JPH0130477B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、シリカゲル中に埋め込まれた酵素活
性調製物の製法に関する。 酵素活性を有する不溶性の調製物は特に、医学
上の分析にならびに食品工業用及び製薬工業用の
基礎物質の製造において使用される。さらにこの
調製物は光学活性物質を合成するためにも好適で
ある。この種の従来の調製物は、溶解され又は懸
濁化された酵素活性調製物に比して、基質から容
易に分離できること、安全であること、反応生成
物を不純化しないこと、ならびに反応を連続的に
行いうることに関して、若干の利点もあるが、か
なりの欠点も免れない。すなわち、酵素活性調製
物の担体物質への吸着性及びイオン性結合が、通
常はこれらに要求される確実性及び耐久性につい
て満足しない。さらにこれらの方法では、酵素活
性物を純粋な酵素か又は前もつてかなり精製した
酵素の形で用いる必要がある。このことは、細胞
材料及び微生物又はその砕片に限られる湿潤化が
問題にならない限り、調製物に共有結合が存在す
る場合にも起こる。 この欠点を広範囲に除く方法がドイツ特許出願
公開1939347号明細書に示されている。そこでは
酵素活性物質の存在下に水性の二酸化珪素ゲルを
製造することが記載されている。この方法ではゲ
ル状物が沈殿するが、このものを反応器への装入
に適した形にするためには、費用がかかり損失の
多い手段によらねばならない。しかもゲルの製造
に際しては、時間がかかりかつ煩雑な方法によつ
て得られる二酸化珪素ゾルから出発する。 本発明者らは、酵素活性調製物及び溶解された
珪酸アルカリ金属塩及び／又は珪酸アンモニウム
塩からの水性混合物を、水と混合しない有機液体
中に懸濁させ、次いで水に不溶なゲルに移行させ
るとき、シリカゲル中に埋め込まれた酵素活性調
製物を、前記の欠点を避けて簡単に製造しうるこ
とを見出した。 酵素活性調製物（Praeparat）とは、好ましく
は粒子に結合された酵素、細胞破砕物、細胞画
分、乾燥された細胞、腺分泌物、微生物ならびに
菌及び微生物の胞子を意味する。また溶解、懸
濁、分散又は乾燥した状態の酵素も包含される。 その例は特に下記のものである。ストレプトミ
セス属の微生物、グルコースイソメラーゼ活性を
有するアースロバクター及びバチルス、ペニシリ
ンアシラーゼ活性を有するエシエリヒア・コリ、
ステロイドの脱水素のためのアースロバクター・
シムプレツクス、ケトンの還元のためのサツカロ
ミセス・セレビシエ、ステロイドのヒドロキシル
化のためのクルブラリア・ルナータ及びアミノア
シラーゼ活性を有するアスペルギルス・オクラセ
ウム。さらに下記のものも適している。トリプシ
ン、キモトリプシン、パンクレアチン、α−及び
β−アミラーゼ、リボヌクレアーゼ、デスオキシ
リボヌクレアーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、ペ
クチナーゼ、キチナーゼ、ペプシン、ブロメライ
ン、ケラチナーゼ、アミログリコシダーゼ、リパ
ーゼ、コリンエステラーゼ、レシチナーゼ、ホス
フアターゼ、アルギナーゼ、アスパラギナーゼ、
グルタミナーゼ、ウレアーゼ、ラクターゼ、ペニ
シリンアミダーゼ、ペニシリナーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシダーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼ、シトクロームレダクター
ゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、
レンニン、フイチン、サブチリシン、タンナー
ゼ、フエノールオキシダーゼ、プルラナーゼ、パ
ンクレアチン、イソアミラーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、デイアホラー
ゼ、アルドラーゼ、グルコール酸オキシダーゼ、
ルシフエラーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ナリ
ンギナーゼ、ウリカーゼ、グルタチオンレグクタ
ーゼ、亜硝酸塩レダクターゼ、硝酸塩レダクター
ゼ、こはく酸デヒドロゲナーゼ、カテコールオキ
シダーゼ、β−フラクトシダーゼ、アミノ酸アシ
ラーゼ及びウロキナーゼならびにこれら酵素の調
製物。 珪酸塩の溶液としては、SiO2として８〜27重
量％好ましくは11〜24重量％の濃度を有する珪酸
ナトリウム、珪酸カリウム又は珪酸アンモニウム
の溶液が用いられる。 水と混合しない溶剤として特に有利には、脂肪
族、脂環族及び芳香族の炭化水素又はハロゲン化
炭化水素、たとえば１，１，１−トリクロルエタ
ンを基礎とする溶剤が用いられる。 懸濁化工程を懸濁助剤により補強することが好
ましく、そのためには油中水型（又は反対型）懸
濁重合の実施に際して用いられる物質が適してい
る。その例はソルビタンエステルならびに米国特
許2982749号明細書、ドイツ特許出願公開2009218
