JPH01296985A - 接着性動物細胞の培養方法 - Google Patents
接着性動物細胞の培養方法Info
- Publication number
- JPH01296985A JPH01296985A JP63125663A JP12566388A JPH01296985A JP H01296985 A JPH01296985 A JP H01296985A JP 63125663 A JP63125663 A JP 63125663A JP 12566388 A JP12566388 A JP 12566388A JP H01296985 A JPH01296985 A JP H01296985A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（ａ）産業上の利用分野
本発明は接着性動物細胞の培養方法に関するものである
。更に詳しくは有用物質を産生ずる接着性動物細胞を、
固体表面に接着させて培養する際に細胞の脱落を抑制す
る方法に関するものである。
。更に詳しくは有用物質を産生ずる接着性動物細胞を、
固体表面に接着させて培養する際に細胞の脱落を抑制す
る方法に関するものである。
（ｂ）従来−技術
工業的規模による細胞大量培養は、例えばウィルス、ワ
クチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、或いは
ホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。これらの
１好性物質の生産に用いられる動物細胞は接着性のもの
が多く、その効率的培養技術の開発は工業的に重要な課
題である。
クチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、或いは
ホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。これらの
１好性物質の生産に用いられる動物細胞は接着性のもの
が多く、その効率的培養技術の開発は工業的に重要な課
題である。
従来、接着制細胞の大量培養方法及びそのための装首と
していくつかの提案がなされているが、その多くは固体
表面に細胞を接着させて増殖せしめるものである。細胞
の固体表面への接着はフィブロネクチンなどの接着因子
を介して行なわれ、カルシウムイオンやマグネシウムイ
オンの存在が必須であることが知られている。しかし、
細胞と培養器面の接着のみならず、細胞と細胞の間の接
着もカルシウムイオン依存性であるため、培養系中にカ
ルシウムイオンが過度に存在すると細胞と細胞の間の接
着力が細胞と培養器面の接着力を上回り、細胞同志が凝
集塊を形成し、培養器面から剥離、脱落してしまう。
していくつかの提案がなされているが、その多くは固体
表面に細胞を接着させて増殖せしめるものである。細胞
の固体表面への接着はフィブロネクチンなどの接着因子
を介して行なわれ、カルシウムイオンやマグネシウムイ
オンの存在が必須であることが知られている。しかし、
細胞と培養器面の接着のみならず、細胞と細胞の間の接
着もカルシウムイオン依存性であるため、培養系中にカ
ルシウムイオンが過度に存在すると細胞と細胞の間の接
着力が細胞と培養器面の接着力を上回り、細胞同志が凝
集塊を形成し、培養器面から剥離、脱落してしまう。
現在、一般に使用されている培地中のカルシウムイオン
濃度は０．３ｍ）Ｉ〜１．８ｍＮである。しかし、この
濃度では細胞同志の凝集力が強く、細胞か培養器面から
脱落して凝集塊を形成する傾向が強い。
濃度は０．３ｍ）Ｉ〜１．８ｍＮである。しかし、この
濃度では細胞同志の凝集力が強く、細胞か培養器面から
脱落して凝集塊を形成する傾向が強い。
特に培養が長期間にわたる場合、または培地が無血清培
地である場合にこの傾向が強い。
地である場合にこの傾向が強い。
（Ｃ）発明の目的
そこで、本発明者らは接着性動物細胞を長期間安定に固
体表面に接着した状態で培養することを目的として研究
を進めた結果、本発明に到達した。
体表面に接着した状態で培養することを目的として研究
を進めた結果、本発明に到達した。
（ｄ３発明の構成
すなわち本発明は、接着性動物細胞を、固体表面に接着
させた状態において培Ｍプるに当たって、培養系中のカ
ルシウムイオンｍ度を０．０１＋１１Ｈ以上０．３ｎ＋
Ｈ未満に維持することを特徴とする接着性動物細胞の培
養方法である。
させた状態において培Ｍプるに当たって、培養系中のカ
ルシウムイオンｍ度を０．０１＋１１Ｈ以上０．３ｎ＋
Ｈ未満に維持することを特徴とする接着性動物細胞の培
養方法である。
以下、本発明について詳細に説明Ｊる。
本発明の細胞培養方法は固体表面に細胞を接着させて培
養する方法に適用される。接着させる固体の材質はガラ
スやプラスチックなど一般に細胞培養に用いられるもの
ならば特に限定されない。
養する方法に適用される。接着させる固体の材質はガラ
スやプラスチックなど一般に細胞培養に用いられるもの
ならば特に限定されない。
また、培養方式は微小担体（マイクロキャリヤー）やホ
ローファイバー上に担持する方法など、細胞が固体表面
に接着しているものならば特に限定されない。
ローファイバー上に担持する方法など、細胞が固体表面
に接着しているものならば特に限定されない。
本発明において用いられる接着性動物細胞は、通常の静
置培養において接着、伸展性を示すものであり、天然の
正常細胞のみならず、人為的あるいは遺伝子操作により
変性された細胞であってしよい。また、本発明は特に有
用な生理活性物質を産生ずる接着性動物細胞の培養にお
いて、生理活性物質を高い濃度で得る目的のために適し
ている５゜具体的にはヒト胎児腎細胞由来２９３株、Ｂ
ＨＫ。
置培養において接着、伸展性を示すものであり、天然の
正常細胞のみならず、人為的あるいは遺伝子操作により
