相関させることができる
。

本発明の要素は、更に、他の還元剤、例えばアスコルビ
ン酸塩（アスコルビン酸及び当量のアルカリ金属塩）、
システィン、グルタチオン、チオレドキシン等を測定す
るため有用である。

本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて稿々の形で要素を形
成することができる。

本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、試験すべ
き液体試料（例えばｌ〜２００μりと、試料が要素中の
試薬と混合するように接触させることによって被分析物
又は生存細胞を測定する。このような接触は、任意の適
当な方法で、例えば要素を試料中に浸漬するか、又は好
ましくは適当な分配手段を用いて一滴以上の試料を手又
は機械で要素にスポットすることによって達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果倉得るの全
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。

被分析物又は生存細胞の検は１は、水と相溶性の被還元
性化合物が還元さｔｖ４て適当な方法で検出しうる棟を
放出する場合に達成される。前記のように、検出可能な
種は標準比色又は螢光測定装ｆ？検出操作を用いて検出
されうる、比色測定染料又は螢光染料であるのが好まし
い。検出可能な種が色原体又は螢光原性物質以外のもの
、例えば化学発光性基又は燐光性基である場合に扛、適
当な化学発光又は燐光検出装置を使用することができる
。

検出可能な種の最大波長又は最大波長以外の波長で分光
測定することができる。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　、ＡＴ
ＣＣ−５タコ−）及び黄色ブドウ球菌 （８ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ　、
ＡＴＣＣ−よタコ３）細胞をそれぞれＢＨＩ培地中で３
７０Ｃで振とうせずに一夜増殖させ、毎日移植した。

参〇＊ｌの細胞を遠心分離によって回収し、０．０ｊモ
ル０ＨＥＰＥ８緩衝液（ｐＨ７，ｒ）１０ｄ中に再懸濁
した。ｌｐ２０ｎｍで測定した吸収をそれぞれ０．２及
び７．０に調節した。ｏ、ｒ３３（ｊＪＱｎｍ）の吸収
は１ｘ１０　　細胞／−に等しいことが判った。カンジ
ダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　　ａｌｂｉｃａｎ
ｓ、ＡＴＣＣ／弘Ｏ！３）細胞＝２８ＡＢ肉汁中で攪拌
しながらｕｊ’ｃで一夜増殖させ、遠心分離により回収
し、洗浄し、ＨＢＰＥ８緩衝液中に再懸濁した。細胞懸
濁液を／、０の光学濃度に調節した。

例／：　水性組成物の製造 本発明の組成物を下記のようにして製造した：本発明の
化合物を、濃硫酸０．７傳を添加して酸性にし＆Ｎ　、
　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）−！Ｏｄ中に溶
解させ、生じた溶液をコｊｙｔｌの０００５モル燐酸カ
リウム緩衝液又はｏ、ｏｒモルＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７，ｒ）に添加した。

金物の比較 この例は、次面活性剤を含まない組成物を用いる本発明
の分析と、表面活性剤を含む組成物を用いた欧州特許出
願公開第λ／／　、ｒりを号公報に記載の分析との比較
に、本発明の２種の水と相溶性の本発明の化合物（前記
の六のｌ及びｉｏ）を使用する。

大腸菌細胞ＩＢＨＩ培地中で３７°Ｃで振とうせずに一
夜増殖させた。μＯ−の細胞を遠心分離によって回収し
た。生じるベレットを燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、ｊ
、μ＝０．ＯＪ）、２Ｊｔｄ中に再懸濁させ、生じた懸
濁液を遠心分離した。はレットを洗浄し、緩衝液−ｒａ
ｔ中に再懸濁させ、既知量の懸濁液を同じ緩衝液を用い
て希釈して、Ａ２０ｎｍ″？？０．／の吸収を得た。

Ａ、　下記の溶液から本発明の組成物ｔｇ造した＝７エ
ナジンメトスル７エート（ＦＭＳ　）又はコーヒドロキ
シメチルーよ、ｔ−ジメチル−／。

グーベンゾキノン（ＨＤＭＢＱ）（メタノールやり、ｌ
×ｉｏ　　　モル）、本発明の化合物／又は１０（Ｎ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）中／、７Ｘ／（
１）　　　モル）及びグルコース溶液（水中７０％）。

