JPH01252291A - 部位特異的変異用ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、遺伝子工学において使用される部位特異的変
異法（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）に有効なベクターに関するものである。 （従来の技術） 近年、遺伝子工学手法による変異方法は、従来の遺伝学
的手法による変異法に比べ、変異株や変異遺伝子が正確
且つ高頻度に得られる為、重要な道具となってきている
。この遺伝子工学手法による変異は、あるＤＮＡ配列中
に目的とする変異を導入する手法であり、分子生物学、
蛋白工学研究等の研究にきわめて有効な手段の一つとな
ってきているものである。蛋白質の構造は、コーディン
グ領域のＤＮＡ配列を操作することにより、人為的に変
更できるため、自然界で見いだされる蛋白質、例えば酵
素の構造を変えることにより有効な特性をもつ酵素に改
質することが可能となってきている。その特性とは、蛋
白質の作用ｐｌ＋、安定性、耐熱性、Ｋｍ値、プロテア
ーゼ耐性等酵素の機能に関するものである。これらの特
性を変化させることで、設計目標にあった酵素に改質で
きる可能性があり、その将来性が期待されている。 また、遺伝子発現には転写、あるいは翻訳、ＲＮＡのプ
ロセッシングの過程を経て行われるが、ＤＮ＾のレベル
でその塩基配列を逐次変化させることを検討すれば発現
の程度が変わる可能性があるため、生産性向上、発現機
構の研究に重要かつ欠くべからざる方法である。この他
、部位特異的変異法による手法は酵素やペプタイドの生
理活性物質の活性部位の検索、生理活性物質の分泌機構
の解明等、幅広く分子生物学、遺伝学に使用されている
。 部位特異的変異の典型的な操作手順は、次の項目から成
り立っている。（第１図参照）（１）　　変異させたい
ＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡで存在できる
ベクターにクローニングする。 （２）　　変異させる領域を１個所ミスマツチさせる塩
基部分以外を相補的に合成したオリゴヌクレオチドを環
状−本鎖すコンビナンドＤＮＡにハイブリダイズさせる
。 （３）　　次に相補−本鎖オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして、ＤＮＡポリメラーゼでフィリングイン、ラ
イゲーションで新合成鎖とオリゴヌクレオチドの５′端
と連結させる。 （４）　　目的の変異点以外は、完全に相補的な２本鎖
ＤＮＡをＨ，ｃｏ！ｉに形質転換し複製させ、親ＤＮＡ
をもつファージクローンと変異ＤＡＮをもつファージク
ローンを成育させる。 このようにして二種のＤＮＡに由来するファージが調整
され、変異ファージクローンを分離して、これより変異
ＤＮＡを作成する。この場合、各ＤＮＡ由来ファージの
生成する確率は５０％と理論的に計算される。しかし実
際には変異ＤＮＡば極めて低収率であるのが現状である
。 （発明の解決しようとする課題） 従来の部位特異的変異法において、ベクターとしてファ
ージＤＮＡすなわち旧３ファージ由来の・ベクターが使
用されているが、次に述べるような短所を持っており、
この方法が効率的に使用できないことが指摘されていた
。即ち、このベクターはファージ由来であるため大きな
りＮＡ断片、例えば５Ｋｂ以上の長さのＤＮＡは挿入さ
れにくい欠点をもっている。更にこのようなファージベ
クターはファージ特有の複製過程で変異か起こり易い欠
点が指摘されている。 （課題を解決するための手段） 本発明者らは、これらの欠点を改良したベクター、即ち
、（１）変異ＤＮＡが高い確率で採取される、（２）大
きなサイズのＤＮＡの挿入が可能である、（３）複＝　
３− 型中に組換え体ベクターが変異を受けないなど、これら
