JPH01277497A - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子組換え手法によって形質転換された微生
物によるペプチドの製造方法に関す更に詳しくは薬剤耐
性遺伝子及びその耐性機構を利用し、薬剤の添加により
ペプチド合成能を誘導することを特徴とするペプチドの
製造方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕近年、
分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景に、遺伝子組換
え手法によって有用な物質を生み出す方法が脚光を浴び
ている。この技術を用いて物質を生産する方法の１つは
、所望物質をコードする遺伝子を組み込んで造成したプ
ラスミドを用いて微生物を形質転換し、得られた形質転
換体を培養したのち、所望物質を回収する方法である。

また、上記方法によって所望物質を生産させるについて
、効率よく所望物質を得るための手段が種々検討されて
いる。例えば、所望物質が宿主微生物細胞にとって有害
な物質である場合、宿主微生物の培養過程においてその
増殖の初期から該物質をコードする遺伝子が発現し該物
質が産生されたならば、宿主微生物はその時点で死滅し
てしまうため該物質の生産は元より該物質をコードする
遺伝子による宿主微生物の形質転換さえ不可能となる。

このため何らかの手段により該遺伝子の発現の時期をコ
ントロールし、宿主微生物の増殖終了移譲遺伝子の発現
が起こるよう誘導する必要がある。

バチルス属細菌において上記のような発現のコントロー
ルは抗生物質（薬剤）によって誘導される薬剤耐性遺伝
子を用いた例が知られている。この薬剤耐性遺伝子のプ
ロモーターおよび発現制御に関する遺伝子を用いて他の
遺伝子の発現をコントロールすると言う試みはこれまで
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕ
ｓ）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔ−８
６を用いたジヒドロキシ葉酸脱水素酵素（ＤＩＩＦＲ）
の生産〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　２４．１７１−１７
７　（１９８３）　）、スタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓ　ｔａｐｈ　ｉ　１ｏ−ｃ、ｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ）由来のエリスロマイシン剛性プラスミドｐＥ１
９４を用いた肝癌ウィルスのコア抗原の生産〔ネイチ−
ｔ−（Ｎａｔｕｒｅ）　、％Ｊ３　、４８１（１９８１
）　）で行われている。しかし、何れの場合においても
プロモーター及び発現制御に関する遺伝子部分のみを単
離して行っているわけではなく、薬剤耐性遺伝子の構造
遺伝子部分の途中にそれぞれＤＨＰＲ、コア抗原をコー
トする遺伝子を挿入しており、該所望ペプチドと薬剤耐
性ペプチドの一部との融合蛋白の形で発現させている。

このため、所望のペプチドを得るには、さらに生産され
た融合蛋白を酵素的、あるいは化学的に切断する工程が
必要となり、また、薬剤耐性遺伝子の構造遺伝子の翻訳
開始部分付近が薬剤による遺伝子の発現制御に必要か否
かは不明のままであった。

［課題を解決するための手段］ 以上のような課題に対し、本発明者らはテトラザイクリ
ンやクロラムフェニコール等の薬剤耐性遺伝子のプロモ
ーター及び発現制御に関する遺伝子を用い、構造遺伝子
部分をすべて削除しその部分を他の蛋白の構造遺伝子に
変換上しめても、テトラザイクリンやクロラムフェニコ
ール等の薬剤による誘導発現が可能であること、換言す
ると、薬剤の添加によってペプチド合成能を誘導するこ
とができ、ペプチド合成の開始時期をコントロールでき
るということを見出し、本発明に至った。

即ち、本発明は薬剤耐性遺伝子のプロモーター及び発現
制御に関する遺伝子を含み、かつ、該発現制御に関する
遺伝子の直後に目的ペプチドをコードする構造遺伝子を
有するプラスミドによって形質転換された微生物を培養
し、該培養過程で目的ペプチドの合成能の誘導が起こる
に必要な量の薬剤を培地中に添加することを特徴とする
ペプチＦの製造方法を提供するものである。

本発明において用いられる、薬剤耐性遺伝子のプロモー
ター及び発現制御に関する遺伝子を含み、かつ該発現制
御に関する遺伝子の直後に目的ペプチドをコートする構
造遺伝子を有するプラスミドを得る方法としては、例え
ば次に示す方法が挙げられる。