号、同2634486号及び同210372号各明細書に記載
の物質である。 珪酸塩のゲル化は常法により、電解質の添加又
は水と混合しうる有機溶剤の添加により、あるい
は特に有利には水にも有機液体にも可溶な試薬の
添加によるPH価の低減により行われる。 ゲル化は、有機液体と、珪酸塩及び酵素活性調
製物を含有する水性の混合物とから成る懸濁液
に、両相に可溶な有機酸好ましくは酢酸を滴加す
るとき特に良好に行われ、その際中和と沈殿が起
こる。均質な沈殿を達成するためには、酸を少量
の有機液体で希釈するとよい。酸の量又は酸誘導
体たとえば無水物もしくはハロゲン化物の量を選
定することにより、沈殿終了時のPH価を固定した
酵素調製物に同調させることができる。 予想外にも数秒間ないし数十分間にわたつて行
われるアルカリ負荷にもかかわらず、本方法では
きわめてアルカリに過敏な酵素が関与していない
限り、その酵素活性が広い範囲に一定に保持され
る。酵素活性物質と混合する前に、少量の酸をア
ルカリ金属珪酸塩又は珪酸アンモニウムの溶液に
添加すると、この負荷を軽減できる。 ゲル化に際しては、酵素活性調製物と一緒に有
機又は無機の不活性物質を混入加工することによ
り、生ずる調製物の水中での膨潤を軽減すること
が好ましい。またこれによりその密度を変化でき
る。好ましい不活性物質はたとえば軽石粉末、ガ
ラス粉末又はガラス繊維、珪藻土、ゼオライト、
有機重合体の粉末、活性炭又は難溶性塩類であ
る。 そのほか固化は、珪酸塩の水性混合物に可溶な
硫酸塩又は燐酸塩を加え、ゲル化したのち得られ
た調製物を、そのカチオンが難溶性の硫酸塩又は
燐酸塩を形成する塩類の水溶液により処理するこ
とにより達成される。そのような塩類の例は塩化
カルシウム及び塩化バリウムである。 この新規方法により製造された酵素調製物は、
きわめて簡単に使用でき、しかも多数回の使用に
際してもきわめて長期間安定である。 下記実施例にあげた微生物は、酵素活性物質の
ための試料であるにすぎない。その微生物がある
とき、なんらかの理由により役に立たなくなつた
ならば、酵素活性を有する任意の他の微生物によ
り代替が可能である。 実施例 １ パン酵母の固定 撹拌器及び滴下漏斗を備えた内容500mlの三つ
口フラスコを用いて、下記の混合物又は溶液を製
造する。 (1) トルオール300ml中の懸濁助剤（ドイツ特許
出願公開2710372号明細書による保護コロイド
Ａ）0.04ｇ、 (2) 水10ml中の塩化カルシウム4.7ｇ、 (3) 乾燥パン酵母７ｇ及び水12ml、 (4) 水12ml及び1N硫酸12ml中の珪酸ナトリウム
20ｇの溶液（SiO2として26％）、 (1)をフラスコ中に入れておき、(4)を手早く(3)と
混合し、撹拌しながら(1)に加える（このとき小滴
状に分布される）。１分以内にこれに(2)を滴加す
る（そのとき酵母−珪酸塩混合物が固化する）。
１分間の撹拌後、生成物を、粗大なガラスフリツ
ト上で吸引過し、何回も水洗したのち70℃で真
空乾燥すると、粒径１mm以下のほぼ球状の生成物
13ｇが得られる。 ドイツ特許出願公開2710372号明細書による保
護コロイドＡは、ジシクロペンタン152Kg、無水
マレイン酸８Kg及びスチロール10Kgを窒素ガス中
で１時間267℃に加熱することにより製造される。
揮発化合物を除去したのち、軟化点197℃、分子
量900及び沃素価70の生成物が得られる。 実施例 ２ パン酵母の固定 同一装置で実施例１と同様にして、ただし(1)と
しては懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号
明細書による保護コロイドＡ）0.04ｇ、シクロヘ
キサン150ml及びｎ−オクタン150mlからの混合物
を、そして(2)としては濃塩酸４mlからの混合物を
使用して操作すると、きわめて細かい球状生成物
７ｇが得られる。 ドイツ特許出願公開2634486号明細書による保
護コロイドＡは、無水マレイン酸10部ならびに分
子量が1500で、シス−１，４−異性体75％、トラ
ンス−１，４−異性体24％及びビニル性二重結合
１％を含有するブタジエンオイル90部を、180〜
200℃に加熱することにより得られる。 実施例 ３ パン酵母の固定 同一装置で実施例２と同様に、ただし混合物(2)
を無水酢酸12.1ｇからの混合物に変えて操作する
と、球状生成物14ｇが得られる。 実施例 ４ パン酵母の固定 撹拌器及び滴下漏斗を備えた内容１の三つ口
フラスコを用いて、下記の混合物又は溶液を製造
する。 (1) シクロヘキサン650ml中の懸濁助剤（ドイツ
特許出願公開2634486号明細書による保護コロ
イドＡ）0.1ｇ、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸３ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ及び水35ml、 (4) 水12.5mlで希釈した珪酸ナトリウム溶液
（SiO2として26％）50ｇ。 この差異のほか溶液(2)を５分以内に加えて実施