路長／備のキュベツト（容ｔ４’ｍ／）Ｋ細胞懸濁液０
．／１ａｌｃ最終濃度ｔｘｉｏ　　　細胞／ｄ）、燐酸
塩緩衝液Ｊ、Ｏｔｄ、グルコース溶液ｊＯμｌ（最終濃
度ｒ、Ｉｘ１０　　　モル濃度）及ヒＰＭＳ又はＨＤＭ
ＢＱＪｚμ！（最終濃度７．７Ｘ１０５モル濃度）を充
填した。キュベツトを蒸発を防止するため融封し、３７
°Ｃで熱で平衡にした。本発明の化合物／又は１０の７
〃Ｍｌ（最終濃度７．ｌ×１０　　　モル濃度）の添加
により反応を開始させた。細胞を用いないで対照溶液を
製造した。

Ｂ、　　　トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−／　ｏｏ茨圃
面活性剤使用する従来技術の組成物を下記の溶液から製
造した：　（１）　Ｐ　Ｍ　８又はＨＤＭＢＱ（メタノ
ール中２．ｔ×／θ　　モル濃度）％（２）本発明の化
合物／又は／　ｏ（ＤＭＦ中７．／Ｘ１０−２モル濃度
）、（３ン！０μＥの溶液−十７００μｌのトリトンＸ
−１００宍面活性剤＋ｊ１！Ｌｌの燐酸塩緩衝液、（４
）グルコース溶液（水中ｉｏ％）及び（５）燐酸塩緩衝
液中の６×７０　細胞／Ｍｌ。

路長／ｉｍのキュベツトに／Ｉｒｒｔｄの溶液３（最Ｈ
化合物濃Ｆ１７　、　＆　ｘ　ｉ　ｏ　　’モル＠度）
、６μｌの溶液≠（最終グルコース濃度ｒ、ｒｘｔｏ−
３モル濃度）及び／コ、！μｌの溶液！（最終細胞濃度
ぶ×１０　　細胞／ｄ）を充填した。キュベツトにカバ
ーをし、３７°Ｃで熱で平衡にした。

次Ｋ、３μｌの溶液／（最終ＥＴＡ濃度７．７Ｘ１０−
５モル濃度）の添加によって反応を開始させた。細胞を
用いないで対照溶液ｆｔｍ造した。

弘Ｏ２ｎｍで染料の外観を監視することによって反応を
追跡する。下記の第■六に示す結果は、３又は弘回の測
定の平均値であり、本発明の組成物からの細胞応答の増
加を示す。

第■表 ／　　　　　　ＦＭＳ　　　　　　！−１ｒ　　　　　
／、Ｊ〃１対照）　　〃　　　　　　　≠２　　　　０
．１／／　　　　）１１）ＭＢＱ　　　　　！／　　　
　　０．１〃（対照）　　〃　　　　　　　−タ　　　
　Ｑ・／ｉｏ　　　　　ＦＭＳ　　　　　　ｔｏ　　　
　　ｉ、ｉ〃（対照）　　　／／　　　　　　　　ｊ３
　　　　　　／、Ｏｔｔ　　　　ＨＤ　Ｍ　Ｂ　Ｑ　　
　　　Ｉ≠　　　　／、３〃（対照）　　　ｔｔ　　　
　　　　ｔ　２　　　　０　、　ｊ分析をミリリッター
ＨＡｊ’［ウェル・フィルトレイジョン・プレー　ト（
Ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ　　ＨＡｆ４　　Ｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ　Ｐｌａｔｅ）中で実施した。

励起！１０ｎｒｎ及び発色１ｒ２０ｎｍで読み取るよう
に変形したダイナチック・マイクロ７ａ−ル・リーダー
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ　Ｒｅａｄ
ｅｒ）を使用した螢光を測定した。