■　まず薬剤耐性遺伝子のプロモーター及び発現制御に
関する遺伝子を、それを有するプラスミドから通常の方
法で制限酵素により切り出す。

■　一方、目的ペプチドをコードする構造遺伝子を、そ
れを生産する生物の染色体ＤＮＡから通常の方法で切り
出すかまたはＤＮＡ合成機にて合成する。

■　ヘクターを切断し、■で得られた薬剤耐性遺伝子の
プロモーター及び発現制御に関する遺伝子の直後に（必
要であればリンカ−を介して）、■で得られた目的ペプ
チドをコードする構造遺伝子を、順に挿入する（リガー
ゼで連結）。

このような方法により得られたプラスミドによって、宿
主微生物を公知の常法にて形質転換し、元来ベクターが
有している性質を利用して目的とする組換プラスミドを
保持している形質転換菌を選択する。

本発明において、宿主として用いられる微生物としては
、枯草菌、大腸菌などが例示される。

また、本発明において用いられる薬剤及びその耐性遺伝
子としてはテトラザイクリン、クロラムフェニコール、
エリスロマイシン及びそれらの耐性遺伝子などが例示さ
れる。上記の如き薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドと
しては、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミ
ドとしてｐＴＨＴ１５．　ｐＴＰ５．　ｐＮｓ１９８１
　、’）　Ｏラムフェニコール耐性遺伝子を有するプラ
スミドとしてρＣ１９４，ｐＴＰ４　、エリスロマイシ
ン耐性遺伝子を有するプラスミドとしてｐＥ１９４．　
ｐＢＤ１５等が挙げられる。このようなプラスミドがら
薬剤耐性遺伝子のプロモーター及び発現制御に関する遺
伝子を切り出す。

本発明において、ヘクターとして用いられるプラスミド
は、宿主が枯草菌の場合、ｐＵＢｌｌｏなど、大腸菌の
場合、ｐＢＲ３２２，ｐＵｃ８．　ｐＵｃ９．　ｐＵｃ
１８などが挙げられる。

本発明において形質転換された微生物を培養する際、用
いられる培地は微生物の増殖に必要な各種栄養源を含む
ものであれば良く、必要に応じて他の成分（形質転換菌
の生育上の便宜をはかるためアンピシリン等）を添力１
１してもよい。

本発明においてはさらに形質転換された微生物を培養す
る過程で、培地中に目的ペプチド合成能の誘導を起こす
に必要充分量の薬剤を添加する必要がある。薬剤の量は
０．１〜１μ９／ｍ１程度が好ましく、１　ｐｇ　／　
ｍｌより多いと菌が死滅してしまうので０．５μｇ　／
　ｍｌ　（らいが最も好ましい。

培地のｐｉ（は微生物の生育可能な範囲であればよく、
用いられる微生物によって適宜好ましいｐｕを設定すれ
ばよい。宿主として枯草菌を用いる場合には、ｐＨ６，
５〜８．０の範囲が好ましく、宿主として大腸菌を用い
る場合には、ｐＨ７，０〜８．０の範囲が好ましい。培
養温度は、使用する微生物の増殖または生育が可能で、
かっ、産生物が安定である温度であればよい。宿主とし
て枯草菌を用いる場合には、３０〜５０°Ｃが好ましく
、３７°Ｃ付近がもっとも好ましい。宿主として大腸菌
を用いる場合には、３７°Ｃ付近が好ましい。

培養時間は、所望物質の産生量が最大となる時間が好ま
しい。このような培養時間の検討は、波長６００　ｎｍ
の光の光学密度（００６゜。）の測定、生菌数の測定等
を指標として行うことができる。

本発明において培養液から目的ペプチドを取得する方法
としては、目的物により異なるが、例えばα−アミラー
ゼの場合、培養上清をアセトン沈澱した後、沈澱を溶解
し、セファデックスＧ−２５でゲル濾過、脱塩し、ＤＥ
Ａ−スフェロシルで順次溶出させ、α−アミラーゼ画分
を得た後、これを濃縮する方法等が挙げられる。