例１と同様に操作すると、ほぼ球状の生成物23ｇ
が得られる。 実施例 ５ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ、シクロヘ
キサン300ml及びｎ−オクタン300ml、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸５ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ、軽石粉未10ｇ及び水40
ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）50
ｇ、水30ml及び1N硫酸30ml。 実施例１と同様にして沈殿させ、シクロヘキサ
ン／ｎ−オクタン混合物を吸引過したのち、生
成物を５％塩化カルシウムの溶液中で30秒間撹拌
し、氷酢酸1.25ｇの添加により完全に中和し、次
いでなお１分間撹拌する。水中での２分間の撹拌
を２回行つたのち、50℃で真空乾燥すると、ほぼ
球状の生成物37.6ｇが得られる。 実施例 ６ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ、シクロヘ
キサン325ml及びｎ−オクタン325ml、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸５ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ及び水30ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）50
ｇ、水10ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液20ml及び1N硫酸25ml。 実施例５と同様に操作すると、球状生成物31ｇ
が得られる。 実施例 ７ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ及び１，１，
１−トリクロルエタン300ml、 (2) エタノール60ml、 (3) 乾燥パン酵母31ｇ及び水72ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）10
ｇ、水5.6ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液4.4ml及び1N硫酸5.6ml、 (5) 1N塩酸13ml、塩化カルシウム10ｇ及び水500
ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、沈殿ののち、さ
らに５分間撹拌する。細塵状成分を傾潟して除
き、次いで沈殿生成物を(5)の中で４分間撹拌す
る。水洗したのち50℃で真空乾燥すると、微粒状
生成物20ｇが得られる。灼熱定量法により測定す
ると酵母含量は84重量％である。 実施例 ８ ペニシリンアシラーゼ活性を有するエシエリヒ
ア・コリの固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.065ｇ、シクロ
ヘキサン300ml及びｎ−オクタン300ml、 (2) シクロヘキサン15ml中の氷酢酸3.2ｇ、 (3) エシエリヒア・コリATCC11105の水性懸濁
液（乾燥物としての含量15.8重量％）70ｇ、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）32.1
ｇ、水6.5ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液12.8ml及び1N硫酸16ml、 (5) ５％塩化カルシウム水溶液350ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過のの
ち、生成物を(5)の中で１分間撹拌する。そしてま
ず１％の、次いで0.5％の塩化ナトリウム溶液で
洗浄し、最後に50℃で真空乾燥すると、球状生成
物25ｇが得られる。 実施例 ９ グルコースイソメラーゼ活性を有するストレプ
トミセス・ウエドモレンシスの固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.065ｇ、シクロ
ヘキサン300ml及び１，１，１−トリクロルエ
タン300ml、 (2) シクロヘキサン15ml中の氷酢酸４ｇ、 (3) ストレプトミセス・ウエドモレンシス
ATCC21175の水性懸濁液（乾燥物としての含
量15.8重量％）75ｇ、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）32.1
ｇ、水6.5ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
ナトリウム溶液12.8ml及び1N硫酸16ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過のの
