JPH01285196A - 発光蛋白エクオリンの製造法 - Google Patents
発光蛋白エクオリンの製造法Info
- Publication number
- JPH01285196A JPH01285196A JP63113979A JP11397988A JPH01285196A JP H01285196 A JPH01285196 A JP H01285196A JP 63113979 A JP63113979 A JP 63113979A JP 11397988 A JP11397988 A JP 11397988A JP H01285196 A JPH01285196 A JP H01285196A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aequorin
- gene
- plasmid
- cells
- mammalian cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［技術の分野］
本発明はクラゲ発光蛋白エクオリンの哺乳動物細胞系で
の製造法に関する。
の製造法に関する。
更に詳しくは、組換えＤＮＡ技術を用いて、クラゲ発光
蛋白エクオリンの生合成を特定する遺伝子を、哺乳動物
細胞系発現ベクターに組みこみ、そのＤＮＡを哺乳動物
細胞にトランスフェクションした細胞を用いる、発光蛋
白エクオリンの製造法に関する。
蛋白エクオリンの生合成を特定する遺伝子を、哺乳動物
細胞系発現ベクターに組みこみ、そのＤＮＡを哺乳動物
細胞にトランスフェクションした細胞を用いる、発光蛋
白エクオリンの製造法に関する。
［従来の技術とその問題点］
カルシニウム受容発光蛋白エクオリンは、米国ワシント
ン州シアトル近郊のフライデー・ハーバ−島近辺に７〜
９月に発生する発光オワンクラゲの傘周辺に存在し、刺
激を与えるこにより発光する。この発光クラゲｌＯ万匹
より約２００１１１ｇの精製エクオリンが得られている
。
ン州シアトル近郊のフライデー・ハーバ−島近辺に７〜
９月に発生する発光オワンクラゲの傘周辺に存在し、刺
激を与えるこにより発光する。この発光クラゲｌＯ万匹
より約２００１１１ｇの精製エクオリンが得られている
。
エクオリンはカルシュラムイオンと特異的に結合し、発
光する性質から、微弱発光利用によるカルシェウムイオ
ンの定量に利用されている。特に動物細胞中のカルシュ
ラムイオンの測定に広く使用されている。
光する性質から、微弱発光利用によるカルシェウムイオ
ンの定量に利用されている。特に動物細胞中のカルシュ
ラムイオンの測定に広く使用されている。
しかし、前述の如く、天然発光クラブより得られるエク
オリンの量は少なく、市場の需要を満たすことはできな
い、そこで我々は、組換えＤＮＡの手法を用いて、発光
クラブより、エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０を単離した
（特願昭５９−１７６．１２５号）。
オリンの量は少なく、市場の需要を満たすことはできな
い、そこで我々は、組換えＤＮＡの手法を用いて、発光
クラブより、エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０を単離した
（特願昭５９−１７６．１２５号）。
さらに、このエクオリン遺伝子を用いて、原核細胞であ
る大腸閑に於いてアポエクオリンの生産系を確立（特願
昭６１−２４９，０９８号）し、その精製系も確立した
（特願昭８２−２９１，６４０号）。
る大腸閑に於いてアポエクオリンの生産系を確立（特願
昭６１−２４９，０９８号）し、その精製系も確立した
（特願昭８２−２９１，６４０号）。
このことにより、エクオリン供給の道が開け、波及効果
も期待できる。
も期待できる。
たとえば十分な精製エクオリンを用いることにより、そ
の発光機構や原理の解明が可能となり、他の分野の研究
協力により応用研究への可能性も広がることが示唆され
る。
の発光機構や原理の解明が可能となり、他の分野の研究
協力により応用研究への可能性も広がることが示唆され
る。
現在までの基礎的研究から、以下のようなエクオリンの
性質が明らかとなっている。
性質が明らかとなっている。
一般に哺乳動物細胞の発生や分化の過程は、主として遺
伝子の転写レベルで制御されていると推定され、発現制
御シグナルは、クローン化した遺伝子を用い、細胞に再
導入して、遺伝子の発現あるいは、転写に及ぼす影響を
調べるこにより、解析されている。
伝子の転写レベルで制御されていると推定され、発現制