本発明の方法で生産できるペプチドは分泌系のペプチド
であれば特に限定はない。具体的には、プロテアーセ、
エステラーゼ等の各種酵素；インシュリン、ソマトスフ
チン、成長ホルモン、ＶＩＰ　、ヘロデルミン等のホル
モン；その他、フィブリノーゲン、プロトロンビン、ア
ルブミン、インターフェロン等が挙げられる。

〔実施例〕

以下、具体的実施例を持って本発明を説明する。

実施例１　（テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ー及び発現制御に関する遺伝子 を含有するプラスミドを利用したα− アミラーゼの製造） （１）　　　−α−アミラーゼ゛　云　のクローニン久 枯草菌ＬＡ４１２株（オハイオ州立大の動沖」↓吋Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　（ＢＧＳＣ）
より入手した）から斉藤・三浦の方法（Ｈ，Ｓａ＋ｔｏ
＋　Ｋ、旧ｕｒａ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｉｓ、八ｃｔａ、″７２
．６１９　（１９６３）　）により調製シタ染色体ＤＮ
Ａ　１０μ＠を１００　ｔｄ　ノＳａｕ　３Ａ　１溶液
（ｌｏｍＭ　ｌ−リス−１１ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）
、　７ｍＭ　ＭｇＣ］ｚ、　１００ｍＭ　ＮａＣ１）に
溶がし、制限酵素Ｓａｕ　３Ａ　１１単位を加え、３７
°ＣＩＯ分間反応さセ、フェノール溶液（フェノールを
ＴＥ緩衝液（１０１１１Ｍトリス−１１ｃＩ緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）、　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）で飽和したもの
）を加え反応を止めた後、エタノール沈澱物として枯草
菌染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩの部分分解物を得た。

一方、１μ３の枯草菌ヘクターｐｔｌＢ１１０をハＬ旧
溶液（１０ｍＭＬリスー賎ｌ緩衝液（ｐｉ（８，０）、
　　７ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ＋　１００ｍＭ　ＮａＣ１，２
ｍＭ２−メルカプトエタノール、　０．０１％生血清ア
ルブミン（ＢＳＡ））中で５単位の制限酵素展旧と３７
°Ｃ１時間反応させ、フェノール溶液処理後エタノール
沈澱物として得た。

次に上記二つのＤＮＡ断片の連結を行った。

上記のように調製したそれぞれのＤＮＡ断片を１０ｍの
ライゲーションン容ン夜（６６ｍＭ　　ｌ−リス−１１
ＣＩ緩衝液（ｐ）Ｉ７．６）、　６．６ｍＭ　ＭｇＣｈ
、　１０＋＋＋Ｍ　ＤＴＴ。

０．１１へ１゛Ｐ〕に溶かした後、７昆合しＴｌｌＤＮ
Ａリガーゼ１０単位を加え２０°Ｃで１時間反応を行っ
た。次にこのＤＮＡ溶液を用いて、枯草菌稀２８９株（
ＢＧＳＣより入手した）を常法（Ｃｈａｎ＋Ｓ−＋Ｃｏ
ｈｅｎ、Ｎ、、Ｍｏ１ｅｃ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　
１６８．１１１−１１５（１９７９）に従い形質転換し
た。カナマイシン耐性を示す約２万個のコロニーが得ら
れ、このうち１株が菌体外にα−アミラーゼを分泌生産
していることを、寒天平板培地上でコード・デンプン反
応で確認した。この株からプラスミドＤＮＡを分離し制
限酵素により解析を行うことにより、第１図に示す制限
酵素切断地図を作製しこのプラスミドをｐＤｃＡｌｏｏ
と名付けた。ｐＤＣ八１へ０はｐＵＢｌｌｏのハしＩＩ
Ｉザイ！へに３、　ＩＸｂの皿３ＡＩ断片が挿入された
７、６Ｋｂのプラスミドで、３．　ＩＫｂのＳａｕ　３
ＡＩ断片の中には、枯草菌由来のα−アミラーゼ遺伝子
（Ｙａｍａｚａｋｉ、Ｈ，ｅＬ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、、　１５６゜３２７（１９８４））と全く
同じ制限酵素パターンが認められ、α−アミラーゼ遺伝
子がクローニングできたものと判断した。

