JPH0129761B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ≪産業上の利用分野≫ 本発明は例えば、リンパ球、骨随細胞、更には
精子、受精卵等の生体細胞を凍結するための装置
に関する。

≪従来の技術≫ 生体細胞を長期保存の目的のために凍結するに
あたつて、その生存率を高くすることは最も重要
な事柄ポイントであり、その凍結細胞の生存率
は、細胞の冷却速度に大きく影響されるものであ
り、その関係は第４図に示す通りである。

図示の如く、生存率の向上に際し、有利な冷却
速度には２領域あつて、その１つは１℃〜数℃／
毎分の緩速冷却域Ａであり、他の１つは極めて急
速な10000℃／毎分以上といつた、超急速冷却域
Ｂである。

又、細胞液の塩濃縮、脱水、細胞内氷晶形成等
が、どの程度行なわれるかによつて適性冷却速
度、非適正冷却速度が定まるのであるが、特に毎
分10000℃以上の超急速冷却域Ｂにおいては、細
胞内水分が非晶質（所謂ガラスの様な状態）とし
て凍結するか、あるいは、氷晶ができても極めて
微細であるので、細胞が凍害を受けないとされて
いる。

ところが従来、生体細胞の凍結方法としては、
ストロー管等のチユーブ状収納管に細胞を凍害防
止剤を含む緩衝液と共に収納し、これを液化窒素
等の低温液化ガス、あるいは冷凍機を用いて冷却
し、凍結を行うことが実施されており、従つてそ
の冷却域は、前記緩速冷却域Ａである。

上述従来方法においては、凍結の直接の対象で
ある細胞が、これに比較して極めて大量の緩衝液
の中に浮遊した状態で存在するために、収納管の
周囲環境をいかに急速凍結の条件下においてやつ
ても、細胞を取り囲む緩衝液が細胞の冷却に対し
ては極めて大きな抵抗となるので、細胞の冷却速
度を前記超急速冷却域Ｂまで上げることはでき
ず、結局前記緩速冷却域Ａに依存するしかなかつ
た。

その結果、上述従来方法では次のような諸問題
が指摘される。

(イ) 緩速冷却域Ａにおいて、高い生存率とするこ
とができるが、これはあくまでも凍害防止剤を
添加した条件下での成績であるから、従来方法
によるときは、凍害防止剤の添加が不可欠とな
つてくるだけでなく、又上記条件下でも緩速冷
却域Ａにおいては、細胞の種類により、20％程
度の非実用的な低い生存率しか得られない。

(ロ) 上記凍害防止剤を添加する際、急激に所定の
濃度にすると、細胞への悪影響が非常に大きく
なるため、４〜５回に分けて段階的に濃度を上
げていかねばならず、この作業は甚だ面倒で時
間がかかり、それでもこのような労力をかけて
も、多少の悪影響から、のがれることはできな
い。

(ハ) さらに、生体細胞への悪影響を防ぐため、細
胞の解凍時には、凍害防止剤を洗浄、除去する
作業が必要となり、更に、細胞の流失によるロ
スが生じる。

(ニ) 毎分１℃から数℃という比較的狭い領域で冷
却しなければならないため、冷却速度の制御は
厳格に行う必要があり、プログラムコントロー
ラー等、高度な制御装置を必要とする上、凍結
時間が２〜３時間と長くなる。

(ホ) 凍害防止剤の添加等の前処理に時間を要する
上、凍結時間も長く、細胞の凍結までの時間が
総体的に長くかかるため、細胞の活性が低下し
易い。

≪発明が解決しようとする問題点≫ そこで本発明は、上記の諸問題点を解消するた
めに、生体細胞を毎分10000℃以上の超急速冷却
によつて凍結を実現する新規な凍結装置を得たも
ので、構成が簡潔で、かつ操作が極めて容易であ
り、しかも、凍結細胞の生存率が高く、活性レベ
ルも高く維持でき、更に凍結細胞の回収率を殆ど
100％近くまで向上できるようにしようとするの
が、その目的である。

≪問題点を解決するための手段≫ 即ち本発明は、断熱したチヤンバーには底部に
凍結細胞回収用のメツシユによる回収容器を連結
したチユーブ状のサンプルホルダーが着脱自在に
内装され、当該サンプルホルダー内の上部に、外
部から気密に貫設した液体ヘリウム蒸気供給用の
トランスフアーチユーブと、生体細胞を可及的な
最小単位で培養液に包まれた状態にて供与する微
細管とを夫々開口配置して構成し、上記問題点を
解決したものである。