ち、生成物を0.5％塩化ナトリウム溶液500ml中で
２分間ずつ２回洗浄し、次いで50℃で真空乾燥す
ると、球状生成物20ｇが得られる。 実施例 10 グルコースイソメラーゼ活性を有するアースロ
バクター・スピーシスNRRL3726の固定 実施例４と同じ装置により、混合物３としてア
ースロバクター・スピーシスNRRL3726の水性
懸濁液（乾燥物としての含量25.5重量％）50ｇを
用い、実施例９と同様に操作すると、球状生成物
22.7ｇが得られる。 実施例 11 β−フルクトシダーゼの固定 実施例１と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) １，１，１−トリクロルエタン150ml中の懸
濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明細書
による保護コロイドＡ）0.02ｇ、 (2) １，１，１−トリクロルエタン５ml中の氷酢
酸0.25ｇ、 (3) 0.2モル酢酸ナトリウム緩衝液（PH4.65）５
ml中のβ−フルクトシダーゼ50mg、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）10
ｇ、水10ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液４ml及び1N硫酸５ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過ののち
生成物を水洗し、次いで室温で真空乾燥すると、
生成物3.9ｇが得られる。 酵素活性の測定： インベルターゼ活性（パン酵母とβ−フルクト
シダーゼの場合）を測定するために、各実施例の
調製物１ｇを室温で、0.05モル酢酸ナトリウム緩
衝液（PH4.65）中の40重量％蔗糖溶液中において
１時間振とうした。加水分解の程度は旋光分析に
より測定した。 別にグルコースイソメラーゼ活性を測定するた
めに、調製物１ｇを70℃で下記物質の水溶液中に
おいて１時間振とうした。 グルコース １モル りん酸カリウム緩衝剤 0.2モル MgSO4・7H2O 0.01モル 塩化コバルト 0.001モル 次いで反応に対応してフルクトースを60mgまで
を含有しているこの溶液の試料を、レゾルチン試
薬（4N HCl中レゾルチン0.05％）５mlに添加し
た。この溶液を80℃に７分間加熱したのち、５℃
に５分間冷却した。冷却の15〜30分後に490nｍ
での吸光を測定し、反応率を検定カーブと比較す
ることにより判定した。 またペニシリンアシラーゼ活性を測定するため
に、調製物１ｇを0.05モルりん酸カリウム緩衝液
（PH7.5）中のペニシリンＧ（ナトリウム塩、35
mg／ml）の溶液６ml中において45℃で振とうし
た。０分後、30分後及び60分後にそれぞれ0.1ml
の試料を採取し、その６−アミノペニシラン酸の
含量を測定した。この測定の原理は、６−アミノ
ペニシラン酸及びｐ−ジメチルアミノ−ベンズア
ルデヒドからシツフ塩基を生成することであり、
このものは409nｍで最水吸光を有する。６−ア
ミノペニシラン酸含有試料（0.1ml）を、20％酢
酸４ml及び0.05モルNaOH2mlと混合し、それぞ
れこん濁を除くため10分間遠心分離した。この遠
心分離溶液3.5mlに0.5％メタノール性ｐ−ジメチ
ルアミノベンズアルデヒド溶液１mlを添加し、よ
く混和した。15分後に409nｍでの吸光を、６−
アミノペニシラン酸不含の試料を対照として測定
し、加水分解率を検定カーブから判定した。 活性収率の判定は、固定化してない酵素活性物
質を用いて同じ条件下に得られた結果と比較する
ことにより行われた。 カラムでの活性試験に際しては、ペニシリンア
シラーゼ活性の追跡におけるバツチ試験と異な
り、0.75モルりん酸カリウム緩衝液（PH7.5）を
用いた。グルコースイソメラーゼ活性の検定は、
緩衝剤なしのPH8.25及び0.004モル／の塩化マ
グネシウム含量で行われた。 細胞材料又は微生物における酵素活性物質の含
量は、灼熱定量法における経験に基づいて、下記
の実験式から算出した。 Ｇ＝Ｔ／Ａ・100−３ この式中のＧは生成物中の酵素活性物質の重量
％による含量、Ｔは使用した酵素活性物質の乾物
量、Ａは各実施例により得られた生成物の重量す
なわち収量を表わす。活性検定試験の結果を下記
表に示す。 【表】
性調製物の製法に関する。 酵素活性を有する不溶性の調製物は特に、医学
上の分析にならびに食品工業用及び製薬工業用の
基礎物質の製造において使用される。さらにこの
調製物は光学活性物質を合成するためにも好適で
ある。この種の従来の調製物は、溶解され又は懸
濁化された酵素活性調製物に比して、基質から容
易に分離できること、安全であること、反応生成
物を不純化しないこと、ならびに反応を連続的に
行いうることに関して、若干の利点もあるが、か
なりの欠点も免れない。すなわち、酵素活性調製
物の担体物質への吸着性及びイオン性結合が、通
常はこれらに要求される確実性及び耐久性につい
て満足しない。さらにこれらの方法では、酵素活