誘導発現可能なテトラザイクリン耐性遺伝子として好熱
性バチルス属由来のプラスミドｐ’ＴｌｌＴ１５を選ん
だ。このプラスミドｐＴＩＩＴ１５の有するテトラサイ
クリン酸性遺伝子は、すでにその全塩基配列が決定され
ており（ｔｌｏｓｈｉｎｏ。

Ｔ、、ｅｔ、ａｌ、、　ｇｅｎｅ　３７１３１−１３８
　（１９８５））、テトラサイクリンによるこの遺伝子
の誘導発現も確認、されている。この遺伝子のプロモー
ター及び発現制御に関する遺伝子は、テトラザイクリン
耐性遺伝子の開始コドンＧＴＧより上流部分であり、制
限酵素１ａｅ　ｍとＰｏｋ　　Ｉにより切断された１８
３　ｂｐの中に含まれるものと考えられる。そこで１μ
９のｐＴＩｌ’ｌ’１５を、ハに！緩衝液（１０ｍＭ　
　ｌ−リス−１（ＣＩ緩衝液（ｐｌ＋７．５）　、　’
ｌｎＭＭｇＣＩｚ、　６０ｍＭ　ＮａＣ＋、　７ｍＭ　
　２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＳ＾）に溶
かし制限酵素Ｆｏｋ　　１とｔｌａｅ　Ｉｎを５単位ず
つ加え３７°Ｃで１時間反応させ、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけることにより、目的の１８３　ｌａ
ｐ断片を単離した。

一方、枯草菌のα−アミラーゼ構造遺伝子は肛ｎｆＩ−
肛ｎ　ｆ■（２５３ｂｐ）、坦ｎＨ−Ｅｃ虹Ｒ１（２７
１ｂｐ）、Ｅｃｏ　Ｉｌｌ　−釦ＬＩ　（１３７１ｂｐ
）の３つのＤＮＡ断片によって、５゛側の１４ｂｐをの
ぞいて再構築できる。そこで、１μ３のｐＤＣＡ　１０
０を上記の制限酵素で切断したのち、ポリアクリルアミ
ド電気泳動により、目的の２５３ｂｐ、２７１ｂｐ、１
３７１ｂｐ断片を単離精製した。

また、テトラサイクリン酸性遺伝子のプロモーターと発
現制御に関する遺伝子とα−アミラーゼ構造遺伝子を連
結するための合成りＮＡリンカ−として５’　−ＴＧＡ
ＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡ＾＾八ＣＧ−３’と５″−Δ
へＴＣＧＴへＴＴＧＣＡへへＣＡＴＡＴ−３”　をアッ
プライドバイオシステム社のＤＮＡ合成装置を用いて合
成した。このＤＮＡをカイネーション溶液（５０ｍＭ　
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐｌ＋８．０）、　１０ｍＭ　
ＭｇＣｈ。

１０ｍＭ　　２−メルカブトコニタノール、　　１００
ｍＡ１’１１）にそれぞれ６ｎｇずつ入れ、Ｔ４ＤＮＡ
キナーゼ１０単位を加え３７°Ｃで３０分反応させたの
ち両１）ＮＡを混ぜ６５°Ｃで５分静置し、その後約１
時間かけ３７°Ｃに戻すことによりアニーリングを行わ
せ、ＤＮＡ　リンカ−とした。

Ａ 次に、大腸菌ベクターｐＵｃ１９を制限酵素ＨｉｎｃＩ
ｌと鋤Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動を行うこと
によりベクターＩＩＮへを単離した。

以」二のＤＮＡ断片を混合し、ライゲーション溶液５０
／ｉ１としたのち、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ１０単位を加
え３７°Ｃで１時間静置した。

このライゲーション溶液１０βを用いて、常法にしたが
って大腸菌１１　Ｂ　１０１株に形質転換した。アンピ
シリン耐性のコロニーが約１万株得られ、そのうち５０
株についてプラスミドＤＮＡを調製したところ、内２株
が目的通り連結されたプラスミドを有することが確認さ
れたので、このプラスミドをｐＭＤ３０１２　とした。