≪実施例≫ 以下本発明の実施例を図面に基づいて、詳述す
れば、第１図に示したようにチヤンバー１は、相
似形としたとき有底状の内筒１ａおよび外筒１ｂ
を適当な間隔だけ離間して組み合せ、これによ
り、当該両筒１ａ，１ｂ間に真空断熱層２を形成
したもので、該チヤンバー１の上端開口部３か
ら、ポリ四弗化エチレン（ダウケミカル社の商品
名：テフロン）あるいはポリイミド等の撥水性材
料で筒形状に形成したサンプルホルダー４を挿入
し、その上端部外周に設けられたホルダーフラン
ジ５を、上記チヤンバー１の開口部３の周辺に固
設したフランジ６と、該フランジ６上に重積状態
でボルト７………にて固定される押え部材８とに
挟着固定して、該サンプルホルダー４をチヤンバ
ー１内の略中央部に脱着自在に吊持させてある。

上記サンプルホルダー４の底部には、少なくと
も生成する凍結微細粒よりも小さいメツシユ、望
ましくは滅菌フイルター級のメツシユ材よりなる
有底形状とした凍結細胞の回収容器９を接着、あ
るいは熱収縮チユーブの収縮手段を用いるなどし
て凍結させてある。

又、上記サンプルホルダー４の上部には、該サ
ンプルホルダー４内部に液体ヘリウム蒸気を供給
する為のトランスフアーチユーブ１０と、同じく
サンプルホルダー４内部に、生体細胞を培養液と
共に供給する為の微細管１１が、上記押え部材８
を気密に貫通して、当該サンプルホルダー４内の
上部空間に開口している。

上記トランスフアーチユーブ１０の外端は、図
示しない液体ヘリウム蒸気発生容器に接続させて
あり、一方、上記微細管１１の外端は、培養液１
２中に生体細胞１３を分散した状態で収納してあ
る細胞容器１４にポンプＰを介して連結させてあ
るもので、この生体細胞を供給する為の微細管１
１の上記サンプルホルダー４内に開口した少なく
とも開口端部１１ａは、生体細胞が望ましくは１
個だけ通過し得る程度の微細な内径を有する例え
ばガラスキヤピラリーチユーブ等にて形成させて
ある。

尚、図において１５はチヤンバー１の下部に設
けた排気管を示す。

以上が本発明装置の構成であるが、次にその作
用を説示する。

先づトランスフアーチユーブ１０を介してサン
プルホルダー４の内部空間に液体ヘリウムを蒸気
又はミスト状態で供給し、望ましくは20〓（−
235℃）以下の極低温に予冷し、その温度域に保
持するように液体ヘリウムを供給しながら、微細
管１１から培養液の微細液滴中に包まれた状態で
細胞を同サンプルホルダー４内に滴下する。

微細液滴には生体細胞が１個乃至数個等、可及
的に少ない数だけ含まれるようにするのが望まし
く、そのため微細管１１に振動機によつて微小な
振動を与えると、滴下する液滴がより小さくな
り、１個のみの生体細胞を含む液滴を形成し易く
なる。

このようにして、サンプルホルダー４の上部か
ら滴下される生体細胞は、20〓以下の極低温で、
しかも極めて熱容量の大きな液体ヘリウム蒸気の
雰囲気により、落下途中で毎分10000℃以上の超
急速で冷却、凍結され、凍結細胞としてサンプル
ホルダー４底部の回収容器９に堆積する。

一方、上記サンプルホルダー４内に供給された
液体ヘリウム蒸気は生体細胞と熱交換に多少昇温
し、回収容器９のメツシユを抜けてチヤンバー１
の排気管１５から大気中に排気される。

以上の如くして、所定量の生体細胞を凍結し終
つたならば、液体ヘリウム蒸気と細胞の供給を停
止し、ボルト７及び押え部材８を外してサンプル
ホルダー４をチヤンバー１内から抜き出し、汚染
防止、異物混入防止の為に、別途用意した図示し
ないサンプルホルダー４用のキヤツプを同サンプ
ルホルダー４の上端開口部にねじ込み等の手段で
取り付けるか、あるいは、サンプルホルダー４の
上端開口部を溶封する等して密閉し、該サンプル
ホルダー４をそのまま液体窒素等の低温液化ガス
中に浸漬して保持する。