御シグナルは、クローン化した遺伝子を用い、細胞に再
導入して、遺伝子の発現あるいは、転写に及ぼす影響を
調べるこにより、解析されている。
現在までに、哺乳動物細胞系において、種々の発現ベク
ターが開発され、発現遺伝子マーカーとして、 ＣＡ
Ｔ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）がよく用いられている。
ターが開発され、発現遺伝子マーカーとして、 ＣＡ
Ｔ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）がよく用いられている。
しかし、このＣＡＴ活性測定には、ラジオアイソトープ
を含む＋４（−クロラムフェニコールを基質として、生
成する１４Ｃ−アセチルクロラムフェニコールをＴＬＣ
により分離し、その活性を求める。
を含む＋４（−クロラムフェニコールを基質として、生
成する１４Ｃ−アセチルクロラムフェニコールをＴＬＣ
により分離し、その活性を求める。
ＣＡＴ法は、ラジオアイソトープの使用が必須であり、
現在ＣＡＴ遺伝子におきかわるもつと使用上安全性の高
く、非アイソトープ系で、高感度検出能を有する発現遺
伝子マーカーが求められている。
現在ＣＡＴ遺伝子におきかわるもつと使用上安全性の高
く、非アイソトープ系で、高感度検出能を有する発現遺
伝子マーカーが求められている。
そこで、本発明者等は哺乳動物細胞系に於いて、この発
現遺伝子マーカーとしてカルシュラム受容発光蛋白エク
オリンの遺伝子を用いることにより、非ラジオアイソト
ープ系で、微弱発光活性を測定することにより高感度検
出が可能となることを見出した。
現遺伝子マーカーとしてカルシュラム受容発光蛋白エク
オリンの遺伝子を用いることにより、非ラジオアイソト
ープ系で、微弱発光活性を測定することにより高感度検
出が可能となることを見出した。
［問題点を解決するための手段］
本発明は、発光クラブよりエクオリンの生合成を特定す
る遺伝子＋１ＡＱ４４０を、哺乳動物細胞発現系ベクタ
ーに組みこみ、動物細胞へトランスフェクションするこ
とにより導入を行い、アポエクオリンを生産させ、エク
オリンへの再生する方法（エクオリンの製造法）である
。
る遺伝子＋１ＡＱ４４０を、哺乳動物細胞発現系ベクタ
ーに組みこみ、動物細胞へトランスフェクションするこ
とにより導入を行い、アポエクオリンを生産させ、エク
オリンへの再生する方法（エクオリンの製造法）である
。
たとえば、使用する哺乳動物細胞系として、ＣＯＳ細胞
株−５Ｖ４０系の使用が可能である。 ＣＯＳ細胞株
での遺伝子の発現に於いて、サル腎細胞でベクタープラ
スミドＤＮＡが自律増殖するには、ベクタープラスミド
ＤＮＡにＳＶ４０゜ｒ＋（複製起点）が存在し、細胞中
にＳＶ４０１ａｒｇｅＴ（ＩＴＪ抗原が存在することが
必要である。
株−５Ｖ４０系の使用が可能である。 ＣＯＳ細胞株
での遺伝子の発現に於いて、サル腎細胞でベクタープラ
スミドＤＮＡが自律増殖するには、ベクタープラスミド
ＤＮＡにＳＶ４０゜ｒ＋（複製起点）が存在し、細胞中
にＳＶ４０１ａｒｇｅＴ（ＩＴＪ抗原が存在することが
必要である。
ｃｏｓ（ｃｖ−ｔ、ｏｒｌ、５ｖ４ｏ１細胞株（Ｇｌｕ
ｚｍａｎ、Ｙ、Ｃｅ１ｌ ２３１７５ （１９８５）は
５Ｖ４０ｏｒ＋欠損変異株によりトランスフオームされ
たサル腎ＣＶ−１細胞で、ＩＴ抗原が生産されているた
めＳＶ４０初期変異株の増殖が可能である。
ｚｍａｎ、Ｙ、Ｃｅ１ｌ ２３１７５ （１９８５）は
５Ｖ４０ｏｒ＋欠損変異株によりトランスフオームされ
たサル腎ＣＶ−１細胞で、ＩＴ抗原が生産されているた
めＳＶ４０初期変異株の増殖が可能である。
そこで、現在よく使用されている発現ベクタープラスミ
ドｐＳＶ２−ｇｐｔのｇｐｔ遺伝子（キサンチンーグア
ニンフオスフオリボシルトランスフエラーゼの遺伝子）
の部分を、エクオリン遺伝子と交換したｐＳｖ−＾Ｑプ
ラスミド及び、レトロウィルスの発現プロモータ一部分
を含むＬＴＲ（両末端反復配列）を組みこんだｐＲ５Ｖ
−＾ｑを構築した。
ドｐＳＶ２−ｇｐｔのｇｐｔ遺伝子（キサンチンーグア
ニンフオスフオリボシルトランスフエラーゼの遺伝子）
の部分を、エクオリン遺伝子と交換したｐＳｖ−＾Ｑプ
ラスミド及び、レトロウィルスの発現プロモータ一部分
を含むＬＴＲ（両末端反復配列）を組みこんだｐＲ５Ｖ
−＾ｑを構築した。
以下本発明を実施例によって詳細に述べる。
実施例
■［動物細胞でのアポエクオリン発現ベクターの構築］
動物細胞内でのアポエクオリン発現ベクターｐｓＶ２−