の長所をもつベクターを製造することに成功し、本発明
に達した。 すなわち本発明はアンピシリン耐性をコードする遺伝子
を含むプラスミド／ファージ融合ベクターであって、該
アンピシリン耐性をコードする遺伝子領域にアンバー変
異コドンが組入れられていることを特徴とする特許 ある。 本発明では、市販されているｐＢＳベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）の制限酵素Ｎａｒ　　Ｉサイトに、
Ｍ１３ＤＮＡのＲｓａ　ＩからＤｒａ　Ｉサイトまでの
４５４のヌクレオチド断片を挿入し、合成したベクター
ｐＢｓＭ１３　＋、およびｐＢｓＭ１３　−　（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社製）を出発材料として用いた。このベ
クターはバクテリオファージＭ１３由来のインタージェ
ニックリージョンを含んでおり、プラスミド／ファージ
融合ベクターである。 このベクターの特徴は、塩基配列数が少なく（　３２０
４ｂｐ　）　、大きなサイズ（　５　Ｋｂ以上）の遺伝
子が挿入できる利点があり、且つＭ１３ベクターでみら
れる短所、つまり複製時に変異が生ずる不安定性は認め
られない特徴を有しでいる。このベクターを保持ずるＥ
．ｃｏｌｉにＭ１３ヘルパーファージを感染させると一
本鎖ＤＮＡが収率よく産生される。この方法で一本鎖Ｄ
ＮＡを採取できるのでヘルパーファージおよびオリゴヌ
クレオチドによる突然変異誘発によって、一本鎖変異Ｄ
Ｎ＾を産生できる。しかしこのベクターでは同時に産生
きれる親一本鎖ＤＮＡから特異的に変異ＤＮＡを識別す
ることが容易でない欠点を有している。 本発明のベクターは、このベクターを改良することによ
り宿主で変異ＤＮＡをもつファージクローンを特異的に
選別し、迅速に変異体を作製することができるベクター
である。 前述の通り、ファージベクターを使用ずる従来の部位特
異的変異では、アンハー変異を導入したベクター、即ち
作成したい変異を組入れたオリゴヌクレオチドをアニー
リングさせ酵素で、フィリングインおよびライゲーショ
ンさせたハイブリッＦ’　１１　Ｎ　Ａを形質転換し、
複製した時、変異ファージクローンは５ｕｐＥ−株、５
ｕｐＥ’株いずれでも複製成育できるが、親ファージク
ローンは５ｕｐＥ＋株のみで複製成育できる仕組みのベ
クターが使用されている。このベクターでは、前述した
ように、ファージクローンｉｓ、大きなサイズのＤＮＡ
が挿入できないこと、不安定な複製を示す短所をもって
いる。 本発明の部位特異的変異用ベクターは、プラスミドにＭ
１３ファージのインタージェニックリージョンをもつプ
ラスミド／ファージ融合ベクターに、アンバー変異を導
入したものであり、プラスミｌ′／ファージ融合ベクタ
ー（ｐＢＳ門１３＋、９８５Ｍ１３−　）にアンバー変
異を導入する領域として、アンピシリン耐性をコートす
る遺伝子に注目し、その機能を横なうことなく、変異を
導入したものである。 例えばアンピシリン耐性をコードする遺伝子領域のＤｄ
ｅ　Ｉサイｌ−（２７１５）から１ｌｐａｌｌサイト　
（２７５２）までの３７塩基に注目し、以下に示す方法
でアンバー変異を導入した。 このＤＮＡフラグメント（Ｄｄｅ　ｒ　−１１ｐａ　Ｉ
Ｉ　）の塩基配列は下記に示す。 この領域にアンバー変異を導入するため、次の塩基配列
をもつＤＮＡフラグメントを合成した。 上記合成１１ＮＡ断片の塩基配列に示すように、９８５
Ｍ１３　ベクターのＤｄｅ　Ｉザイトから、１Ｉｐａｌ
ＴサイトまでのＤＮＡフラグメント中の二つのＴＴＧコ
ドンをＣＴＡに変化させたものである。これによりＴＴ
ＧでコードされていたアスパラギンからＣＴＡに変える
ことによりストップコドンに変化させられている。これ
は５ｕｐ（−）株ではアンバーコドンＵＡＧに対応して
グルタミンを取り込ませるはたらきをもった特別のｔＲ
ＮＡをもっていないため、ペプチド鎖はそこで終わって