性物を純粋な酵素か又は前もつてかなり精製した
酵素の形で用いる必要がある。このことは、細胞
材料及び微生物又はその砕片に限られる湿潤化が
問題にならない限り、調製物に共有結合が存在す
る場合にも起こる。 この欠点を広範囲に除く方法がドイツ特許出願
公開1939347号明細書に示されている。そこでは
酵素活性物質の存在下に水性の二酸化珪素ゲルを
製造することが記載されている。この方法ではゲ
ル状物が沈殿するが、このものを反応器への装入
に適した形にするためには、費用がかかり損失の
多い手段によらねばならない。しかもゲルの製造
に際しては、時間がかかりかつ煩雑な方法によつ
て得られる二酸化珪素ゾルから出発する。 本発明者らは、酵素活性調製物及び溶解された
珪酸アルカリ金属塩及び／又は珪酸アンモニウム
塩からの水性混合物を、水と混合しない有機液体
中に懸濁させ、次いで水に不溶なゲルに移行させ
るとき、シリカゲル中に埋め込まれた酵素活性調
製物を、前記の欠点を避けて簡単に製造しうるこ
とを見出した。 酵素活性調製物（Praeparat）とは、好ましく
は粒子に結合された酵素、細胞破砕物、細胞画
分、乾燥された細胞、腺分泌物、微生物ならびに
菌及び微生物の胞子を意味する。また溶解、懸
濁、分散又は乾燥した状態の酵素も包含される。 その例は特に下記のものである。ストレプトミ
セス属の微生物、グルコースイソメラーゼ活性を
有するアースロバクター及びバチルス、ペニシリ
ンアシラーゼ活性を有するエシエリヒア・コリ、
ステロイドの脱水素のためのアースロバクター・
シムプレツクス、ケトンの還元のためのサツカロ
ミセス・セレビシエ、ステロイドのヒドロキシル
化のためのクルブラリア・ルナータ及びアミノア
シラーゼ活性を有するアスペルギルス・オクラセ
ウム。さらに下記のものも適している。トリプシ
ン、キモトリプシン、パンクレアチン、α−及び
β−アミラーゼ、リボヌクレアーゼ、デスオキシ
リボヌクレアーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、ペ
クチナーゼ、キチナーゼ、ペプシン、ブロメライ
ン、ケラチナーゼ、アミログリコシダーゼ、リパ
ーゼ、コリンエステラーゼ、レシチナーゼ、ホス
フアターゼ、アルギナーゼ、アスパラギナーゼ、
グルタミナーゼ、ウレアーゼ、ラクターゼ、ペニ
シリンアミダーゼ、ペニシリナーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシダーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼ、シトクロームレダクター
ゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、
レンニン、フイチン、サブチリシン、タンナー
ゼ、フエノールオキシダーゼ、プルラナーゼ、パ
ンクレアチン、イソアミラーゼ、ヘキソキナー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、デイアホラー
ゼ、アルドラーゼ、グルコール酸オキシダーゼ、
ルシフエラーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ナリ
ンギナーゼ、ウリカーゼ、グルタチオンレグクタ
ーゼ、亜硝酸塩レダクターゼ、硝酸塩レダクター
ゼ、こはく酸デヒドロゲナーゼ、カテコールオキ
シダーゼ、β−フラクトシダーゼ、アミノ酸アシ
ラーゼ及びウロキナーゼならびにこれら酵素の調
製物。 珪酸塩の溶液としては、SiO2として８〜27重
量％好ましくは11〜24重量％の濃度を有する珪酸
ナトリウム、珪酸カリウム又は珪酸アンモニウム
の溶液が用いられる。 水と混合しない溶剤として特に有利には、脂肪
族、脂環族及び芳香族の炭化水素又はハロゲン化
炭化水素、たとえば１，１，１−トリクロルエタ
ンを基礎とする溶剤が用いられる。 懸濁化工程を懸濁助剤により補強することが好
ましく、そのためには油中水型（又は反対型）懸
濁重合の実施に際して用いられる物質が適してい
る。その例はソルビタンエステルならびに米国特
許2982749号明細書、ドイツ特許出願公開2009218
号、同2634486号及び同210372号各明細書に記載
の物質である。 珪酸塩のゲル化は常法により、電解質の添加又
は水と混合しうる有機溶剤の添加により、あるい
は特に有利には水にも有機液体にも可溶な試薬の
添加によるPH価の低減により行われる。 ゲル化は、有機液体と、珪酸塩及び酵素活性調
製物を含有する水性の混合物とから成る懸濁液
に、両相に可溶な有機酸好ましくは酢酸を滴加す
るとき特に良好に行われ、その際中和と沈殿が起
こる。均質な沈殿を達成するためには、酸を少量
の有機液体で希釈するとよい。酸の量又は酸誘導
体たとえば無水物もしくはハロゲン化物の量を選
定することにより、沈殿終了時のPH価を固定した
酵素調製物に同調させることができる。 予想外にも数秒間ないし数十分間にわたつて行
われるアルカリ負荷にもかかわらず、本方法では