対照組成物を下記のようにして製造した。

溶液（対照化合物／Ｊ■／ｄ酸性化ＤＭＦ）コ！Ｏμ！
、トリトンＸ−１００ｆｃ面活性剤溶液２００μ１％Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，ｒ）λ！ｄ１トリメチル−７
、グーベンゾキノン（ＴＭＢＱ）（ｉ　、ｚｍｙ７ｇ４
メタノール）！Ｏ０μ１１及びグルコース溶液（水中７
０％溶液）　ｊ００μ１０対照化合物は、カルボキシ基
の代わりにシアノ基を有する以外は、第１表の化合物≠
と同様であった。

本発明の組成物を下記のようにして製造した。

化合物４ｔ（／　７’９／ｄａ性化ＤＭＦ）、２ＪＯｔ
ｔｌ！％ＨＥＰＥＳ緩衝液−ｊμｇ、ＴＭＢＱ（／　、
ｔ■／−メタノール）２００μｌ及びグルコース溶液（
水中７０％溶液＞２００ゴ。

ウェルに黄色ブドウ球菌細胞懸濁液（最終濃度／×ｌ０
−７細胞／１ｍ）／ｊＯμＥを添加し、プレートを３７
°Ｃに加温し、対照組成物及び試験組成物／！Ｑμｌを
添加することによって分析を二重に実施した。細胞を含
まないブランク溶液を製造した。次いで、ゼロ時及び３
７°Ｃで３０分培養後に螢光を測定した。データを下記
の第■表に示す。これらのデータは、本発明が賢面活性
剤の不存在で染料の放出を増加することを示す。

第■表 対照　　　　　　　／ｊ　　　　　　　２７７０試験　
　　　　　／３０　　　　　　）Ｊりｔ＠２比較 この例は、一種の水と相溶性の本発明の化合物及び３種
の電子移動剤を使用して本発明の組成物における細胞応
答の増大を示す。

使用した本発明の化合物は、３、μ、！、乙、そして／
−であった。

使用したＥＴＡは、ＥＴＡＩ、すなわちテトラメチル−
／、４ｔ−ベンゾキノン、ＢＴＡ、２、すなわち−、、
？、ｊ−）リメテルー／、弘−ペンゾキノン、ＥＴＡｊ
、すなわちコツ３−ジメトキシー！−メチル−７、≠−
ベンゾキノンであった。

微量滴定プレート中でそれぞれの水と相溶性の化合物及
びそれぞれのＥＴＡから溶液を製造した。

対照溶液（トリトンｘ−ｉｏｏ表面活性剤を含む）は下
記のものを含んでいる：ＨＥＰＥ８緩衝液（ｐＨ７，ｊ
ｒ）Ｐ、Ｊａｕ、化合物（酸性化Ｄ　Ｍ　Ｆ中の最終濃
度７．４ｘ１０　　　モル濃度）Ｏ１／μｌ、トリトン
Ｘ−１００表面活性剤０．−μｌ、１０％グルコース溶
液Ｏ，コμＡ’ｘ　ＥＴＡ（メタノール中の最終濃度Ｊ
、Ｉ！×１０　　　モル濃度）Ｑ、コμｌ及び大腸菌細
胞（最終濃度１０　　細胞／ゴＨＥＰＥＳ緩衝液）。ト
リトンＸ−１００我面活性剤が存在しない以外は同じ成
分から試験溶液を製造した。バックグラウンドを測定す
るため、細胞以外の全成分を含むブランク溶液を製造し
た。

次いで、ゼロ時及び３７°Ｃで３０分培養後に螢光を測
定した。データを下記の第■我に示す。

例乙：　白血球の溶液分析 この例は、溶液分析で白血球を測定するための本発明の
使用を示す。１念、これを前記の欧州特許出願公開第一
／　／　、１９１号公報の組成物を用いて実施した同様
の分析と比較する。

本発明の組成物を例７に記載したようにして製造した。

対照Ａ組成物は、例７の対照組成物と同様にして製造し
、対照Ｂは使用した化合物が本発明の水と相溶性の化合
物！である以外は対照Ａと同一であった。対照Ａ及びＢ
は、表面活性剤を含んでいた。