しまい、タンパク質の機能が失われて生産できず、該株
は生育できないのに対して、５ｕｐ（＋）株では生育で
きる特徴をもたせているものである。この仕組みにより
変異ファージクローンと親ファージクローンが区別でき
るのである。つまり部位特異的変異体作成過程において
変異ファージクローンのＤＮＡ　＋まプラスミド／ファ
ージ融合ベクター（ｐＢＳ旧３（＋）、９８５Ｍ１３（
−）の（÷）鎖から由来するのでアンバー変異を含まな
いのに対して、親ファージクローンのＤＮＡはアンバー
変異を含むことになる。これはＩＩＪ　ＤＮＡをもつフ
ァージクローンがアンバーＳｕｐ宿主に感染し培養すれ
ば、アンバー変異はレスキューされるが、５ｕｐ（−）
株では成育できない。他方アンバー変異を持たない変異
ファージクローンを５ｕｐ（−）株に感染、培養すれば
成育できるので変異ファージクローンのみを特異的に選
択できる。 本発明のベクターはＴ７ＲＮＡブロモター、Ｔ３ＲＮＡ
ブロモターがポリリンカーサイト（ＥｃｏＲＩ　、Ｓａ
ｃ　Ｉ　。 ３ｍａ　Ｉ　Ｘ　ＢａｍＨＩ　　、、Ｘｂａ　Ｉ　　、
Ｓａｌ　Ｉ　　、１ｌｉｎｃｌＩ　、Ａｃｃ　Ｉ　。 Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｓｐｈ　Ｉ　、　ｔｌｉｎｄ　ｍ　）
の両側に配置されている。 この為部位特異的変異を受けた遺伝子を直ちにＴ７ＲＮ
ＡポリメラーゼＴ３ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを
合成翻訳させタンパクまで生成し、変異による機能の変
化を調べることができる利点がある。多くのポリリンカ
ーサイトがあるので外来遺伝子を挿入しやすい特徴をも
っている。該ベクターをｐＫＭＮ（＋）及びｐＫＭＮ（
−）と命名した。 次にｐＫＭＮ（＋）及びｐＫＭＮ（−）の構築手順を示
す。 （１）　　９８５Ｍ１３（＋）　　及び９８５Ｍ１３（
−）　　からの八ａｔ　　ＩＩ（３１４０）　−Ｐｓｔ
　Ｉ　（９２４）　（９８９ｂｐ）の調整まず９８５Ｍ
１３（＋）、９８５Ｍ１３（−）から１３のインタージ
ェニックリージョンを含む領域を調整するため制限酵素
ＡａｔＩｌおよびＰｓｔ■でダブルダイジエスションを
行い、その消化物をアガロース電気泳動で９８９ｂｐの
長さのＤＡＮフラグメントを分離精製した。９８５Ｍ１
３　（＋）、および９８５Ｍ１３（−）の制限酵素地図
は第２図第、３図に示す。Ａａｔ　　Ｕ　（３１４０）
−Ｐｓｔ　Ｉ（９２４）　（９８９ｂｐ）フラグメント
の調整のためダブルダイジェスションの反応条件は下記
の通りである。 上記混合物を温度３７°Ｃで２時間反応させた。 （２）　　ｐＢｓＭ１３（＋）からの八ａｔ　ＩＩ　（
３１３９）　−Ｈｐａ　ＩＩ　（２７５２）（３８８ｂ
ｐ）、Ｄｄｅ　Ｉ　（２７１４）　−Ｂｇｌ　　Ｉ　（
２３３８）（３７７ｂｐ）、Ｂｇｌ　Ｉ　（２３３７）
　−Ｐｓｔ　Ｉ　（９２５）　（１４１３ｂｐ）の８周
整ｐＢｓＭ１３（＋）よりｐＫＭＮ（＋）、ｐＫＭＮ（
−）ベクター構築用の各ＤＮＡフラグメントを調整する
ため、それぞれの制限酵素でダブルダイジエスションを
おこない分解物をアガロース電気泳動し、アカ゛ロース
より分離精製した。この方法で第４図Ｇこ示されるＤＮ
Ａフラグメントを８周整した。 （３）　　Ｈｐａ　ＩＩ　（２７５１）　−Ｄｄｅ　Ｉ
　（２７１５）フラグメントの合成 ｐＢｓＭ１３（＋）　　、ｐＢｓＭ１３（−）のｌ１ｐ
ａ　ＩＩ　（２７５１）　−Ｄｄｅ　Ｉ　（２７１５）
領域にアンバー変異を付与するため、下記のＩ）ＮＡフ
ラグメントを常法に従い合成した。 （４）　　本発明のｐＫＭＮ（＋）、ｐＫＭＮ（−）の
構築上記過程で調整したフラグメントよりアンバー変異
をもつベクターｐＫＭＮ（＋）、ｐＫＭＮ、（−）を構
