JPH01281075A - 安定化プロトプラスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、安定化したバクテリアプロトプラスト組成
物に、その製造方法に、およびバクテリアプロトプラス
トの保存方法に関する。

ＥＰ−Ａ−０２４６１６３において、チーズを作るため
にミルクを処理する方法が開示されている。この方法は
、レンネットの添加前にミルクをバクテリアプロトプラ
ストで接種することからなる。

Ｌ２方法で使用されるバクテリアプロトプラストは、従
来既知の方法に従って調製され、その方法は、バクテリ
ア細胞壁を除去することから本質的になるものである。

これら方法の１つによると、プロトプラストの懸濁物の
調製にリゾチームが使用される。

これらプロトプラスト懸濁物は、バクテリア懸濁物にリ
ゾチームを添加した後は、できるだけすぐに使用すべき
である。

′Ｎ延した使用のためには、懸濁物は１例えばシュクロ
ースやラクトースのような浸透圧安定化剤をプロトプラ
スト懸濁物に含めることにより。

または該プロトプラストおよびスキムミルクを用いて、
プロトプラストの細胞内容物に近い浸透圧を有するミル
クを再構成することにより安定化させなければならない
。

しかしながら、そのような安定化懸濁物は、限られた期
間しか貯蔵できない。

を期されなかった様態で、プロトプラストが安定化され
た（すなわち、長い貯蔵期間にわたって、細胞メンプラ
ンを含む結果溶菌に至る劣化がない）バクテリアプロト
プラスト組成物が見い出Ｊれた。

かくして、この発明の１つの特徴は、凍結もしくは凍結
乾燥された状態にある。耐寒性（ｃｒｙａｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ）培地中のバクチリアブミドプラスト懸濁物か
らなる安定化プロトプラスト組成物に関する。

この発明に従って使用される耐毒性培地は、凍結、凍結
乾燥およびその後の貯蔵中にプロトプラストの一体性を
維持することを可能とする培地である。

この培地は、有利には、スキムミルクまたは糖を含む水
溶液である。この発明の目的に適切な糖は、例えばその
分子睦が大きすぎるために、プロトプラストに侵入しな
い分子を有する糖である。

特に有用は糖は、オシド（ａｓ　１ｄｅ）であり殊に、
ホロシト頁ｈａｌｏｇｉｄｅ）または多糖１例えばシュ
クロース、プルドース、セロビオース、メリビオース、
ラクトース、トレハロースまたはマルトデキストリンで
ある。

耐寒性培地中の糖のψは、後者の浸透圧がプロトプラス
トの細胞内容物のそれに近接するように選ばれる。細胞
内容物の浸透圧は、プロトプラストが形成されるバクテ
リアに依存する０例えば、ストレプトコッカス番サーモ
フィラス由来のプロトプラストにとっては、約３４０の
分子騒を有し、クライオスコピックオスモメータ（ｃｒ
７ｏｓｃｏｐｉｃ　ａｓｍｏｓｅｔｅｒ）で測定したオ
シドの実際のオスモル濃度（ｏｓｓｏｌａｌｉｔｙ）が
約６５０ミリギルであるオシドを含有する水溶液が有利
に用いられる。

そのような組成物は、既知のバクテリア株からＪ製でき
る。バクテリア株の中でも、農食品産業において醗酵目
的で使用される株は、好ましいものである。その中でも
、好熱性株および中温性株が特に好ましい、乳酸バクテ
リアが特によく適している。

これら乳酸バクテリアは、特に、ラクトバチルス（Ｌａ
ｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、およびストレプトコッカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ＋）属を特に含み、またコ
リネフォルムバクテリアのアルカリ化性（ａｌｋａｌｉ
ｚｉｎｇ）バクテリアを挙げることもでき、その中では
、アルトロ八クタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属お
よびブレビバクテリウム・リネ７　ス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕ＊　ｌｉｎｅｍｓ）　Ｎが、ミクロコッキ
（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉ）　（ミクロコツカス（Ｍｉｃ
ｒａｃｏｃｃｕｇ）属）またはプロピオン酸バクテリア
（プロピｔ７バタテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属）（その作用は、グルエレオブコムテ（ｇ
ｒｕ７ｅｒｅｏｆ　ｃｏ■ｔｅ）のような、内部孔を有
するチーズについてよく知られている）と同様に決定的
な役割を東たす。

この発明の第２の特徴は、 ｌ）バクテリアからプロトプラストを形成する工程、 ２）■程ｌ）で得たプロトプラストの耐寒性液体中懸濁
物を凍結する工程、 ３）必要に応じて、該凍結懸濁物を凍結乾燥する工程 を具備したことを特徴とする。安定化したプロトプラス
ト組成物の製造方法に関する。