酸性クエン酸デキストロース／、ｊｒｒｄｆ含む標準採
血管中に血液試料（ｒ　、　ｊｄ）ｔ−集めた。管７１
固当たり／、！〜コｄの量でそれぞれに６％デキストラ
ン溶液を添加し、管内容物を倒立によって混合し、／、
３時間静置した。台管からの血漿層を／よ−の滅菌遠心
分離管に移し、ｒ、ｙｙ７１のＮａαを含む０９３モル
燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，ｔ）を添加した。次いで
、管及びその内容物ｆ１０分間、／　０００　ｒ　ｐｍ
で遠心分離し、上澄液をデカントした。生じた細胞ベレ
ットを細胞溶解溶液Ｃａｌ当たり塩化アンモニウムｔ、
３ｔ、炭酸ナトリウム／を及びエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム０．ＯＪｆ）１０ｗｌ中に再懸濁し、次いで
、管を１分間放置して溶液を澄明にした。

管内容物を再び７０分間、１１０００ｒｐで遠心分離し
、上澄液をデカントした。生じたベレットを再び、燐酸
塩緩衝食塩水中に再１１１ｉｉ　Ｌ％遠心分離し、上澄
液をデカントし、ベレットｆＯ，ｊ、１の燐酸塩緩衝食
塩水中に再懸濁した。

３０−の孔を有する市販のコールタ−・カランｐ−（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ　　Ｃｏｕｎｔｅｒ　）装置を使用して、
白血球を調整後に標準的操作で数えた。数を一致させる
ため補正した。評価前に細胞を一夜凍結させ、次いで使
用前に燐酸塩緩衝食塩水中に１３倍に希釈した。

マイクロリットルプレートウェルに希釈した白血球懸濁
液（２，／×１０　　細胞／肩ｌで７！θμＩり、本発
明の化合物組成物（／！Ｏμｇ）、トリメチルベンゾキ
ノンＥＴＡ（／。！ｍｙ／−メタノール溶液−２！μｌ
）及びグルコース（７０％Ｗ／Ｖ溶液−！μｌ）を添加
した。プレート′ｆ：、３７０Ｃで静置し、放出された
染料をキセノンアーク灯源を装着した市販の螢光計を使
用して螢光（発光４２０ｎｒｎ、励起ｊ４ｔＯｎｍ）ｉ
測定することにより評価した。各試験′ｌ１−３回繰り
返した。

下記の第ｖ表に示した分析結果は、白血球が表面活性剤
を欠いた組成物中に水と相溶性の化合物！を使用した場
合だけ検出できることを示す。

第７表 対照Ａ　　　　　　　−１弘 対照Ｂ　　　　　　　　−ｊ 例ぶ　　　　！− 測定 この例は、本発明の化合物ｔを含む乾式要素を使用して
、一種の細菌、すなわち大腸菌及び黄色ブドウ球菌並び
に酵母、すなわちカンジダ・アルビカンスの測定を示す
。

ファツトｖン（Ｗｈａｔｍａｎ）の３ｍｍのりＣ１？ト
ゲラフイーペーパーのストリップを下記の溶液中に浸漬
した：メタノール７ａｌ、溶液（本発明の化合物ｔ、ｏ
、ｉ％硫酸を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中０．
０．２１ｒモル濃度）／ｄ、ＥＴＡ溶液（２，Ｊ−ジメ
トキシ−！−メチル−７゜弘−ベンゾキノン、０．０１
モル濃度メタノール）／−及びグルコース溶液（水中ｉ
ｏ外浴溶液／ｗＬｌ。

次いで、ストリップを暗所で−Ｊ−’Ｃで７時間乾燥さ
せた。

標準紙パンチを使用して乾燥したストリップからディス
ク〔直径約／／参インチ（Ｏｌｔｃｔｌｔ）〕を切断し
、ディスクをコーニング・セル・ウェル２（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｗｅｌｌｓ、商標）に入れた。

対照（緩衝剤だけを含む）及び試験細胞懸濁液（大腸菌
、〜ｒ×ｉｏ８細胞／ｄ、黄色ブドウ球菌、Ｐ−１×１
０　　細胞／ｄ及びカンジダ・アルビカンス、〜ｊＸ１
０　　ＩＩＥ胞／　ｍｌ　）の試料１０）ｔｌのスポラ
トラペーパーストリップ上に落とし、ゼロ時及びダイナ
チック・マイクロ７０−ル・リーダーを使用して３７°
Ｃで３０分培養後に螢光（励起Ｊ′≠Ｏｎｍ、発光ｔコ
（Ｊｎｍ）を測定した。