築するため、各フラグメントの混合物をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで１６°Ｃで一昼夜ライゲーションした。 以下余白 ライゲーション後、その反応液を市販のＢ、ｃｏｌｉＢ
ＭＨ７１−１８ＭＩＩＴＳ　（Ｓｕｐ（＋）　）にトラ
ンスフオームした。ｐｉｔＭＮ（＋）作成用反応液から
３クローン、ｐＫＭＮ（−）作成用反応液から２クロー
ンを得た。このクローンから得たプラスミドをＥ、ｃｏ
ｌｉＭＫ３０−３（Ｓｕｐ（−））に形質転換し、クロ
ーンの生成をテストしたが、生成りローンは皆無であり
、この５種のベクターはアンバー変異をもっていること
が確認された。更にインタージェニックリージョンの方
向性を確認するため、各プラスミドを形質転換株より調
整した。調整したプラスミドを制限酵素Ｎａｅ　Ｉ　−
Ｐｖｕ　Ｉ　、Ｂａｍ１ｌ　Ｉでダブルダイジエスショ
ンを行い、分解物を電気泳動してフラグメントの長さを
調べて方向性を確かめると予期した結果であった。 作成したｐＫＭＮ（＋）およびｐＫＭＮ　（〜）を第５
図および第６図に示す。 次に本発明の部位特異的変異用ベクターを用いて、生理
活性物質をコードする塩基配列に部位特異的変異を行な
った例を示す。 例１ ラット脳膜蛋白をコードする約６０００ｂｐのＤＮＡの
塩基配列（以下ｒＩＩ−１＾と表す）の２つの塩基を変
異させることにより、該蛋白の１３１５の位置にあるＡ
ｒｇをＧｌｎに、および１３１９の位置にあるＡｒｇを
Ｇｉｎに変えることを試みた。このような変異に成功し
たかを判断するために、１つの塩基を変異させて制限酵
素Ｎｓｖ　Ｉで切断されるサイトを導入した。 各工程を以下に示す。 （１）　　外来遺伝子γＩＩ−ＬＡを挿入したｐＫＭＮ
（−）の調載 γｌｌ−１八を本発明のｐＫＭＮ（−）のポリリンカー
サイトに常法により挿入して組換え体プラスミドｐＫＭ
Ｎ（−）　（Ｔ　ＩＩ−ＩＡ）を挿入した。この組換え
プラスミドを大腸菌Ｊ旧０１に形質転換し、組換え体プ
ラスミドｐＫＭＮ（−）　（γＩＩ−ＬＡ）を保持した
ＴＩＫＭＮ（−）（７１１−１八）／ＪＭＩＯＩを調整
した（２１　　ｐＫＭＮ（−）　（Ｔ　ｌｌ−１八）の
５ｓＤＮＡの調整ｐＫＭＮ（−）　（ｒ　ＩＩ−ＩＡ）
／ＪＭＩＯＩを培地（ハタ！・トリプトン：１６ｇ／ｌ
、酵母抽出物：　１０　ｇ　／Ｉ、　ＮａＣ１：　１５
　ｇ　／ｌ、　ｐＨ７，６）に植菌しＯ，Ｄ、１ｌｏｏ
＝０．３まで成育した時、ヘルパーファージＲ４０８を
ｍｏｉ２０に加え水平傾斜振とう培養（３７°Ｃ１１ｈ
ｒ）を行った。これをもとに更に５００ｍ１フラスコで
５０ｍ１の培地（２ｘＹＴ、アンピシリン１００μＢ７
ｍｌ、カナマイシン１００μｇ７ｍｌ、０．０１％チア
ミン）で培養した。培養後、遠心分離し上澄みにポリエ
チレングリコール６０００を２０％、ＮａＣｌを２．５
Ｍになるように加えてファージを沈澱させた。遠心分離
、（８０００ｒｐｍ、　１５分）後、沈澱物を６００　
μｍのＴｌｊ緩衝液に加えて懸濁した。 更にｘｌＯＩｌｉｇｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　７０　Ｂ　１、
ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの混合物７０μｌを加えて、３
７°Ｃ１１時間、インキュベートした。 反応終了後、フェノール処理、クロロホルム処理を二度
繰り返してから、水層にＮａＣ１を加えて一２０°Ｃで
放置し遠心分離後、沈澱を集めた。沈澱物に３００μｍ
のＴＥ緩衝液を加えて溶解し５ｓＤＮＡ　（１５μｇ）
を溶解した。更にフェノール処理、およびエタノール沈
澱を行い、沈澱物を１００μｌの蒸留水に加えて５ｓＤ
ＮＡ溶液を調整した。 （３）　　γｎ−ＩＡを挿入した９８５Ｍ１３（−）　
ｒ　ＩＩ−ＩＡの調整 ９８５Ｍ１３（−）およびγＩＩ−ＩＡから常法により
調整した９８５Ｍ１３（−）　Ｔ　ＩＩ　−ＩＡ　１５