プロトプラストの形成すなわち「プロトプラスト化」は
、既知の手法に従い、バクテリア細胞壁を破壊し得る酵
素の作用によりおこなう、特許出′ＩｎＥＰ−Ａ−０２
４８１８３ニ記載された方法によりリゾチームの存在下
におこなうことが有利である。

好ましい手法によれば、プロトプラストの形成は、耐浸
透圧性培Ｊ′ｌ！！（ｏｓｓｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　
ｍｅｄｉｕｍ）すなわち、形成したプロトプラストの一
体性を保持し得る培地中でおこなわれる。事実、後者の
浸透圧は、プロトプラストの安定化において重要な役割
を果たす、糖の水溶液が有利に用いられ、好ましくは耐
寒性培地として用いられたものと同じものである。その
ような溶液の糖のモル濃度は０．５Ｍであることが有利
である。かくして得られた。必要に応じて耐浸透圧性培
地で安定化されたプロトプラストの懸濁物は１次に、上
に述べたような耐寒性液体中で凍結される。好ましくは
、［程２）の耐寒性培地は、工程ｌ）の耐浸透圧性培地
を包含する。

凍結は、プロトプラストの細胞膜に悪影響を与え得る大
きな結晶の形成を避けるために迅速におこなうことが必
要である。

好ましい凍結処理は、温度が一８０℃である容器中に、
深さ０．５ないし２ｃｍの液層が生じるように、ＩＭま
たはそれ以上の受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に分散さ
せたＩｎ９．当り１０ないし１０”’のプロトプラスト
を含む耐寒性培地を置くことからなる。これら条件下で
、かくして調製された凍結組成物は、約１時間以内で完
全な結晶構造を獲得する。この組成物は、必要に応じて
凍結乾燥することができる。

凍結乾燥は、当業者に知られたルールに従っておこなう
ことが必要であり、生物学的物質のもろい性質を考慮し
なければならない。

好ましくは、凍結懸濁物は、−４５℃に維持された凍結
乾燥器中で少なくとも２４時間凍結乾燥される。凍結乾
燥が完結したら、得られた組成物を、残りのべ分を除去
するために２０℃に加温することが有利である。

こうして得られたバクテリアプロテアーゼ組成物は、　
ＥＰ−Ａ−０２４８１８３に記載された方法に使用する
ことができる。

凍結組成物を使用した場合、これらを含む受容体を、そ
れらを解凍し得る温度にまず置くことが有利である。凍
結乾燥組成物を使用する場合、これを蒸留水で再水和す
べきである。

この発明の今１つの特徴は、 ａ）バクテリアプロトプラストを耐寒 性培地中に導入する工程。

ｂ）得られた懸濁物を凍結する１ 程、および Ｃ）該凍結懸濁物を、その使用まで貯 蔵する工程 を具備したことを特徴とするバクテリアプロトプラスト
の保存方法に関する。−８０℃での貯蔵が特に適してい
る。

この貯蔵方法は、凍結組成物を凍結乾燥に供することに
より改りできる。凍結乾燥組成物は有利に＋４℃で貯蔵
できる。

以下、この発明の実施例を２峨するが、この発明はそれ
に限定されるものではない。

実施例　ｌ ■　プロトプラスト系凍結乾燥組成物の調製ｌ）株 以下の８種の株を用いた。これら全ての株は知られてお
り、一般に入手できる。これらは、特に、センター・ナ
シオナル・デウ会レシェルシェ・ズーテクニク（Ｃｅｎ
ｔｒｅ　Ｈａ目ｏｎｎａｌ　ｄａＲｅｃｈｅｒｃｈｅｓ
　Ｚｏｏｔｅｃｈａｉｑｕｅｓ）　（ＣＮＲＺ）　（７
ランス）から入手できる。

（中温性菌） フィリックバクテリア、ソフトペーストといつ衣株の成
長培地 に２株は、以下の培地の１つ上で成長させた。

Ａ培地 （テルザギ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）他により、アプライド
番マイクロバイオロジー、　２３　、６　、１９７５：
　８０７−８１３に記載されたＭ１７として知られてい
る培地）組成： パートａ： （ビオカー、リファレンス１０４００８）イーストエキ
ス　　　　　　　　　２．５ｇ（デイフコ、リファレン
ス０１２７−０５−３）ビーフエキス　　　　　　　　
　　５ｇ（デイフコ、リファレンス０１２Ｂ−Ｏｆ−０
８）アスコルビン酸　　　　　　　　　０．５ｇジナト
リウムグリセロホスフェート　ＩｇＩ　Ｍ　　Ｍｇ５０
４−７８２０　　　　　　　　　　　１　ｍ　ｌ蒸留水
　　　　　　　　９５０℃見とするに４Ｎ　　ＮａＯＨ
でｐＨを７．２に１箇した後、パートａを熱処理（１２
０℃、２０分）により減菌する。

パ　−　ト　　ｂ　＝ ラクトース　　　　　　　　　　１０ｇ蒸留水　　　　
　　　　５０℃見とする績パートｂは、０．２２ｇｍ孔
のメンプランによりろ過滅菌する。

Ａ培地はパートｂをパートａに添加することにより得ら
れる。

Ｂ培地 （デイフコ、リファレンス０３７０−０１）（デイフコ
、リファレンス０１２７−０５−３）蒸留水　　　　　
　　１０００ｍ文とする埴４Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ
を７．２に１箇した後、培地を熱処理（ｉ　２０℃、２
０分）により′Ｊ７Ｒ菌する。

Ｃ培地 組成： Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　１０ｇ酢酸アンモ
ニウム　　　　　　　　　　５ｇ酢酸ナトリウム　　　
　　　　　　　　２ｇＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ Ｍ　ｎ　Ｓ　１３４　・４ＨＺ　０　　　　　　　　　
　　　　　　０−０５　ｇ微Ｘ１元素溶液　　　　　　
　　　　　１ｍ見Ｈ３８０３３０麿８ ＭｎＣｌ、・４８２０　　　　　　　　　７０ｍｇＺｎ
Ｃ１，２００ｍｇ Ｈａ２１４ａＯ，・２Ｈ２０２０ｓｇ ＦｅＣ］３６Ｈ２０５０ｍｇ ＣｕＳＯ４τＨ２０２００ｖｇ 蒸留水　　　　　５００１とする量 蒸留水　　　　　　　１０００ｍ文とする量滅菌前にｐ
Ｈを６．７に調節する。

培地を熱処理（１２０”０．２０分）により滅菌する。

Ｄ培地 組成： 溶」Ｌユ Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　１０ｇＮ　ａ　
ｚ　ＨＰ　％　２　Ｈ２０２ｇＫＨ２ＰＯヤ　　　　　
　　　　　　　　　　２ｇＭｇ５Ｏｙ７Ｈｈ０　　　　
　　　　　　　　　０　、５　ｇＮｎＳＯ４４ＪＯＯ、
（１５ｇ 蒸留水　　　　　　　　９００ｍ文とする着誠菌前にＰ
Ｈを６．８に調節する。

この溶液を０．２２ｇｍ孔のメンプランによりろ過Ｍ菌
する。

溶〕Ｌヱ 組成： イーストエキス　　　　　　　　　　　１０ｇ（デイフ
コ、リファレンス０１２７−０５−３）蒸留水　　　　
　　　　１００ｍＪＬとする量滅菌前にｐＨを６．８に
調節する。

この溶液を熱処理（１２０℃、２０分）により滅菌する
。

溶液２を溶液ｌに添加することによりＤ培地が得られる
。

卵１１リソチームの 、組成： 蒸留水　　　　　　　　１００ｍ１とする墳この溶液を
０．２２ｘｍ孔のメンプランでろ過滅菌する。

プロトプラスト１ 組成： シュクロース　　　　　　　　　１７１ｇＭａｉｌ　　
　　　　　　　　　　　　　０．５８４　ｇＭｇＣＩ？
、１．０２　　ｇ １０００ｍｉにする量 この緩衝液は熱処理（１２０”０．２０分）により滅菌
する。

１襄立亙遣 蒸留水９３０ｍＪＬをレジレイト（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）
粉末１００ｇに添加することによりスキムミルクを再構
成する。これを熱処理（１１”Ｑ、２ｏ分）によりＭ菌
する。

３）「順 一般原則 株を、それぞれの作用懸濁物が得られるように培地中に
置く。

これら作用懸濁物は、プロトプラストの生産のだめの出
発材料となる。得られたプロトプラスト懸濁物は凍結し
、ついで凍結乾燥する。

ａ）Ｌ匹羞」 培養条件は第１表に示す通りである。

プロピオニバクテリウムを除き、各棟に対し、培地１０
ｍＪｌを一８０℃で凍結されたアンプルに含まれたバク
テリア懸濁物的５００ｕＪｌで接種する。接種後、この
前培養物を同じ培地に写す、得られた懸濁物をおだやか
な攪拌下にインキュベートする。

プロピオ二バタテリウム株も、凍結アンプルから出発し
て培養する。これは前培養しない、培地に攪拌すること
なく直接接種する。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）としてカウントした約１０
９個のバクテリアを含有する作用懸濁物（ＷＳ）を収積
する。この段階で、培養物は、対数増殖期の終点にある
。

ｂ）プロトプラストの” 一ヒ記ａ）で得た懸濁物（ＷＳ）を立を遠心（４８２５
ｇ、３０分）する。

に澄液（Ｓｌ）を捨てる。バクテリアケーキ（ｃｉ）を
生理食塩水３００ｍ見に入れる。得られた懸濁物（ＳＣ
Ｉ）を遠心（４８２５ｇ、３０分）する、上ｆｆ１（５
２）を捨てる。バクテリアケーキ（Ｃ２）を生理食塙水
３００ｍｕに入れる。得られた懸濁物（Ｓ　Ｃ２）を遠
心（４８２５ｇ、３０分）する、上澄（Ｓ３）を捨てる
。バクテリアケーキ（Ｃ３）を、プロトプラスト形成に
用いた緩衝液１３０ｍＭに入れる。得られた懸濁物（Ｓ
　Ｃ３）を撹拌によりホモジナイズする。

