JPH0128044B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はノルマルヘパリン（normal heparin）
から出発して顕著に有利な薬理学的性質及び治療
学的性質を備えた低分子量ヘパリンを得る方法に
関する。

ヘパリンは良く知られており、そして不安定な
ヘパリン酸の安定な一価又は二価塩である。それ
はα1−４グリコシド結合により結合されたヘキ
スロン酸（Ｄ−グルクロン酸及びＬ−イズロン
酸）及びグルコサミン60−及びＮ−サルフエート
により形成された二糖単位の重合体である。

その抗凝塊特性（anti−clotting properties）
は1917年に組織から発見及び単離されて以来多年
にわたり知られている。

ヘパリンはタンパク部分に多少ゆるく結合して
多くの組織及び細胞において種々の形態で存在す
る。皮膚において、部分的に異なつた種のヘパリ
ンの肺において、高分子形態で存在し、これはア
スコルビン酸又は腸粘膜に存在すると考えられる
或る酵素の作用に感受性である。アスコルビン酸
又は腸粘膜均等質（intestinal mucosa
homogenates）で処理した後これらの巨大分子
形態の肺又は皮膚ヘパリンは腸粘膜から単離する
ことができるヘパリンと同じ分子寸法に減じるこ
とができる。

15000ダルトンの平均分子量（Ｗ）を有する
腸粘膜から単離されたヘパリン又は前記した如き
常用の方法のいくつかによるこのＷに減じられ
た他の供給源からのヘパリンはヘパリンの天然分
子の最小寸法を与える。本発明に従えば、かかる
タイプのヘパリンはノルマルヘパリンと定義され
る。事実、更に腸粘膜からのヘパリンを低い分子
量画分に分解することができる体内の酵素は存在
せず、その生物学的活性を全部失なうことなくノ
ルマルヘパリン分子を解重合することができる化
学的方法も開発されなかつた。フラボバクテリウ
ム ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）
からの或る種の微生物酵素（microbial
enzymes）、たとえばヘパリナーゼのみはヘパリ
ン分子を変性した二糖単位に完全に解離させるこ
とができる。この方法は構造研究に適用されたが
新規な生物学的に活性な分子を得るためには不適
当であることが証明された。

故に本発明の一つの目的はノルマルヘパリンか
ら出発して高められた薬理学的活性を備えた低分
子量ヘパリン画分を得ることを可能とする方法を
提供することである。

この目的を達成するために本発明は下記段階： (a) ノルマルヘパリンを酸性化してヘパリン酸を
得ること、 (b) オートクレーブ中で過酸化物の存在下に加熱
することによつて該ヘパリン酸を解重合して低
分子量へパラミンを得ること、 (c) 該ヘパラミンをサルフエート化
（sulphation）して対応する低分子量ヘパリン
を得ること、より成ることを特徴とする方法を
提供する。

本発明により提唱された方法に従う反応式は以
下に記載される。

式中＜であり、そして15000Dのヘ
パリンに相当する値である26.7の場合に７
＜＜22である。

それは下記の如くして計算される： ＝15000／56226.7 式中、567は前記した式（）及び（）によ
り表わされた二糖単位（化学式
C₁₂H₁₅O₁₆NS₂Na₃の）のである。

上記反応式に従えば、式はノルマルヘパリン
のナトリウム塩を示す；簡単化のため該式はＤ−
グルクロン酸のみを示し、Ｌ−イズロン酸を含有
する分子の部分を示さない。同様に、他の一価又
は二価カチオンがナトリウムカチオンの代わりに
存在することができる。

該ヘパリンは前記した段階(a)に従つて酸性化
されてその遊離酸、即ち式のヘパリン酸が得ら
れる。

式のヘパリン酸は段階(b)において解重合され
て、Ｎ−サルフエート基の大部分を損失し、そし
て式のヘパラミンを生成する。

最後に、式のヘパラミンは段階(c)に従つて処
理されてＮ−サルフエート基の再構成によつて本
発明に従う最終生成物、即ちLMW（低分子量）
ヘパリン又はRD（再構成解重合ヘパリン）とし
て定義されている式のヘパリンを得る。

本発明の方法の更に特定の説明に従えば、該ヘ
パリン酸は簡単な酸性化又は好ましくはカチオン
性交換樹脂による処理によつてノルマルヘパリン
から得られる。

次いでヘパリン酸は解重合の段階(b)を通つて
進み、これは好ましくは１気圧（atm）乃至２気
圧の圧力で加熱することによつて過酸化物、たと
えばH₂O₂の存在下にオートクレーブ中で行なわ
れ、オートクレープ処理は予め選ばれた時間で
（たとえば15、30、60、120、240分で）停止させ
ることができる。この方法において、＝
15000Dのノルマルヘパリンから出発して最終生
成物、即ち、約12000乃至4000Dの範囲の種々の
平均分子量（）を有するＬ又はRD、ヘ
パリンを得ることが可能である。該解重合の収率
はすべての例において同じ（約65重量％）であ
る。における減少は末端還元基の滴定〔ソモ
ジの方法（Somoji′s method）〕又は比粘度の減
少によつて追跡される。