きわめてアルカリに過敏な酵素が関与していない
限り、その酵素活性が広い範囲に一定に保持され
る。酵素活性物質と混合する前に、少量の酸をア
ルカリ金属珪酸塩又は珪酸アンモニウムの溶液に
添加すると、この負荷を軽減できる。 ゲル化に際しては、酵素活性調製物と一緒に有
機又は無機の不活性物質を混入加工することによ
り、生ずる調製物の水中での膨潤を軽減すること
が好ましい。またこれによりその密度を変化でき
る。好ましい不活性物質はたとえば軽石粉末、ガ
ラス粉末又はガラス繊維、珪藻土、ゼオライト、
有機重合体の粉末、活性炭又は難溶性塩類であ
る。 そのほか固化は、珪酸塩の水性混合物に可溶な
硫酸塩又は燐酸塩を加え、ゲル化したのち得られ
た調製物を、そのカチオンが難溶性の硫酸塩又は
燐酸塩を形成する塩類の水溶液により処理するこ
とにより達成される。そのような塩類の例は塩化
カルシウム及び塩化バリウムである。 この新規方法により製造された酵素調製物は、
きわめて簡単に使用でき、しかも多数回の使用に
際してもきわめて長期間安定である。 下記実施例にあげた微生物は、酵素活性物質の
ための試料であるにすぎない。その微生物がある
とき、なんらかの理由により役に立たなくなつた
ならば、酵素活性を有する任意の他の微生物によ
り代替が可能である。 実施例 １ パン酵母の固定 撹拌器及び滴下漏斗を備えた内容500mlの三つ
口フラスコを用いて、下記の混合物又は溶液を製
造する。 (1) トルオール300ml中の懸濁助剤（ドイツ特許
出願公開2710372号明細書による保護コロイド
Ａ）0.04ｇ、 (2) 水10ml中の塩化カルシウム4.7ｇ、 (3) 乾燥パン酵母７ｇ及び水12ml、 (4) 水12ml及び1N硫酸12ml中の珪酸ナトリウム
20ｇの溶液（SiO2として26％）、 (1)をフラスコ中に入れておき、(4)を手早く(3)と
混合し、撹拌しながら(1)に加える（このとき小滴
状に分布される）。１分以内にこれに(2)を滴加す
る（そのとき酵母−珪酸塩混合物が固化する）。
１分間の撹拌後、生成物を、粗大なガラスフリツ
ト上で吸引過し、何回も水洗したのち70℃で真
空乾燥すると、粒径１mm以下のほぼ球状の生成物
13ｇが得られる。 ドイツ特許出願公開2710372号明細書による保
護コロイドＡは、ジシクロペンタン152Kg、無水
マレイン酸８Kg及びスチロール10Kgを窒素ガス中
で１時間267℃に加熱することにより製造される。
揮発化合物を除去したのち、軟化点197℃、分子
量900及び沃素価70の生成物が得られる。 実施例 ２ パン酵母の固定 同一装置で実施例１と同様にして、ただし(1)と
しては懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号
明細書による保護コロイドＡ）0.04ｇ、シクロヘ
キサン150ml及びｎ−オクタン150mlからの混合物
を、そして(2)としては濃塩酸４mlからの混合物を
使用して操作すると、きわめて細かい球状生成物
７ｇが得られる。 ドイツ特許出願公開2634486号明細書による保
護コロイドＡは、無水マレイン酸10部ならびに分
子量が1500で、シス−１，４−異性体75％、トラ
ンス−１，４−異性体24％及びビニル性二重結合
１％を含有するブタジエンオイル90部を、180〜
200℃に加熱することにより得られる。 実施例 ３ パン酵母の固定 同一装置で実施例２と同様に、ただし混合物(2)
を無水酢酸12.1ｇからの混合物に変えて操作する
と、球状生成物14ｇが得られる。 実施例 ４ パン酵母の固定 撹拌器及び滴下漏斗を備えた内容１の三つ口
フラスコを用いて、下記の混合物又は溶液を製造
する。 (1) シクロヘキサン650ml中の懸濁助剤（ドイツ
特許出願公開2634486号明細書による保護コロ
イドＡ）0.1ｇ、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸３ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ及び水35ml、 (4) 水12.5mlで希釈した珪酸ナトリウム溶液
（SiO2として26％）50ｇ。 この差異のほか溶液(2)を５分以内に加えて実施
例１と同様に操作すると、ほぼ球状の生成物23ｇ
が得られる。 実施例 ５ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ、シクロヘ
キサン300ml及びｎ−オクタン300ml、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸５ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ、軽石粉未10ｇ及び水40
ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）50
ｇ、水30ml及び1N硫酸30ml。 実施例１と同様にして沈殿させ、シクロヘキサ
ン／ｎ−オクタン混合物を吸引過したのち、生
成物を５％塩化カルシウムの溶液中で30秒間撹拌