変性された細胞であってしよい。また、本発明は特に有
用な生理活性物質を産生ずる接着性動物細胞の培養にお
いて、生理活性物質を高い濃度で得る目的のために適し
ている５゜具体的にはヒト胎児腎細胞由来２９３株、Ｂ
ＨＫ。
ＣＨＯまたはそれらに遺伝子を導入したトランスノ４−
マント等が挙げられ、ヒト胎児腎細胞由来２９３株また
はそれらに遺伝子を導入したｌ−・ランスフィーマント
であることが好ましい。
マント等が挙げられ、ヒト胎児腎細胞由来２９３株また
はそれらに遺伝子を導入したｌ−・ランスフィーマント
であることが好ましい。
Ｊした、本発明の培養方法は回分培養でおっても潅流培
養であってもよいが、潅流培養であることか好ましい。
養であってもよいが、潅流培養であることか好ましい。
潅流培養するに当たって重要なことの１つは、培養液中
の生細胞と前記古い培養液とを効率よく分離し、古い培
養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の生育環境
を最適条件下に維持することである。また、ここで培養
液中から分離され、培養槽外へ取り出された古い培養液
は、膜による分離法、或いは吸着による分離法などにＪ
、す、ぞの中に含まれる生育阻害物質を除去し、更に必
要による産生された有用物質を分画された後、培養に必
要な添加成分を新たに加えることにより、新しい培養液
として再使用Ｊることかできる。
の生細胞と前記古い培養液とを効率よく分離し、古い培
養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の生育環境
を最適条件下に維持することである。また、ここで培養
液中から分離され、培養槽外へ取り出された古い培養液
は、膜による分離法、或いは吸着による分離法などにＪ
、す、ぞの中に含まれる生育阻害物質を除去し、更に必
要による産生された有用物質を分画された後、培養に必
要な添加成分を新たに加えることにより、新しい培養液
として再使用Ｊることかできる。
本発明で用いられる培養液は実質的に水によりなる水性
媒体に、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ糖
、アミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される
添加成分か加えられている。
媒体に、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ糖
、アミノ酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される
添加成分か加えられている。
また培養液には血清を加えることもできるし、血清を用
いない所謂無血清培地を培養液どして使用することもで
きるが、本発明は特に無血清培地において優れた効果を
示す。いずれにしても培養液中のカルシウムイオン）農
度は一般に１よ０．ＯｔｍＨ以」已り１３ｎ＋Ｈ未満と
し、培養液中のカルシウムイオン濃度を］ントロールす
るために添加するカルシウム塩としては塩化カルシウム
、硝酸カルシウムのいずれか、或いは両者の混合物など
が挙げられる。
いない所謂無血清培地を培養液どして使用することもで
きるが、本発明は特に無血清培地において優れた効果を
示す。いずれにしても培養液中のカルシウムイオン）農
度は一般に１よ０．ＯｔｍＨ以」已り１３ｎ＋Ｈ未満と
し、培養液中のカルシウムイオン濃度を］ントロールす
るために添加するカルシウム塩としては塩化カルシウム
、硝酸カルシウムのいずれか、或いは両者の混合物など
が挙げられる。
本発明の培養系中のカルシウムイ、Ｊ′、／濶度は０．
０１ｍＭ以−１＝０．３ｍＭ未満、好ましくは０．０５
１１１）ｉ以上０．２５ｔＩＩＨ以下、特に好ましくは
０．１１１ＩＨ以上０．２＋ｎＨ以下である。培養系中
のカルシウム濃度を０．０１ｍＭ以十〇、 ３ｍＭ未満
とすることにより、固体表面に接着ざぜた細胞の剥離、
脱落を抑制し、細胞を長期的に安定に培養することが可
能となる。
０１ｍＭ以−１＝０．３ｍＭ未満、好ましくは０．０５
１１１）ｉ以上０．２５ｔＩＩＨ以下、特に好ましくは
０．１１１ＩＨ以上０．２＋ｎＨ以下である。培養系中
のカルシウム濃度を０．０１ｍＭ以十〇、 ３ｍＭ未満
とすることにより、固体表面に接着ざぜた細胞の剥離、
脱落を抑制し、細胞を長期的に安定に培養することが可
能となる。
本発明の培養方法において、培養系中の酸素濃度を−・
定に維持するために、酸素を供給する方法どしては、培
養液中へ酸素または酸素含有ガスを直接供給してもよい
。他の供給手段としては、例えば酸素キャリアーを用い
る方法がある。酸素キャリアーとしては、水と実質的に
混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合物が使用され
、その例としては、人工血液の素材として使用されるよ
うな種々のフルオロカーボンが挙げられる。かようなフ
ルオロカーボンを酸素供給手段として使用する場合には
、酸素を溶解させたフルオロカーボンを培養液中の上部
から液滴状または薄膜状で添加すればよい。また、酸素
透過性のデフロンやシリコンのチューブを培養槽内に取
付けることによる供給方法もめる。
定に維持するために、酸素を供給する方法どしては、培
養液中へ酸素または酸素含有ガスを直接供給してもよい
。他の供給手段としては、例えば酸素キャリアーを用い
る方法がある。酸素キャリアーとしては、水と実質的に
混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合物が使用され
、その例としては、人工血液の素材として使用されるよ
うな種々のフルオロカーボンが挙げられる。かようなフ
ルオロカーボンを酸素供給手段として使用する場合には