該解重合の生成物は低分子量ヘパリンであ
り、その分子量は予め選ばれた種々の時間のオー
トクレーブ処理に従つて約1/3に下がつた対応す
る出発ヘパリンのそれより低い。

該解重合段階においては、前記した如く、窒素
に結合したサルフエート基の大部分が失なわれ、
ヘパラミンは最後には、反応混合物の冷却及び
PHの上昇後、活性硫酸基（active sulphuric
group）の再構成に付されて、たとえばアルカリ
炭酸塩の存在下に窒素含有塩基のスルホトリオキ
シド（たとえばピリジンスルホトリオキシド、ト
リメチルアミンスルホトリオキシド等）との反応
又はクロロスルホン酸及び窒素含有塩基との反応
の如き公知方法によつて該段階(c)に従つて最終生
成物を得る。最終生成物の収率はオートクレー
ブ処理の時間にはかかわりなくヘパリンの出発量
に関連した重量という点ですべての場合に同じで
ある。

本発明をより良く理解するためいくつかの実施
例を説明するがこれは本発明を限定するものでは
ない。

実施例 １ 20ｇの量のナトリウム又はカルシウムヘパリン
（抗凝塊活性＝150IU／mg）を脱イオン水100ml中
に溶解し、そしてH⁺形態のアンバーライト
IRC120（AmberliteIRC120）100mlを含有する
カラムに入れる。

カラムを脱イオン水100mlで洗浄し、そして液
体を集める。溶液のPHは１〜1.5であつた。過酸
化水素の飽和溶液（36％）20mlを加え、そして液
体を１気圧で15分間オートクレーブ中で加熱し
た。室温に冷却した後、PHを2N NaOHで7.2に
上昇させ、ピリジン16ml及びピリジンスルホトソ
オキシド16ｇを撹拌下に加えた。

ピリジンを少し添加してPHを５乃至６に保持し
て反応を12時間続ける。次いでPHをNaOHによ
り８に上昇せしめ、溶液を真空中で100mlに濃縮
して過剰のピリジンを除去する。塩を混合床イオ
ン交換カラムにおいて除去し、溶液を無菌過し
それを凍結乾燥した。

収率：85−100IU／mgの抗凝塊活性及び元の2/
３であつた（ソモジー法）を有する白色粉末
として65％。

実施例 ２ ナトリウム又はカルシウムヘパリン、150IU／
mg、20ｇを注入のため水100ml中に溶解し、そし
てH⁺形態のカチオン交換樹脂で脱カチオン化し
た。

その溶液（PH＝１−1.5）に過酢酸（40％溶液）
20mlを添加し、次いで全体を１気圧で60分間オー
トクレーブで処理した。

冷却し、そしてPHを7.2に上昇させて後、トリ
メチルアミンスルホトリオキシド20ｇ＋
Na₂CO₃20ｇを加えた。反応混合物を60℃を越え
ない温度で多時間撹拌し、次いでダウエツクス
リターデイオン11A8カラム（Dowex
Retardion11A8column）を通過させた。溶液
のPHを６に調節し、溶液を冷却し、そして３容量
のエタノールを加えた。白色沈殿物を集め、エタ
ノール又はメタノール又はアセトンで洗浄し、そ
して真空中で乾燥した。

最終生成物は35−50IU／mgの抗凝塊活性及び
元の1/3である（ソメジー法）を有する。

実施例 ３ 下記操作条件を用い実施例１に記載の如くして
操作することによつて、２気圧で30分間オートク
レーブ処理すると、35−50IU／mgの抗凝塊活性
及び元の約1/3であるを有する最終生成物が
得られる。

生成物は精製されたヘパリンの化学組成及
び物理化学特性と同一である化学組成（サルフエ
ート、ヘキソサミン、ヘキスロン酸含有率）及び
一定の物理化学的性質〔比旋光度（specific
optical rotation）〕を有するが端末還元基の滴定
における異なつた値（ソメジー法）、種々の電気
泳動移動度及び塩基性染料、たとえばトルイジン
青と共に形成された錯体におけるシフトした最大
吸収波長を与える。