し、氷酢酸1.25ｇの添加により完全に中和し、次
いでなお１分間撹拌する。水中での２分間の撹拌
を２回行つたのち、50℃で真空乾燥すると、ほぼ
球状の生成物37.6ｇが得られる。 実施例 ６ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ、シクロヘ
キサン325ml及びｎ−オクタン325ml、 (2) シクロヘキサン25ml中の氷酢酸５ｇ、 (3) 乾燥パン酵母17.5ｇ及び水30ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）50
ｇ、水10ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液20ml及び1N硫酸25ml。 実施例５と同様に操作すると、球状生成物31ｇ
が得られる。 実施例 ７ パン酵母の固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.1ｇ及び１，１，
１−トリクロルエタン300ml、 (2) エタノール60ml、 (3) 乾燥パン酵母31ｇ及び水72ml、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）10
ｇ、水5.6ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液4.4ml及び1N硫酸5.6ml、 (5) 1N塩酸13ml、塩化カルシウム10ｇ及び水500
ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、沈殿ののち、さ
らに５分間撹拌する。細塵状成分を傾潟して除
き、次いで沈殿生成物を(5)の中で４分間撹拌す
る。水洗したのち50℃で真空乾燥すると、微粒状
生成物20ｇが得られる。灼熱定量法により測定す
ると酵母含量は84重量％である。 実施例 ８ ペニシリンアシラーゼ活性を有するエシエリヒ
ア・コリの固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.065ｇ、シクロ
ヘキサン300ml及びｎ−オクタン300ml、 (2) シクロヘキサン15ml中の氷酢酸3.2ｇ、 (3) エシエリヒア・コリATCC11105の水性懸濁
液（乾燥物としての含量15.8重量％）70ｇ、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）32.1
ｇ、水6.5ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液12.8ml及び1N硫酸16ml、 (5) ５％塩化カルシウム水溶液350ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過のの
ち、生成物を(5)の中で１分間撹拌する。そしてま
ず１％の、次いで0.5％の塩化ナトリウム溶液で
洗浄し、最後に50℃で真空乾燥すると、球状生成
物25ｇが得られる。 実施例 ９ グルコースイソメラーゼ活性を有するストレプ
トミセス・ウエドモレンシスの固定 実施例４と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) 懸濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明
細書による保護コロイドＡ）0.065ｇ、シクロ
ヘキサン300ml及び１，１，１−トリクロルエ
タン300ml、 (2) シクロヘキサン15ml中の氷酢酸４ｇ、 (3) ストレプトミセス・ウエドモレンシス
ATCC21175の水性懸濁液（乾燥物としての含
量15.8重量％）75ｇ、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）32.1
ｇ、水6.5ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
ナトリウム溶液12.8ml及び1N硫酸16ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過のの
ち、生成物を0.5％塩化ナトリウム溶液500ml中で
２分間ずつ２回洗浄し、次いで50℃で真空乾燥す
ると、球状生成物20ｇが得られる。 実施例 10 グルコースイソメラーゼ活性を有するアースロ
バクター・スピーシスNRRL3726の固定 実施例４と同じ装置により、混合物３としてア
ースロバクター・スピーシスNRRL3726の水性
懸濁液（乾燥物としての含量25.5重量％）50ｇを
用い、実施例９と同様に操作すると、球状生成物
22.7ｇが得られる。 実施例 11 β−フルクトシダーゼの固定 実施例１と同じ装置により、下記の混合物又は
溶液を用いる。 (1) １，１，１−トリクロルエタン150ml中の懸
濁助剤（ドイツ特許出願公開2634486号明細書
による保護コロイドＡ）0.02ｇ、 (2) １，１，１−トリクロルエタン５ml中の氷酢