ＡＱ、 ｐｓＶｌ−ＡＱ及びｐＲ５Ｖ−ＡＱ （Ｄ構築
を第１図に示した。
ＡＱ、 ｐｓＶｌ−ＡＱ及びｐＲ５Ｖ−ＡＱ （Ｄ構築
を第１図に示した。
動物細胞に於ける発現ベクタープラスミドルＳシーｇｐ
ｔ Ｍｕｌｌｌｇａｎ Ｒ，（：ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、＾ｃｏｄ、ｓｃｌ ＵＳ＾Ｑ ２０７２（１９８
１）ｓｍａｌｌ Ｔ抗原ｍＲＮＡの５°、３°フプライ
ス部分及び、初期ｍＲＮＡ用、ｐｏｌｙ（＾）付加シグ
ナルを含む部分をＥｃｏＲＩ ／ ＥｃｏＲＶ消化後分
消化上分離取 得のフラグメントをクローニングベクターｐｔｌｃ１９
Ｙａｎｉｓｃｈ、Ｃ，ら、Ｇｅｎｅ、３３１１０（１
９８５）のＴ４ポリメラーゼ処理した鏡！部位とＥｃｏ
Ｒ７部分にサブクローニングを行い、プラスミドｐＮｏ
−１４を構築する。
ｔ Ｍｕｌｌｌｇａｎ Ｒ，（：ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、＾ｃｏｄ、ｓｃｌ ＵＳ＾Ｑ ２０７２（１９８
１）ｓｍａｌｌ Ｔ抗原ｍＲＮＡの５°、３°フプライ
ス部分及び、初期ｍＲＮＡ用、ｐｏｌｙ（＾）付加シグ
ナルを含む部分をＥｃｏＲＩ ／ ＥｃｏＲＶ消化後分
消化上分離取 得のフラグメントをクローニングベクターｐｔｌｃ１９
Ｙａｎｉｓｃｈ、Ｃ，ら、Ｇｅｎｅ、３３１１０（１
９８５）のＴ４ポリメラーゼ処理した鏡！部位とＥｃｏ
Ｒ７部分にサブクローニングを行い、プラスミドｐＮｏ
−１４を構築する。
ｐＮＯ−１４の脱リン酸化（ＲＡＰ処理） ＳｍａＩ
部位にＫｌｅｎｏ胃フラグメント及びＴ４ボリメレース
処理したエクオリンｃＤＮ＾を有するｐＡＱ４４０の里
！、堕Ｒ１フラグメントを挿入しｐｓＶｏ−八〇を作成
する。このｐｓＶＯ−＾ｑのエクオリン遺伝子の上流部
分に、各種のプロモーター、エンハンサ−１ｏｒ１等を
挿入スることにより、動物細胞でアポエクオリン発現可
能なベクターを容易に構築できる。
部位にＫｌｅｎｏ胃フラグメント及びＴ４ボリメレース
処理したエクオリンｃＤＮ＾を有するｐＡＱ４４０の里
！、堕Ｒ１フラグメントを挿入しｐｓＶｏ−八〇を作成
する。このｐｓＶＯ−＾ｑのエクオリン遺伝子の上流部
分に、各種のプロモーター、エンハンサ−１ｏｒ１等を
挿入スることにより、動物細胞でアポエクオリン発現可
能なベクターを容易に構築できる。
たとえば、ｐｓＶ２−ｇＰｔより５Ｖ４Ｇのｏｒｉ部分
（プロモーター及びエンハンサ−を含む）を ｐｖｕｌ
ｌ。
（プロモーター及びエンハンサ−を含む）を ｐｖｕｌ
ｌ。
皿！■消化により取得し、ｐｓＶｏ−ＡＱのＸｂａ １
部分に挿入することにより ＣＯＳ細胞でアポエクオリ
ン発現可能なｐＳＶ２−ＡＱを構築した。
部分に挿入することにより ＣＯＳ細胞でアポエクオリ
ン発現可能なｐＳＶ２−ＡＱを構築した。
このｐＳＶ２−＾ｑより Ｓｐｈ ｒ消化、結合により
生じるｐｓＶｌ−ＡＱは、各種エンハンサ−活性をエク
オリン活性を用いて測定することが、可能である。
生じるｐｓＶｌ−ＡＱは、各種エンハンサ−活性をエク
オリン活性を用いて測定することが、可能である。
一方、レトロウィルスのＬＴＲ（Ｌｏｎｇ ｔｅｒＩＩ
ｌｉｎａｌｒｅｐｅａｔ、末端反復配列）には、動物細
胞中で調節可能プロモーターが含まれている。たとえば
、Ｒ５Ｖ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）Ｙ
ａ＋ｌａｍｏｔｏ、ＴらＰｒｏ。
ｌｉｎａｌｒｅｐｅａｔ、末端反復配列）には、動物細
胞中で調節可能プロモーターが含まれている。たとえば
、Ｒ５Ｖ（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）Ｙ
ａ＋ｌａｍｏｔｏ、ＴらＰｒｏ。
Ｎａ１ｔ Ａｃｏｄ Ｓｏ ＵＳ＾（１９８１）のＬＴ
Ｒを含むフラグメントをｐｓＶ２−ＡＱ （７） Ｘｂ
ａ１部位に挿入したｐＲ５Ｖ−ＡＱを構築した。
Ｒを含むフラグメントをｐｓＶ２−ＡＱ （７） Ｘｂ
ａ１部位に挿入したｐＲ５Ｖ−ＡＱを構築した。
■［動物細胞への発現プラスミドのトランスフェクショ
ン法］ （１）用いた動物細胞はサル腎由来ＣＯＳ細胞である。
ン法］ （１）用いた動物細胞はサル腎由来ＣＯＳ細胞である。
（２）動物細胞培養のための培地組成
培地５００ｍＪ２当り組成は以下のとおりである。
ダルベツコ変法イーグル培地■
（日本製薬株式会社） ４．７５ｇＦ
ｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ （牛脂仔血清）
