JPH01304887A - クローニングベクター - Google Patents
クローニングベクターInfo
- Publication number
- JPH01304887A JPH01304887A JP63136225A JP13622588A JPH01304887A JP H01304887 A JPH01304887 A JP H01304887A JP 63136225 A JP63136225 A JP 63136225A JP 13622588 A JP13622588 A JP 13622588A JP H01304887 A JPH01304887 A JP H01304887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna fragment
- micromonospora
- cloning vector
- plasmid
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製可能な
りローニングベクターに関する。従って本発明は、遺伝
子組換え技術をミクロモノスポラ属菌に適用する際のベ
クターを提供する。
りローニングベクターに関する。従って本発明は、遺伝
子組換え技術をミクロモノスポラ属菌に適用する際のベ
クターを提供する。
従来の技術
従来、放線菌における組換えＤＮＡ技術の開発は、もっ
ばらストレプトマイセス属菌において検討されている（
Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒら；カレント・トピックス・
イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ
（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ！Ｊｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ １ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、
９６．６９−９５ （１９８２））。
ばらストレプトマイセス属菌において検討されている（
Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒら；カレント・トピックス・
イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ
（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ！Ｊｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ １ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、
９６．６９−９５ （１９８２））。
発明が解決しようとする課題
従来検討されているストレプトマイセス属菌由来のベク
ターは、他の属の放線菌では自律複製できなかったり、
安定に保持されないため〔ジャーナル・オブ・アンチビ
オティクス（Ｊ、＾ｎｔｉｂ＋ｏｔｉｃｓ）旦 Ｎα４
．５８３〜５８５ （１９８ｇ）） 、遺伝子のクロー
ニングなどには適用することができなかった。ストレプ
トマイセス属菌以外の放線菌、特にミクロモノスポラ属
菌は、フォーティミシン、サガミシン。
ターは、他の属の放線菌では自律複製できなかったり、
安定に保持されないため〔ジャーナル・オブ・アンチビ
オティクス（Ｊ、＾ｎｔｉｂ＋ｏｔｉｃｓ）旦 Ｎα４
．５８３〜５８５ （１９８ｇ）） 、遺伝子のクロー
ニングなどには適用することができなかった。ストレプ
トマイセス属菌以外の放線菌、特にミクロモノスポラ属
菌は、フォーティミシン、サガミシン。
ジェンタミシンなどの抗生物質を生産する菌として知ら
れており、これらの物質の生合成系の解明は、該物質を
製造するうえにおいて非常に重要になってきている。し
かし、ミクロモノスポラ属菌において自律複製可能で、
形質転換効率がストレプトマイセス属の遺伝子組換え系
に匹敵するようなベクターが開発されていないため、ミ
クロモノスポラ属菌において遺伝子組換え技術が適用で
きなかった。従ってミクロモノスポラ属菌の宿主−ベク
ター系の開発が望まれている。
れており、これらの物質の生合成系の解明は、該物質を
製造するうえにおいて非常に重要になってきている。し
かし、ミクロモノスポラ属菌において自律複製可能で、
形質転換効率がストレプトマイセス属の遺伝子組換え系
に匹敵するようなベクターが開発されていないため、ミ
クロモノスポラ属菌において遺伝子組換え技術が適用で
きなかった。従ってミクロモノスポラ属菌の宿主−ベク
ター系の開発が望まれている。
課題を解決するための手段
本発明者は、ミクロモノスポラ属菌の宿主−ベクター系
を開発するために、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複
製可能なプラスミドを種々検討した。その結果、ミクロ
モノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣＣ３１０１０
およびミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ３６２
９−４ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１４）より、ミクロ
モノスポラ属菌種中で自律複製可能なプラスミドを分離
した。
を開発するために、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複
製可能なプラスミドを種々検討した。その結果、ミクロ
モノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣＣ３１０１０
およびミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ３６２
９−４ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１４）より、ミクロ
モノスポラ属菌種中で自律複製可能なプラスミドを分離
した。
さらに、これらのプラスミドの自律複製能を利用し、適
当なベクターマーカーを組み込むことにより、ミクロモ
ノスポラ属菌種のクローニングベクターを開発した。
当なベクターマーカーを組み込むことにより、ミクロモ
ノスポラ属菌種のクローニングベクターを開発した。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明は、ミクロモノスポラ属菌種中またはミクロモノ
スポラ属菌および大腸菌の両方で自律複製可能なプラス
ミドを提供する。
スポラ属菌および大腸菌の両方で自律複製可能なプラス
ミドを提供する。
ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製可能なプラスミド
としては、具体的には、ミクロモノスポラ・オリポアス
テロスポラＡＴＣＣ３１０１０由来のプラスミドｐＭＯ
１０１およびミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ
３６２９．−４ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１４）由来
のプラスミドｐＭ。
としては、具体的には、ミクロモノスポラ・オリポアス
テロスポラＡＴＣＣ３１０１０由来のプラスミドｐＭＯ
１０１およびミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ
３６２９．−４ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１４）由来
のプラスミドｐＭ。
２０．１があげられる。これらのプラスミドは、プラス
ミド（Ｐｌａｓｍｉｄ） １２．１９ （１９８４）
に記載の方法に従ってこれらを保持する菌体から容易に
分離できる。
ミド（Ｐｌａｓｍｉｄ） １２．１９ （１９８４）
に記載の方法に従ってこれらを保持する菌体から容易に
分離できる。
プラスミドｐＭｏ ｌ ０１は、分子量が約２５メガダ
ルトンの環状ＤＮＡである。各種制限酵素に対する感受
性部位数を第１表に示す。ｐＭＯ１０１はＩｌ：ｃｏＲ
ＩおよびＢｇｊｌｌに対する感受性部位は有していない
。
ルトンの環状ＤＮＡである。各種制限酵素に対する感受
性部位数を第１表に示す。ｐＭＯ１０１はＩｌ：ｃｏＲ
ＩおよびＢｇｊｌｌに対する感受性部位は有していない
。
第１表 ｐ＼４０１０１の制限酵素による切断特性制限
酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｈ
ｉｎｄｕ １ ３８．５ Ｂａｍ）ＩＩ ５ １．０．４．０．７．８
．８．５．１１１１Ｂｃｆｆ Ｉ ３ ８．
５．１０．５．１９Ｓａｃ １ １ ３８．
５ Ｘｂａ Ｉ ３ ３．１．１１．０．２４
Ｘｈｏ Ｉ １ ３８．５Ｋｐｎ Ｉ
６ １．４． １．６．
３、ｌ、 ６，５． １１．５． １４プラスミドｐ
Ｍ０２０１は、アガロース電気泳動法で４０キロベース
（Ｋｂ）以上を示す大きさで、また臭化エチジウム・塩
化セシウム密度匂配遠心分離法で染色体Ｄ Ｎ Ａの下
方に明瞭なバンドを与えることから、閉環状ＤＮＡ構造
を持つと推定される。しかし、種々の制限酵素による切
断はアガロース電気泳動において多数の階段状のＤＮＡ
バンドを与えることから、このプラスミドはかなり大型
で、かつ２種類以上から成るプラスミドの混合物と考え
られる。従って、ｐＭＯ２０１の構造を決定することは
できなかったが、ｐＭＯ２０１が有しているミクロモノ
スポラ属菌種中での自律複製能を利用して、種々のベク
ターを構築することができる。
酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｈ
ｉｎｄｕ １ ３８．５ Ｂａｍ）ＩＩ ５ １．０．４．０．７．８
．８．５．１１１１Ｂｃｆｆ Ｉ ３ ８．
５．１０．５．１９Ｓａｃ １ １ ３８．
５ Ｘｂａ Ｉ ３ ３．１．１１．０．２４
Ｘｈｏ Ｉ １ ３８．５Ｋｐｎ Ｉ
６ １．４． １．６．
３、ｌ、 ６，５． １１．５． １４プラスミドｐ
Ｍ０２０１は、アガロース電気泳動法で４０キロベース
（Ｋｂ）以上を示す大きさで、また臭化エチジウム・塩
化セシウム密度匂配遠心分離法で染色体Ｄ Ｎ Ａの下
方に明瞭なバンドを与えることから、閉環状ＤＮＡ構造
を持つと推定される。しかし、種々の制限酵素による切
断はアガロース電気泳動において多数の階段状のＤＮＡ
バンドを与えることから、このプラスミドはかなり大型
で、かつ２種類以上から成るプラスミドの混合物と考え
られる。従って、ｐＭＯ２０１の構造を決定することは
できなかったが、ｐＭＯ２０１が有しているミクロモノ
スポラ属菌種中での自律複製能を利用して、種々のベク
ターを構築することができる。
上記のプラスミドは、その存在を識別するために必要な
ベクターマーカーを有していない。ミクロモノスポラ属
菌における宿主−ベクター系を確立するためには、ベク
ターの存在を識別しうる適当なベクターマーカーを有す
るクローニングベクターの方が望ましい。このようなり
ローニングベクターは、上記のプラスミドのミクロモノ
スポラ属菌種中での自律複製能を利用し、適当なベクタ
ーマーカーを組み込むことにより構築することができる
。
ベクターマーカーを有していない。ミクロモノスポラ属
菌における宿主−ベクター系を確立するためには、ベク
ターの存在を識別しうる適当なベクターマーカーを有す
るクローニングベクターの方が望ましい。このようなり
ローニングベクターは、上記のプラスミドのミクロモノ
スポラ属菌種中での自律複製能を利用し、適当なベクタ
ーマーカーを組み込むことにより構築することができる
。
ベクターマーカーとしては、ミクロモノスポラ、寓菌種
中で遺伝形質が発現される遺伝子を含むＤＮＡ断片であ
ればよい。具体的には、ミクロモノスポラ・エスピーＭ
Ｋ−５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１３）由来のネオマイ
シン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片があげられる。好適に
は、約３Ｋｂの制限酵素Ｂｇｊ！ｎ断片ＤＮＡＭ片でか
つ制限酵素に対する感受性部位数がＫｌ）ｎＩ １．
ＢａｍＨＩ３、Ｐｓｔｌ ２，５ａｃｌ ２．Ｃ１
’ａＩ １゜Ｘｂａｌ １、Ｘｈｏｌ １．ＢＣ
β１１で特徴づけられるＤ Ｎ Ａ断片、約３Ｋｂの制
限酵素）３ａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対
する感受性部位数がＰｓｔＩ １．、Ｘｈｏｉ ｌ
。
中で遺伝形質が発現される遺伝子を含むＤＮＡ断片であ
ればよい。具体的には、ミクロモノスポラ・エスピーＭ
Ｋ−５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１３）由来のネオマイ
シン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片があげられる。好適に
は、約３Ｋｂの制限酵素Ｂｇｊ！ｎ断片ＤＮＡＭ片でか
つ制限酵素に対する感受性部位数がＫｌ）ｎＩ １．
ＢａｍＨＩ３、Ｐｓｔｌ ２，５ａｃｌ ２．Ｃ１
’ａＩ １゜Ｘｂａｌ １、Ｘｈｏｌ １．ＢＣ