本発明に従つて得られるLMWヘパリン（RD
ヘパリン）はノルマルヘパリンと比較して非常
に興味ある薬理学的及び治療学的性質を示す。

これらの最も重要なものは、比 抗Xa試験（Anti−Xa test）／APTT 式中、抗Xa試験＝Yin′s test、APTT＝活性
化部分トロンボプラスチン時間（Activated
Partial thromboplastin time）である、により
測定される抗血栓活性（anti−thrombotic
activities）と全抗凝塊活性（total anti−
clottting activities）との間の試験管内又は生体
内（実験動物及び人間における）における改良さ
れた比である。

異なつたRDヘパリン、比抗凝塊活性
（specific anti−clotting activity）はの減少
と共に減少するけれども抗血栓活性／全抗凝塊活性の比
の値 はの減少と共に増加することを示す。

或る場合には、＝15000を有するノルマル
ヘパリンは全抗凝塊活性〓150IU／mg及び抗−
Xa／APTTの比＝１を有するが、これに対し本
発明のRDヘパリンは全抗凝塊活性＜150IU／mg
及び抗−Xa／APTT＞１を有する。特に該比は
化合物と比較して化合物に対して殆んど二倍
であり、化合物の抗血栓活性はノルマルヘパリ
ンのそれの二倍であり、換言すれば、抗凝塊活
性に関して、化合物の投与量の半分又はそれよ
り少ない投与量がノルマルヘパリンの全投与量
（whole dose）によつて生じるのと同じ抗血栓作
用を生じるのに必要である。

これらのデータはトロンビン及びトロンボプラ
スチン誘発トロンビ（thrombi）の形成に対する
静脈内に投与された化合物及びの防御作用を
測定することによつて実験動物により確かめられ
た。

故に、本発明の方法によつて得られ得るRDヘ
パリンの族（family）においては、血栓症に対
する防御の分野において特定的使用のため比抗凝
塊活性及び抗血栓／抗凝塊比の点から最も好適な生成物 を選ぶことができる。

たとえば、非常に短い凝塊時間を持つ凝塊形成
性状態の患者は相当高い抗凝塊活性を有する抗血
栓剤を必要とするが、これに対し、外科の介入を
受けるべき患者は、出血及び手術後の血栓症の危
険がある場合には低い抗凝塊活性を有する抗血栓
剤を必要とする。

更に、人間に皮下投与した後、化合物は化合
物より長く血液中に残存する。別の試験、即
ち、カルシウム再沈着時間（recalcification
time）、活性化部分トロンボプラスチン時間
（APTT）、トロンビン時間、抗Xa活性（Anti−
Xa activity）が化合物がいかに長く循環中に
残存するかを検査するのに使用される。

更に、化合物は或る動物種（ラツト、マウ
ス、犬）における経口吸収を示すが、これに対し
て化合物は経口的には吸収されない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性： 加水分解後のヘキソサミン；ヘパリンに対する
   と同じ 加水分解後のウロン酸；ヘパリンに対すると同じ サルフエート基；ヘパリンに対すると同じ 旋光性；ヘパリンに対すると同じ 平均分子量（）；12000−4000D 全抗凝塊活性；＜150IU／mg 抗−Xa／APTT；＞１ を有することを特徴とする低分子量ヘパリン。 ２ 高められた薬理学的性質を備えた低分子量ヘ
   パリンを得るための方法において、下記段階： (a) ノルマルヘパリンを酸性化してヘパリン酸を
   得ること、 (b) 過酸化物の存在下に加熱することによつて該
   ヘパリン酸を解重合して低分子量ヘパラミンを
   得ること、 (c) 該ヘパラミンをサルフエート化して対応する
   低分子量ヘパリンを得ること、 より成ることを特徴とする方法。 ３ 該解重合をオートクレーブ中で行なうことを
   特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 該サルフエート化を、塩基の存在下に、窒素
   含有有機塩基のスルホトリオキシドによる処理に
   より行なうことを特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ５ 該塩基が該スルホトリオキシドに対応する遊
   離窒素含有塩基であることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ６ 該塩基がアルカリ炭酸塩であることを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７ 該サルフエート化をクロロスルホン酸及び窒
   素含有有機塩基で処理することにより行なうこと
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ８ 下記の特性； 加水分解後のヘキソサミン：ヘパリンに対すると
   同じ、 加水分解後のウロン酸；ヘパリンに対すると同
   じ、 サルフエート基；ヘパリンに対すると同じ、 旋光性；ヘパリンに対すると同じ、 平均分子量（）；12000−4000D 全抗凝塊活性；＜150IU／mg 抗−Xa／APTT；＞１ を有する低分子量ヘパリンを、活性成分として含
   有する血栓症の処置のための薬剤組成物。