５０ｏＪＩＬ−グルタミン酸
０．２９２ｇメイロン（８，４９６炭酸水素ナトリ
ウム） ９ｍｊ２ペニシリンＧ
４５単位（３）トランスフェクションの方法 ＣＯＳ細胞の上記の培地で５％Ｃｏ、、３７℃Ｃ０２イ
ンキユベーター中で培養する。対数増殖期にあるｃｏｓ
Ｍ５胞をトランスフェクション２４時間前に １００ｍ
ｍ Ｆａｌｃｏｎ ＋ＨｓｈにｌＸｌ０’細胞／１０ｍ
Ｌとなるように植継ぐ、さらにトランスフェクション４
時間前に新鮮な培地を交換する。
ｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ （牛脂仔血清）
５０ｏＪＩＬ−グルタミン酸
０．２９２ｇメイロン（８，４９６炭酸水素ナトリ
ウム） ９ｍｊ２ペニシリンＧ
４５単位（３）トランスフェクションの方法 ＣＯＳ細胞の上記の培地で５％Ｃｏ、、３７℃Ｃ０２イ
ンキユベーター中で培養する。対数増殖期にあるｃｏｓ
Ｍ５胞をトランスフェクション２４時間前に １００ｍ
ｍ Ｆａｌｃｏｎ ＋ＨｓｈにｌＸｌ０’細胞／１０ｍ
Ｌとなるように植継ぐ、さらにトランスフェクション４
時間前に新鮮な培地を交換する。
１５ｇｇのエクオリン発現ベクターＤＮＡをリン酸カル
シュウム法（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ、＆ Ａ、Ｊ、ｖａ
ｎｄｅｒ Ｅｂ。
シュウム法（Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ、＆ Ａ、Ｊ、ｖａ
ｎｄｅｒ Ｅｂ。
■匹江ｕＪｊ、 ４５８ （１９７３） ） ニより
ｃｏｓ細胞ニトランスフェクションする。
ｃｏｓ細胞ニトランスフェクションする。
以下の組成である。
ＤＮＡ１５μｆｌ／２１９μｆ （１ｍＭＴｒｌｓ−
ＨＣＩ（ｐ）１７．５）０．１ｍＭ ＥＤＴ＾・２Ｎａ
） ２Ｍ ＣａＣ１ａ ３１μｍ１ ２ ｘ ＨＢＳ ２５０μｆＬ （ＩＩＥＰＥｓ
１０ｇ／ １１ 、ＮａＣ１１６ｇ／ Ｉｌ及び７０
ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４，７０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含む 〜５００μｍ トランスフェクション後１２時間前記のように培養を行
い、新鮮な培地に交換し、さらに３６時間同条件で培養
する。
ＨＣＩ（ｐ）１７．５）０．１ｍＭ ＥＤＴ＾・２Ｎａ
） ２Ｍ ＣａＣ１ａ ３１μｍ１ ２ ｘ ＨＢＳ ２５０μｆＬ （ＩＩＥＰＥｓ
１０ｇ／ １１ 、ＮａＣ１１６ｇ／ Ｉｌ及び７０
ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４，７０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含む 〜５００μｍ トランスフェクション後１２時間前記のように培養を行
い、新鮮な培地に交換し、さらに３６時間同条件で培養
する。
■［産生アポエクオリンの抽出方法］
トランスフエフ９５２４８時間後シャーレの培地を除去
し、細胞をＰＢＳ ＮａＣｌ ａ、ｏｇ、 ＫＣＩ ０
．２ｇ、 Ｎａ２ＨＰＯａ １．１５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ
４０，２ｇを水１ｆＬに溶解したもの（（：ａ２° Ｍ
ｇ ２ ＊不含！Ｊ ンａｌＥ衝液） テ３ 回洗浄
ｔる、さらに、 ＰｂＳを少量加えシャーレ上の細胞を
ポリスマンでかきとり、エッペンドルフチューブに集め
る。卓上遠心機で５０００ｒｐ１１．１分間遠心し、上
溝を除去する。集めた細胞沈殿物を２００μＬの３０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）１（ｌＩｌｌＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａに懸濁する。ドライアイス−メタノー
ルで凍結、３７℃で融解を３度くり返すことにより細胞
を破壊する。
し、細胞をＰＢＳ ＮａＣｌ ａ、ｏｇ、 ＫＣＩ ０
．２ｇ、 Ｎａ２ＨＰＯａ １．１５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ
４０，２ｇを水１ｆＬに溶解したもの（（：ａ２° Ｍ
ｇ ２ ＊不含！Ｊ ンａｌＥ衝液） テ３ 回洗浄
ｔる、さらに、 ＰｂＳを少量加えシャーレ上の細胞を
ポリスマンでかきとり、エッペンドルフチューブに集め
る。卓上遠心機で５０００ｒｐ１１．１分間遠心し、上
溝を除去する。集めた細胞沈殿物を２００μＬの３０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）１（ｌＩｌｌＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａに懸濁する。ドライアイス−メタノー
ルで凍結、３７℃で融解を３度くり返すことにより細胞
を破壊する。
細胞破壊の有無を、トリバンブルーで染色し確認した後
、１４，０００ｒｐ■、１０分間４℃で遠心分離後、そ
の上清を産生アポエクオリンの抽出液として用いた。
、１４，０００ｒｐ■、１０分間４℃で遠心分離後、そ
の上清を産生アポエクオリンの抽出液として用いた。
■［アポエクオリンのエクオリンへの変換及びエクオリ
ン活性の測定法］ 産生アポエクオリン抽出液に２−メルカプトエタノール
６μβ、セレンテラジン３μ２（１μｇ／μｍ溶を夜）
を加え、３０＋ａＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐ）１７．
６） 、ＩＱｍｌＡＥＤＴ＾・２Ｎａ液で全量を３００
μｍにする。このものを氷上（４℃）に１２時間放置す
ることによりエクオリンへと変換・再生する。
ン活性の測定法］ 産生アポエクオリン抽出液に２−メルカプトエタノール
６μβ、セレンテラジン３μ２（１μｇ／μｍ溶を夜）
を加え、３０＋ａＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐ）１７．
６） 、ＩＱｍｌＡＥＤＴ＾・２Ｎａ液で全量を３００
μｍにする。このものを氷上（４℃）に１２時間放置す
ることによりエクオリンへと変換・再生する。
再生したエクオリン反応液を６０μｌ測定用チユーブに
入れ、ルミフォトメーターＴＯ−４０００（ラボサイエ
ンス社製）の測光室に移し、６θＯμｍの３０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２／３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）
を（主人し、初期最大発光強度を測定する。
入れ、ルミフォトメーターＴＯ−４０００（ラボサイエ
ンス社製）の測光室に移し、６θＯμｍの３０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２／３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）
を（主人し、初期最大発光強度を測定する。
その結果を示したのが表１である。
（表 １）
９ＳＶｌ−＾ｑ５
ｐｓＶ２−ＡＱ ５２ 。
以上の結果から、エクオリン遺伝子は哺乳動物細胞系で
発現可能であり、エクオリン遺伝子が動物細胞内での遺
伝子マーカーとなることが明らかとなり、さらには動物
細胞内で生産することが明らかとなった。
発現可能であり、エクオリン遺伝子が動物細胞内での遺
伝子マーカーとなることが明らかとなり、さらには動物
細胞内で生産することが明らかとなった。
第１図は、本発明の詳細な説明図である。
以 上
Claims (1)
- （１）クラゲ発光蛋白エクオリンの生合成を特定する遺
伝子（ｐＡＱ４４０）を、哺乳動物細胞系発現ベクター
プラスミドにクローニングして得られたプラスミドを哺
乳動物細胞にトランスフェクションし、該トランスフェ
クション後の哺乳動物細胞で産生することを特徴とする
発光蛋白エクオリンの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63113979A JPH01285196A (ja) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | 発光蛋白エクオリンの製造法 |
| EP89107335A EP0341477A1 (en) | 1988-05-11 | 1989-04-24 | A process for producing a photoprotein aequorin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63113979A JPH01285196A (ja) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | 発光蛋白エクオリンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01285196A true JPH01285196A (ja) | 1989-11-16 |
Family
ID=14626010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63113979A Pending JPH01285196A (ja) | 1988-05-11 | 1988-05-11 | 発光蛋白エクオリンの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0341477A1 (ja) |
| JP (1) | JPH01285196A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714666A (en) * | 1993-02-09 | 1998-02-03 | Children's Hospital Of Philadelphia | Measurement of intracellular calcium using bioluminescent apoaequorin expressed in mammalian cells |
| CA2336929C (en) | 1998-07-06 | 2005-10-04 | Euroscreen S.A. | High-throughput screening diagnostic and/or dosage method of an agonist and/or an antagonist for a calcium-coupled receptor |
| SE0101519D0 (sv) * | 2001-04-27 | 2001-04-27 | Astrazeneca Ab | Nucleic ACID |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| CA1277931C (en) * | 1984-06-05 | 1990-12-18 | Shimon Ulitzur | Detection and/or identification of microorganisms in a test sample usingbioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker |
| NZ214563A (en) * | 1984-12-31 | 1991-05-28 | Univ Georgia | Production of apoaeqorin using recombinant dna |
| US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
| JPS62171695A (ja) * | 1985-12-14 | 1987-07-28 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 |
-
1988
- 1988-05-11 JP JP63113979A patent/JPH01285196A/ja active Pending
-
1989
- 1989-04-24 EP EP89107335A patent/EP0341477A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0341477A1 (en) | 1989-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Orlandini et al. | Identification of a c-fos-induced gene that is related to the platelet-derived growth factor/vascular endothelial growth factor family. | |
| Minchenko et al. | Regulation of endothelin-1 gene expression in human microvascular endothelial cells by hypoxia and cobalt: role of hypoxia responsive element | |
| Skalnik et al. | CCAAT displacement protein as a repressor of the myelomonocytic-specific gp91-phox gene promoter. | |