β１１で特徴づけられるＤ Ｎ Ａ断片、約３Ｋｂの制
限酵素）３ａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対
する感受性部位数がＰｓｔＩ １．、Ｘｈｏｉ ｌ
。
５ａｃＩ １，５ｐｈＩ １で特徴づけられるＤＮ
Ａ断片または約１．５ Ｋ ｂの制限酵素ＢａｍＨＩ／
５ａｃＩ切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対する感受性
部位数がＰｓｔｌ １．Ｘｈｏｌ １で特徴づけら
れるＤＮＡ断片があげられる。
Ａ断片または約１．５ Ｋ ｂの制限酵素ＢａｍＨＩ／
５ａｃＩ切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対する感受性
部位数がＰｓｔｌ １．Ｘｈｏｌ １で特徴づけら
れるＤＮＡ断片があげられる。
ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製可能で、その存在
を識別しうる適当なベクターマーカーを有するクローニ
ングベクターは、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製
可能なプラスミドを、その自律複製能を欠損しないよう
な制限酵素切断部位で切断し、適当なベクターマーカー
と同一の切断末端を利用して組み換えることにより構築
できろ。
を識別しうる適当なベクターマーカーを有するクローニ
ングベクターは、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製
可能なプラスミドを、その自律複製能を欠損しないよう
な制限酵素切断部位で切断し、適当なベクターマーカー
と同一の切断末端を利用して組み換えることにより構築
できろ。
プラスミドｐＭｏ １０１またはｐＭＯ２０１のミクロ
モノスポラ属菌種中での自律ｆｆ１ｌｕ能を担うＤＮＡ
断片と、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ＝５０由来
のネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組み換
えて、種々のクローニングベクターを構築することがで
きるが、具体的には、ｐＭ○１１６、ｐＭＯ１２６，ｐ
ＭＯ１３３，ｐＭＯ１３６またはｐ ＭＯ２１７があげ
られる。
モノスポラ属菌種中での自律ｆｆ１ｌｕ能を担うＤＮＡ
断片と、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ＝５０由来
のネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組み換
えて、種々のクローニングベクターを構築することがで
きるが、具体的には、ｐＭ○１１６、ｐＭＯ１２６，ｐ
ＭＯ１３３，ｐＭＯ１３６またはｐ ＭＯ２１７があげ
られる。
プラスミドｐＭＯ１１６，ｐＭＯ１２６，ｐＭ。
１３３またはｐＭＯ１３６は、ｐＭＯ１０１の自律複製
能を利用して、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−
５０由来のネオマイシン耐性遺伝子を含む上記のＤＮＡ
断片をそれぞれ組み換えて構築したクローニングベクタ
ーである。各プラスミドの各種制限酵素に対する感受性
部位数を、それぞれ第２表〜第５表に示す。ｐＭＯｉ１
６はＥｃｏＲＩおよび）（ｉｎｄｌｌＩに対する感受性
部位を、Ｉ） Ｍ ０１２６はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌ
Ｉｌ、Ｂｇｊ！ＩＩ。
能を利用して、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−
５０由来のネオマイシン耐性遺伝子を含む上記のＤＮＡ
断片をそれぞれ組み換えて構築したクローニングベクタ
ーである。各プラスミドの各種制限酵素に対する感受性
部位数を、それぞれ第２表〜第５表に示す。ｐＭＯｉ１
６はＥｃｏＲＩおよび）（ｉｎｄｌｌＩに対する感受性
部位を、Ｉ） Ｍ ０１２６はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌ
Ｉｌ、Ｂｇｊ！ＩＩ。
ＣβａｌおよびＫｐｎｌに対する感受性部位を、ｐＭｏ
１３３はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｕおよびＢｇｊ！Ｉｆ
に対する感受性部位を、ｐＭｏ １３６はＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩ［、ＢｃｌｌｌおよびＣｊ！ａｌに対する感
受性部位を有していない。
１３３はＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｕおよびＢｇｊ！Ｉｆ
に対する感受性部位を、ｐＭｏ １３６はＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄＩ［、ＢｃｌｌｌおよびＣｊ！ａｌに対する感
受性部位を有していない。
第２表 ｐＭＯ１１６の制限酵素による切断特性制限酵
素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａ
ｍＨＩ ２ １．０．５．９８ｇβＩ
Ｉ １ ６．９Ｂｃｊ！１ １
６．９Ｐｓｔ Ｉ ２
１．０．５．９ＳａｃＩ 、２ ０゜３
５．６．５Ｘｂａ Ｉ ２ ３．０
．３．９Ｘｈｏ Ｉ ２ ２．４．
４．５Ｃｆａｌ １ ６．９Ｋｐｎ
Ｉ １ ６．９Ｍ１ｕ Ｉ
１ ６．９第３表 ｐＭｏ １２６の制限
酵素による切断特性制限酵素 切断箇所 生じるＤＮ
Ａ断片の長さ（Ｋｂ）ＢａｍｌｌＩ １
７．２Ｂｃβ１ １ ７．２ Ｐｓｔ Ｉ ２ １．０．６．２Ｓ
ａＣＩ １ ７．２Ｘｂａ Ｉ
２ ３．１．４．１Ｘｈｏ Ｉ
３ １．８．２．４．３．０Ｍ１ｕ Ｉ
１ ７．２ｓｐｈｒ １
７．２第４表 ｐＭｏ ｌ ３３の制限酵素に
よる切断特性制限酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片
の長さ（Ｋｂ）Ｂｃｌｌｌ １ ２２ Ｓａｃ Ｉ ３ ０．３５．７．１．１５
Ｘｂａ Ｉ ４ ２．７．３．１．５．７
．１０．９Ｘｈｏ Ｉ ２ ５．０．１７
ｃｔａ Ｉ ２ ２．４．２０Ｋｐｎ
Ｉ ３ ３．４．６．６．１２．４第５表
ｐＭｏ １３６の制限酵素による切断特性制限酵素 切
断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａｍ）ｌ
Ｉ １ ７． ＩＢｇｊ！ｎ
１ ７．ＩＰｓｔ Ｉ ２１．０
．６．１Ｓａｃ Ｉ １ ７．ＩＸ
ｂａ Ｉ １ ７゜ＩＸｈｏ Ｉ
２ ３．５．３．６！Ｊｌｕｌ
１ ７，１プラＸミドｐＭＯ２１Ｔは、
ｐＭＯ２０１の自律複製能を利用して、ミクロモノスポ
ラ・エスピー ＭＫ−５０由来のネオマイシン耐性遺
伝子を含む約３ＫｂのＢｇｌ ｍ切断ＤＮＡ断片を組み
込むことにより構築したクローニングベクターである。
素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａ
ｍＨＩ ２ １．０．５．９８ｇβＩ
Ｉ １ ６．９Ｂｃｊ！１ １
６．９Ｐｓｔ Ｉ ２
１．０．５．９ＳａｃＩ 、２ ０゜３
５．６．５Ｘｂａ Ｉ ２ ３．０
．３．９Ｘｈｏ Ｉ ２ ２．４．
４．５Ｃｆａｌ １ ６．９Ｋｐｎ
Ｉ １ ６．９Ｍ１ｕ Ｉ
１ ６．９第３表 ｐＭｏ １２６の制限
酵素による切断特性制限酵素 切断箇所 生じるＤＮ
Ａ断片の長さ（Ｋｂ）ＢａｍｌｌＩ １
７．２Ｂｃβ１ １ ７．２ Ｐｓｔ Ｉ ２ １．０．６．２Ｓ
ａＣＩ １ ７．２Ｘｂａ Ｉ
２ ３．１．４．１Ｘｈｏ Ｉ
３ １．８．２．４．３．０Ｍ１ｕ Ｉ
１ ７．２ｓｐｈｒ １
７．２第４表 ｐＭｏ ｌ ３３の制限酵素に
よる切断特性制限酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片
の長さ（Ｋｂ）Ｂｃｌｌｌ １ ２２ Ｓａｃ Ｉ ３ ０．３５．７．１．１５
Ｘｂａ Ｉ ４ ２．７．３．１．５．７
．１０．９Ｘｈｏ Ｉ ２ ５．０．１７
ｃｔａ Ｉ ２ ２．４．２０Ｋｐｎ
Ｉ ３ ３．４．６．６．１２．４第５表
ｐＭｏ １３６の制限酵素による切断特性制限酵素 切
断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａｍ）ｌ
Ｉ １ ７． ＩＢｇｊ！ｎ
１ ７．ＩＰｓｔ Ｉ ２１．０
．６．１Ｓａｃ Ｉ １ ７．ＩＸ
ｂａ Ｉ １ ７゜ＩＸｈｏ Ｉ
２ ３．５．３．６！Ｊｌｕｌ
１ ７，１プラＸミドｐＭＯ２１Ｔは、
ｐＭＯ２０１の自律複製能を利用して、ミクロモノスポ
ラ・エスピー ＭＫ−５０由来のネオマイシン耐性遺
伝子を含む約３ＫｂのＢｇｌ ｍ切断ＤＮＡ断片を組み
込むことにより構築したクローニングベクターである。
各種制限酵素に対する感受性部位数を第６表に示す。ｐ
ＭＯ２１７はＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎｄ■に対する感受
性部位を有していない。
ＭＯ２１７はＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎｄ■に対する感受
性部位を有していない。
第６表 ｐＭ○２１７の制限酵素による切断特性制限酵
素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａ
ｍＨＩ ６ １．０．１．１．１．５．１．
７．１．８．５．５８ｇｆｆ ｔＩ ２ ３
．０．９．６ＢｃβＩ ５ ０．６０，０．
７５，２．肌４．１，４．３Ｐｓｔ Ｉ ５
０．９０．１．０．１．肌４．０．５．４Ｓａｃ
Ｉ ５ ０．３５．１．０． １．９．２
．２，７．ＩＸｂａｌ １ １２．６ Ｘｈｏ Ｉ ２ ５．８．６．８１ａｌ
３ ３．３，４．６，４．７Ｋｐｎｌ
３ ０．４０．５．６．６．６ＳｐｈＩ
１ １２．６ さらに本発明は、ミクロモノスポラ属菌および大腸菌の
両方で自律複製可能なンヤトルベクターを提供する。こ
のシャトルベクターは、上記のミクロモノスポラ属菌種
中で自律複製可能なプラスミドと、大腸菌中で自律複製
可能なプラスミドを組み換えることにより構築すること
ができる。シャトルベクターは、放線菌由来の遺伝子を
生育の仔い放線菌を用いずに大腸菌を用いて増幅させる
ことができ、このことにより遺伝子の解析や試験管内変
異を容易に行うことができる。
素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）Ｂａ
ｍＨＩ ６ １．０．１．１．１．５．１．
７．１．８．５．５８ｇｆｆ ｔＩ ２ ３
．０．９．６ＢｃβＩ ５ ０．６０，０．
７５，２．肌４．１，４．３Ｐｓｔ Ｉ ５
０．９０．１．０．１．肌４．０．５．４Ｓａｃ
Ｉ ５ ０．３５．１．０． １．９．２
．２，７．ＩＸｂａｌ １ １２．６ Ｘｈｏ Ｉ ２ ５．８．６．８１ａｌ
３ ３．３，４．６，４．７Ｋｐｎｌ
３ ０．４０．５．６．６．６ＳｐｈＩ
１ １２．６ さらに本発明は、ミクロモノスポラ属菌および大腸菌の
両方で自律複製可能なンヤトルベクターを提供する。こ
のシャトルベクターは、上記のミクロモノスポラ属菌種
中で自律複製可能なプラスミドと、大腸菌中で自律複製
可能なプラスミドを組み換えることにより構築すること
ができる。シャトルベクターは、放線菌由来の遺伝子を
生育の仔い放線菌を用いずに大腸菌を用いて増幅させる
ことができ、このことにより遺伝子の解析や試験管内変
異を容易に行うことができる。
大腸菌中で自律複製可能なプラスミドとしては、例えば
、ｐＵｃ１９ｃジー７ （Ｇｅｎｅ） ３３．１０３（
１９８５）） 、 Ｉ） ＢＲ３２２［ジーｙ （Ｇ
ｅｎｅ） ２２．２７７（１９８３））、Ｉ）ＡＣＹＣ
１８４Ｃジャーナル・オブ／ ｓｌタテリオロジイ （
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）旦４．１１４１（１９７
８） ：］などがあげられる。
、ｐＵｃ１９ｃジー７ （Ｇｅｎｅ） ３３．１０３（
１９８５）） 、 Ｉ） ＢＲ３２２［ジーｙ （Ｇ
ｅｎｅ） ２２．２７７（１９８３））、Ｉ）ＡＣＹＣ
１８４Ｃジャーナル・オブ／ ｓｌタテリオロジイ （
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）旦４．１１４１（１９７
８） ：］などがあげられる。
ミクロモノスポラ属菌種中での自律複製能を担うＤＮＡ
断片と、大腸菌での自律複製能を担うＤＮＡ断片とを、
同一の切断末端を利用して組み換えることにより、両菌
種中で自律複製可能なシャトルベクターを構築すること
ができる。具体的には、ミクロモノスポラ属菌種中で自
律複製可能なプラスミドｐＭｏ １３６と、大腸菌で自
律復製可能なプラスミドｐＵｃ１９とを組み換えて構築
したプラスミドｐＭＥＤｌ ０１があげられる。
断片と、大腸菌での自律複製能を担うＤＮＡ断片とを、
同一の切断末端を利用して組み換えることにより、両菌
種中で自律複製可能なシャトルベクターを構築すること
ができる。具体的には、ミクロモノスポラ属菌種中で自
律複製可能なプラスミドｐＭｏ １３６と、大腸菌で自
律復製可能なプラスミドｐＵｃ１９とを組み換えて構築
したプラスミドｐＭＥＤｌ ０１があげられる。
ｐＭＥＤ１０１は第７表に示すような各種制限酵素に対
する感受性部位を有する。また、ＥｃｏＲ［、ＢｃβＩ