ｐＭＤ３０１２は第３図のような制限酵素切断パターン
を示し、制限酵素Ｂａｍ１ｌＩと９ｈ　　Ｉによる切断
でベクターに挿入された断片を１つの断片として回収で
きる。そこで、１μ３のｐＭＤ３０１２を堕１）１】溶
液に入れ、制限酵素並ｍＨＩとｌＩをそれぞれ５単位ず
つ加え３７°Ｃで１時間反応させた後、アガロースゲル
電気泳動によりテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ター発現側＜Ｂ　ｉＪ域とα−アミラーゼ遺伝子を有す
る２１０８ｂｐ断片を単離した。

また、枯草菌ベクターｐＵＢ１１０を１μ９とりｈｌｌ
Ｉ　Ｔ溶液に入れ、制限酵素ハしＨｌと並ｈｌを加え３
７°Ｃで１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動
でカナマイシン耐性を有する４３０５ｂｐの断片を単離
した。

上記２つのＤＮＡ断片をライゲーション溶液にいれ、Ｔ
４ＤＮ＾リガーゼを１０単位加え２０°Ｃで１時間反応
させた後、常法により枯草菌１八２８９株を形質転換し
た。得られたカナマイシン耐性株の内２４株についてプ
ラスミドＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動で調
べたとごろ、供試した全ての株が目的通りのプラスミド
を有しており、このプラスミドをｐＭＤ３０４１と名付
けた。

（３）デ上う準イフ」ジ外」磐Ｓ　（Ｘ　−二り糺乞二
虻■誘専発央 ｐＭＤ３０４１を有する枯草菌１八２８９株を、カナマ
イシン５μ９／ｍ１を含むＮＹＳ寒天培地（可溶性デン
プン　１０ｇ、ニュートリエンドブロス８ｇ、酵母エキ
ス５　ｇ、　ＮａＣ１３ｇ、　Ｍｇ５Ｏｎ　０．２ｇ、
寒天１５ｇ／　１１　（ｐＨ７，０））とそれにテトラ
サイクリンを０．５μ９／ｍ１加えた２種類の培地に植
菌し３７°Ｃ−夜培養した後、ヨードデンプン反応によ
りα−アミラーゼ生産性を調べてみたところ、テトラサ
イクリンを加えた培地に植菌した枯草菌はα−アミラー
ゼを分泌していたが、未添加の培地ではα−アミラーゼ
の分泌はわずかであった。

そこで、更にα−アミラーゼ生産性を正確に比較するた
めカナマイシン５μ９／ｍ１を含むＮＹＳ培地（ＮＹＳ
寒天培地から寒天を除いたもの）とそれにテトラサイク
リン０．５μ９／ｍｌ含む２種類の液体培地にそれぞれ
ｐＭＤ３０４１を有する枯草菌Ｉ　Ａ２８９株を植菌し
３７°Ｃで８時間培養し、その培養上清についてα−ア
ミラーゼ活性を不破らの方法（Ｆｕｗａ、Ｈ，、Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ＋４１＋５８３−６０３　（１９５４））
を用いて測定したところ第１表に示すように、１０倍以
上ものα−アミラーゼ活性の違いが認められ、明らかに
テトラサイクリンによってα−アミラーゼ遺伝子の誘導
発現が起こっていることが確認された。

第　　　１　　　表 また、増殖過程における対数増殖期後期または停止期前
期における誘導発現については以下の実験を行った。Ｎ
Ｙ寒天培地上で３７”Ｃ−夜培養したｐＭ０３０４１を
有する枯草菌ＬＡ２８９株をＮＹ培地に植菌し３７°Ｃ
１２時間浸透培養し、この培養液を新たにＮＹ培地へ１
１５０００接種し３７°Ｃ−夜培養した。０Ｉｌ１６ｏ
ｏ−約１．３の峙テトラサイクリンを０．５ｐｇ／ｍｌ
の濃度になるように添加し、３７°Ｃで更に振盪培養し
た一定時間毎に培養上清をサンプリングしα−アミラー
ゼ活性と００６００値を測定した。その結果は第４図に
示した。