約１０”’　ＣＦ　Ｕを含有する懸濁物（ＳＣ３）１３
０　ｍ　、（ｌに、リゾチーム溶液２０ｍＭを加える。

得られた混合物をおだやかに撹拌しながら、４４℃で、
ミクロコツカス３２株については４時１ｉｆｔ　、他の
株についてはそれぞれ２時間インキュベートする。１４
られた懸濁物（Ｓｐｌ）は、プロトプラストと、そのま
まの細胞壁を有するバクテリアとを含有する。

プロトプラスト形成に至る操作の効率を、懸濁物（Ｓ　
ｐ　ｌ）中に含まれているプロトプラストを、０．５Ｍ
シュクロース溶液中に稀釈した後ＭＡＬＡＳＳＥＺ細胞
カウンタを用いてカウントし、　５ＯＳ（ドデシル４ｔ
Ｅ酸ナトリウム）の１％溶液に稀釈した後残存バクテリ
アをカウントすることにより調べた、さらに、懸濁物を
寒天培地上に画線した後残存バクテリアの数を評価した
。こうして、Ｓ、ラクチスのＷＳ懸濁物の場合には１０
０００中わずか１個のバクテリアが、ブレビバクテリウ
ムリネンのＷＳ懸濁物の場合には１０００中わずか１個
のバクテリアが、そしてミクロコツカスｓｐおよびプロ
ピオニバクテリウムのＷＳ懸濁物の場合には１００中わ
ずか１個のバクテリアが、上記第理に耐性を示すことが
観察された。

ｃ）４＝　　よび　し 上記ｂ）で得られた懸濁物（ＰＰＩ）を遠心（２８３０
ｇ、−３０・分、＋４℃）する、ｌ：澄（Ｓ４）を捨て
る。ケーキ（Ｃ４）を０．５Ｍスクロース溶液１５０ｏ
ｎ９．に入れる。得られた懸濁物（Ｓ　Ｃ４）を遠心（
２８３０ｇ、３０分、＋４℃）する、Ｊ：澄（Ｓ５）を
捨てる。ケーキ（Ｃ５）をスキムミルク１２ｍ、ｌｌに
入れる。

得られた！！ｊＩ！４物（ＳＣ５）を、２５　ｍ　ｌピ
ペットからの注意深い吸入および吸引によりホモジナイ
ズし、この懸濁物が５ｍｍの深さを持つようにペニシリ
ン型フラスコに分配する。適当なストッパを７ラスコに
取り付ける。このフラスコを凍結乾燥機の皿に赦せる。

皿を一８０℃に謂箇されたディープフリーズ（ｄｅｅｐ
　ｆｒｅｅｚｅ）中に置く、この温度で少なくとも１時
間放置した後１皿を凍結乾燥機に入れる。凍結乾燥機の
チャンバは予め一４５℃に冷却されている。

凍結乾燥は２４時間以内に完７Ｌ、その終了時に生成物
を２０℃に加温する。フラスコは、皿をＦげることによ
って昇華チャンバ中に閉じられている。

■、凍結乾燥組成物の性質 ■で調製された８個の組成物は、凍結乾燥前の組成物に
含まれていたのと同じ容量の生理食塩水を添加して再水
和した後の単位容量光りに多数のプロトプラストを含ん
でいることが分った。

このプロトプラストをＭＡＬＡＳＳＥＺ細胞カウンタで
計数したところ、下記の結果が得られた。ここに記録さ
れた収率は、凍結乾燥に対して抵抗性を有するプロトプ
ラストのパーセンテージを示す。

第　　２　　表 ■、凍結乾燥プロトプラストに基づいた、チーズ製造に
おける凍結乾燥組成物の利用 次の二つの試験を行なった。第一の試験は、ミックス外
皮（ｍ１ｘｅｄ　ｒｉｎｄ）を有する安定化されたソフ
トチーズの製造に関する。第二の試験は、浸蝕された外
皮（ｗａｓｈｅｄ　ｒｉｎｄ　）を有するソフトチーズ
の製造に関する。これらの試験は、安定化プロトプラス
トを調製した後、４８時間行なった。

製造プロセスは、標準的なやり方で行なった。

プロトプラストは、レンネットを添加する前に、製造桶
に収容された牛乳に添加した。

プロトプラストの作用を評価するために、物理的パラメ
ータの測定によ・って熟成度を決定した。

官能テスト（第二試験）も実施した。

（１）ミックス外皮を有する安定化 されたソフトチーズの製造 ａ）製造プロトコール ストレプトコッカス・ラクチスの菌株を用いた。１．２
．ｃ、で得られた凍結乾燥組成物から、生理食塩水中の
プロトプラスト懸濁液を二つ調製した。一つは１０１２
個のプロトプラストを含み、他の一つは１０１０個のプ
ロトプラストを含む。

試験は、レンネットが未だ添加されていない牛乳ｔｏｏ
　Ｉｌ中に添加されるプロトプラストの数において異な
る二つの系列で行なった。

・系列１　：　１０”個のプロトプラスト・系列２：１
Ｂ１２個のプロトプラストチーズの説明 ・スキンミルクチーズ二 ２５％脂肪／乾燥抽出物 ・形態：平均重量１．５ｋｇの円形 製造パラメータ ・レンネットの添加前に、ｐＨ６，４で熟成したミルク
。

・ＰＬＯＲＡ　ＤＡＮＩＣＡ　（商標名）バクテリアに
よる乳酸菌叢の接種。

・レンネットの添加 ・製造桶からの少量のラクトース除去。

・ｐＨが５．２０に達するまで自然に排水。

・１．２〜１６３％の塩濃度を与えるためのブライン塩
漬け。

熟成パラメータ ・微生物接種の性質 一生乳にミクロコツカス類及び赤酵素を接種ミクロコツ
カス類から成る微生物調合剤、赤酵素およびゲオトリク
ムカンジダ類の芽胞を表面に接種。

一熟成プロセス ーチーズを１３〜１４℃で１７日間保管−包装 一チーズを８℃で保管 プロトプラストが添加されていない対照製造系列を、系
列１および系列２と並行して行なった。

系列１および系列２のチーズ試料、並びに対照系列のチ
ーズ試料を採取した。

一ブラインから除去後４８時間。

一包装の直前。

一包装の８日後、２５日後。

ａ　＞　ａｐ１定の実施 試料から調製した水抽出物の氷点を測定し、蒸溜水の氷
点からの標準偏差（低下）を計算することによって、熟
成度の変化を３８日間モニターした。

ｌ）方法 使用した方法は、Ｍ、Ｃ０ＵＲＲＯＹＥが記述した方法
（Ｒｃｖｕｃ　Ｌａ１ｔｌｃｒｅ　Ｐｒａｎｃａｌｓｅ
、４Ｂ２．１９８７：５３〜５４）の変形である。

夫々の試料を下記のようにして処理する。

縦型コアで夫々のチーズ片の外縁と中心との間の中間を
サンプリングすることにより採取した３０〜４０ｇの＋
イ科を、食品加工タイプのミキサーによって粉砕する。

粉砕された材料を、４０−の超純水中に懸濁させる。こ
の懸濁液を、８０℃で２０分間インキュベートする。水
性抽出物を分離する。不溶性のペーストを、５−の超純
水で２回洗浄する。

最後に、水性抽出物および洗浄水を集め、超純水で容量
を５００−とする。

こうして４′Ｊ３製された抽出物の全量をＷＩＩＡＴＭ
ＡＮ（商標名）　Ｎｏ、４２濾紙で濾過する。濾液を回
収し、これを熟成度の決定に用いる。この熟成度の決定
は、濾液の氷点を測定し、次いで蒸溜水の氷点からの低
下を計算することによって間接的に行なう。

熟成度が高いほど、氷点の低下は大きくなる。

使用する装置は、自動氷点測定用の浸透圧計（商標名は
Ｒｏｅｂｌｌｎｇ）である。

この装置は濾液１００μｇの氷点を１５１３定し、その
結果を蒸溜水の氷点と比較することによって氷点降下を
決定する。得られた値を変換することにより、濾液の浸
透圧を直接表示する。

上記で得られた浸透圧値は、熟成度を℃で：ＩＰ１定し
た氷点低下で記載した既述のＭ、Ｃ０ＵＲＩ？ＯＹＥの
データの比較できるように、これを以下のデータ（第３
表）から作製される標準曲線と比較することによって変
換される。

第　　３　　表 ２）結果 第１図に示した曲線は、系列１について行なった測定を
示している。曲線Ｙｌは、製造試験に対応し、曲線ＴＹ
Ｉはプロトプラストを添加せずに同一条件で行なった対
照製造系列に対応する。統計学的な試験によって、同日
に行なった試験系列および対照系列の対についての二つ
の測定値の間に認められる差は顕著であることが立証さ
れた。

試験製造における熟成は、常に、対照製造における熟成
よりも更に進んだ段階にあることが認められる。

系列２においても、同じ結果が得られた。

この系列２について、熟成３８日口のａｌ定にを下記第
４表に示す。

第　　４　　表 この結果から、プロトプラストを導入することによって
熟成度の制御も可能で、より多数のプロトプラストを添
加することにより熟成をより促進できることが分る。