およびＣβａｌに対する感受性部位は有していない。
する感受性部位を有する。また、ＥｃｏＲ［、ＢｃβＩ
およびＣβａｌに対する感受性部位は有していない。
第７表 ｐＭＥＤ１０１の制限酵素による切断特性制限
酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）ｔ
ｌｉｎｄＩＩＩ １ ７．５ＢａｍＨ
１１７，５ ８ｇβｎ １ ７．５Ｐｓｔ Ｉ
２ ０．８．６．７Ｓａｃ Ｉ
１ ７．５Ｘｂａ Ｉ ２
３．５．４．０χｈａ ｉ ２
３．５．４．０Ｋｐｎ １ １
７．５Ｍ１ｕＩ １ ７，５Ｓｐｈ
Ｉ １ ７．５本発明のプラスミドは
、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製可能であるので
、ミクロモノスポラ属菌種、具体的には下記の菌種を宿
主として使用できる。
酵素 切断箇所 生じるＤＮＡ断片の長さ（Ｋｂ）ｔ
ｌｉｎｄＩＩＩ １ ７．５ＢａｍＨ
１１７，５ ８ｇβｎ １ ７．５Ｐｓｔ Ｉ
２ ０．８．６．７Ｓａｃ Ｉ
１ ７．５Ｘｂａ Ｉ ２
３．５．４．０χｈａ ｉ ２
３．５．４．０Ｋｐｎ １ １
７．５Ｍ１ｕＩ １ ７，５Ｓｐｈ
Ｉ １ ７．５本発明のプラスミドは
、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製可能であるので
、ミクロモノスポラ属菌種、具体的には下記の菌種を宿
主として使用できる。
ミクロモノスポラ・エチノスボラ
（ｌＡｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐ
ｏｒａ）ミクロモノスポラ・プルブレア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ
）ミクロモノスポラ・サガミエンンス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓａｇａｍｉｅｎｓ
ｉｓ）ミクロモノスポラ・グリセア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅａ）ミク
ロモノスポラ・イニョエンシス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ １ｎｙｏｅｎｓｉｓ
）ミクロモノスポラ・ジオネンシス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｚｉｏｎｅｎｓｉｓ
）ミクロモノスポラ・ロードランシェア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｈｏｄｏｒａｎｇ
ｅａ）ミクロモノスポラ・ロザリア （１わｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）
ミクロモノスポラ・ラフストリス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ Ｉａｃｕｓｔｒｉｓ
）ミクロモノスポラ・チャルセア （！Ｊｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈａｌｃｅａ）
ミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ（Ｍｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａ
）宿主微生物が制限系を解除されたような株ならば、よ
り有効である。このような制限解除株は、Ｌｏｍｏｖｓ
ｋａｙａらの方法〔マイクロバイオロジカル・レビｘ
−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ）
、 ４４．２０６（１９８０） ）に従って得ること
ができる。
ｏｒａ）ミクロモノスポラ・プルブレア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ
）ミクロモノスポラ・サガミエンンス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓａｇａｍｉｅｎｓ
ｉｓ）ミクロモノスポラ・グリセア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅａ）ミク
ロモノスポラ・イニョエンシス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ １ｎｙｏｅｎｓｉｓ
）ミクロモノスポラ・ジオネンシス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｚｉｏｎｅｎｓｉｓ
）ミクロモノスポラ・ロードランシェア （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｈｏｄｏｒａｎｇ
ｅａ）ミクロモノスポラ・ロザリア （１わｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒｏｓａｒｉａ）
ミクロモノスポラ・ラフストリス （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ Ｉａｃｕｓｔｒｉｓ
）ミクロモノスポラ・チャルセア （！Ｊｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈａｌｃｅａ）
ミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ（Ｍｉｃｒｏ
ｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａ
）宿主微生物が制限系を解除されたような株ならば、よ
り有効である。このような制限解除株は、Ｌｏｍｏｖｓ
ｋａｙａらの方法〔マイクロバイオロジカル・レビｘ
−（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ）
、 ４４．２０６（１９８０） ）に従って得ること
ができる。
上記のプラスミドを宿主微生物に導入するには、Ｋ、
Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒらの方法〔カレント・トピックス・
イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ（
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ！Ｊｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）９６、
６９−９５ ＜１９８２））に従い、プロトプラストを
調製してプラスミドを導入する（詳しくは実施例に示す
）。
Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒらの方法〔カレント・トピックス・
イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イムノロシイ（
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ！Ｊｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）９６、
６９−９５ ＜１９８２））に従い、プロトプラストを
調製してプラスミドを導入する（詳しくは実施例に示す
）。
本発明のプラスミドｐＭＯ１１６，ｐＭＯ１２６゜ｐＭ
Ｏ１３３，ｐＭＯ２１？およびｐＭＥＤ１０１をそれぞ
れ保有する菌株は、それぞれ第８表に示すように、工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されてい
る。
Ｏ１３３，ｐＭＯ２１？およびｐＭＥＤ１０１をそれぞ
れ保有する菌株は、それぞれ第８表に示すように、工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されてい
る。
第 ８ 表
以下に実施例を示す。
実施例１゜
プラスミドｐＭＯ１０１およびｐＭＯ２０１の採取
（１）培養
ミクロモノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣＣ３１
０１０またはミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ
３６２９−４ （ＦＥＲＭＢＰ−１６１４）を４ｍｌの
ＳＫＮα２ＣＫＨ２ＰＯ４−スＫ（松谷化学工業社製）
２０ｇ、グルコース５ｇ、酵母エキス（大工栄養化学社
製）５ｇ、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ、肉エキ
ス（極東製薬工業社製）３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇ、
ＭｇＳＯ４・７）（２００，６ｇおよびＣａ ＣＯ３１
ｇを脱イオン水で１４７とし、ｐＨ７，６に調整したも
の、１２０℃で２０分間高圧滅菌する〕に接種して、３
０℃で２〜３日振盪培養した。次にこの培養液全量を５
０ Ｑｍｌの５ＫＮｏ、２培地（上記５ＫＮ（Ｌ２Ｃ培
地からＣａ ＣＯ３を除いたもの）に接種して、さらに
３０℃で２日間振盪培養した。
０１０またはミクロモノスポラ・オリポアステロスポラ
３６２９−４ （ＦＥＲＭＢＰ−１６１４）を４ｍｌの
ＳＫＮα２ＣＫＨ２ＰＯ４−スＫ（松谷化学工業社製）
２０ｇ、グルコース５ｇ、酵母エキス（大工栄養化学社
製）５ｇ、ペプトン（極東製薬工業社製）５ｇ、肉エキ
ス（極東製薬工業社製）３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，２ｇ、
ＭｇＳＯ４・７）（２００，６ｇおよびＣａ ＣＯ３１
ｇを脱イオン水で１４７とし、ｐＨ７，６に調整したも
の、１２０℃で２０分間高圧滅菌する〕に接種して、３
０℃で２〜３日振盪培養した。次にこの培養液全量を５
０ Ｑｍｌの５ＫＮｏ、２培地（上記５ＫＮ（Ｌ２Ｃ培
地からＣａ ＣＯ３を除いたもの）に接種して、さらに
３０℃で２日間振盪培養した。
（２）プラスミドの単離
（１）で得た培養液を遠心分離（４℃、１０分間。
８０００ｒｐｍ）して細胞を回収した。５ｍｇ／ｍｌの
卵白リゾチーム（生化学工業社製）を含む４０〜５Ｑｍ
ｌのリティック溶液（１０，３％シヨ糖、２５ｍＭ）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）−塩酸緩衝液（＋）Ｈ８，０）、２５ｍＭエチレン
ジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ））に懸濁し、
３７℃で３０分間インキュベートした。これに２％のド
デシル硫酸ナトリウム（牛丼化学社製）を含有する０、
３規定の水酸化ナトリウム溶液３０ｍ１を加えてよく混
ぜ、室温で１０分間放置した。
卵白リゾチーム（生化学工業社製）を含む４０〜５Ｑｍ
ｌのリティック溶液（１０，３％シヨ糖、２５ｍＭ）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）−塩酸緩衝液（＋）Ｈ８，０）、２５ｍＭエチレン
ジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ））に懸濁し、
３７℃で３０分間インキュベートした。これに２％のド
デシル硫酸ナトリウム（牛丼化学社製）を含有する０、
３規定の水酸化ナトリウム溶液３０ｍ１を加えてよく混
ぜ、室温で１０分間放置した。
次に７５℃で１０分間加温し、水槽に浸して冷却後、４
分の３等量のフェノール・クロロホルム混液（５００ｍ
ｌのクロロホルムと５００ｇのフェノールおよび８００
ｍｇの８−ヒドロキシキノリン（東京化成工業社製）を
よく混合した後、２０ Ｑｍｌの脱イオン水を加えて振
って得た下層を用いる〕を加えて激しく３０秒間攪拌し
た。
分の３等量のフェノール・クロロホルム混液（５００ｍ
ｌのクロロホルムと５００ｇのフェノールおよび８００
ｍｇの８−ヒドロキシキノリン（東京化成工業社製）を
よく混合した後、２０ Ｑｍｌの脱イオン水を加えて振
って得た下層を用いる〕を加えて激しく３０秒間攪拌し
た。
冷却遠心分離（４℃、１０分間、 ８０００ｒｐｍ）
によって得られる上層部分にその１０分の１容の３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液を加え、続いて２％のトライトンｘｔ
ｏｏ ＜牛丼化学社製）を含む等容のイソプロピルアル
コールを加えてよく混ぜ、室温で３０分間放置して再び
遠心分離（４℃、１０分間、８０００ｒｐｍ）した。得
られるペレットをＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）、１ｍＭ ＥＤＴＡＩ ２０ｍ１
に溶解し、そこに８０℃で１０分間加熱処理したＲＮＡ
分解酵素（リボヌクレアーゼＡ、タイプＩＡ、 シグ
マ社製）を終濃度２０■／ ｍ ｌになるように加えて
３７℃で３０分間インキニベートした。次いで２ｍｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムと２０ｍ１のイソプロピルアルコー
ルを加えて混合後、室温に３０分間放置して冷却遠心分
離（５分間、４℃、８０００ｒｐｍ）を行イヘレットを
得た。これを再びＴＥ緩衝液に溶解し、さらに臭化エチ
ジウムが終濃度０．７５ ｍｇ／ｍｌになるように加え
た溶１３ｍ１に８、ＯＯｇの塩化セシウムを加えた。得
られる溶液を１８℃で１０５．０００Ｘｇ、４０時間遠
心した。この密度匂配遠心により共有結合で閉じられた
環状のＤＮＡは紫外線ランプを照射することによって蛍
光を発する特異的なバンドとして検出された。注射針を
使ってこのバンドを取り出し、ＴＥ緩衡液で飽和された
イソアミルアルコール（牛丼化学社製）と共に数回振る
ことによって臭化エチジウムを除去し、１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロピルアルコールを
混合して水冷下３０分間放置した。４℃、５分間、１２
，０００Ｏｒｐｍで遠心してペレットを回収し、さらに
冷７％エタノールで洗浄して真空下乾燥した。０．３ｍ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解して一２０℃で凍結保存した。こ
の操作によって４０〜５０■のプラスミドＤＮＡが得ら
れた。
によって得られる上層部分にその１０分の１容の３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液を加え、続いて２％のトライトンｘｔ
ｏｏ ＜牛丼化学社製）を含む等容のイソプロピルアル
コールを加えてよく混ぜ、室温で３０分間放置して再び
遠心分離（４℃、１０分間、８０００ｒｐｍ）した。得
られるペレットをＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）、１ｍＭ ＥＤＴＡＩ ２０ｍ１
に溶解し、そこに８０℃で１０分間加熱処理したＲＮＡ
分解酵素（リボヌクレアーゼＡ、タイプＩＡ、 シグ
マ社製）を終濃度２０■／ ｍ ｌになるように加えて
３７℃で３０分間インキニベートした。次いで２ｍｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムと２０ｍ１のイソプロピルアルコー
ルを加えて混合後、室温に３０分間放置して冷却遠心分
離（５分間、４℃、８０００ｒｐｍ）を行イヘレットを
得た。これを再びＴＥ緩衝液に溶解し、さらに臭化エチ
ジウムが終濃度０．７５ ｍｇ／ｍｌになるように加え
た溶１３ｍ１に８、ＯＯｇの塩化セシウムを加えた。得
られる溶液を１８℃で１０５．０００Ｘｇ、４０時間遠
心した。この密度匂配遠心により共有結合で閉じられた
環状のＤＮＡは紫外線ランプを照射することによって蛍
光を発する特異的なバンドとして検出された。注射針を
使ってこのバンドを取り出し、ＴＥ緩衡液で飽和された
イソアミルアルコール（牛丼化学社製）と共に数回振る
ことによって臭化エチジウムを除去し、１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロピルアルコールを
混合して水冷下３０分間放置した。４℃、５分間、１２
，０００Ｏｒｐｍで遠心してペレットを回収し、さらに
冷７％エタノールで洗浄して真空下乾燥した。０．３ｍ
ｌのＴＥ緩衝液に溶解して一２０℃で凍結保存した。こ
の操作によって４０〜５０■のプラスミドＤＮＡが得ら
れた。
実施例２゜
プラスミドｐＮＭＲ−１およびｐＮＭＲ−１０の構築
（１） ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０（
ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１３）の総ＤＮＡの抽出 ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０を４ｍｌのＳ
ＫＮα２ｃ培地に接種して３０℃で３日間振盪培養し、
その全量を３ＱｍｌのＳＫＮα２培地に接種して、さら
に３０℃で２日間振盪培養した。４℃、１０分間、
１２．０００ｒｐｍで遠心して菌体を集め、２Ｑｍｌの
１０．３％ショ糖溶液で２回菌体を洗浄した。菌体を５
ｍｌのＴＳ援衡液［：１０．３％のショ糖右よび２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）〕に懸濁し、さらに５０ｍｇの卵白リゾチー
ムを加えて３７℃で１時間インキュベートした。これに
Ｑ、５ｍｌのプロティナーゼＫ（シグマ社製。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１６１３）の総ＤＮＡの抽出 ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０を４ｍｌのＳ
ＫＮα２ｃ培地に接種して３０℃で３日間振盪培養し、
その全量を３ＱｍｌのＳＫＮα２培地に接種して、さら
に３０℃で２日間振盪培養した。４℃、１０分間、
１２．０００ｒｐｍで遠心して菌体を集め、２Ｑｍｌの
１０．３％ショ糖溶液で２回菌体を洗浄した。菌体を５
ｍｌのＴＳ援衡液［：１０．３％のショ糖右よび２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）〕に懸濁し、さらに５０ｍｇの卵白リゾチー
ムを加えて３７℃で１時間インキュベートした。これに
Ｑ、５ｍｌのプロティナーゼＫ（シグマ社製。
ＴＳ緩衝液で２ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したもの）を加
え、次いで３．５ｍｌの３．３％ドデシル硫酸ナトリウ
ム溶液を加えて、３７℃で１時間インキュベートして溶
菌した。さらに５０℃で３０分間加温後、水槽に浸して
冷却した。
え、次いで３．５ｍｌの３．３％ドデシル硫酸ナトリウ
ム溶液を加えて、３７℃で１時間インキュベートして溶
菌した。さらに５０℃で３０分間加温後、水槽に浸して
冷却した。
１０ｍ１のフェノール・クロロホルムを加えて５分間静
かに攪拌した後、４℃、１５分間。
かに攪拌した後、４℃、１５分間。
１２、００ Ｏｒｐｍで遠心した。上層を取り、ＲＮＡ
分解酵素を最終濃度２０■／ ｍ ｌになるように添加
し、３７℃で４５分間インキュベートした。
分解酵素を最終濃度２０■／ ｍ ｌになるように添加
し、３７℃で４５分間インキュベートした。
１０分の１容の５Ｍ塩化す） ＩＪウム溶液を加え、続
いて４分の１容のポリエチレングリコール６．０００（
牛丼化学社製）を加えて静かに混合した。水冷下−晩装
置した後、４℃、５分間。
いて４分の１容のポリエチレングリコール６．０００（
牛丼化学社製）を加えて静かに混合した。水冷下−晩装
置した後、４℃、５分間。
５、 ＯＯＯｒｐｍで遠心して得られるペレットを５〜
１０ｍ１のＴＥ緩衝液に溶解した。１０分の１容の３Ｍ
酢酸ナトリウムおよび３０分の１容の６６ｍＭ Ｍｇ
ＣＬ溶液を加えた後、２．２容の９９％冷エタノールを
加えてゆっくりと攪拌し、４℃、５分間、 ５．００
Ｏｒｐｍで遠心してペレットを得た。このペレットを７
０％冷エタノールで２回洗浄した後、４ｍｌのＴＥ緩衝
液に溶解した。こうして約４５０ ｑ／ｍｌのＤＮＡ溶
液が得られた。
１０ｍ１のＴＥ緩衝液に溶解した。１０分の１容の３Ｍ
酢酸ナトリウムおよび３０分の１容の６６ｍＭ Ｍｇ
ＣＬ溶液を加えた後、２．２容の９９％冷エタノールを
加えてゆっくりと攪拌し、４℃、５分間、 ５．００
Ｏｒｐｍで遠心してペレットを得た。このペレットを７
０％冷エタノールで２回洗浄した後、４ｍｌのＴＥ緩衝
液に溶解した。こうして約４５０ ｑ／ｍｌのＤＮＡ溶
液が得られた。
（２）ネオマイシン耐性遺伝子のクローニング（１）で
得たミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０の染色体
ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩ（ベーリンガー社！りを
用いて、４〜６Ｋｂの長さのＤＮＡ断片が主成分になる
ように部分的に分解した。フェノール・クロロホルムヲ
加えて混合し酵素を失活させた２河のＤＮＡを含む溶液
１００．ｄにベクターｐｌＪ７０２ ［：ジャーナル・
オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジシイ（，７，Ｇ
ｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂｉ吐） １２９．２７０３−２７１
４（１９８３）） （制限酵素Ｂｇｊ！ＩＩ （ペー
リンガー社製）で切断し、アルカリ性フォスファターゼ
（分子生物学用、ベーリンガー社製）処理を施したもの
〕２■を加え、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等
容のイソプロピルアルコール・を加えて混合した。水冷
下３０分放置した後、４℃、５分間、 ｌ ２，００
Ｏｒｐｍで遠心してペレットを得、７０％冷エタノー
ルで１回洗浄して真空下乾燥した。
得たミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０の染色体
ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩ（ベーリンガー社！りを
用いて、４〜６Ｋｂの長さのＤＮＡ断片が主成分になる
ように部分的に分解した。フェノール・クロロホルムヲ
加えて混合し酵素を失活させた２河のＤＮＡを含む溶液
１００．ｄにベクターｐｌＪ７０２ ［：ジャーナル・
オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジシイ（，７，Ｇ
ｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂｉ吐） １２９．２７０３−２７１
４（１９８３）） （制限酵素Ｂｇｊ！ＩＩ （ペー
リンガー社製）で切断し、アルカリ性フォスファターゼ
（分子生物学用、ベーリンガー社製）処理を施したもの
〕２■を加え、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等
容のイソプロピルアルコール・を加えて混合した。水冷
下３０分放置した後、４℃、５分間、 ｌ ２，００
Ｏｒｐｍで遠心してペレットを得、７０％冷エタノー
ルで１回洗浄して真空下乾燥した。
２５ｄのライゲーション１１衡液（６，６ｍ’ＭＭｇＣ
１ｘ 、１０ｍＭジチオスライトール（牛丼化学社製）
および０．８ｍＭアデノシントリフォスフエイト（シグ
マ社製）を含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，６））にペレットを溶解し、これに１単位のＴ４ラ
イゲース（ペーリンガー社製）を加え１５℃で一晩イン
キエベートした。この反応液に７５ｄのＰ−メディウム
（ショ糖ｔｏ、３ｇ、ＫＩＳＯ４２５■。
１ｘ 、１０ｍＭジチオスライトール（牛丼化学社製）
および０．８ｍＭアデノシントリフォスフエイト（シグ
マ社製）を含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，６））にペレットを溶解し、これに１単位のＴ４ラ
イゲース（ペーリンガー社製）を加え１５℃で一晩イン
キエベートした。この反応液に７５ｄのＰ−メディウム
（ショ糖ｔｏ、３ｇ、ＫＩＳＯ４２５■。
Ｍ ｇ Ｃｌ ２・６ＨａＯ２０３ｍｇおよび微量金属
元素液０．２ｍｌを脱イオン水で９０ｍ１とし高圧滅菌
する。これに別に高圧滅菌したｌ Ｑｍｌの０．２５Ｍ
ＴＥＳ ［Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）−メチ
ル−２−アミノエタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ７，２
） 、 ０．５ｍｌの５Ｍ ＣａＣ１，。
元素液０．２ｍｌを脱イオン水で９０ｍ１とし高圧滅菌
する。これに別に高圧滅菌したｌ Ｑｍｌの０．２５Ｍ
ＴＥＳ ［Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）−メチ
ル−２−アミノエタンスルホン酸〕緩衝液（ｐＨ７，２
） 、 ０．５ｍｌの５Ｍ ＣａＣ１，。
および１ωｌの０．５％ＫＨｔＰＯ＊を加えたもの；以
下Ｐ−溶液という）を添加し、次いで常法〔カレント・
トピックス・イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イ
ムノロシイ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ＋ｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
） ９６．６９−９５（Ｉ９８５） ］によって得たス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ Ｉ １ｖｉｄａｎｓ） Ｔ Ｋ ２３株のプロト
プラスト懸濁液２５ｍを加え、静かに混合後１分間室温
で静置した。５００１ｄｔのＴ−メディウム〔７５％容
のＰ−溶液と２５％容のポリエチレングリコール１００
０ （牛丼化学社製）を混合したもの；以下Ｔ−溶液と
いう〕を加えて攪拌後、Ｐ−溶液で１０倍に希釈した。
下Ｐ−溶液という）を添加し、次いで常法〔カレント・
トピックス・イン・マイクロバイオロジイ・アンド・イ
ムノロシイ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ＋ｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
） ９６．６９−９５（Ｉ９８５） ］によって得たス
トレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ Ｉ １ｖｉｄａｎｓ） Ｔ Ｋ ２３株のプロト
プラスト懸濁液２５ｍを加え、静かに混合後１分間室温
で静置した。５００１ｄｔのＴ−メディウム〔７５％容
のＰ−溶液と２５％容のポリエチレングリコール１００
０ （牛丼化学社製）を混合したもの；以下Ｔ−溶液と
いう〕を加えて攪拌後、Ｐ−溶液で１０倍に希釈した。
希釈液１ｏｏＩｔ１をＲ５再生寒天平板培地〔シヨ糖１
０３ｇ、Ｋ１５Ｏ４０，２５ｇ、ＭｇＣ１ｚ・６ＨｚＯ
Ｌｏ、１２ｇ、グルコース１０ｇ、カヂミノ酸（デイフ
コ社製）０．１ｇ、酵母エキス（デイフコ社製）５ｇ、
微量金属元素液２ｍ１゜ＴＥＳ ５．７ｇ、カセイソ
ーダ２．５ｇを脱イオン水で１１ｐＨ７，２）とする。
０３ｇ、Ｋ１５Ｏ４０，２５ｇ、ＭｇＣ１ｚ・６ＨｚＯ
Ｌｏ、１２ｇ、グルコース１０ｇ、カヂミノ酸（デイフ
コ社製）０．１ｇ、酵母エキス（デイフコ社製）５ｇ、
微量金属元素液２ｍ１゜ＴＥＳ ５．７ｇ、カセイソ
ーダ２．５ｇを脱イオン水で１１ｐＨ７，２）とする。
これを５等分し、４．４ｇのバタトアーガー（デイフコ
社製）−と混合して１２０℃、２０分間高圧滅菌する。
社製）−と混合して１２０℃、２０分間高圧滅菌する。
このうちの１つに３ｍｌの２０％Ｌ−グルタミン酸ナト
リウＡ、３ｍｌの２％Ｎ ａ ＮＯ３，２ｍｌの０．５
％Ｋ Ｈ２Ｐ ＯｓおよびＱ、６ｍＩの５ＭＣａＣｌ２
を加えて素早く混合し、２０１１１１ずつプレートにま
き、２時間クリーンベンチ内で乾燥させたもの）１２枚
に塗布した。３０℃で１５時間培養した後、抗生物質チ
オペプチン０．５ ｍｇ／ｍｌ含有軟寒天培地（８ｇの
ニュートリエンドブロス（デイフコ社製）と５ｇのバタ
トアーガーを１１の脱イオン水と共に１２０℃で２０分
間高圧滅菌したもの〕を重層し、さらに３０℃で２〜３
週間培養すると充分胞子が着底してきた。ベルヘット布
を用いて、ネオマイシン（硫酸塩。
リウＡ、３ｍｌの２％Ｎ ａ ＮＯ３，２ｍｌの０．５
％Ｋ Ｈ２Ｐ ＯｓおよびＱ、６ｍＩの５ＭＣａＣｌ２
を加えて素早く混合し、２０１１１１ずつプレートにま
き、２時間クリーンベンチ内で乾燥させたもの）１２枚
に塗布した。３０℃で１５時間培養した後、抗生物質チ
オペプチン０．５ ｍｇ／ｍｌ含有軟寒天培地（８ｇの
ニュートリエンドブロス（デイフコ社製）と５ｇのバタ
トアーガーを１１の脱イオン水と共に１２０℃で２０分
間高圧滅菌したもの〕を重層し、さらに３０℃で２〜３
週間培養すると充分胞子が着底してきた。ベルヘット布
を用いて、ネオマイシン（硫酸塩。
シグマ社製）が２５ｇ／ｍ＋の濃度で含有されるＹＥＭ
Ｅ培地〔酵母二キス（デイフコ社製〉３ｇ、バクトベブ
トン（デイフコ社製）５ｇ、麦芽エキス（デイフコ社製
）３ｇ、グルコースｌ。
Ｅ培地〔酵母二キス（デイフコ社製〉３ｇ、バクトベブ
トン（デイフコ社製）５ｇ、麦芽エキス（デイフコ社製
）３ｇ、グルコースｌ。
ｇ、バクトアーガ−２０ｇを脱イオン水１βに含む培地
（ｐＨ７゜２）を高圧滅菌して作成する〕にレプリカし
、さらに３０℃で４日間培養した。
（ｐＨ７゜２）を高圧滅菌して作成する〕にレプリカし
、さらに３０℃で４日間培養した。
生育してきたコロニーはネオマイシン耐性遺伝子を有す
る組換え体プラスミドを保持していると考えられ、その
プラスミドを実施例１で示した方法と同様な方法で採取
した。各種制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳
動による解析の結果、得られた２種のプラスミドｐ Ｎ
ＭＲ−１およびｐＮＭＲ−１０には、ネオマイシン耐性
を発現する２つの異なる遺伝子がそれぞれ挿入されてい
ることがわかった。
る組換え体プラスミドを保持していると考えられ、その
プラスミドを実施例１で示した方法と同様な方法で採取
した。各種制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳
動による解析の結果、得られた２種のプラスミドｐ Ｎ
ＭＲ−１およびｐＮＭＲ−１０には、ネオマイシン耐性
を発現する２つの異なる遺伝子がそれぞれ挿入されてい
ることがわかった。
実施例３゜
クローニングベクターｐＭｏ ｌ １６およびｐＭ。
１３３の構築
実施例１で得られた３、８贋のｐＭＯ１０１を、８栄位
の制限酵素１３ｃｊ！Ｉ（ベーリンガー社製）を含む３
０〃のＭ緩衝液〔マニュアル フォージュ不ティック
エンジニアリング（コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−）、 ｐ、２２８． （１９８０）を参照〕に
加え、５０℃で２時間インキュベートし、脱イオン水を
加えて９０〃とした。これに１０４のＩＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，６）を加え、次いで１゜５単位のアル
カリ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加えて、３
７℃で４５分間インキュベートした。１００頭のフェノ
ール・クロロホルムを加えて激しく３０秒間攪拌した後
、１８℃で５分間、 １２．０００ｒｐｍで遠心した
。得られた上層に、実施例２で得られたｐＮＭＲｌ中の
３ＫｂのＢｇＥＵ切断ＤＮＡ断片約２Ａｇを加え、１０
分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウムと等容のイソプロピ
ルアルコールを加えて混合し、水冷下３０分間放置した
。再び４℃、５分間、１２．００Ｏｒｐｍで遠心して得
られたベレットを、冷７０％エタノールで洗浄し、真空
乾燥した。これにライゲーション緩衝液２０４を加え、
さらにＴ ４ライゲースを１単位加えて１５℃で一晩放
置した。この反応液に８０ＩＬｆｌのＰ−溶液を加え、
次いで実施例２の（２）でストレプトマイセス・リビダ
ンスＴＫ２３株のプロトプラストを調製したのと同様の
方法で調製したミクロモノスポラ・オリポアステロスポ
ラＡＴＣＣ２１８１９のプロトプラスト菌液を素早くせ
濁し、１分間室温で放置後、Ｔ−溶液５００ρを加えて
静かに混合した。これをＰ−溶液で１０倍に希釈し、希
釈液１００ρずつを２４枚の再生寒天平板培地ＲＭ−Ｉ
Ｃンヨ糖１・００ｇ、スタビロースＫ １０ ｇ、
Ｋｌ−（２Ｐ０４ ５０ｍｇ、 ＭｇＣｊ！２・６Ｈ２
０５，１ｇ、ＣａＣｊ！ｚ・２Ｈ２０３，７ｇ。
の制限酵素１３ｃｊ！Ｉ（ベーリンガー社製）を含む３
０〃のＭ緩衝液〔マニュアル フォージュ不ティック
エンジニアリング（コールドスプリングハーバ−ラボラ
トリ−）、 ｐ、２２８． （１９８０）を参照〕に
加え、５０℃で２時間インキュベートし、脱イオン水を
加えて９０〃とした。これに１０４のＩＭ）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，６）を加え、次いで１゜５単位のアル
カリ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加えて、３
７℃で４５分間インキュベートした。１００頭のフェノ
ール・クロロホルムを加えて激しく３０秒間攪拌した後
、１８℃で５分間、 １２．０００ｒｐｍで遠心した
。得られた上層に、実施例２で得られたｐＮＭＲｌ中の
３ＫｂのＢｇＥＵ切断ＤＮＡ断片約２Ａｇを加え、１０
分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウムと等容のイソプロピ
ルアルコールを加えて混合し、水冷下３０分間放置した
。再び４℃、５分間、１２．００Ｏｒｐｍで遠心して得
られたベレットを、冷７０％エタノールで洗浄し、真空
乾燥した。これにライゲーション緩衝液２０４を加え、
さらにＴ ４ライゲースを１単位加えて１５℃で一晩放
置した。この反応液に８０ＩＬｆｌのＰ−溶液を加え、
次いで実施例２の（２）でストレプトマイセス・リビダ
ンスＴＫ２３株のプロトプラストを調製したのと同様の
方法で調製したミクロモノスポラ・オリポアステロスポ
ラＡＴＣＣ２１８１９のプロトプラスト菌液を素早くせ
濁し、１分間室温で放置後、Ｔ−溶液５００ρを加えて
静かに混合した。これをＰ−溶液で１０倍に希釈し、希
釈液１００ρずつを２４枚の再生寒天平板培地ＲＭ−Ｉ
Ｃンヨ糖１・００ｇ、スタビロースＫ １０ ｇ、
Ｋｌ−（２Ｐ０４ ５０ｍｇ、 ＭｇＣｊ！２・６Ｈ２
０５，１ｇ、ＣａＣｊ！ｚ・２Ｈ２０３，７ｇ。
ペプトン（極東製薬社製）０．５ｇ、酵母エキス（大玉
栄養化学社製）１．０ｇ、Ｆｅ５０． ・７Ｈ，０５０
ｍｇ、 ＴＥＳ ５．６ｇ、バタトアーガー（デイフ
コ社製）２０ｇを脱イオン水で１２としくｐＨ８，０）
、１２０℃、２０分間高圧滅菌したものを２５ｍ１ずつ
プレートにまいて固化する〕に塗布し、３０℃で４日間
培養した。０．４０ｇ ／ｍ ｌのネオマイシンを含む
軟寒天培地２．５１＋１１を重層し、さらに３０℃で１
４日間培養した。得られたネオマイシン耐性の再生味を
、ネオマイシンを２．５ｇ／ｍｌの１度で含むＡＴＣＣ
３−５培地〔スタビロースＫＩＯｇ、酵母エキス（大玉
栄養化学社製）Ｉｇ、肉エキス（極東製薬社製）Ｉｇ、
バクトトリブトース（デイフコ社製）２ｇ、Ｆｅ５０＋
・２Ｈ２Ｈ２Ｏ１００，バタトアーガー２０ｇを脱イオ
ン水で１ｐとしくｐＨ７，２）１２０℃、２０分高圧滅
菌したもの〕に植菌し、５日間、３０℃で培養した。
栄養化学社製）１．０ｇ、Ｆｅ５０． ・７Ｈ，０５０
ｍｇ、 ＴＥＳ ５．６ｇ、バタトアーガー（デイフ
コ社製）２０ｇを脱イオン水で１２としくｐＨ８，０）
、１２０℃、２０分間高圧滅菌したものを２５ｍ１ずつ
プレートにまいて固化する〕に塗布し、３０℃で４日間
培養した。０．４０ｇ ／ｍ ｌのネオマイシンを含む
軟寒天培地２．５１＋１１を重層し、さらに３０℃で１
４日間培養した。得られたネオマイシン耐性の再生味を
、ネオマイシンを２．５ｇ／ｍｌの１度で含むＡＴＣＣ
３−５培地〔スタビロースＫＩＯｇ、酵母エキス（大玉
栄養化学社製）Ｉｇ、肉エキス（極東製薬社製）Ｉｇ、
バクトトリブトース（デイフコ社製）２ｇ、Ｆｅ５０＋
・２Ｈ２Ｈ２Ｏ１００，バタトアーガー２０ｇを脱イオ
ン水で１ｐとしくｐＨ７，２）１２０℃、２０分高圧滅
菌したもの〕に植菌し、５日間、３０℃で培養した。
生育してくる菌の保有するプラスミドを実施例１で示し
た方法で採取し、２種類のプラスミドｐＭ。
た方法で採取し、２種類のプラスミドｐＭ。
１１６とｐＭｏ １３３を得た。
実施例４゜
ｐＭｏ １２６の構築
ＩＮのｐ ＭＯ１，１６を含む３０ＭのＭ緩衝液に４単
位の制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇ！■を加え、３７℃で２
．５時間インキュベートした。これに６０４の脱イオン
水およびｌＯρのＩ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ
８，６＞を加え、さらに１単位のアルカリ性フォスファ
ターゼを添加して３７℃で４５分間インキュベートした
。１００ｇのフェノール・クロロホルムを加えて激しく
攪拌した後、１５℃、５分間、 １２．００ Ｏｒｐ
ｍで遠心して得た上清に、ｐＮＭＲ１０から得られる３
ＫｂのＢａｍＨＩ切断Ｄ Ｎ Ａ断片０．５■を加えて
混合し、１０分の１容の３Ｍ酢酸すｌ−’Ｊウムと等容
のイソプロピルアルコールを加えて水冷下３０分間放置
した。以降の操作は実施例３と同様に行い、最終的に得
られるミクロモノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣ
Ｃ２１８１９のネオマイシン耐性の再生味のプラスミド
を単離し、プラスミドｐＭＯ１２６を得た。
位の制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇ！■を加え、３７℃で２
．５時間インキュベートした。これに６０４の脱イオン
水およびｌＯρのＩ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ
８，６＞を加え、さらに１単位のアルカリ性フォスファ
ターゼを添加して３７℃で４５分間インキュベートした
。１００ｇのフェノール・クロロホルムを加えて激しく
攪拌した後、１５℃、５分間、 １２．００ Ｏｒｐ
ｍで遠心して得た上清に、ｐＮＭＲ１０から得られる３
ＫｂのＢａｍＨＩ切断Ｄ Ｎ Ａ断片０．５■を加えて
混合し、１０分の１容の３Ｍ酢酸すｌ−’Ｊウムと等容
のイソプロピルアルコールを加えて水冷下３０分間放置
した。以降の操作は実施例３と同様に行い、最終的に得
られるミクロモノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣ
Ｃ２１８１９のネオマイシン耐性の再生味のプラスミド
を単離し、プラスミドｐＭＯ１２６を得た。
実施例５゜
ｐＭｏ １３６の構築
１ｄのｐＭｏ ｌ １６を含む３０ｄのＭ緩衝液に、４
単位の制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｃＩ（いずれもベーリ
ンガー社製）を加え、３７℃で２．５時間インキュベー
トした。これに６０４の脱イオン水とｌＯρの１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）を加え、１単位のアルカ
リ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加えて３７℃
で４５分間インキュベートした。１００ρのフェノール
・クロロホルムを添加して３０秒間激しく振盪した後、
１５℃、５分間、１２．ＯＯＯｒｐｍで遠心して上清を
得た。これにｐＮＭＲ−１０から得られる１、５Ｋｂの
ＢａｍＨＩ／５ａｃｌ切断ＤＮＡ断片約０．５■を加え
て混合し、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等容の
イソプロピルアルコールを加え、水冷下３０分間放置し
た。以降の操作は実施例３と同様に行い、最終的に得ら
れるミクロモノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣＣ
２１８１９のネオマイシン耐性の再生株のプラスミドを
単離し、プラスミドｐＭｏ １３６を得た。
単位の制限酵素ＢａｍＨＩと５ａｃＩ（いずれもベーリ
ンガー社製）を加え、３７℃で２．５時間インキュベー
トした。これに６０４の脱イオン水とｌＯρの１Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）を加え、１単位のアルカ
リ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加えて３７℃
で４５分間インキュベートした。１００ρのフェノール
・クロロホルムを添加して３０秒間激しく振盪した後、
１５℃、５分間、１２．ＯＯＯｒｐｍで遠心して上清を
得た。これにｐＮＭＲ−１０から得られる１、５Ｋｂの
ＢａｍＨＩ／５ａｃｌ切断ＤＮＡ断片約０．５■を加え
て混合し、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等容の
イソプロピルアルコールを加え、水冷下３０分間放置し
た。以降の操作は実施例３と同様に行い、最終的に得ら
れるミクロモノスポラ・オリポアステロスポラＡＴＣＣ
２１８１９のネオマイシン耐性の再生株のプラスミドを
単離し、プラスミドｐＭｏ １３６を得た。
実施例６゜
９ＭＯ２１７の構築
９ＭＯ２０１約２ｇを４１位（Ｄ制限９素Ｂｇｊ！■（
ベーリンガー社製）を含むＭ緩衝液３０ρに加えて、３
７℃で２．５時間反応させた後、６０ｄの脱イオン水と
１０ｍのＩＭ） ’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ８，６）、
および１単位のアルカリ性フォスファターゼ（分子生物
学用）を添加して３７℃で４５分間インキュベートした
。これに１００４のフェノール・クロロホルムを加えて
３０秒間激しく攪拌した後、１８℃、５分間、１２．Ｏ
ＯＯｒｐｍで遠心して上清を得た。これに０．５ｇのｐ
Ｎ Ｍ Ｒ−１由来の３ＫｂのＢｇｊ！ＩＩ切断ＤＮ
Ａ断片を添加し、１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウ
ムと、等容のイソプロピルアルコールとを混合し、水冷
下３０分間放置した。この後の操作は実施例３と同様に
行い、最終的に得られるミクロモノスポラ・オリポアス
テロスポラＡＴＣＣ２１８１９のネオマイシン耐性の再
生株が保有するプラスミドを分離し、プラスミドｐＭＯ
２１７を得た。
ベーリンガー社製）を含むＭ緩衝液３０ρに加えて、３
７℃で２．５時間反応させた後、６０ｄの脱イオン水と
１０ｍのＩＭ） ’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ８，６）、
および１単位のアルカリ性フォスファターゼ（分子生物
学用）を添加して３７℃で４５分間インキュベートした
。これに１００４のフェノール・クロロホルムを加えて
３０秒間激しく攪拌した後、１８℃、５分間、１２．Ｏ
ＯＯｒｐｍで遠心して上清を得た。これに０．５ｇのｐ
Ｎ Ｍ Ｒ−１由来の３ＫｂのＢｇｊ！ＩＩ切断ＤＮ
Ａ断片を添加し、１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウ
ムと、等容のイソプロピルアルコールとを混合し、水冷
下３０分間放置した。この後の操作は実施例３と同様に
行い、最終的に得られるミクロモノスポラ・オリポアス
テロスポラＡＴＣＣ２１８１９のネオマイシン耐性の再
生株が保有するプラスミドを分離し、プラスミドｐＭＯ
２１７を得た。
実施例７゜
ｐＭＥＤ１０１の構築
（ｒ） ｐＭＯ１３６の制限酵素による消化実施例５
で得たｐＭＯ１３６２屑を、２単位の制限酵素ＢｇｌＵ
と２単位の制限酵素Ｓａｃ■ くいずれもベーリンガー
社製）を含むＭ緩衝液３０ＪＩＩＩに加え、３７℃で２
時間インキニベートした。脱イオン水を加えてｔｏｏｌ
ｉｌｌとし、等量のフェノール・クロロホルムを加えて
激しく３０秒間攪拌した後、１８℃で５分間、１２．０
０Ｏｒｐｍで遠心した。得られた上清に１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロピルアルコールを
加えて混合し、水冷下３０分間放置した。４℃、５分間
、１２．００Ｏｒｐｍで遠心して得られるペレットを冷
７０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
で得たｐＭＯ１３６２屑を、２単位の制限酵素ＢｇｌＵ
と２単位の制限酵素Ｓａｃ■ くいずれもベーリンガー
社製）を含むＭ緩衝液３０ＪＩＩＩに加え、３７℃で２
時間インキニベートした。脱イオン水を加えてｔｏｏｌ
ｉｌｌとし、等量のフェノール・クロロホルムを加えて
激しく３０秒間攪拌した後、１８℃で５分間、１２．０
０Ｏｒｐｍで遠心した。得られた上清に１０分の１容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロピルアルコールを
加えて混合し、水冷下３０分間放置した。４℃、５分間
、１２．００Ｏｒｐｍで遠心して得られるペレットを冷
７０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
（２）ｐＵｃ１９のＡａｔ１１部位のＢｇｌｒｉ部位へ
の変換 ｐＵｃ１９ ３．５■を、５単位の制限酵素ＡａｔＩ［
（東洋紡社製）を含むＭ緩衝液５０ｍに加え、３７℃で
２時間インキニベートした。
の変換 ｐＵｃ１９ ３．５■を、５単位の制限酵素ＡａｔＩ［
（東洋紡社製）を含むＭ緩衝液５０ｍに加え、３７℃で
２時間インキニベートした。
脱イオン水を加えてｔｏｏｎとし、等量のフェノール・
クロロホルム混液を加えて激しく攪拌した後、１８℃、
５分間、１２．００Ｏｒｐｍで遠心した。得られた上層
に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロ
ピルアルコールを加えて混合し、水冷下３０分間放置し
た。４ｔ、 ５分間、 １２，０００ｒｐＩ′１１
の遠心で得られるペレットを冷７０％エタノールで洗浄
し、真空下乾燥した。２０ｄのＴ４ポリメラーゼ用緩衝
液（０，０３３Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，９）。
クロロホルム混液を加えて激しく攪拌した後、１８℃、
５分間、１２．００Ｏｒｐｍで遠心した。得られた上層
に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと等容のイソプロ
ピルアルコールを加えて混合し、水冷下３０分間放置し
た。４ｔ、 ５分間、 １２，０００ｒｐＩ′１１
の遠心で得られるペレットを冷７０％エタノールで洗浄
し、真空下乾燥した。２０ｄのＴ４ポリメラーゼ用緩衝
液（０，０３３Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，９）。
０．０６６Ｍ酢酸カリウム、０．０１Ｍ酢酸マグネシウ
ム、０．５ｍＭジチオスライトール＋０．１ｍＭｄＡＴ
Ｐ （デオキシアデノシントリフオスフェート、シグマ
社製）、０．１ｍＭ ａｃ’ｒｐ （デオキシグアノ
シントリフオスフェート、シグマ社製）、Ｑ、１ｍＭ
ｄＣＴＰ （ｆ、ｔキシシチジントリフオスフェート
、シグマ社製）、Ｏ，１ｍＭｄＴＴＰ （デオキシチミ
ジントリフオスフェート、シグマ社製）〕に再溶解し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）５単位を加え、
３７℃で５分間インキニベートした。脱イオン水を加え
て１００ｄとし、等量のフェノール・クロロホルム混液
を加えて激しく攪拌した後１８℃。
ム、０．５ｍＭジチオスライトール＋０．１ｍＭｄＡＴ
Ｐ （デオキシアデノシントリフオスフェート、シグマ
社製）、０．１ｍＭ ａｃ’ｒｐ （デオキシグアノ
シントリフオスフェート、シグマ社製）、Ｑ、１ｍＭ
ｄＣＴＰ （ｆ、ｔキシシチジントリフオスフェート
、シグマ社製）、Ｏ，１ｍＭｄＴＴＰ （デオキシチミ
ジントリフオスフェート、シグマ社製）〕に再溶解し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）５単位を加え、
３７℃で５分間インキニベートした。脱イオン水を加え
て１００ｄとし、等量のフェノール・クロロホルム混液
を加えて激しく攪拌した後１８℃。
５分間、 １２．００ Ｏｒｐｍで遠心した。得られ
た上層に１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウムと、等
容のイソプロピルアルコールを加えて混合し水冷下３０
分間放置した。４℃、５分間。
た上層に１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウムと、等
容のイソプロピルアルコールを加えて混合し水冷下３０
分間放置した。４℃、５分間。
１２．００ Ｏｒｐｍで遠心して得られるベレットを冷
７０％エタノールで洗浄し、真空下乾燥した。
７０％エタノールで洗浄し、真空下乾燥した。
これを、１．２ＪＬｇのＢｇｊ！■リンカ−ｄ （ｐ
Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ、全酒造社製）と共に
、ライゲーション緩衝液に溶解し、１単位のＴ４ライゲ
ース（ベーリンガー社製）を加え、１５℃で一晩インキ
コベートした。脱イオン水で１００〃とし、等景のフェ
ノール・クロロホルム混液を加えて激しく攪拌した後、
１８℃、 ５分間、１２．ＯＯＯｒｐｍで遠心した。
Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ、全酒造社製）と共に
、ライゲーション緩衝液に溶解し、１単位のＴ４ライゲ
ース（ベーリンガー社製）を加え、１５℃で一晩インキ
コベートした。脱イオン水で１００〃とし、等景のフェ
ノール・クロロホルム混液を加えて激しく攪拌した後、
１８℃、 ５分間、１２．ＯＯＯｒｐｍで遠心した。
得られた上層に１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウム
と、等容のイソプロピルアルコールを加えて混合し、水
冷下３０分間放置した。４℃、５分間。
と、等容のイソプロピルアルコールを加えて混合し、水
冷下３０分間放置した。４℃、５分間。
１２、０００ｒｐｍで遠心して得られるベレットを冷７
０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
（３）ｐＵｃ１９由来ＢｇｊＮＩ−ＳａｃＩ断片の調製
上記（２）で調製したｐＵｃ１９のＡａｔ１１部位がＢ
ｇＩ！、Ｉ［部位に変換されたＤＮＡ断片を、２０栄位
の制限酵素Ｂｇ、ｅｎと４単位の制限酵素５ａｃＩ（い
ずれもベーリンガー社製）を含むＭ緩衝液３０頭に加え
、３７℃、２時間インキュベートした。脱イオン水を加
えて１００ρとし、これに１０〃のＩ Ｍ ） ＩＪス
ス−酸緩衝液（ｐＨ８，６＞を加え、次いで１，５単位
のアルカリ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加え
て３７℃、１時間インキコベートした。アガロースゲル
電気泳動後、目的とするＢｇｊ！ＩＩ。
ｇＩ！、Ｉ［部位に変換されたＤＮＡ断片を、２０栄位
の制限酵素Ｂｇ、ｅｎと４単位の制限酵素５ａｃＩ（い
ずれもベーリンガー社製）を含むＭ緩衝液３０頭に加え
、３７℃、２時間インキュベートした。脱イオン水を加
えて１００ρとし、これに１０〃のＩ Ｍ ） ＩＪス
ス−酸緩衝液（ｐＨ８，６＞を加え、次いで１，５単位
のアルカリ性フォスファターゼ（分子生物学用）を加え
て３７℃、１時間インキコベートした。アガロースゲル
電気泳動後、目的とするＢｇｊ！ＩＩ。
５ａｃＩ切断ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出し
、透析チューブ内で電気的に溶出した。
、透析チューブ内で電気的に溶出した。
溶出液に、等容のフェノール・クロロホルム混液を加え
て激しく３０秒間攪拌後、１８℃、５分間、 １２．
０００ｒｐｍで遠心した。得られた上層に１０分の１容
の３Ｍ酢酸ナトリウムと、等容のイソプロピルアルコー
ルを加えて混合し、水冷下３０分間放置した。４℃、５
分間。
て激しく３０秒間攪拌後、１８℃、５分間、 １２．
０００ｒｐｍで遠心した。得られた上層に１０分の１容
の３Ｍ酢酸ナトリウムと、等容のイソプロピルアルコー
ルを加えて混合し、水冷下３０分間放置した。４℃、５
分間。
１２、００ Ｏｒｐｍで遠心して得られるベレットを冷
７０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
７０％エタノールで洗浄し真空下乾燥した。
（４）ＢｇｌｌＵ−３ａｃＩ消化したｐＭｏ １３６と
、ｐＵｃ１９由来Ｂｇβ■−５ａｃｌ断片との結合 （１）で得たｐＭＯ１３６由来のＢｇｆｌｌ−３ａｃＩ
断片（約５．３Ｋｂ）と（３）で得たｐＵｃ１９由来の
ＢｇｌｌＵ−３ａｃｌ断片（約２．２ Ｋ ｂ ）を３
０βのライゲーション緩衝液に溶解し、Ｔ４ライゲース
（ベーリンガー社製）１単位を加え、１５℃で一晩イン
キユベートした。１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウ
ムと、等容のイソプロピルアルコールを加えて混合し、
水冷下３０分間放置した。４℃、５分間、 １２．０
００ｒｐｍで遠心して得られるベレットを冷７０％エタ
ノールで洗浄し真空下乾燥し、これを１０屑のＴＥ緩衡
液に懸濁した。
、ｐＵｃ１９由来Ｂｇβ■−５ａｃｌ断片との結合 （１）で得たｐＭＯ１３６由来のＢｇｆｌｌ−３ａｃＩ
断片（約５．３Ｋｂ）と（３）で得たｐＵｃ１９由来の
ＢｇｌｌＵ−３ａｃｌ断片（約２．２ Ｋ ｂ ）を３
０βのライゲーション緩衝液に溶解し、Ｔ４ライゲース
（ベーリンガー社製）１単位を加え、１５℃で一晩イン
キユベートした。１０分の１容の３Ｍ酢酸す） ＩＪウ
ムと、等容のイソプロピルアルコールを加えて混合し、
水冷下３０分間放置した。４℃、５分間、 １２．０
００ｒｐｍで遠心して得られるベレットを冷７０％エタ
ノールで洗浄し真空下乾燥し、これを１０屑のＴＥ緩衡
液に懸濁した。
（５）大腸菌に−１２：ＨＢＩＯＩの形質転換とｐＭＥ
ＤＩ Ｏ１の調製 常法ＣＢｏｌｉｖａｒ ら、ジーン（Ｇｅｎｅ） ２
ニア５−９３゜（１９７７）参照〕により調製した大
腸菌に−１２：Ｈ８１０１株のコンピテント細胞１００
ρに、（４）で得た試験管内組換えＤＮＡ （約１．０
ｇｇ）を混合し、水冷下２０分間インキュベートした。
ＤＩ Ｏ１の調製 常法ＣＢｏｌｉｖａｒ ら、ジーン（Ｇｅｎｅ） ２
ニア５−９３゜（１９７７）参照〕により調製した大
腸菌に−１２：Ｈ８１０１株のコンピテント細胞１００
ρに、（４）で得た試験管内組換えＤＮＡ （約１．０
ｇｇ）を混合し、水冷下２０分間インキュベートした。
次いで３７℃で５分間インキュベートした後、１、Ｑｍ
ｌのし一培地〔バタトトリプトン（デイフコ社製）１０
ｇ、バクトイ−ストエキストラクト（デイフコ社製）５
ｇ、ＮａＣｊ！ ５ｇを脱イオン水を用いて１１とし
くｐＨ７，０）、１２０℃、２０分間高圧滅菌したもの
〕を加え、３７℃で１時間インキュベートした。この一
部を適当に希釈してアンピシリン５０Ｉｔｇ／ｍ＋を含
有するＬ−培地寒天平板〔上記し一培地に１．５％バタ
トアガー（デイフコ社製）を加えたもの〕上に塗布した
。アンピシリン耐性を獲得して生育してきたコロニーを
選択し、アンピシリン５０μｇ ／ｍ ｌを含むし一培
地で３７℃、−晩培養後、その閑の保有するプラスミド
を実施例１と同様の方法で分離し、ｐＭＥＤｌ ０１を
得た。
ｌのし一培地〔バタトトリプトン（デイフコ社製）１０
ｇ、バクトイ−ストエキストラクト（デイフコ社製）５
ｇ、ＮａＣｊ！ ５ｇを脱イオン水を用いて１１とし
くｐＨ７，０）、１２０℃、２０分間高圧滅菌したもの
〕を加え、３７℃で１時間インキュベートした。この一
部を適当に希釈してアンピシリン５０Ｉｔｇ／ｍ＋を含
有するＬ−培地寒天平板〔上記し一培地に１．５％バタ
トアガー（デイフコ社製）を加えたもの〕上に塗布した
。アンピシリン耐性を獲得して生育してきたコロニーを
選択し、アンピシリン５０μｇ ／ｍ ｌを含むし一培
地で３７℃、−晩培養後、その閑の保有するプラスミド
を実施例１と同様の方法で分離し、ｐＭＥＤｌ ０１を
得た。
実施例８゜
各種プラスミドの制限酵素切断地図の作製実施例１〜７
で得られたプラスミドｐＭＯ１０１゜ｐＭＯ１１６，ｐ
ＭＯ１２６，ｐＭＯ１３３゜ｐＭＯ１３６，ｐＭｏ ２
１ ？およびｐＭＥＤ１０１をそれぞれ各種制限酵素に
よる消化とアガロースゲル電気泳動により解析し、第１
図〜第７図に示すような制限酵素切断地図を作製した。
で得られたプラスミドｐＭＯ１０１゜ｐＭＯ１１６，ｐ
ＭＯ１２６，ｐＭＯ１３３゜ｐＭＯ１３６，ｐＭｏ ２
１ ？およびｐＭＥＤ１０１をそれぞれ各種制限酵素に
よる消化とアガロースゲル電気泳動により解析し、第１
図〜第７図に示すような制限酵素切断地図を作製した。
また、ｐＮＭＲ１およびｐＮＭＲ−１０上にクローン化
されている、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０
由来のネオマイシン耐性遺伝子を同様に解析し、ネオマ
イシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ、断片の制限酵素切断地
図を作製した（第８図、第９図参照）。
されている、ミクロモノスポラ・エスピー ＭＫ−５０
由来のネオマイシン耐性遺伝子を同様に解析し、ネオマ
イシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ、断片の制限酵素切断地
図を作製した（第８図、第９図参照）。
実施例９゜
ｐＭＯｌ １６．ｐＭＯ１３３および９ＭＯ２１７によ
るミクロモノスポラ・オリポアステロスポラの形質転換 上記で調製した９ＭＯ１１６，９ＭＯ１３３および９Ｍ
Ｏ２１７をそれぞれＩＮ用いて、ミクロモノスポラ・オ
リポアステロスポラＡＴＣＣ２１８１９株を実施例３と
同様の方法で形質転換した。９ＭＯ１１６，９ＭＯ１３
３またはｐＭ。
るミクロモノスポラ・オリポアステロスポラの形質転換 上記で調製した９ＭＯ１１６，９ＭＯ１３３および９Ｍ
Ｏ２１７をそれぞれＩＮ用いて、ミクロモノスポラ・オ
リポアステロスポラＡＴＣＣ２１８１９株を実施例３と
同様の方法で形質転換した。９ＭＯ１１６，９ＭＯ１３
３またはｐＭ。
２１７を用いて得られた形質転換株の数はそれぞれ、５
．０Ｘ１０’個、１．２ＸｌＯ’個、１．ｌＸｌ０’個
であり、非常に高い形質転換効率を示した。
．０Ｘ１０’個、１．２ＸｌＯ’個、１．ｌＸｌ０’個
であり、非常に高い形質転換効率を示した。
実施例１０゜
ｐＭＥＤ１０１によるミクロモノスポラ オリポアステ
ロスポラの形質転換 実施例７で得たｐＭＥＤ１０１約１．０ｇにＰ−溶液を
加え１００ｍとし、ミクロモノスポラ オリポアステロ
スポラＡＴＣＣ２１８１９のプロトプラスト菌液５０ｇ
を素早く懸濁して１分間室温で放置後、Ｔ−溶液６００
屑を加えて静かに混合した。これをＰ−溶液で１０倍に
希釈しその１００威ずつを２４枚の再生寒天平板培地Ｒ
Ｍ−１に塗布した。プロトプラストはこの寒天培地上で
培養することによって正常菌糸細胞に復帰再生した。
ロスポラの形質転換 実施例７で得たｐＭＥＤ１０１約１．０ｇにＰ−溶液を
加え１００ｍとし、ミクロモノスポラ オリポアステロ
スポラＡＴＣＣ２１８１９のプロトプラスト菌液５０ｇ
を素早く懸濁して１分間室温で放置後、Ｔ−溶液６００
屑を加えて静かに混合した。これをＰ−溶液で１０倍に
希釈しその１００威ずつを２４枚の再生寒天平板培地Ｒ
Ｍ−１に塗布した。プロトプラストはこの寒天培地上で
培養することによって正常菌糸細胞に復帰再生した。
３０℃で４日間培養後、０．Ｆ■／ｍｌのネオマイシン
硫酸塩（シグマ社製）を含む軟寒天培地２．５ｍｌを重
層し、固化後さらに３０℃で３週間培養した。
硫酸塩（シグマ社製）を含む軟寒天培地２．５ｍｌを重
層し、固化後さらに３０℃で３週間培養した。
ネオマイシン耐性を獲得して生育してきた再生株をＳＫ
Ｎα２培地で培養し、実施例１と同様の方法で、再生株
が保有するプラスミドを検討した結果、再生株はｐＭＥ
Ｄｌ ０１を保有していた。この実験において１■のｐ
ＭＥＤｌ ０１を用いて総計１３２個の形質転換体を得
ることができた。
Ｎα２培地で培養し、実施例１と同様の方法で、再生株
が保有するプラスミドを検討した結果、再生株はｐＭＥ
Ｄｌ ０１を保有していた。この実験において１■のｐ
ＭＥＤｌ ０１を用いて総計１３２個の形質転換体を得
ることができた。
発明の効果
本発明によれば、ミクロモノスポラ属菌種中で自律複製
可能なりローニングベクターを得ることができ、ミクロ
モノスポラ属菌種における宿主−ベクター系を提供する
ことができる。
可能なりローニングベクターを得ることができ、ミクロ
モノスポラ属菌種における宿主−ベクター系を提供する
ことができる。
第１図〜第７図は、それぞれｐＭｏｔｏｔ。
９ＭＯ１１６，９ＭＯ１３３，ｐＭＯ１２６゜ｐＭＯ１
３６，９ＭＯ２’１７およびｐＭＥＤｌ ０１の制限酵
素切断地図を示す。第８図および第９図は、ミクロモノ
スポラ・エスピー ＭＫ−５０由来のネオマイシン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を示す。図
中、太線の範囲にネオマイシ耐性遺伝子が存在する。 第８図のへの部分が、９ＭＯ１１６，ｐＭ。 １３３およびｐＭＯ２１Ｔに挿入されたＤＮＡ断片であ
る。第９図のＢの部分がｐＭｏ １２６に、Ｃの部分が
ｐＭＯ１３６およびｐ、ＭＥＤＩＯＩにそれぞれ挿入さ
れたＤＮＡ断片である。 図中の各数字はそれぞれ下記の値（Ｋｂ）を表す。 第１図＋１．０．００／３８．５２．０．５１３．１０
．５４、’ １４．９ ５．１５．２ ６．１７．３
７．１７．９＆、 １８．３ ９． ２３．３ １０
． ２６．４ １１． ２９．０１２、２９．２ １３
．２９．９ １４．３７．１第２図：ｌ、 ０．００／
６．９２．１．５３．１．９４．２．１５、２．３５
６．２．７ ？、 ２．８ ８．２．９９、２．９５
１０．３．１ １１．３．４ １２．３．５１３、５
．８ １４．６．０ １５．６．８第３図：１．０．０
０／２２．４２．０．１０３．０．５０４、０．６０
５．０．７０ ６．０．８０ ？、 １．１５８、１
．６ ９．２．０ １０．３．２ １１．３．４１２、
５．９ １３．８．３５ １４．１４．１ １５．１４
．４１６、１４．５ １？、 １５．．１ １８．１？
、２ １９．１７．５２０、２０．９ ２１．２１．０
２２．２２．０第４図：１．Ｏ，Ｏロ／７．２２．０
．７５３．１．２５４．１．５０５．２．０５ ６．３
．１ ？、 ３．９ Ｂ、 ４．２９、 ６．５
ＩＯ，６，６１１，６，９１２，７，０第５図：ｌ、
Ｏ，ＯＱ／７．１ ２．０．２０３． Ｇ、４０４．
０．７０５、 １．２ ６． ４．２ ７． ４．０
８． ５．２９、 ５．３ １０． ６．８ 第６図：ｌ、 ０．００／１２．６２．０．１０３．０
，６０ ４．１．０５、 １．１ ６． １．２ ７．
１．３ ８． １．４９、 １．７５ １０． ２．
０ ］、１． ２．２ １２． ２．６１３、 ３．
０ １４． ３．３ １５． ４．２ １６． ５．９
１７、 ６．４ １８． ７．５ １９． ８．９ ２
０． ９．２２１、 ９．３ ２２． ９．６ ２３．
９．６ ２４． ９．９２５、 １０．６ ２６．
１０．８ ２７． １１．５ ２８． １２．１第７図
：ｌ、 ０．００／７．５２．０．１０３．０．９０４
．０．９３５、 ４．１ ６． ４．６ ７． ４．９
第８図：ｌ、 ｏ、ｏｏ ２．０．３０３．０．７２
４．１，１０５、 １．３２ ６． １．５７ ７．
１．９２ ８． ２．０２９．２．１２ １０． ２．
２１ Ｉｔ、 ２．３５ １２． ２．６５１３．
２．７５ １４． ３．２０ １５． ３．３０ １６
． ６．１０１７、 ７．１０ １８． ７．８０ 第９図：ｌ、 ０．００ ２． ０．２５ ３． ０
．７６ ４． １．１０５、 １．６９ ６． ２．８
０ ７． ２．８８ ８． ３．６１９、 ４．１０
１［）、 ４．４２ １１． ４．９３ １２． ５
．９１１３、 ６．２５ １４． １３゜５０ １
５． ６．８６ １６． ７．７０特許出願人（＋０
２）協和醗酵工業株式会社に− 第５図 ｐＵｃ１９由来のポリリンカー 第８図 第９図
３６，９ＭＯ２’１７およびｐＭＥＤｌ ０１の制限酵
素切断地図を示す。第８図および第９図は、ミクロモノ
スポラ・エスピー ＭＫ−５０由来のネオマイシン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を示す。図
中、太線の範囲にネオマイシ耐性遺伝子が存在する。 第８図のへの部分が、９ＭＯ１１６，ｐＭ。 １３３およびｐＭＯ２１Ｔに挿入されたＤＮＡ断片であ
る。第９図のＢの部分がｐＭｏ １２６に、Ｃの部分が
ｐＭＯ１３６およびｐ、ＭＥＤＩＯＩにそれぞれ挿入さ
れたＤＮＡ断片である。 図中の各数字はそれぞれ下記の値（Ｋｂ）を表す。 第１図＋１．０．００／３８．５２．０．５１３．１０
．５４、’ １４．９ ５．１５．２ ６．１７．３
７．１７．９＆、 １８．３ ９． ２３．３ １０
． ２６．４ １１． ２９．０１２、２９．２ １３
．２９．９ １４．３７．１第２図：ｌ、 ０．００／
６．９２．１．５３．１．９４．２．１５、２．３５
６．２．７ ？、 ２．８ ８．２．９９、２．９５
１０．３．１ １１．３．４ １２．３．５１３、５
．８ １４．６．０ １５．６．８第３図：１．０．０
０／２２．４２．０．１０３．０．５０４、０．６０
５．０．７０ ６．０．８０ ？、 １．１５８、１
．６ ９．２．０ １０．３．２ １１．３．４１２、
５．９ １３．８．３５ １４．１４．１ １５．１４
．４１６、１４．５ １？、 １５．．１ １８．１？
、２ １９．１７．５２０、２０．９ ２１．２１．０
２２．２２．０第４図：１．Ｏ，Ｏロ／７．２２．０
．７５３．１．２５４．１．５０５．２．０５ ６．３
．１ ？、 ３．９ Ｂ、 ４．２９、 ６．５
ＩＯ，６，６１１，６，９１２，７，０第５図：ｌ、
Ｏ，ＯＱ／７．１ ２．０．２０３． Ｇ、４０４．
０．７０５、 １．２ ６． ４．２ ７． ４．０