最初のサンプリングはテトラサイクリン添加後約１時間
目に行ったが、すでにテトラサイクリン無添加の者に比
べ約２倍のα−アミラーゼが分泌しており、極めて誘導
発現の速度が速いことが示唆された。また菌の増殖が停
止した後もα−アミラーゼを分泌生産し続けていること
が明らかとなり、この事からも工業的な培養においても
この発現制御系が利用可能であると考えられる。

生産される目的ペプチドが宿主微生物にとって有害な物
質である場合には、このように、宿主微生物の増殖が進
んだ対数増殖期後期から停止期前期の時期にテトラサイ
クリンを培地に添加し、目的ペプチド生産性を開始させ
ることにより、工業的な培養が可能である。

実施例２（クロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモー
ターおよび発現制御に関する 遺伝子を含有するプラスミドを利用し たα−アミラーゼの製造） クロラムフェニコール耐性プラスミドｐｃ１９４の全塩
基配列はすでに決定されており、クロラムフェニコール
耐性遺伝子部分の構造も明らかとなっている。そのクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーターは制限酵素
層Ｈの切断によっても失活しないことは１ｕｌｌ認され
ている。

そこで、クロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモータ
ー及び発現制御に関する遺伝子を含む断片として１μ３
のｐｃ１９４を制限酵素層■とＭｎｌ　　Ｉとで切断し
２５３ｂｐのＤＮＡ断片を回収積製した。

一方、実施例１と同様に枯草菌のα−アミラーゼ構造遺
伝子の２５３ｂｐ、　２７１ｂｐ、　１３７１ｂｐ断片
を単離精製した。

また、クロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーター
及び発現制御に関する遺伝子とα−アミラーゼ構造遺伝
子を連結するだめの合成りＮＡクリンカとして５’−Ｃ
ＡＣＴＴＴＡＧＡＴＡ八八＾＾ＴＴＴＡＧＧへへＧＣＡ
ＴＡＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧ−３’　　
と５’−へへＴＣＧＴＴＴＴＧＣＡへへＣＡＴＴＴＧＡ
ＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴ＾ＴＣＴＡＡＡ
ＧＴＧ−３”をアプライドバイオシステム社のＤＮ八へ
成装置を用いて合成した。このＤＮＡをカイネーション
溶液にそれぞれ５ｎｇずつ入れ、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ　
１０単位を加え３７°Ｃで３０分反応させたのち両ＤＮ
Ａを混ぜ６５°Ｃで５分静置し、その後約１時間かけ３
７°Ｃに戻すことによりアニーリングを行わせ、ＤＮＡ
リンカ−とした。

次に、大腸菌ベクターｐＵＣ１９を制限酵素ＡｃｃＩと
釦Ｌ■で切断し、アガロースゲル電気法動を行うことに
よりベクターＤＮＡを単離した。

以上のＤＮＡ断片を混合し、ライゲーション溶液５０４
としたのち、Ｔ４ＯＮＡ　リガーゼ１０単位を加え２０
°Ｃで１時間静置した。

このライゲーション溶液１０ｍを用いて、常法に従って
大腸菌８８１０１株に形質転換した。

アンピシリン耐性のコロニーが約１万株得られ、その内
の４８株についてプラスミドＤＮＡを調製したところ内
４株が目的通り連結されたプラスミドを有することが確
認されたので、このプラスミドをｐＭＤ３０２とした。

このｐＭＤ３０２は第５図の様な制限酵素パターンを示
し、制限酵素Ｂａｍ　ＨｌとＩＩによる切断でベクター
に挿入された断片を１つの断片として回収できる。そこ
で１μ３のｐＭＤ３０２をＲａｍＨＩ溶液に入れ、制限
酵素ハし旧とｌＩをそれぞれ５単位ずつ加え３７°Ｃで
１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動によりク
ロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーター及び発現
制御に関する遺伝子とα−アミラーゼ構造遺伝子を有す
る２２３１ｂｐの断片を単離した。