８ｇを制限酵素Ｎｓｉ　１および旧ｕｌで切断した。更
にアルカリフオスファクターゼ処理を行った後、アクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルから
抽出し、直鎖ＤＮＡ　のＮｓｉ　Ｉ　−Ｍｌｕ　Ｉフラ
グメンｌ−９８５Ｍ１３（−）（γＩＩ−ＩＡ）を調整
した。 （４）　　変異プライマーの調整 ラット脳膜蛋白をコードする遺伝子のアミノ酸、即ちＡ
ｒｇ　（１３１５）−Ｇｌｎ、Ａｒｇ　（１３１９）→
→Ｇｌｎに変えるため、下記のプライマーを作製した。 同時に変異を制限酵素による解析だけで選び出す目的で
、Ｐｈｅ　（１３２０）の第３コドンＴ→Ｃに変える為
、下記のＤＮＡ配列のプライマー（下の鎖）を作製した
。この場合Ｐｈｅ　（１３２０）はそのままで他のアミ
ノ酸に変化しない。 ・印をつけた箇所がミスマツチする塩基である。 下の鎖を鋳型にしてＤＮＡが合成されると

【　　】の所
が下記の配列を有し、アンダーラインの所にＮ５ｐＶサ
イトが新しくできることになる。 ↓ 変異に使用する上記プライマー（オリゴマー５６ｍｅｒ
　）を下記方法でラベリングした。 プライマー（１２ｐｍｏｌ）　　　２　　　ｐ　ｌキナ
ーゼ緩衝液　　　　０．５　μｍ （γ−３２Ｐ）−ＡＴＰ　　　　　Ｏ，５μｍ３．５　
μｍ 上記混合物を３７°Ｃで３０（分間）反応させた。 １０ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ（ｃｏｌｄ）　　　　　０．５　μ
ｍ１．０　μｌ さらに上記混合物を加えて３７°Ｃで３０分間反応させ
た。 （５）　　ギヤップドデュブレツクスＤＮＡの構築（八
）　ｄｓＤＮＡと５ｓＤＮＡのハイフ゛リダイゼーショ
ン （３）で作成したｄｓＤＮＡ断片を含むベクター、即ち
Ｎｓｉ　Ｉ−旧ｕＩフラグメントを含むｐＢｓｌ’１１
３（−）　（Ｔ１１−１八）０．６μｇ及び（２）で作
成したｐＫＭＮ（−）　（γ■−ＩＡ）の５ｓＤＮ八１
．５μｇを次のようにハイフ゛リダイゼーションした。 上記混合物をつくり、１００°Ｃで３分間加熱後、６５
°Ｃで更に５−１０分間インキユーヘートした。この後
−２０°Ｃで凍結した。試料（１）の反応液はＮ５ｉｒ
−旧ｕｌフラグメンＩ−ｐＢｓＭ１３（−）　（ｒ　ｎ
−ＩＡ）の二重鎖がなくなっており、Ｎｓｉ　Ｉ　−Ｍ
ｌｕ　Ｉフラグメント−ｐＢｓＭ１３（−）　（γＩＩ
−ＩＡ）とｐＫＭＮ（−）（γＩＩ−ＬＡ）の５ｓＤＮ
八がハイフ゛リダイセションしていることをアガロース
電気泳動で確認した。 （Ｂ）変異プライマーのアニーリング （５）　−（八）で作製したハイブリダイゼーション反
応液と（４）で作製したラヘリングされた変異プライマ
ーを下記のようにアニーリングさせた。 ハイブリダイゼーション反応液　　８　μｍラベルされ
た変異プライマー　　　１．５１ｔｌ■１゜０　　　　
　　　　　　　　　０．５μｍ１０．０　μｍ 上記混合物を調整し、６５°Ｃで５分間加熱後、ゆっく
り室温まで下げてアニーリングさせた。 （Ｃ）　ポリメリゼーションとライゲーション（５）−
（Ｂ）で作製したプライマーアニーリングＤＮＡのポリ
メリーゼーションとフィリング−インを次′のように行
った。 蒸　　留　　水　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２３　　μｍｘｌｏ　フィリング緩衝液　　　　　
　　４　μｍクレノー断片　　　　　　　　　　　１　
μＩＴ４　　ＤＮＡ　　　リ　ガーゼ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２　　　μ　１４０　　μｍ 上記混合物を室温で４５分間反応させた後、０．５Ｍ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）１　ｕ　Ｉを加えて反応を止め