結果ｆＪＯ分後の相対螢光度の変化として下記の第■安
に示す。−回の読みの平均値を挙げる。本発明を乾式要
素を用いて微生物を測定するため使用しうることは明ら
かである。

第■表 対照　　　　　　　　　　　　　、ｚｒ。

大腸菌　　　　　　　　　　　コア０／黄色ブドウ球菌
　　　　　　　コｔｒｉカンジダ・アルビカンス　　　
、２０Ｊ！この例は、数種の微生物を測定するための本
発明の被還元性化合物（本発明の化合物ｌ）の使用を説
明するものである。すべての細胞を前記のように、振と
うせずに３７°Ｃで増殖させたが、ミＪｕｔｅｕｓ　）
及び枯草菌（Ｂａｃｉ目ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）は３
ｏ０ｃで増殖させ、緑腸菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）は振とうせずに増殖させた
。

前記の例！及びｔに記載したように分析を実施した。一
種の異なるＥＴＡ％ＦＭＳ及びＨＤＭＢＱ（両方とも前
記の例！及び乙に記載した）を使用した。得られた結果
を下記の第■表に示す。

〔発明の効果〕

本発明は、生理学的ｐＨ（すなわちり以下）の液体中の
被分析物、例えば酵素、代謝産物又は生存細胞（例えば
細菌、酵母、真菌又は白血球）を迅速かつ高度に定量的
に測定する際に被還元性化合物を使用する手段を提供す
る。これらの被還元性化合物は、賢面活性剤を使用する
ことなく被榎組成物又は溶液分析組成物中に溶解するこ
とができる。従って、表面活性剤の使用に伴って遭遇す
る問題点（細胞に対する不利な影＋Ｗ）は回避される。

更に、表面活性剤の不存在で分析の感度が改善されるこ
とが以外にも判明した。本発明は、更に、検出可能な種
に変えることのできる化学的又は生物学的に有用な基を
放出する手段を提供する。

これらの利点は、被還元性化合物に水と相溶性にする基
を組み入れることによって達成された。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社昭和６３年／／
月ぜ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式１の構造を有し、９以下のｐＨで還元される
   と移動可能で検出可能な種Ｒ＾５を放出することができ
   、水と相溶性にする部分を少なくとも１個含み更にＲ＾
   ５がＨで置換されている場合には水中で測定して少なく
   とも＋１００ｍＶのＥ（１）／（２）を有するものであ
   る水と相溶性の被還元性化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼一般式■ 式中Ｒ＾１、Ｒ＾２およびＲ＾３は水素以外の置換基で
   あつてこのうちの少なくとも一つは電子受容性の基を表
   す。 Ｘは酸素原子、硫黄原子あるいは窒素原子を含む基▲数
   式、化学式、表等があります▼を表す（ここでＲ＾４は
   水素原子以外の基あるいは単なる結合を表す）。Ｘが▲
   数式、化学式、表等があります▼である場合にはＲ＾１
   〜Ｒ＾４のうち少なくとも一つは電子受容性の基を表す
   。 Ｒ＾１とＲ＾２、Ｒ＾２とＲ＾３、Ｒ＾３とＲ＾４、Ｒ
   ＾４とＲ＾１はそれぞれ互いに結合して環を形成しても
   よい。 ＴｉｍｅはＮ−Ｘ間の一重結合が開裂したときにそれを
   引き金としてＲ＾５開裂、放出する基を表わし、ｔは０
   または１を表わす。 Ｒ＾５は移動可能で検出可能な種を表わす。 式中、実線は結合を、破線はそのうちの少なくとも１つ
   が結合していることを表す。 ２、被分析物を含有すると思われる液体試料を請求項１
   記載の被還元性化合物と接触させ、次いで被分析物の存
   在の結果として放出された検出可能な種Ｒ＾５を検出す
   る工程を含む被分析物の測定方法。