（１）浸蝕された外皮を有するソフトチーズの製造 ａ）製造プロトコール ４系列の実験を行なった。夫々の系列において、特定の
菌株から調製されたプロトプラストの懸濁液を、未だレ
ンネットが添加されていない製造牛乳ｉｏｏ　Ｏにに対
する接種に用いた。各系列において用いた菌株と、牛乳
１００ｇに添加したプロトプラストの数を第５表に示す
。

第　　５　　表 チーズの説明 ・浸蝕外皮を有するソフトチーズ； ４５％脂肪／乾燥抽出物 ・形！！３：平均重Ｑ５００ｇの円形 製造パラメータ ・１１”Ｃにおいて１４時間、ｐＨが６．６に達するま
で０．１％の酵素で予成熟させたミルク。

・２５℃において１時間３０分、０．１％の酵素と共に
桶中で成熟。

・ｐＨ６，４５でレンネットの添加 ・凝縮物の切断に続いてモールディング・モールド中で
２４時間排水。

・１時間のブライン処理 （塩濃度：チーズ中で１．８％） 熟成パラメータ ・チーズの外での作業 ・ブレビバクテリウム系の塩溶液で１週間に２回洗浄し
ながら、１３℃でチーズを熟成・試料を採取 一熟成３０日および熟成４５日 ａ）ａｌ定の実施 熟成３０日および４５０目に官能テストを行なった。

ｌ）方法 テストは４人のパネラ−により、次の項目について行な
った。

・視覚による熟成度の評価 ・味覚による熟成度の評価 ・チーズ外観の全体的な評価 これらテストの結果を第６表および第７表に示す。

第　　６　　表 第　　７　　表 上記結果を分析する前に、次のことに注意しなければな
らない。即ち、対照に用いたのと同じ従来の製造方法で
は、良好な芳香および味を生じるのに通常は２月または
２．５月の熟成を必要とする。

また、これらのチーズを熟成４５日に検査した時に、外
皮下の流動状態のような成る種の欠陥が、極めて頻繁か
つ現実に観察される。

ここに示された結果は、プロトプラストを添加しない場
合には４５日後でなければ得られない成熟状態のチーズ
を、プロトプラストの添加によって３０日以内に得るこ
とが可能となることを示している。ここに示された熟成
の促進は、その味覚値や外観の劣化を伴わない。他方、
驚くべきことに、これらの試験チーズの熟成は安定化さ
れており、熟成の３０日［１および４５日目の間には認
め得べき変化は観察されなかった。後者の結果は血著で
ある。

これは、升−ズ工場で３０［ｉ後にすぎないチーズが出
荷され得、また期間を延長することなく販売され得るこ
とを示している。本発明の安定化プロトプラスト組成物
を用いたこれらのチーズ製造試験によって、従って、チ
ーズ製造工業における後者の価値が確認される。

実施例２ 凍結乾燥したプロトプラスト系組成物の調製とプロトプ
ラストの溶菌率のａＦ＋定 １）株 以下の６株を使用した。

ミクロコツカス　ＳＰ。

ＣＮＲＺ　Ａ２Ｂ　　（中ｍ　菌） ストレプトコッカス　ラクテイス ＣＮＲＺ　３０４　　（中温菌） ストレプトコッカス　クレモリス ＣＮＩ？Ｚ　ＩＨ（中？Ｋ　ＩＷ　） ストレプトコッカス　ジアセチラクテイスＣＮ！？Ｚ　
１２４　　（中温菌） ストレプトコッカス　サーモフィラス ＣＮＲＺ　３０２　　（好温菌） ストレプトコッカス　サーモフィラス ＣＮＲＺ　３８５　　（ｋＦ　温（４）２）培地、溶液
と試薬 培地　　　　　　　：　実施例１のＡ培地リゾチーム溶
液　　：　実施例１で用いたちのプロトプラスト調整用
緩衝液：　ＰＭＮＳ緩衝液（組　　成） シュクロース　　　　　　　　１７１　ｇ＃！塩化ナト
リウム　　　　　　　０．５８４　ｇ／ｆｌ塩化マグネ
シウム　　　　　　１．０２ｇ／ｆＩＯ１ＩＭのフォス
フェート緩衝液（ｐＨ７）を下記組成物が１０１００Ｏ
となるように加える。

リン酸二水素ナトリウムＨ２０：　１５．８ｇ／ｊ！　
、及びリン酸水索二ナト！Ｊ　’７　ム１２　Ｈ２０：
　３５．８５　ｇ／ｆｌＰ　Ｍ　Ｎ　Ｓ　緩衝液は０．
２２Ｂ孔のメンブランフィルタ−で濾過滅菌する。

耐寒性培地 スキムミルク ＤＩＥＣＯ社製スキムミルクパウダー１　ｏｏＩＣに蒸
溜水１０００　ｍｌを加えてスキムミルクを再構成し、
１１５℃で２０分間の熱処理により滅菌する。

０．５Ｍシュクロース溶液 シュクロース（ＭＥＲＣＫ社製）１７１ｇを蒸溜水に溶
かし１ｇとする。

これを０．２２μｍ孔のメンブランフィルタ−により濾
過滅菌する。

０．５Ｍマルトース溶液 マルトース−水化物（ＰＲＯＬＡＢＯ社製）：１８０ｇ
を蒸溜水に溶かし１ｇとする。

これを０．２２１孔のメンブランフィルタ−により濾過
滅菌する。

０．５Ｍセロビオース溶液 Ｄ（＋）セロビオース（ＦＬＵＫＡ社製）：１７１ｇを
蒸溜水に溶かし１ｇとする。

これを０．２２ｔｎ＊孔のメンブランフィルタ−により
濾過滅菌する。

０．５Ｍメリビオース溶液 Ｄ（＋）メリビオース（１コ！、Ｕ　Ｋ　Ａ社製）：１
７１ｇを蒸溜水に溶かし１ｉ！とする。

これを０．２２Ｍ孔のメンブランフィルタ−にかける。

０．５Ｍラクトース溶液 ラクトース−水化物（ＰＩｉＯＬＡＢＯ社製）＝１８０
ｇを蒸溜水に溶かしＩＩＩとする。

これを０．２２ｔｓ孔のメンブランフィルタ−により濾
過滅菌する。

０．５Ｍトレハロース溶液 Ｄ（＋）　トレハロース（ＩＧＭＡ社製）：１ｇ９ｇを
蒸溜水に溶かし１ｇとする。

これを０．２２μ膳孔のメンブランフィルタ−により濾
過滅菌する。

マルトデキストリン溶液 Ｐｉ　Ｎｏ、８　（ＲＯＱＵＥＴＴＥ社製）：２００ｇ
を蒸溜水に溶かし１ｇとする。

この溶液は滅菌処理を施していない。

３）手順 ａ）株の培養 中温菌は３０℃で、高温菌は３７℃で成長させた。スト
レプトコッカスサーモフィラスＣＮＲＺ３８５１はＡ培
地を１５ｆｆｅＥｂ２０ｗｌ　（Ｄ培ａ？５で増殖させ
、それ以外の株は２１１のフラスコに５００ｍ１の培養
液を入れたもので培養（攪伴：９０９０−１２０ｒｐし
て増殖させた。これらの株は対数増殖期の終わりで増殖
を止めた。

ｂ）プロトプラスト調製 プロトプラストは実施例１と同様の方法で調製した。

プロトプラスト形成効率を前と同様にチエツクしたとこ
ろいつも９９．９％以上であった。

Ｃ）凍結および凍結乾燥 凍結乾燥するサンプルを直径９０ｍｍのペトリ皿に１０
ｍＩずつ入れ、−８０℃で少なくとも２時間凍結した。

ついで、凍結乾燥を凍結乾燥機中で４８時間行なったが
、最後の２時間は２０℃に加温した。これは嫂余の水分
を減少させるためである。

凍結乾燥試料は＋４℃のバイアル（ガラス瓶）内に栓を
して貯蔵したが、密閉されていない。

ｄ）ＬＤＨａ？Ｊ定によるプロトプラストの溶菌率の検
討 凍結乾燥前および凍結乾燥後経過時間別のプロトプラス
トの溶菌率は、細胞内酵素系のマーカー、すなわち、乳
酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）により測定できる。この
酵素は使用したすべてのバクテリアに存在している。

溶菌率Ｔは下記の式に従い、プロトプラスト懸濁液の上
清のＬＤＨ活性と懸濁液の全ＬＤＨ活性を測定して得ら
れる。ここで懸濁液とは、凍結乾燥されたプロトプラス
トの組成物の場合には蒸留水を加えて再構成する。また
全ＬＤＨ活性は、浸透圧膨張により完全に溶菌した後に
生じた活性である。

得られた主な結果を第８表と第９表に示す。

第８表は、ストレプトコツがス・サーモフィラスＣＮＲ
２３８５株の溶菌率が、使用した各種耐寒性培地では、
いずれも低い値となっていることを示している。

第９表から、ストレプト・ジアセチラクティスＣＮＲＺ
　１２４株の耐寒性培地としてスキムミルクが適してお
り、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＲＺ３０
２株の耐寒性培地として０゜５Ｍのマルトース溶液が適
していることがわかる。

実施例３　安定化プロトプラスト組成物調製の方去の簡
略化の検討 ストレプトコッカス・サーモフィラスＣＮＲ２３８５株
の約５００　ｕｆ！懸濁液を１００ｍ１）の培也Ａにｈ
ｉ菌して、６時間インキュベートし、この懸濁？Ｉｊｃ
１０ｒｒｌを５００ｒｒｌの培地Ａに移した。

二のバクテリアを緩かに攪伴しながら３７℃で６１間増
殖させた。６時間経過時には、光学密度の１はほぼ２に
なっていた。

そしてこの液を遠心分離操作し、ケーキを５０ＯｍｆＩ
のＰＫＭＳ緩衝液（実施例２で使用）に入れた。得られ
た懸濁液を再び遠心して得られたケーキをＰＫＭＳ緩衝
液５０ｍＪｌ！に加えた。このようにして懸濁液が得ら
れ、これをマグネティックスターラー付の４４℃の恒温
槽に移し変えた。温度平衡が達成された後、リゾチーム
溶液（実施例１および実施例２で使用）をバクテリア懸
濁液に濃度１ｇ／Ｎで加えた。１時間１５分に亘って、
プロトプラストの形成が行なわれた。プロトプラストの
形成効率は上記したように、約９９．５％であった。

このようにして調製したプロトプラストを含んだ培地サ
ンプルをガラスフラスコに移し変え、−８０℃で２時間
凍結させた。次にそのうちの一部を、４８時間凍結乾燥
した。このとき、この４８時間の最後２時間は、残って
いる水分を減少させるために２０℃に加温した。得られ
た凍結乾燥試料を＋４℃でガラスフラスコに保存した。

安定化プロトプラスト組成物調製の６異なる段階および
保存中の溶菌率は、実施例２と同様にＬＤＨをΔ−１定
することにより決定した。その主な結果を下記第１０表
に示す。

第１Ｏ表 プロトプラスト形成完結時に得られた培地の凍結及び／
又は凍結乾燥後のストレブトコ・ツカスサーモフィラス
ＣＮＲＺ　３８５プロトプラストの溶菌率第１０表に明
らかなように、ＣＮＲ２３８５株は低い溶菌率を示して
いる。したがって、プロトプラストの形成完結時にプロ
トプラストを囲包する０、５Ｍのシュクロース水溶液の
培地がこの株を良好に耐寒保護することが判明した。し
かし１、この培地の他の成分は、０．５Ｍのシュクロー
ス水溶液の耐寒効果（実施例２参照）を損わない。

このようにして凍結乾燥後得られた安定化プロトプラス
ト組成物は、吸湿性であり、粉末状にしにくいという欠
点を有している。これを防ぐには、プロトプラストの形
成完結後の懸濁液に、粒径７０μｍの水酸化シリカ（Ｔ
ｔｘｏｓ　ｉ　１３８Ａ。

Ｒｈ　ｏ　ｎ　ｅ　Ｐ　ｏ　ｕ　Ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｉｔ
製）を加えると良い。

上記のようにプロトプラストの形成の完結時において、
プロトプラストを囲む培地を耐寒保護体として使用する
ことにより、安定化プロトプラストの組成物の調製がか
なり簡単になる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプロトプラストを用いて製造したチー
ズからｊ％７られた抽出液の氷点降下を示す線図である
。 出願人代理人　弁理士　鈴江武彦

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）凍結もしくは凍結乾燥された状態にある、耐寒性
   培地中のバクテリアプロトプラスト懸濁物からなる安定
   化プロトプラスト組成物。
2. （２）耐寒性培地が糖を含む水溶液である請求項１記載
   の組成物。
3. （３）糖がオシドである請求項２記載の組成物。
4. （４）糖が多糖である請求項２記載の組成物。
5. （５）耐寒性培地がスキムミルクである請求項１記載の
   組成物。
6. （６）プロトプラストが、農食品産業において醗酵目的
   で使用されるバクテリア株由来である請求項１ないし５
   のいずれか１項記載の組成物。
7. （７）バクテリア株が乳酸バクテリアの株である請求項
   ６記載の組成物。
8. （８）ａ）バクテリアからプロトプラストを形成する工
   程、 ｂ）工程ａ）で得たプロトプラストの耐寒性培地中懸濁
   物を凍結する工程、 ｃ）場合に応じて、該凍結懸濁物を凍結乾燥する工程 を具備したことを特徴とする、請求項１ないし７のいず
   れか１項記載の組成物を製造する方法。
9. （９）工程ａ）を耐浸透圧性培地中でおこなうことを特
   徴とする請求項８記載の方法。
10. （１０）工程ｂ）の耐寒性培地が工程ａ）の耐浸透圧性
    培地を含むことを特徴とする請求項８または９記載の方
    法。
11. （１１）ａ）バクテリアプロトプラストを耐寒性培地中
    に導入する工程、 ｂ）得られた懸濁物を凍結する工程、 ｃ）該凍結懸濁物を、それを使用するまで貯蔵する工程 を具備したことを特徴とするバクテリアプロトプラスト
    の保存方法。
12. （１２）工程ｂ）の終了時に、凍結懸濁物を凍結乾燥す
    ることを特徴とする請求項１１記載の方法。