、６５°ＣＩＯ分間インキュへ−１−した。 ×１０　フィリング緩衝液は次の組成を有する。 −１９＝ ６２５ｍＭ　　ＫＣｌ ２７５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ７，５）１
５０ｍＭ　　Ｍ＠Ｃ１ｚ ２０ｍＭ　　ＤＴＴ ０　、５　ｍ　Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐ ｏ、２５ｍＭ　　ｏｆ　　４　　ｄＮＴＰｓ　　ｅａｃ
ｈ反応後、アガロース電気泳動をおこないフィリングさ
れていることを確認した。 （Ｄ）　Ｅ、ｃｏｌｉ　５ｕｐｒｅｓｓｏｒ　Ｅ”株へ
の形質転換フィリングインさせたＤＮＡ反応液３０μｌ
、　ｘｌｏクロラムフェニコール２０μ＋、水１５０　
ｐ　１．Ｅ、ｃｏｌｉ　５ｕｐｔＥ”のコンビ−テント
セルを混合し、寒天プレートに塗布し、−夜インキユヘ
ートしてコロニーヲ成育させ、合計３８個のコロニーの
生成を観察した。 （Ｅ）　　コロニーからのＤＮＡ分離 ３８個のコロニーから１２のクローンを採取してプラス
ミドを抽出し、精製して１００μｍのＤＮＡ溶液とした
。 （Ｆ）　Ｅ、ｃｏｌｉ　５ｕｐＥ−株への形質転換（５
）ｉＥ）で調整した各クローンのＤＮＡを下記の方法で
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｅ−株であるＭＸ３０−３に形質転換し
た。 ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３　μ　１クロラムフエニコール（ｘｌｏ）　　
５０　μｍ１０６　μｍ 上記混合液を寒天プレートに塗布させインキュベートシ
コロニーを成育させた。生育したコロニーの数は下記の
通りであった。 （Ｇ）　ＤＮＡの分離と制限酵素Ｎ５ｐＶによる変異の
確認 各プレートよりコロニーを楊枝で釣り上げそれよりＤＮ
Ａを抽出（ＰＩＥＧ沈澱法）し、ＤＮＡ溶液を調整した
。調整したＩＩＩＮＡ　？８液５μｍを制限酵素Ｎｓν
１で切断し、消化液をアガロース電気泳動をおこない制
限酵素Ｎ５ｐＶによる切断性をしらべた。その結果１２
クローンの中で９クローンはＮ５ｐＶで切断され、３り
ｌ’Ｊ−ンは切断されなかった。９クローンのＤＮＡは
変異を受けていることを確認するためサンガー法により
ＤＮＡ配列決定を行い、Ａｒｇ　（１３１５）−→Ｇｌ
ｎ、、Ａｒｇ（１３１９）→Ｇｌｎに変異を生じている
ことを確認した。 （発明の効果） 本発明の部位特異的変異用ベクターは変異ＤＮＡが高い
確率で採取され、大きなサイズのＤＮＡ挿入が可能とな
る、複製中の組換え体ベクターが変異を受けないなどの
利点を有している。このような部分特異的変異用ベクタ
ーを用いて、人為的に蛋白質の構造を変えることにより
有効な特性をもつ蛋白質に改質することができる。また
塩基配列を逐次変更させることにより、遺伝子発現の機
構の研究等を行なうことができ、その用途は多岐にわた
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は部位特異的変異法の典型的な操作手順を示す。 第２図は９８３Ｍ１３　（＋）の制限酵素地図を示す。 第３図は９８３Ｍ１３（−）の制限酵素地図を示す。 第４図は９８３Ｍ１３（＋）の３つのフラグメントを示
ず。 第５図は本発明のｐＫＭＮ（＋）の制限酵素地図を示す
。 第６図は本発明のｐＫＭＮ（−）の制限酵素地図を示す
。 特許出願人　　東洋紡績株式会社 占　　　　　　　　−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アンピシリン耐性をコードする遺伝子を含むプラスミド
   ／ファージ融合ベクターであって、該アンピシリン耐性
   をコードする遺伝子領域にアンバー変異コドンが組入れ
   られていることを特徴とする部位特異的変異用ベクター
   。