８． ５．２９、 ５．３ １０． ６．８ 第６図：ｌ、 ０．００／１２．６２．０．１０３．０
，６０ ４．１．０５、 １．１ ６． １．２ ７．
１．３ ８． １．４９、 １．７５ １０． ２．
０ ］、１． ２．２ １２． ２．６１３、 ３．
０ １４． ３．３ １５． ４．２ １６． ５．９
１７、 ６．４ １８． ７．５ １９． ８．９ ２
０． ９．２２１、 ９．３ ２２． ９．６ ２３．
９．６ ２４． ９．９２５、 １０．６ ２６．
１０．８ ２７． １１．５ ２８． １２．１第７図
：ｌ、 ０．００／７．５２．０．１０３．０．９０４
．０．９３５、 ４．１ ６． ４．６ ７． ４．９
第８図：ｌ、 ｏ、ｏｏ ２．０．３０３．０．７２
４．１，１０５、 １．３２ ６． １．５７ ７．
１．９２ ８． ２．０２９．２．１２ １０． ２．
２１ Ｉｔ、 ２．３５ １２． ２．６５１３．
２．７５ １４． ３．２０ １５． ３．３０ １６
． ６．１０１７、 ７．１０ １８． ７．８０ 第９図：ｌ、 ０．００ ２． ０．２５ ３． ０
．７６ ４． １．１０５、 １．６９ ６． ２．８
０ ７． ２．８８ ８． ３．６１９、 ４．１０
１［）、 ４．４２ １１． ４．９３ １２． ５
．９１１３、 ６．２５ １４． １３゜５０ １
５． ６．８６ １６． ７．７０特許出願人（＋０
２）協和醗酵工業株式会社に− 第５図 ｐＵｃ１９由来のポリリンカー 第８図 第９図
Claims (9)
- （１）ミクロモノスポラ属菌由来で、分子量が約２５メ
ガダルトンであり、かつ制限酵素に対する感受性部位数
が、ＨｉｎｄIII１、ＢａｍＨ I ５、Ｂｃｌ I ３、Ｐ
ｓｔ I ９、Ｓａｃ I １、Ｘｂａ I ３、Ｘｈｏ I １、
Ｋｐｎ I ６で あるプラスミドｐＭＯ１０１。 - （２）ミクロモノスポラ属菌種中で遺伝形質が発現され
る遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ミクロモノスポラ属菌種
中で自律複製できるプラスミドに組み込んだ組換え体プ
ラスミドで、かつミクロモノスポラ属菌種中で自律複製
し、該導入遺伝子の発現に基づいてその存在を識別しう
る組換え体クローニングベクター。 - （３）該ＤＮＡ断片が薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
である請求項２記載のクローニングベクター。 - （４）該ＤＮＡ断片がネオマイシン耐性遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片である請求項２または３記載のクローニングベ
クター。 - （５）該ＤＮＡ断片が、ミクロモノスポラ・エスビーＭ
Ｋ−５０（ＦＥＲＭＢＰ−１６１３） 由来のＤＮＡ断片である請求項２〜４記載のクローニン
グベクター。 - （６）該ＤＮＡ断片が、約３キロベースの制限酵素Ｂｇ
ｌII切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対する感受性部位
数がＫｐｎ I １、ＢａｍＨ I ３、Ｐｓｔ I ２、Ｓａ
ｃ I ２、Ｃｌａ I １、 Ｘｂａ I １、Ｘｈｏ I １、Ｂｃｌ I １ で特徴づけられるＤＮＡ断片、約３キロベースの制限酵
素ＢａｍＨ I 切断ＤＮＡ断片でかつ制限酵素に対する
感受性部位数がＰｓｔ I １、Ｘｈｏ I １、Ｓａｃ I
１、Ｓｐｈ I １で 特徴づけられるＤＮＡ断片または約１．５キロベースの
制限酵素ＢａｍＨ I ／Ｓａｃ I 切断ＤＮＡ断片でかつ
制限酵素に対する感受性部位数がＰｓｔ I １、Ｘｈｏ
I １で特徴づけられる ＤＮＡ断片から選ばれる請求項５記載のクローニングベ
クター。 - （７）該クローニングベクターが、ｐＭＯ１１６、ｐＭ
Ｏ１２６、ｐＭＯ１３３、ｐＭＯ１３６またはｐＭＯ２
１７から選ばれるプラスミドである請求項２〜６記載の
クローニングベクター。 - （８）該クローニングベクターが、ミクロモノスポラ属
菌および大腸菌の両方で自律複製可能なプラスミドであ
る請求項２〜６記載のクローニングベクター。 - （９）該クローニングベクターが、ｐＭＥＤ１０１であ
る請求項８記載のクローニングベクター。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63136225A JPH01304887A (ja) | 1988-06-02 | 1988-06-02 | クローニングベクター |
| EP89109923A EP0344767A1 (en) | 1988-06-02 | 1989-06-01 | Cloning vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63136225A JPH01304887A (ja) | 1988-06-02 | 1988-06-02 | クローニングベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01304887A true JPH01304887A (ja) | 1989-12-08 |
Family
ID=15170217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63136225A Pending JPH01304887A (ja) | 1988-06-02 | 1988-06-02 | クローニングベクター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0344767A1 (ja) |
| JP (1) | JPH01304887A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6569668B2 (en) | 2000-04-04 | 2003-05-27 | Schering Corporation | Isolated nucleic acids from Micromonospora rosaria plasmid pMR2 and vectors made therefrom |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6047684A (ja) * | 1983-08-23 | 1985-03-15 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | プラスミドおよびその製法 |
| JPS647760A (en) * | 1987-06-30 | 1989-01-11 | Canon Kk | Image reproducer |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57179196A (en) * | 1981-04-28 | 1982-11-04 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid and its preparation |
-
1988
- 1988-06-02 JP JP63136225A patent/JPH01304887A/ja active Pending
-
1989
- 1989-06-01 EP EP89109923A patent/EP0344767A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6047684A (ja) * | 1983-08-23 | 1985-03-15 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | プラスミドおよびその製法 |
| JPS647760A (en) * | 1987-06-30 | 1989-01-11 | Canon Kk | Image reproducer |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6569668B2 (en) | 2000-04-04 | 2003-05-27 | Schering Corporation | Isolated nucleic acids from Micromonospora rosaria plasmid pMR2 and vectors made therefrom |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0344767A1 (en) | 1989-12-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Novick | [27] Genetic systems in Staphylococci | |
| Chang et al. | High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA | |
| Hoch | [13] genetic analysis in Bacillus subtilis | |
| Donohue et al. | [22] Genetic techniques in rhodospirillaceae | |
| EP0937098B1 (en) | Recombinational cloning in vitro using engineered recombination sites | |
| US4493893A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
| AU2003218114A1 (en) | Integrated system for high throughput capture of genetic diversity | |
| Kahn et al. | Essential regions for replication of a stringent and a relaxed plasmid in Escherichia coli | |
| Vargas et al. | Isolation of cryptic plasmids from moderately halophilic eubacteria of the genus Halomonas. Characterization of a small plasmid from H. elongata and its use for shuttle vector construction | |
| US4626504A (en) | DNA transfer vector for gram-negative bacteria | |
| EP0057976B1 (en) | a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| Beare et al. | Gene inactivation in Coxiella burnetii | |
| JPH04346787A (ja) | Ｄｎａ、組換えベクター、微生物、ｄｎａの取得法、組換え蛋白質の取得法及び組換え蛋白質 | |
| Ma et al. | Development of a CRISPR/Cas9D10A nickase (nCas9)-mediated genome editing tool in Streptomyces | |
| Najah et al. | Design of a generic CRISPR-Cas9 approach using the same sgRNA to perform gene editing at distinct loci | |
| EP0118367B1 (en) | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes | |
| Klapatch et al. | Restriction endonuclease activity in Clostridium thermocellum and Clostridium thermosaccharolyticum | |
| US4631259A (en) | Transposon in cloning DNA | |
| US4703009A (en) | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes | |
| JPH01304887A (ja) | クローニングベクター | |
| EP0108301B1 (en) | Method of heterologous cloning of gene in bacillus microorganism | |
| US4992371A (en) | Hybrid plasmids having a streptomycetes replicon and an escherichia coli replicon | |
| JP2526203B2 (ja) | ストレプトミセスプラスミドｐｓｇ５ | |
| Baum et al. | Multiple roles for TnpI recombinase in regulation of Tn 5401 transposition in bacillus thuringiensis | |
| US4418194A (en) | DNA Fragments for forming plasmids |