このように、回収容器９に凍結細胞を回収し
て、サンプルホルダー４ごと保持具として扱える
ようになるから、凍結細胞の回収の手間が省ける
上、凍結細胞を別の保存用容器に移し替える作業
も不要であり、更には、凍結細胞の回収ロスも無
くなり、凍結後に、外気に曝す時間を最少限にで
きるので、不用意に凍結細胞を解凍してしまうと
いつたことも生じ難い。

又、上記のメツシユによる回収容器９は、凍結
中にあつて、サンプルホルダー４から液体ヘリウ
ム蒸気の排気部となる上、液体窒素に浸漬し、又
は取り出す時に液体窒素の入口、あるいは抜け口
となつて好都合である。

更に、回収容器９のメツシユを、滅菌フイルタ
ー級の微細なものとすれば、当該装置による工程
では、細胞の移し替え等の外気曝露の機会がない
ので生体細胞の再汚染を完全に防止することが可
能である。

又、サンプルホルダー４を撥水性材料で形成
し、又は同材料でコーテイングすると、凍結中に
生体細胞が、内壁面に付着することがなく、回収
率を高めることができる。

第２図、第３図は、サンプルホルダー４をチヤ
ンバー１内の略中央部に配置するための他実施例
を示している。

同図に示す如く、チヤンバー１の底部１ｃを別
体とし、フランジ１６，１７と、図示しないボル
ト等の手段で当該底部１ｃを脱着可能に形成し、
その底部１ｃの内面中央部にピン１８を立設して
おき、一方、上記サンプルホルダー４の底部に連
結した回収容器９の底面には、上記ピン１８に適
合するブツシユ１９を下向きに固説し、該ブツシ
ユ１９とピン１８相互を係嵌すると共に、上記チ
ヤンバー１の上端開口部３から短管２０を垂設
し、該短管２０をサンプルホルダー４の上端開口
部に嵌合するよう形成されている。

このような構成によつても、サンプルホルダー
４をチヤンバー１内の略中央部に固定可能であつ
て、かつサンプルホルダー４の脱着も容易にする
ことができる。

≪発明の効果≫ 以上説明したように本発明に係る、生体細胞の
凍結装置は構成されたものであるから、冷却、凍
結する単位が、殆ど生体細胞１個ないし、これに
近い僅かな単位であつて、しかも極低温で熱容量
の大きな液体ヘリウム蒸気の雰囲気で冷却できる
ので、毎分10000℃以上の超高速で生体細胞を冷
却できる為、凍害防止剤を要することなく、従来
例に比較して相対的に高い生存率で生体細胞を凍
結でき、又チヤンバー１内にサンプルホルダー４
が二重管を形成するように配置されるので、特に
サンプルホルダー４内が低温を得易い上、冷媒を
効率良く使用できると共に、サンプルホルダー４
の底部にメツシユによる細胞回収容器９を有し、
チヤンバー１に脱着自在として当該サンプルホル
ダー４を保存用ホルダーに兼用できるので、凍結
細胞回収の手間が不要な上、回収率が高く、かつ
保存容器等への移し替えが不要であり、しかも凍
結細胞が外気温に曝露される機会を最少限にで
き、又、保存用液体窒素に出し入れする際、メツ
シユが液体窒素の出入口となつて好都合であり、
更に又、構成も簡潔である為、操作が極めて容易
であり、かつ安価に製作できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る生体細胞の凍結装置を示
す一実施例の使用状態縦断正面図第２図、第３図
は同凍結装置の他の実施例を一部拡大して各々示
した各縦断正面図、第４図は凍結細胞の生存率と
冷却速度の関係を示すグラフである。 １……チヤンバー、４……サンプルホルダー、
９……凍結細胞の回収容器、１０……トランスフ
アーチユーブ、１１……微細管。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 断熱したチヤンバーには底部に凍結細胞回収
   用のメツシユによる回収容器を連結したチユーブ
   状のサンプルホルダーが着脱自在に内装され、当
   該サンプルホルダー内の上部に、外部から気密に
   貫設した液体ヘリウム蒸気供給用のトランスフア
   ーチユーブと、生体細胞を可及的な最小単位で培
   養液に包まれた状態にて供与する微細管とを夫々
   開口配置してなることを特徴とする生体細胞の凍
   結装置。 ２ サンプルホルダーが、ポリ四弗化エチレン、
   ポリイミド等の撥水性材料、もしくは同材料でコ
   ーテイングしたもので形成されている特許請求の
   範囲第１項記載の生体細胞の凍結装置。 ３ 凍結細胞の回収容器が、滅菌フイルターで形
   成されている特許請求の範囲第１項記載の生体細
   胞の凍結装置。