| Wu et al. | Conditional ectopic expression of C/EBP beta in NIH-3T3 cells induces PPAR gamma and stimulates adipogenesis. | |
| Lindberg et al. | Splicing inhibition at the level of spliceosome assembly in the presence of herpes simplex virus protein ICP27 | |
| Lauksund et al. | Atlantic salmon IPS-1 mediates induction of IFNa1 and activation of NF-κB and localizes to mitochondria | |
| KR20130084312A (ko) | 오플로포러스-유래된 루시퍼라아제, 신규 코엘렌테라진 기질, 및 사용 방법 | |
| CN101812127B (zh) | 微管结合蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN111875709A (zh) | 一种融合蛋白及其在构建筛选冠状病毒3cl蛋白酶抑制剂的系统中的应用 | |
| Ishimaru et al. | Analysis of the human CD10/neutral endopeptidase 24.11 promoter region: two separate regulatory elements | |
| CN104232588A (zh) | 一种抗肝纤维化药物高通量筛选细胞模型的构建及应用 | |
| US20170204157A1 (en) | Human fgfr2c extracellular protein as well as coding gene and application thereof | |
| CN104130977B (zh) | 一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用 | |
| St-Arnaud et al. | Wnt-1-inducing factor-1: a novel G/C box-binding transcription factor regulating the expression of Wnt-1 during neuroectodermal differentiation | |
| JPH01285196A (ja) | 発光蛋白エクオリンの製造法 | |
| Harrison et al. | Mechanism of regulation of HGF/SF gene expression in fibroblasts by TGF-β1 | |
| CN104592396A (zh) | 基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针 | |
| Serria et al. | Regulation and differential expression of the c-maf gene in differentiating cultured cells | |
| CN114957439B (zh) | 绵羊pdgfd、编码pdgfd核酸及其重组慢病毒、宿主细胞与应用 | |
| CN117645975A (zh) | 一种用于高通量筛选trpv1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用 | |
| JPH04144684A (ja) | エンドセリン受容体 | |
| CN107936107A (zh) | 长牡蛎干扰素调节因子CgIRF‑1基因重组蛋白、制备方法及应用 | |
| CN106620651A (zh) | 热休克蛋白gp96在治疗溃疡性结肠炎中的应用 | |
| CN106947738B (zh) | microRNA-4281的新用途 | |
| Abraham et al. | A novel glutamine-rich putative transcriptional adaptor protein (TIG-1), preferentially expressed in placental and bone-marrow tissues |