酸0.25ｇ、 (3) 0.2モル酢酸ナトリウム緩衝液（PH4.65）５
ml中のβ−フルクトシダーゼ50mg、 (4) 珪酸ナトリウム溶液（SiO2として26％）10
ｇ、水10ml、1N苛性ソーダ溶液中の4.2％硫酸
アルミニウム溶液４ml及び1N硫酸５ml。 沈殿を実施例１と同様に行い、吸引過ののち
生成物を水洗し、次いで室温で真空乾燥すると、
生成物3.9ｇが得られる。 酵素活性の測定： インベルターゼ活性（パン酵母とβ−フルクト
シダーゼの場合）を測定するために、各実施例の
調製物１ｇを室温で、0.05モル酢酸ナトリウム緩
衝液（PH4.65）中の40重量％蔗糖溶液中において
１時間振とうした。加水分解の程度は旋光分析に
より測定した。 別にグルコースイソメラーゼ活性を測定するた
めに、調製物１ｇを70℃で下記物質の水溶液中に
おいて１時間振とうした。 グルコース １モル りん酸カリウム緩衝剤 0.2モル MgSO4・7H2O 0.01モル 塩化コバルト 0.001モル 次いで反応に対応してフルクトースを60mgまで
を含有しているこの溶液の試料を、レゾルチン試
薬（4N HCl中レゾルチン0.05％）５mlに添加し
た。この溶液を80℃に７分間加熱したのち、５℃
に５分間冷却した。冷却の15〜30分後に490nｍ
での吸光を測定し、反応率を検定カーブと比較す
ることにより判定した。 またペニシリンアシラーゼ活性を測定するため
に、調製物１ｇを0.05モルりん酸カリウム緩衝液
（PH7.5）中のペニシリンＧ（ナトリウム塩、35
mg／ml）の溶液６ml中において45℃で振とうし
た。０分後、30分後及び60分後にそれぞれ0.1ml
の試料を採取し、その６−アミノペニシラン酸の
含量を測定した。この測定の原理は、６−アミノ
ペニシラン酸及びｐ−ジメチルアミノ−ベンズア
ルデヒドからシツフ塩基を生成することであり、
このものは409nｍで最水吸光を有する。６−ア
ミノペニシラン酸含有試料（0.1ml）を、20％酢
酸４ml及び0.05モルNaOH2mlと混合し、それぞ
れこん濁を除くため10分間遠心分離した。この遠
心分離溶液3.5mlに0.5％メタノール性ｐ−ジメチ
ルアミノベンズアルデヒド溶液１mlを添加し、よ
く混和した。15分後に409nｍでの吸光を、６−
アミノペニシラン酸不含の試料を対照として測定
し、加水分解率を検定カーブから判定した。 活性収率の判定は、固定化してない酵素活性物
質を用いて同じ条件下に得られた結果と比較する
ことにより行われた。 カラムでの活性試験に際しては、ペニシリンア
シラーゼ活性の追跡におけるバツチ試験と異な
り、0.75モルりん酸カリウム緩衝液（PH7.5）を
用いた。グルコースイソメラーゼ活性の検定は、
緩衝剤なしのPH8.25及び0.004モル／の塩化マ
グネシウム含量で行われた。 細胞材料又は微生物における酵素活性物質の含
量は、灼熱定量法における経験に基づいて、下記
の実験式から算出した。 Ｇ＝Ｔ／Ａ・100−３ この式中のＧは生成物中の酵素活性物質の重量
％による含量、Ｔは使用した酵素活性物質の乾物
量、Ａは各実施例により得られた生成物の重量す
なわち収量を表わす。活性検定試験の結果を下記
表に示す。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素活性調製物及び溶解された珪酸アルカリ
金属塩及び／又は珪酸アンモニウム塩からの水性
混合物を、水と混合しない有機液体中に懸濁さ
せ、次いで水に不溶なゲルに移行させることを特
徴とする、シリカゲル中に埋め込まれた酵素活性
調製物の製法。 ２ 酵素活性調製物として、微生物、植物、動物
又は人体を起源とする生活細胞又は細胞片を用い
ることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 ３ 懸濁液の生成を、懸濁助剤により容易にする
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 ４ ゲル化を、水にも水と混合しない有機液体に
も可溶な試薬好ましくは有機酸による、PH価の低
減により行うことを特徴とする、特許請求の範囲
第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。 ５ ゲル化を不活性物質の存在下で行うことを特
徴とする、特許請求の範囲第１項ないし第４項の
いずれかに記載の方法。 ６ 水性混合物に可溶な硫酸塩又はりん酸塩を添
加し、そしてゲル化により得られた生成物を、カ
チオンが難溶性の硫酸塩又はりん酸塩を生成する
塩の溶液により処理することを特徴とする、特許
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載
の方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JPS55127990A (ja) |
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