また、枯草菌ヘクターｐＵＢｉｌｏを１のとりＲａｍ旧
溶液溶液れ、制限酵素展旧と鉢ｈＩを加え３７°Ｃで１
時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動でカナマイ
シン耐性を有する４３０５ｂｐの断片を単離した。

上記２つのＤＮＡ断片をライゲーション溶液に入れ、Ｔ
４ＯＮＡ　リガーゼを１０単位加え２０“Ｃで１時間反
応させた後、常法により枯草菌ＬＡ２８９株を形質転換
した。得られたカナマイシン耐性株の内２４株について
プラスミドＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動で
調べたところ、供試した全ての株が目的通りのプラスミ
ドを有しており、このプラスミドをｐＭＤ３０３５と名
付けた。

ｐＭＤ３０３５を有する枯草菌ｌＡ２８９をカナマイシ
ン５μｇ　／　ｍｌを含むＮＹＳ寒天寒天色地れにクロ
ラムフェニコールを０．５μｙ／ｍｌ加えた２種類の培
地に植菌し３７°Ｃ−夜培養した後、α−アミラーゼ生
産性を調べるためヨードデンプン反応を行ってみたとこ
ろ、クロラムフェニコールを加えた培地に植菌した枯草
菌はα−アミラーゼを分泌していたが、未添加の培地で
はα−アミラーゼの分泌は僅かであった。

そこで、更にα−アミラーゼ生産性を正確に比較するた
めカナマイシン５μ９／ｍｌを含むＮＹＳ培地とそれに
クロラムフェニコールを０．５Ｂ９７　ｍｌ含む２種類
の液体培地にそれぞれｐＭＤ３０３５を有する枯草菌ｌ
Ａ２８９株を植菌し３７°Ｃで８時間培養し、その培養
上清についてα−アミラーゼ活性を不破らの方法を用い
て測定したところ第２表に示すように約１０倍はどα−
アミラーゼ活性に違いがあることが認められ、明らかに
クロラムフェニコールによってα−アミラーゼ遺伝子の
誘導発現が起こっていることが確認された。

この様にテトラサイクリン耐性遺伝子の発現制御に関す
る遺伝子同様このクロラムフエニコール耐性遺伝子の発
現制御に関する遺伝子も目的ペプチドの遺伝子の誘導発
現に利用可能であると考えられる。

第　　　２　　　表 〔発明の効果〕 上述した如く、本発明のペプチドの製造方法は、薬剤の
添加によってペプチド合成能を誘導することができ、ペ
プチド合成の開始時期をコントロールできるので、生産
される目的ペプチドが宿主微生物にどって有害な物質で
ある場合には、このように、宿主微生物の増殖が進んだ
対数増殖期後期から停止期前期の時期に薬剤を培地に添
加し、目的ペプチド生産性を開始させることにより、工
業的な培養が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＤＣ＾１００の制限酵素切断地図
、第２図はプラスミドｐＭＤ３０１２の創製経路図、第
３図はプラスミドｐＭＤ３０４１の創製経路図、第４図
はテトラサイクリンを添加してからの培養時間とα−ア
ミラーゼ活性及び菌の生育（００６００）との関係を示
すグラフ、第５図はプラスミドｐａｌ）３０２の創製経
路図、第６図はプラスミドｐＭｌｌ１３０３５の創製経
路図である。 出願人代理人　　古　谷　　　苫 １ト１ト 二　　　　二 図　Ｑ　卯　飯　　： コ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　コ区 ａ） 味

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　薬剤耐性遺伝子のプロモーター及び発現制御に関す
   る遺伝子を含み、かつ、該発現制御に関する遺伝子の直
   後に目的ペプチドをコードする構造遺伝子を有するプラ
   スミドによって形質転換された微生物を培養し、該培養
   過程で目的ペプチドの合成能の誘導が起こるに必要な量
   の薬剤を培地中に添加することを特徴とするペプチドの
   製造方法。 ２　薬剤がテトラサイクリンである請求項１に記載の製
   造方法。 ３　薬剤がクロラムフェニコールである請求項１に記載
   の製造方法。