、酸素を溶解させたフルオロカーボンを培養液中の上部
から液滴状または薄膜状で添加すればよい。また、酸素
透過性のデフロンやシリコンのチューブを培養槽内に取
付けることによる供給方法もめる。
（ｅ）実施例
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例１〜５及び比較例１〜７
培地にはＲＰ）ＩＩｉ６４０培地、ハムＦ１２培地、及
びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合した
ものに、さらにブドウ糖、アミノ酸等を加えたもの（以
下ｅＲＤＦと称する）からカルシウム塩（塩化カルシウ
ム、硝酸カルシウム、パントテン酸カルシウム）を除い
た組成のものを基本培地として用い、増殖因子としてイ
ンスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セ
レン酸ナトリウムを加えた。添加濃度はそれぞれ９μｇ
／ｄ、 １０μ（１／ｄ、 １０μ）Ｉ 、 ２０μＨ
である。この培地にＡＴＣＣから入手したヒト胎児腎細
胞由来の２９３株を細胞密度５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ
／７！になるように懸濁し、更にカルシウム塩を種々の
濃度で添加して直径３５ｍｍのプラスチック細胞培養用
デイツシュに２ｄずつ分注し、５％ＣＯ２含有空気中３
７°Ｃで６日間培養した。培養４日目及び６日目の細胞
密度とデイツシュへの接着率を表に示す。
びダルベツコ変法イーグル培地を２：１：１で混合した
ものに、さらにブドウ糖、アミノ酸等を加えたもの（以
下ｅＲＤＦと称する）からカルシウム塩（塩化カルシウ
ム、硝酸カルシウム、パントテン酸カルシウム）を除い
た組成のものを基本培地として用い、増殖因子としてイ
ンスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セ
レン酸ナトリウムを加えた。添加濃度はそれぞれ９μｇ
／ｄ、 １０μ（１／ｄ、 １０μ）Ｉ 、 ２０μＨ
である。この培地にＡＴＣＣから入手したヒト胎児腎細
胞由来の２９３株を細胞密度５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ
／７！になるように懸濁し、更にカルシウム塩を種々の
濃度で添加して直径３５ｍｍのプラスチック細胞培養用
デイツシュに２ｄずつ分注し、５％ＣＯ２含有空気中３
７°Ｃで６日間培養した。培養４日目及び６日目の細胞
密度とデイツシュへの接着率を表に示す。
実施例６および比較例８
培地にヒト血漿フィブロネクチンを１０μｇ／ｄ添加し
た以外は実施例１〜・５および比較例１〜７と同様に行
なった。結果を表に示す。
た以外は実施例１〜・５および比較例１〜７と同様に行
なった。結果を表に示す。
（ｆ）発明の効果
本発明方法によれば、接着性動物細胞を固体表面に接着
させて増殖せしめる培養において、細胞の剥離、脱落を
抑制して長期間安定に接着した状態で培養することが可
能となる。
させて増殖せしめる培養において、細胞の剥離、脱落を
抑制して長期間安定に接着した状態で培養することが可
能となる。
Claims (4)
- （１）接着性動物細胞を、固体表面に接着させた状態に
おいて培養するに当たって、培養系中のカルシウムイオ
ン濃度を０．０１ｍＭ以上０．３ｍＭ未満に維持するこ
とを特徴とする接着性動物細胞の培養方法。 - （２）培養が潅流培養である請求項１記載の方法。
- （３）培地が無血清培地である請求項１記載の方法。
- （４）細胞がヒト胎児腎細胞由来２９３株またはそれに
遺伝子を導入したトランスフォーマントである請求項１
記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63125663A JPH0728731B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 接着性動物細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63125663A JPH0728731B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 接着性動物細胞の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01296985A true JPH01296985A (ja) | 1989-11-30 |
| JPH0728731B2 JPH0728731B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=14915578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63125663A Expired - Fee Related JPH0728731B2 (ja) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | 接着性動物細胞の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0728731B2 (ja) |
-
1988
- 1988-05-25 JP JP63125663A patent/JPH0728731B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY=1987 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0728731B2 (ja) | 1995-04-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |