JPH01304882A - ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 - Google Patents
ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法Info
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- JPH01304882A JPH01304882A JP13545788A JP13545788A JPH01304882A JP H01304882 A JPH01304882 A JP H01304882A JP 13545788 A JP13545788 A JP 13545788A JP 13545788 A JP13545788 A JP 13545788A JP H01304882 A JPH01304882 A JP H01304882A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、特定のｍＷを使用して、ヒトＣｕ。
Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ（以下、ヒトＳＯ
Ｄと略す）を凍結状態などで安定に保存する方法に関す
るものである。
Ｄと略す）を凍結状態などで安定に保存する方法に関す
るものである。
ヒトＳＯＤは、下式に示す不均化反応によって、スーパ
ーオキシドを消失させる作用を持つ酵素である。
ーオキシドを消失させる作用を持つ酵素である。
２・Ｏ；＋２）！” −一→ ０２＋Ｈ２０□従って、
ヒトＳＯＤは、生体内で発生したスーパーオキシドによ
る組織障害（例えば、炎症、変形性関節炎、慢性関節リ
ウマチ、放射線照射による障害、紫外線による障害、未
熟児酸素網膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌
剤の副作用、虚血部分への血流再開に伴う障害など）に
対する有効な治療薬として注目されている。
ヒトＳＯＤは、生体内で発生したスーパーオキシドによ
る組織障害（例えば、炎症、変形性関節炎、慢性関節リ
ウマチ、放射線照射による障害、紫外線による障害、未
熟児酸素網膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌
剤の副作用、虚血部分への血流再開に伴う障害など）に
対する有効な治療薬として注目されている。
ところで、蛋白質であるヒトＳＯＤは、凍結融解処理ま
たは凍結乾燥処理を行っても、その酵素活性の低下は認
められず、また、不溶性物質の生成も肉眼では認められ
ない。しかし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動、高速ゲル濾過液体クロマトグラフィー
などによる分析では、前記の処理を受けたヒトＳＯＤは
、主として二量体からなる副生物を生じている。
たは凍結乾燥処理を行っても、その酵素活性の低下は認
められず、また、不溶性物質の生成も肉眼では認められ
ない。しかし、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動、高速ゲル濾過液体クロマトグラフィー
などによる分析では、前記の処理を受けたヒトＳＯＤは
、主として二量体からなる副生物を生じている。
従って、ヒトＳＯＤを医薬品として使用する場合には、
これを安定的に保存する必要があるが、その保存処理で
生じる副生物がアレルギーなどの副作用の原因となる恐
れがあるので、その生成を防ぐ必要がある。
これを安定的に保存する必要があるが、その保存処理で
生じる副生物がアレルギーなどの副作用の原因となる恐
れがあるので、その生成を防ぐ必要がある。
一般的に、蛋白質は、凍結融解処理または凍結乾燥処理
によって、副生物の生成、不溶化などの変性を起こし、
その生物学的活性が低下することが知られている。そし
て、そのような変性は、凍結融解処理または凍結乾燥処
理を行う前に、その蛋白質溶液にアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デキストラン、デンプンなどの生物由来の
高分子化合物、アミノ酸、ポリエチレングリコールまた
はグリセロールを添加して、処理することによって防止
されることが知られている。
によって、副生物の生成、不溶化などの変性を起こし、
その生物学的活性が低下することが知られている。そし
て、そのような変性は、凍結融解処理または凍結乾燥処
理を行う前に、その蛋白質溶液にアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デキストラン、デンプンなどの生物由来の
高分子化合物、アミノ酸、ポリエチレングリコールまた
はグリセロールを添加して、処理することによって防止
されることが知られている。
しかしながら、ヒトＳＯＤを医薬品として用いる場合に
は、ヒトにとって異種生物由来のアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デンプンなどは、それ自体がアレルギーを
引き起こすので好ましくない、また、ヒト由来のものを
使用するにしても、その由来がヒトであるが故にその入
手が困難であり、かつ高価であることから、その使用は
実用的ではない。
は、ヒトにとって異種生物由来のアルブミン、ＤＮＡ、
カラゲニン、デンプンなどは、それ自体がアレルギーを
引き起こすので好ましくない、また、ヒト由来のものを
使用するにしても、その由来がヒトであるが故にその入
手が困難であり、かつ高価であることから、その使用は
実用的ではない。
従来、ＳＯＤの安定な保存法としては、ウシ由来のＳＯ
Ｄ （商品名；オルゴテイン、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＤ
ａｔａ、社製）についての保存法（米国特許 第３゜６
３７．６４号）がある、この場合、ウシ由来のＳＯＤの
変性は、凍結乾燥処理によって２５％以上となる。しか
し、ウシ由来のＳＯＤの凍結乾燥処理前にペントース及
びヘキソース（例えば、ガラクトース、フルクトース、
フッコース、アラビノース、グルコース、マンノース、
スクロースなどの糖類）とウシ由来のＳＯＤとを混合し
て、処理することによって、ウシ由来のＳＯＤの変性が
防止されることが示されている。
Ｄ （商品名；オルゴテイン、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＤ
ａｔａ、社製）についての保存法（米国特許 第３゜６
３７．６４号）がある、この場合、ウシ由来のＳＯＤの
変性は、凍結乾燥処理によって２５％以上となる。しか
し、ウシ由来のＳＯＤの凍結乾燥処理前にペントース及
びヘキソース（例えば、ガラクトース、フルクトース、
フッコース、アラビノース、グルコース、マンノース、
スクロースなどの糖類）とウシ由来のＳＯＤとを混合し
て、処理することによって、ウシ由来のＳＯＤの変性が
防止されることが示されている。
しかしながら、ヒトＳＯＤの凍結乾燥処理では、ガラク
トース、アラビノース、グルコースなどの単糖のアルド
ース類とヒトＳＯＤとを混合して処理しても、陰イオン
交換クロマトグラフィーによる分析から、その変性が認
められるので（比較例３〜５）、単糖のアルドース類で
は、ヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥処理において、そ
の変性を防止するために使用する物質としては好ましく
ない。
トース、アラビノース、グルコースなどの単糖のアルド
ース類とヒトＳＯＤとを混合して処理しても、陰イオン
交換クロマトグラフィーによる分析から、その変性が認
められるので（比較例３〜５）、単糖のアルドース類で
は、ヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥処理において、そ
の変性を防止するために使用する物質としては好ましく
ない。
本発明の目的は、特定の糖類を使用して処理したヒトＳ
ＯＤの溶液を、凍結状態または凍結乾燥状態で安定に保
存する方法を提供することである。
ＯＤの溶液を、凍結状態または凍結乾燥状態で安定に保
存する方法を提供することである。
本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒトＳＯＤの保存において、二糖類、ケトー
ス類の単糖類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種
以上の糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することによ
って、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で安定
に保存することができることを見出し、本発明を完成し
た。
した結果、ヒトＳＯＤの保存において、二糖類、ケトー
ス類の単糖類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種
以上の糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することによ
って、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で安定
に保存することができることを見出し、本発明を完成し
た。
部ち、本発明は、
ヒトＳＯＤの保存において、二ｖｌ類、ケトース類の単
Ｉｉ類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種以上の
糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することを特徴とす
るヒトＳＯＤの安定保存法に関するものである。
Ｉｉ類、糖アルコール類のうちの少なくとも一種以上の
糖とヒトＳＯＤとを混合して、保存することを特徴とす
るヒトＳＯＤの安定保存法に関するものである。
本発明の好適態様は、糖の使用量が、ヒトＳＯＤ量の０
．０５〜１０倍、さらに好ましくは０．１〜６倍の重量
比であるのがよい。
．０５〜１０倍、さらに好ましくは０．１〜６倍の重量
比であるのがよい。
以下、本発明について、さらに詳しく説明する。
本発明におけるヒトＳＯＤとしては、ヒトの細胞、組織
、器官など（例えば、赤血球、肝臓、胎盤など）から抽
出精製されたＳＯＤ、遺伝子組換えによって微生物に生
産させたヒトＳＯＤと同一のアミノ酸配列を有するもの
などを挙げることができる。
、器官など（例えば、赤血球、肝臓、胎盤など）から抽
出精製されたＳＯＤ、遺伝子組換えによって微生物に生
産させたヒトＳＯＤと同一のアミノ酸配列を有するもの
などを挙げることができる。
本発明において、ヒトＳＯＤを凍結または凍結乾燥状態
で安定に保存するために用いる糖としては、糖アルコー
ル類（例えば、ソルビトール、マンニトール、イノシト
ール、リビトールなど）、−Ｊｉｍ （例、ｔば、スク
ロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、イソ
マルトース、セロビオース、など）、ケトース類の単１
１！（例えば、フルクトース、キシルロース、リブロー
ス、セドヘプツロースなど）などを挙げることができる
。
で安定に保存するために用いる糖としては、糖アルコー
ル類（例えば、ソルビトール、マンニトール、イノシト
ール、リビトールなど）、−Ｊｉｍ （例、ｔば、スク
ロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、イソ
マルトース、セロビオース、など）、ケトース類の単１
１！（例えば、フルクトース、キシルロース、リブロー
ス、セドヘプツロースなど）などを挙げることができる
。
そして、これらの糖を単独または混合して用いることが
できる。
できる。
ヒトＳＯＤと前記の糖との混合方法は、特に限定されず
、例えば、 （ａ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ ｍ、 ｇ ／ ｍ
Ｉ！、）に糖を直接添加した後によく混合してもよい
し、（ｂ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ｍｇ／ｍｆ）に
糖溶液を加えた後によく混合してもよいし、（ｃ）糖溶
液にヒトＳＯＤを直接添加した後によく混合してもよい
。
、例えば、 （ａ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ ｍ、 ｇ ／ ｍ
Ｉ！、）に糖を直接添加した後によく混合してもよい
し、（ｂ）ヒトＳＯＤ溶液（１〜１００ｍｇ／ｍｆ）に
糖溶液を加えた後によく混合してもよいし、（ｃ）糖溶
液にヒトＳＯＤを直接添加した後によく混合してもよい
。
なお、これらの操作は、０〜４０°Ｃ下、好ましくは０
〜１５℃下で行うのがよく、混合後の処理時間は、特に
制限されない。
〜１５℃下で行うのがよく、混合後の処理時間は、特に
制限されない。
本発明におけるヒトＳＯＤ溶液または糖溶液で用いる溶
媒は、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、
リン酸糧衝液などの緩衝液を用いることができる。
媒は、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、
リン酸糧衝液などの緩衝液を用いることができる。
このようにして調製した糖を含有するヒトＳＯＤ溶液は
、バイアル瓶などの適当な容器に適当量入れ、−８０〜
−１５°Ｃで凍結し、そのまま−８０〜−１５°Ｃで保
存するか、または減圧下（２００〜５００ｍＴ ｏ ｒ
ｒ）で乾燥して一８０〜１０°Ｃで保存する。このよ
うにして、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で
安定に保存することができる。
、バイアル瓶などの適当な容器に適当量入れ、−８０〜
−１５°Ｃで凍結し、そのまま−８０〜−１５°Ｃで保
存するか、または減圧下（２００〜５００ｍＴ ｏ ｒ
ｒ）で乾燥して一８０〜１０°Ｃで保存する。このよ
うにして、ヒトＳＯＤを凍結状態または凍結乾燥状態で
安定に保存することができる。
以下、本発明を参考例及び実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定す
るものではない。
する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定す
るものではない。
各実施例において、ポリアクリルアミド電気泳動試験、
高速ゲル濾過クロマトグラフィー試験及び陰イオン交換
クロマトグラフィー試験は、それぞれ以下に示すような
方法で行った。
高速ゲル濾過クロマトグラフィー試験及び陰イオン交換
クロマトグラフィー試験は、それぞれ以下に示すような
方法で行った。
■ポリアクリルアミド電気泳動試験
特定の糖類を混合し、処理したヒトＳＯＤの凍結または
凍結乾燥保存における副生物生成の分析（以下、電気泳
動分析という）を、レムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２
７，６８０ （１９７０））に準じて次の通りに行った
。
凍結乾燥保存における副生物生成の分析（以下、電気泳
動分析という）を、レムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２
７，６８０ （１９７０））に準じて次の通りに行った
。
濃縮ゲル濃度が３％、分離ゲル濃度が１２．５％のミニ
スラブゲル（縦；６０ｍｍ、横；Ｌｏｏｍｍ、分離部分
；４５ｍｍ。穴；１０個。）を作製し、還元変性処理し
た試料を２０μｇ／穴の割合で穴に入れ、２０ｍＡの一
定電流下で泳動後、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２
５０を用いてその泳動試料を染色した。分子量マーカー
としてファルマシア社製の電気泳動用のものを使用した
場合には、ヒトＳＯＤは２０ＫＤ（キロダルトン）（モ
ノマー）の位置に、また、副生物は４０ＫＤの位置に確
認される。
スラブゲル（縦；６０ｍｍ、横；Ｌｏｏｍｍ、分離部分
；４５ｍｍ。穴；１０個。）を作製し、還元変性処理し
た試料を２０μｇ／穴の割合で穴に入れ、２０ｍＡの一
定電流下で泳動後、コマジ−ブリリアントブルーＲ−２
５０を用いてその泳動試料を染色した。分子量マーカー
としてファルマシア社製の電気泳動用のものを使用した
場合には、ヒトＳＯＤは２０ＫＤ（キロダルトン）（モ
ノマー）の位置に、また、副生物は４０ＫＤの位置に確
認される。
■高速ゲル濾過クロマトグラフィー試験特定の糖類を混
合し、処理したヒｌ−３ＯＤの凍結または凍結乾燥保存
における副生物生成の高速ゲル濾過クロマトグラフィー
による分析（以下、ゲル濾過分析という）を、次の通り
に行った。
合し、処理したヒｌ−３ＯＤの凍結または凍結乾燥保存
における副生物生成の高速ゲル濾過クロマトグラフィー
による分析（以下、ゲル濾過分析という）を、次の通り
に行った。
カラムとしてＴＳＫ−３０００ＳＷ （東洋曹達層）、
溶出液として５０ｍＭリン酸ナトリウム−０，２Ｍ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ７）を用い、流速０．７ｍｊｌ！
／ｍｉｎで行った。分子量マーカーとしてオリエンタル
酵母社の高速ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた場合
には、ヒトＳＯＤは４０ＫＤの位置に確認され、副生物
は７９ＫＤの位置にＴａ認された。
溶出液として５０ｍＭリン酸ナトリウム−０，２Ｍ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ７）を用い、流速０．７ｍｊｌ！
／ｍｉｎで行った。分子量マーカーとしてオリエンタル
酵母社の高速ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた場合
には、ヒトＳＯＤは４０ＫＤの位置に確認され、副生物
は７９ＫＤの位置にＴａ認された。
■陰イオン交換クロマトグラフィー試験特定の糖類を混
合し、処理したヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥保存に
おける変化を、カラムとしてＴＳ−ＤＥＡＥ ５ＰＷ
（東洋曹達層）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによる分析（以下、ＤＥＡＥ分析という）で、次の通
りに行った。
合し、処理したヒトＳＯＤの凍結または凍結乾燥保存に
おける変化を、カラムとしてＴＳ−ＤＥＡＥ ５ＰＷ
（東洋曹達層）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによる分析（以下、ＤＥＡＥ分析という）で、次の通
りに行った。
カラムとしてＴＳ−ＤＥＡＥ ５ＰＷを用い、溶出液
としてＡ液〔２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８゜５）〕とＢ
ｉ（２ＱｍＭトリス酢酸−０，５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８，５））とを用いたリニアグラデイエンド法（Ｂ液
を７４分で０％から１５％とした。）によって、流速０
．８ｍｆ／ｍｉｎで行った。
としてＡ液〔２０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８゜５）〕とＢ
ｉ（２ＱｍＭトリス酢酸−０，５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８，５））とを用いたリニアグラデイエンド法（Ｂ液
を７４分で０％から１５％とした。）によって、流速０
．８ｍｆ／ｍｉｎで行った。
実施例１
０．３１ｍ１のヒトＳＯＤ溶液（ヒトＳＯＤ１００ｍｇ
／蒸留水１ｍ１）に７４ｍｇの糖アルコール類であるソ
ルビトールを加えた後に、蒸留水で全量を１ｍ２とした
。これをバイアル瓶に入れ、−２０℃で凍結した後、室
温下で融解し、前記試験法のゲル濾過分析（■）及びＤ
ＥＡＥ分析（■）で糖添加による凍結保存ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。
／蒸留水１ｍ１）に７４ｍｇの糖アルコール類であるソ
ルビトールを加えた後に、蒸留水で全量を１ｍ２とした
。これをバイアル瓶に入れ、−２０℃で凍結した後、室
温下で融解し、前記試験法のゲル濾過分析（■）及びＤ
ＥＡＥ分析（■）で糖添加による凍結保存ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。
ゲル濾過分析では、７９ＫＤの副生物が認められた。そ
して、その生成量は、連続５回の凍結融解で０． ＯＯ
７％、連続１０回の凍結融解で０．００８％であった。
して、その生成量は、連続５回の凍結融解で０． ＯＯ
７％、連続１０回の凍結融解で０．００８％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。
た。
実施例２
ソルビトールの代わりに塘アルコール類であるイノシト
ールを用いた以外は、実施例１と同様にして糖添加によ
る凍結保存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ールを用いた以外は、実施例１と同様にして糖添加によ
る凍結保存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
１４．０．０１１％であった。
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
１４．０．０１１％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。
た。
実施例３−
ソルビトールの代わりに二Ｉｉ類であるスクロースを用
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．００４．０．００８％であった。
、０．００４．０．００８％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。
た。
実施例４
ソルビトールの代わりに二糖類であるトレハロースを用
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
いた以外は、実施例１と同様にして糖添加による凍結保
存ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれＯ，Ｏ
Ｏ８，０，００７％であった。
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれＯ，Ｏ
Ｏ８，０，００７％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。
た。
実施例５
ソルビトールの代わりに二Ｗ類であるマルトースを用い
た以外は、実施例１と同様にして塘添加による凍結保存
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
た以外は、実施例１と同様にして塘添加による凍結保存
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
０４．０． ＯＯ７％であった。
、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．０
０４．０． ＯＯ７％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た。
た。
比較例１
ソルビトールを用いない以外は、実施例１と同様にして
糖無添加による凍結保存し）ＳＯＤの安定性を検討した
。
糖無添加による凍結保存し）ＳＯＤの安定性を検討した
。
ゲル濾過分析で認められた’７９ＫＤの副生物の生成量
は、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．
０１９．０．０２８％であった。
は、連続５回、連続１０回の凍結融解で、それぞれ０．
０１９．０．０２８％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかう
た。
た。
実施例１〜５における糖添加、及び比較例１における塘
無添加による凍結保存ヒトＳＯＤの安定性についての結
果を、第１表に示す。
無添加による凍結保存ヒトＳＯＤの安定性についての結
果を、第１表に示す。
第１表
実施例６
０、５ ｍ ｌのヒトＳＯＤ？８液（ヒトＳＯＤ １０
０ｍｇ／Ｎ留水１ｍｊり にｌ ＯＯｍｇ（７）１ｉｉ
フルコール類であるソルビトールを加えた後に、蒸留水
で全量を１ｍ２とした。これをバイアル瓶に入れ、−８
Ｑ℃で凍結した後、減圧下（２００〜５００ｍＴｏｒｒ
）で−晩乾燥した。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留
水に溶解した後、凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。
０ｍｇ／Ｎ留水１ｍｊり にｌ ＯＯｍｇ（７）１ｉｉ
フルコール類であるソルビトールを加えた後に、蒸留水
で全量を１ｍ２とした。これをバイアル瓶に入れ、−８
Ｑ℃で凍結した後、減圧下（２００〜５００ｍＴｏｒｒ
）で−晩乾燥した。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留
水に溶解した後、凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０８％であった。
、０．０８％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第１図）。
た（第１図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は、認められなかった。
物は、認められなかった。
実施例７
ソルビトールの代わりに糖アルコール類であるマンニト
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた’７９ＫＤの副生物の生成量
は、０．２３％であった。
は、０．２３％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第２図）。
た（第２図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物が認められた。
物が認められた。
実施例８
ソルビトールの代わりに糖アルコール類であるイノシト
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして塘添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ールを用いた以外は、実施例６と同様にして塘添加によ
る凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．１１％であった。
、０．１１％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第３図）。
た（第３図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例９
ソルビトールの代わりに二糖類であるスクロースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０４％であった。
、０．０４％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第４図）。
た（第４図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例１０
ソルビトールの代わりに二糖類であるトレハロースを用
いた以外は、実施例６と同様にして塘添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
いた以外は、実施例６と同様にして塘添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０５％であった。
、０．０５％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒｌ−３ＯＤの変性は認められなか
った（第５図）。
った（第５図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例１１
ソルビトールの代わりに二糖類であるマル） −スを用
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。
、０．０１％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第６図）。
た（第６図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例１２
ソルビトールの代わりに二糖類であるラクトースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０％であった。
、０％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第７図）。
た（第７図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例１３
ソルビトールの代わりにケトース類の単糖類であるフル
クトースを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加
による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
クトースを用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加
による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。
、０．０１％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第８図）。
た（第８図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
比較例２ ・
ソルビトールを用いない以外は、実施例６と同様にして
糖無添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した
。
糖無添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した
。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．４５％であった。
、０．４５％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性は認められなかっ
た（第１２図）。
た（第１２図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物が認められた。
物が認められた。
比較例３
ソルビトールの代わりに単１！、［であるアラビノース
を用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍
結乾燥ヒトＳｏＤの安定性を検討した。
を用いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍
結乾燥ヒトＳｏＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０３％であった。
、０．０３％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第９
図）。
図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
比較例４
ソルビトールの代わりに単複類であるグルコースを用い
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
た以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾燥
ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１％であった。
、０．０１％であった。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第１
０図）。
０図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
比較例５
ソルビトールの代わりに単糖類であるガラクトースを用
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
いた以外は、実施例６と同様にして糖添加による凍結乾
燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０６％であうた。
、０．０６％であうた。
ＤＥＡＥ分析では、ヒトＳＯＤの変性が認めらた（第１
１図）。
１図）。
電気泳動分析においては、分子量が４０ＫＤを示す副生
物は認められなかった。
物は認められなかった。
実施例６〜１３及び比較例３〜５における糖添加、及び
比較例２における糖無添加による凍結乾燥保存ヒ、）Ｓ
ＯＤの安定性についての結果を、第２表に示す。
比較例２における糖無添加による凍結乾燥保存ヒ、）Ｓ
ＯＤの安定性についての結果を、第２表に示す。
（以下、余白）
第２表
実施例１４
０．５ ｍ ｌのヒトＳＯＤ溶液（ヒトＳＯＤ １００
ｍｇ／薫留水１ｍ１）に５ｍｇの糖アルコール類である
ソルビトールを加えた後に、蒸留水で全量をＬｍｌとし
た。これをバイアル瓶に入れ、−２０°Ｃで凍結した後
、減圧下（２００−５００ｍＴｏｒｒ）で−晩乾燥した
。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留水に溶解した後、
凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ｍｇ／薫留水１ｍ１）に５ｍｇの糖アルコール類である
ソルビトールを加えた後に、蒸留水で全量をＬｍｌとし
た。これをバイアル瓶に入れ、−２０°Ｃで凍結した後
、減圧下（２００−５００ｍＴｏｒｒ）で−晩乾燥した
。得られた凍結乾燥ヒトＳＯＤを蒸留水に溶解した後、
凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．２３６％であった。
、０．２３６％であった。
実施例１５
ソルビトールを１２．５ ｍ ｇ用いた以外は１．実施
例１４と同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。
例１４と同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの
安定性を検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．１０４％であった。
、０．１０４％であった。
実施例１６
ソルビトールを２５ｍｇ用いた以外は、実施例１４と同
様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳ０Ｄの安定性を検
討した。
様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳ０Ｄの安定性を検
討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０６５％であった。
、０．０６５％であった。
実施例１７
ソルビトールを５０ｍｇ用いた以外は、実施例１４と同
様にして塘添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検
討した。
様にして塘添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検
討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０３８％であった。
、０．０３８％であった。
実施例１８
ソルビトールを１００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．０１２％であった。
、０．０１２％であった。
実施例１９
ソルビトールを２００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を
検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０． ｆ） ２６％であった。
、０． ｆ） ２６％であった。
実施例２０
ソルビトールを３００ｍｇ用いた以外は、実施例１４と
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトｓＯＤの安定性を
検討した。
同様にして糖添加による凍結乾燥ヒトｓＯＤの安定性を
検討した。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０％であった。
、０％であった。
比較例６
ソルビトールを用いない以外は、実施例１４と同様にし
て媚態添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。
て媚態添加による凍結乾燥ヒトＳＯＤの安定性を検討し
た。
ゲル濾過分析で認められた７９ＫＤの副生物の生成量は
、０．４２５％であった。
、０．４２５％であった。
実施例１４〜２０における糖添加及び比較例６における
媚態添加による凍結乾燥保存ヒｌ−３ＯＤの安定性につ
いての結果を、第３表及び図１３に示す。
媚態添加による凍結乾燥保存ヒｌ−３ＯＤの安定性につ
いての結果を、第３表及び図１３に示す。
第３表
〔発明の効果〕
本発明の方法（即ち、二糖類、ケトース類の単糖類、糖
アルコール類のうちの少なくとも一種以上の糖とヒトＳ
ＯＤとを混合し、処理して得られた溶液を凍結または凍
結乾燥する方法）によって、ヒｌ−３ＯＤを凍結または
凍結乾燥状態で安定に保存することができる。
アルコール類のうちの少なくとも一種以上の糖とヒトＳ
ＯＤとを混合し、処理して得られた溶液を凍結または凍
結乾燥する方法）によって、ヒｌ−３ＯＤを凍結または
凍結乾燥状態で安定に保存することができる。
４、図面の説明
第１図は、実施例６に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。
す。
第２図は、実施例７に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。
す。
第３図は、実施例８に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。
す。
第４図は、実施例９に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。
す。
第５図は、実施例１０に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第６図は、実施例１１に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第７図は、実施例１２に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第８図は、実施例１３に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第９図は、比較例３に記載したＤＥＡＥ分析の結果を示
す。
す。
第１Ｏ図は、比較例４に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第１１図は、比較例５に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第１２図は、比較例２に記載したＤＥＡＥ分析の結果を
示す。
示す。
第１３図は、実施例１４〜２０における塘添加及び比較
例６における媚態添加による凍結乾燥保存ヒトＳＯＤの
安定性の結果を示す。
例６における媚態添加による凍結乾燥保存ヒトＳＯＤの
安定性の結果を示す。
特許出願人 宇部興産株式会社
第１図
第２図
第３図
第４図
第５図
第６図
第７図
第８図
第９図
第１０図
第１１図
第１２図
第１３図
ソルビトール／ヒトＳ００ （Ｗ／ｗ）手続補正書（方
式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６３−１３５４５７号 ２、 発明の名称 ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定
保存方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ７５５ 山口県宇部市西本町１丁目１２番３２号４、補正命令の
日付 発送日：昭和６３年８月３０日 ５、補正により増加する発明の数 （なし）６．補正
の対象 図面 ７、補正の内容 （１） 図面の第１図〜第１３図を別紙の通り補正す
る。
式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６３−１３５４５７号 ２、 発明の名称 ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定
保存方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ７５５ 山口県宇部市西本町１丁目１２番３２号４、補正命令の
日付 発送日：昭和６３年８月３０日 ５、補正により増加する発明の数 （なし）６．補正
の対象 図面 ７、補正の内容 （１） 図面の第１図〜第１３図を別紙の通り補正す
る。
以上
第１図
第２図
第３図
第４図
第５図
第６図
第７図
第８図
第９図
第１０図
第１１図
第１２図
第１３図
Claims (1)
- ヒトＣｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ（以下
、ヒトＳＯＤと略す）の保存において、ヒトＳＯＤと二
糖類、ケトース類の単糖類、糖アルコール類のうちの少
なくとも一種以上の糖とを混合して、保存することを特
徴とするヒトＳＯＤの安定保存法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13545788A JPH01304882A (ja) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13545788A JPH01304882A (ja) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304882A true JPH01304882A (ja) | 1989-12-08 |
Family
ID=15152160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13545788A Pending JPH01304882A (ja) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01304882A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464614A (en) * | 1992-11-27 | 1995-11-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Stabilized superoxide dismutase (SOD) composition |
| WO2001000230A1 (fr) * | 1999-06-24 | 2001-01-04 | Ltt Institute Co., Ltd. | Composition medicamenteuse contenant une superoxyde dismutase modifiee par lecithine |
| EP0868916A3 (en) * | 1997-03-04 | 2004-09-15 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US363764A (en) * | 1887-05-24 | Washing fluid | ||
| JPS589688A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-01-20 | Toyobo Co Ltd | 安定な酵素組成物 |
| JPS589638A (ja) * | 1981-07-07 | 1983-01-20 | 小竹 圭介 | 除草剤塗布器 |
| JPH0196107A (ja) * | 1987-10-07 | 1989-04-14 | Kanebo Ltd | 皮膚化粧料 |
-
1988
- 1988-06-03 JP JP13545788A patent/JPH01304882A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US363764A (en) * | 1887-05-24 | Washing fluid | ||
| JPS589688A (ja) * | 1981-07-06 | 1983-01-20 | Toyobo Co Ltd | 安定な酵素組成物 |
| JPS589638A (ja) * | 1981-07-07 | 1983-01-20 | 小竹 圭介 | 除草剤塗布器 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464614A (en) * | 1992-11-27 | 1995-11-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Stabilized superoxide dismutase (SOD) composition |
| EP0868916A3 (en) * | 1997-03-04 | 2004-09-15 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| US7186824B2 (en) | 1997-03-04 | 2007-03-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity |
| WO2001000230A1 (fr) * | 1999-06-24 | 2001-01-04 | Ltt Institute Co., Ltd. | Composition medicamenteuse contenant une superoxyde dismutase modifiee par lecithine |
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